Revista Dental de Chile 2002; 93 (1): 17 - 20

Trabajo de Investigacin

Autores:
Dr. Ismael Yvenes L., Dr. Juan Reyes Y., Dra. Marcia Antnez R., Dra. Licarallen Quevedo C. y Dr. Carlos Garrido F.
Depto. de Cs. Fsicas y Qumicas y Odontologa Conservadora. Area de Qumica y Endodoncia. Facultad de Odontologa, Universidad de Chile. Santos Dumont 964, Santiago.

Desmineralizacin de Premolares con Soluciones de EDTA a Diferentes pH de Incubacin.

Premolar Demineralizing With EDTA Solutions at Differents Incubating pH.

Proyecto PRI ODO / 01/ 01

Resumen
En piezas dentarias sanas y cariadas se midi la desmineralizacin mediada por EDTA, con el objetivo de evaluar y comparar el efecto del pH del EDTA en el grabado de la superficie dental. La muestra consider 28 premolares: 14 sanos y 14 cariados, de peso 1.2 g promedio, que se incubaron en EDTA-Na2 0.01 M a pH 5.71, 6.12 y 6.77, durante 3 horas a temperatura ambiente, con una distribucin al azar. Se tomaron muestras cada 30 minutos, midindose pH, concentracin de calcio y fsforo. El pH se midi con un pHmeter, las determinaciones de calcio y fsforo se realizaron leyendo complejos coloreados a 565 nm y 750 nm. Resultados: Se observa un incremento de los iones fsforo y calcio liberados con la disminucin del pH, obtenindose a pH 5.71 la mayor liberacin. El pH del EDTA disminuye con la desmineralizacin, obtenindose la mayor variacin a pH 5.71, siendo estas diferencias significativas entre los pH. No se encontraron diferencias significativas al comparar premolares sanos con cariados. Las curvas de desmineralizacin para calcio y fsforo son semejantes, observndose altos valores iniciales con una disminucin posterior. En el caso del pH del EDTA la disminucin de este es similar para todas las soluciones, con una mayor pendiente para la ms cida. Conclusiones: Los premolares liberan iones calcio, fsforo y protones al incubarse con EDTA, existiendo una fuerte correlacin entre el pH de incubacin y los iones liberados. No existen diferencias al comparar piezas sanas y cariadas.

Summary
EDTA mediated demineralizing agent was used in healthy and carious premolar teeths. Differents pHs were evaluated in order to analize the effect of pH in EDTA etching of dental surfaces. 28 premolars were considered in study. 14 healthy and 14 carious with a mean of 1.2 g. Teeth were incubated in EDTA-Na2 solutions 0.01 M (1 ml = 1 mg CaCO3) at initial pH values of 5.71, 6.12 and 6.77 for 3 hours at a room temperature. The teeth pieces distribution was randomized. Every 30 minutes a sample was taken and its pH, calcium and phosphate concentration was measured i. To determinate the calcium concentrations a complexone o-cresolphenolfaleine method was used. The phosphate determination was performed with a spectrophotometric method measuring coloured phosphomolibdate complex at 750 nm. An Ati Unicam series UV spectrophotometer was used in both evaluations. All the data was analized by statistical analysis of t-Test for uneven variances, with a statistical significance of 95% (p<0.05). The pH was measured using a pHmeter and a glass combined electrode providing an accuracy of 0.01 pH units. During the three studied pHs groups the lower pH had the higher the delivery rate of calcium and phosphate ions. As minerals dissolve pHs change significatively at the initial pH of 5.71. No significaticant differences were found between the healthy and cariuos teeths. The highest initial rate of calcium and phosphate delivery was obtained at pH 5.71 Key Words: Demineralization, premolars, EDTA

