CROMATOGRAFIA Introduo Com origem no grego chroma + graphein, a cromatografia ou escrita da cor, um mtodo contemporneo que ganhou relevo

o por volta de 1903, com o botnico Mikhail Semenovich Tswett, nascido em Asti (Itlia), sendo a famlia originria da Rssia. Foi mais tarde considerado o pai da cromatografia moderna, atravs dos vrios trabalhos experimentais que efetuou, particularmente na separao de extratos de plantas por adsoro diferencial em colunas, tendo verificado a ntida separao de diversos pigmentos corados. Desde ento, enormes avanos tm sido concretizados com elevado mrito por diversos cientistas pioneiros no desenvolvimento e aperfeioamento desta importante tcnica de separao. A cromatografia um mtodo fsico-qumico de separao. Ela est fundamentada na migrao diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interaes, entre duas fases imiscveis, a fase mvel e a fase estacionria. A cromatografia pode ser utilizada para a identificao de compostos, por comparao com padres previamente existentes, para a purificao de compostos, separando-se as substncias indesejveis e para a separao dos componentes de uma mistura. Classificao dos processos cromatogrficos As diferentes formas de cromatografia podem ser classificadas considerando-se diversos critrios, sendo alguns deles listados abaixo: 1. Classificao pela forma fsica do sistema cromatogrfico Em relao forma fsica do sistema, a cromatografia pode ser subdividida em cromatografia em coluna e cromatografia planar. Enquanto a cromatografia planar resume-se cromatografia em papel (PC), cromatografia por centrifugao (Chromatotron) e cromatografia em camada delgada (CCD), so diversos os tipos de cromatografia em coluna. 2. Classificao pela fase mvel empregada Em se tratando da fase mvel, so trs os tipos de cromatografia: a cromatografia gasosa, a cromatografia lquida e a cromatografia supercrtica (CSC), usando-se na ltima um vapor pressurizado, acima de sua temperatura crtica. A cromatografia lquida apresenta uma importante subdiviso: a cromatografia lquida clssica (CLC), na qual a fase mvel arrastada atravs da coluna apenas pela fora da gravidade, e a cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE), na qual se utilizam fases estacionrias de partculas menores, sendo necessrio o uso de uma bomba de alta presso para a eluio da fase mvel. A CLAE foi inicialmente denominada cromatografia lquida de alta presso, mas sua atual designao mostra-se mais adequada.

No caso de fases mveis gasosas, separaes podem ser obtidas por cromatografia gasosa (CG) e por cromatografia gasosa de alta resoluo (CGAR). A diferena entre os dois tipos est na coluna. Enquanto na CGAR so utilizadas colunas capilares, nas quais a fase estacionria um filme depositado na mesma, a CG utiliza colunas de maior dimetro empacotadas com a fase estacionria. 3. Classificao pela fase estacionria utilizada Quanto fase estacionria, distingue- se entre fases estacionrias slidas, lquidas e quimicamente ligadas. No caso da fase estacionria ser constituda por um lquido, este pode estar simplesmente adsorvido sobre um suporte slido ou imobilizado sobre ele. Suportes modificados so considerados separadamente, como fases quimicamente ligadas, por normalmente diferirem dos outros dois em seus mecanismos de separao. 4. Classificao pelo modo de separao Segundo o modo de separao, tem em conta os princpios fsicos e qumicos subjacentes na partio dos solutos entre as duas fases. Na cromatografia de adsoro as separaes ocorrem atravs de interaes eletrostticas e foras de Van Der Waals entre a fase estacionria (slido) e os componentes a separar da fase mvel (lquido ou gs). A natureza da fase estacionria pode ser muito diversa, nomeadamente slica gel, alumina ou celulose. O fracionamento por cromatografia de interao hidrofbica em coluna, sobretudo de misturas contendo espcies no inicas solveis em solventes orgnicos, essencialmente determinado por diferenas de polaridade dos componentes na mistura a resolver. A cromatografia de partio baseada nas diferenas de solubilidade dos componentes na fase estacionria (lquido) e na fase mvel (lquido). Na cromatografia de permuta inica a separao ocorre devida diferentes tendncias dos componentes inicos ou ionizados permutarem com ons da fase estacionria, que, assim, so deslocados para a fase mvel. A afinidade entre os ons da fase mvel e o suporte pode ser controlada por alterao do pH e da fora inica do eluente. A cromatografia de excluso molecular, denominada tambm como filtrao em gel ou separao por peneiros moleculares, separa os componentes segundo o tamanho efectivo (raio hidrodinmico) das molculas, isto , molculas grandes no penetram no interior do suporte (partculas porosas de gel) e movem-se mais rapidamente ao longo da coluna de onde emergem primeiro, enquanto as molculas pequenas vm a sua velocidade de deslocamento retardada porque penetram no gel, portanto, emergem da coluna mais tardiamente.

Na cromatografia de afinidade ocorre uma ligao molecular especfica e reversvel entre o soluto e um ligante imobilizado na fase estacionria. Esta tcnica utiliza-se especificamente para separar produtos biolgicos, e como exemplo pode-se citar: ligaes enzimas e substratos, anticorpos e substratos e receptores de hormonais Para ter uma viso mais ampla dos diferentes tipos de cromatografia, os mesmos esto dispostos no diagrama da figura abaixo:

Cromatografia planar
A cromatografia em papel (tcnica de partio liquido-liquido) A cromatografia em papel (CP) uma das tcnicas mais simples e que requer menos instrumentos para sua realizao, porm a que apresenta as maiores restries para sua utilizao em termos analticos. Neste tipo de cromatografia, baseia-se na diferena de solubilidade das substncias em questo entre duas fases imiscveis, sendo geralmente a gua um dos lquidos. O solvente saturado em gua e a partio se d devido presena de gua em celulose (papel de filtro). Este mtodo, embora menos eficiente que a CCD, muito til para a separao de compostos polares, tais como acares, antibiticos hidrossolveis, aminocidos, pigmentos e ons metlicos sendo largamente usado em bioqumica. A cromatografia em camada delgada (tcnica de adsoro liquido-slido) Na cromatografia em camada delgada (TLC), a fase estacionria uma camada fina formada por um slido granulado (slica, alumina, poliamida, etc.) depositado sobre uma placa de vidro, alumnio ou outro suporte inerte. Pequenas gotas de soluo das amostras a serem analisadas so aplicadas em um ponto prximo ao extremo inferior da placa. Deixa-se a placa secar e, ento se coloca a mesma em um recipiente contendo a fase mvel (solvente ou mistura de solventes). A polaridade do solvente dever ser de acordo com a substncia que se deseja separar. Como somente a base da placa fica submersa, o solvente comea a molhar a fase estacionria e sob por capilaridade. Deixa-se secar a

placa aps o deslocamento da fase mvel sobre ela. A revelao da placa feita com a aplicao de um reativo que de cor s substncias de interesse. A figura abaixo mostra um cromatograma obtido por CCD no qual se pode observar a diferena de afinidade das substncias 1 e 2 pela fase estacionria, sendo a substncia 1 mais retida que a 2. Por ser um mtodo simples, rpido, visual e econmico, a CCD a tcnica predominantemente escolhida para o acompanhamento de reaes orgnicas, sendo tambm muito utilizada para a purificao de substncias e para a identificao de fraes coletadas em cromatografia lquida clssica.

Esquematizao de um cromatograma obtido por CCD.

Cromatografia por Centrifugao (Chromatotron) Consiste num sistema de placa circular de CCD inclinada, o que permite a maior eficcia no escoamento e coleta das substncias.

Chromatotron
Fonte: www.hoeger.uni-bonn.de

Cromatografia em coluna
Cromatografia lquida clssica Esta tcnica muito utilizada para isolamento de produtos naturais e purificao de produtos de reaes qumicas. As fases estacionrias mais utilizadas so slica e alumina, entretanto estes adsorventes podem servir simplesmente como suporte para uma fase estacionria lquida. Fases estacionrias slidas levam separao por adsoro e fases estacionrias lquidas por partio. Suportes quimicamente modificados tambm tm sido usados, sendo o processo de separao misto neste caso. Esses suportes so acondicionados em tubos cilndricos geralmente de vidro, de dimetros variados, os quais possuem uma torneira em sua extremidade inferior. A figura ao lado uma ilustrao de uma coluna cromatogrfica empacotada com slica, sendo mostrados seus demais constituintes. A principal etapa ao se utilizar essa tcnica o empacotamento, o qual, entre outros fatores, definir a eficincia da separao. Enquanto a alumina empacotada em sua forma original, a slica deve s-lo na forma de suspenso.

Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) O grande avano na cromatografia em coluna foi o desenvolvimento e a utilizao de suportes com partculas diminutas responsveis pela alta eficincia, as quais tornam necessrio o uso de bombas de alta presso para a eluio da fase mvel, devido a sua baixa permeabilidade. A figura abaixo mostra um equipamento tpico de CLAE.

Equipamento bsico de CLAE. a) reservatrio da fase mvel; b) bomba de alta presso; c)vlvula de injeo; d) coluna; e) detector e f) registrador.

As fases mveis utilizadas em CLAE devem possuir alto grau de pureza e estar livres de oxignio ou outros gases dissolvidos, sendo filtradas e desgaseificadas antes do uso. A bomba deve proporcionar ao sistema vazo contnua sem pulsos com alta reprodutibilidade, possibilitando a eluio da fase mvel a um fluxo adequado. As vlvulas de injeo usadas possuem uma ala de amostragem para a introduo da amostra com uma seringa e duas posies, uma para o preenchimento da ala e outra para sua liberao para a coluna. Existem alas de diversos volumes, sendo utilizadas geralmente alas na faixa de 5-50 mL para injees analticas e 05-2 mL para preparativas. O detector mais utilizado para separaes por CLAE o detector de ultravioleta, sendo tambm empregados detectores de fluorescncia, de indce de refrao, e eletroqumicos, entre outros. Detectores de polarimetria para CLAE, recentemente desenvolvidos, diferenciam compostos quirais, atravs da rotao de seus estereoismeros frente luz plano-polarizada. O registro de dados pode ser feito atravs de um registrador, um integrador ou um microcomputador. Figura: Cromatograma mostrando a separao dos enantimeros do tetramisol, princpio ativo de vrios medicamentos usados para ascaridase. A versatilidade desta tcnica reside no grande nmero de fases estacionrias existentes, as quais possibilitam anlises e separaes de uma ampla gama de compostos com alta eficincia. Tem sido utilizada em vrias reas da cincia, no acompanhamento de snteses, em anlises de pesticidas, feromnios, no isolamento de produtos naturais e sintticos e na produo e controle de qualidade de medicamentos, dentre tantas outras aplicaes. As separaes em CLAE podem se dar por adsoro, partio ou ambos. O suporte mais comumente utilizado a slica. O uso de fases estacionrias lquidas adsorvidas a um suporte no tem grande aplicao devido perda de fase estacionria, mas o uso de suportes modificados, os quais foram desenvolvidos como conseqncia do problema acima, possibilita a produo de uma imensa variedade de colunas com diferentes propriedades e tipos de seletividade. As fases assim obtidas so chamadas de quimicamente ligadas. Cromatografia gasosa de alta resoluo (CGAR) Em contraste CLAE, o principal mecanismo de separao da cromatografia gasosa est baseado na partio dos componentes de uma amostra entre a fase mvel gasosa e a fase estacionria lquida. A utilizao de fases estacionrias slidas, as quais levariam separao por adsoro, apresenta poucas aplicaes.

A cromatografia gasosa (CG) uma das tcnicas analticas mais utilizadas. Alm de possuir um alto poder de resoluo, muito atrativa devido possibilidade de deteco em escala de nano a picogramas (109 - 10-12 g). A grande limitao deste mtodo a necessidade de que a amostra seja voltil ou estvel termicamente, embora amostras no volteis ou instveis possam ser derivadas quimicamente. Pode ser utilizada para separaes preparativas apenas na faixa de microgramas a miligramas, no sendo muito empregada para esse fim. A figura abaixo mostra os componentes bsicos de um cromatgrafo gasoso.

Componentes bsicos de um cromatgrafo gasoso. a) cilindro do gs de arraste mantido sob alta presso; b) injetor; c) coluna; d) detector e e) registrador.

A diferena entre CG e CGAR est na coluna. Colunas de CGAR so maiores em comprimento, menores em dimetro, possuem a fase lquida como um filme aplicado diretamente s paredes do tubo da coluna e so mais eficientes. Os gases mais utilizados como fase mvel so o hlio (He), hidrognio(H), nitrognio (N). Como o He de difcil obteno e alto custo pouco utilizado no Brasil. Estes gases devem ter alta pureza e ser inertes em relao fase estacionria. Atualmente, espectrmetros de massa tm sido acoplados a equipamentos de cromatografia gasosa, possibilitando a identificao imediata das substncias presentes na amostra. Cromatografia supercrtica (CSC) um tipo de cromatografia em que a fase mvel um fluido supercrtico. Um fluido diz-se estar num estado supercrtico quando ele est em condies de temperatura mais elevada do que a temperatura crtica e presso acima da presso crtica. Nestas condies, as propriedades do fluido so parcialmente semelhantes s de um lquido (como por exemplo, a densidade) e, em parte, semelhantes aos de um gs (por exemplo,viscosidade). A CSC usada para utilizaes especificas apresentando vantagens na rea compreendida entre a cromatografia gasosa e a cromatografia lquida, tornando possvel, por exemplo, a separao de substncias no volteis em colunas abertas, visto

que um fludo supercrtico rene a vantagem da alta difusibilidade do gs e do alto poder de solvatao do lquido. A fase mvel um fluido, sendo o mais utilizado o dixido de carbono que pode ser ou no modificado com substncias tendentes a aumentar a sua polaridade e utilizado tambm por se no txico, menos poluentes e de baixo custo. Representao mais completa dos tipos de cromatografia

REFERNCIAS BIBIOGRFICAS

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