Introduccin
Durante 64 aos se utiliz un cido fuerte para la instrumentacin de conductos estrechos y calcificados, hasta que stby, en 1957, us una solucin quelante constituida por la sal disdica del cido etilendiaminotetraactico, EDTA(1). Este autor mostr que el EDTA era capaz de quelar, de modo eficaz, iones metlicos (calcio de dentina) a pH prximo al neutro (7.3). En 1963 se verific que el uso masivo, continuo e ininterrumpido del EDTA reduca la microdureza de la dentina y que este efecto reductor continuaba por 5 das despus de su aplicacin(2). Dos investigadores determinaron la propiedad qumica autolimitante del EDTA. Ellos observaron que, cuando un exceso de EDTA se colocaba sobre la dentina, aproximadamente un 73% de los componentes inorgnicos eran quelados y que la velocidad de reaccin era mayor en la primera hora de aplicacin, alcanzando el equilibrio a las 7 horas. Verificaron tambin que frente a un exceso de materia inorgnica, solamente una parte de la dentina disponible poda ser quelada cuando reaccionaba con una cantidad conocida de EDTA(3). Se demostr que una solucin de EDTA secuestra de modo definitivo los iones metlicos Pb2+, Zn2+, Co2+, Ni2+, Cd2+, Sn2+, Ca2+, Sr2+, Ba2+, Mg2+, Bi2+ y Fe2+. Al analizar el efecto de soluciones de EDTA sobre tejido dentinario se observ que una solucin de EDTA al 10% y pH 11 disolva dentina de modo considerable, en un tiempo de 10 a 15 minutos. Notaron tambin que esta solucin de EDTA presentaba efecto hidrolizante sobre las protenas y, por tanto, debera ser considerada una solucin daina
Volumen 93. N1 - Pgina 17

para los tejidos vitales en funcin del tiempo de aplicacin(4). Se estudi la accin desmineralizadora del EDTA a diferentes pH, con una solucin de EDTA a 0.3 M, preparada a diferentes pH (5.0, 6.0, 7.0, 8.0 y 9.0). Estas soluciones actuaron en dentina, y se analiz la cantidad de fsforo liberado. Se verific que la accin desmineralizadora del EDTA es influida por el pH de la solucin y el mayor efecto desmineralizador se observ entre pH 5 y 6(5). Al analizar el proceso dinmico de desmineralizacin de dentina con EDTA se observ que el pH del EDTA al interior de la

cavidad pulpar disminuye a medida que ocurre la desmineralizacin. Un aumento de concentracin de EDTA de 0.1 mol/l a 0.5 mol/l causa mayor acumulacin cida y una mayor tasa de desmineralizacin. La eficiencia del EDTA disminuye con el aumento del tiempo de contacto con la dentina, probablemente por la liberacin cida de EDTAHNa (forma predominante a pH neutro)(6). La sal disdica del cido etilendiaminote tractico (EDTA) es usada en Odontologa Conservadora para eliminar el barro dentinario antes de aplicar un adhesivo a la dentina, por su accin quelante sobre el ion

calcio. El uso del EDTA al 15% a pH cido no es apropiado como nico agente acondicionador del esmalte, porque no produce un patrn de grabado capaz de retener a la resina. Su uso despus de grabado cido produce valores de resistencia mayores que cuando se usa slo el cido fosfrico(7). Los objetivos de esta investigacin tienden a evaluar el efecto del pH del EDTA en la desmineralizacin de premolares, medida por la liberacin de Ca+2, PO4-3 e iones H+, y comparar su accin desmineralizante en piezas sanas y cariadas.

Material y Mtodo
En premolares sanos y cariados se procedi a medir el efecto desmineralizante del EDTA-Na2 0.01 M (1 ml = 1 mg de CaCO3), para lo cual se incubaron las piezas dentarias en 30 ml de EDTA buferizadas a los pH de 5.71, 6.12 y 6.77 durante 3 horas a temperatura ambiente, procedindose a medir directamente el pH en el medio y en alcuotas tomadas cada 30 minutos la liberacin de calcio y fsforo. La muestra consisti de 28 premolares: 14 sanos y 14 cariados, de peso 1.2 g promedio; el diseo muestral consisti en una distribucin proporcional en un proceso al azar. El lugar del estudio fue el Laboratorio de Qumica de la Facultad de Odontologa, y la condicin del estudio, in vitro. deproteinizacin. Para esto se utiliza el agente acomplejante !-cresolftalena complexona, que con el ion calcio presente en la muestra forma un complejo coloreado prpura, el cual es directamente proporcional a la concentracin de calcio y cuantificable espectrofotomtricamente a 572 nm. La presencia de 8-hidroxiquinolena evita la interferencia de los iones de magnesio (Mg2+), hasta una concentracin de 4 mmol/ l (100 mg/l). La determinacin de calcio se realiz en una muestra de 20 l del medio de incubacin(8). metilaminofenol-bisulfito (0.1M-2.6N), 20 l de solucin sulfito-carbonato (deproteinizadora) (5.5x10-2M-0.4M), 2 ml de solucin patrn fosfato (5 mg/100 ml), 15 minutos de incubacin a temperatura ambiente y medicin a 750 nm(9).

Material Biolgico:
28 premolares: 14 sanos y 14 cariados.

Equipos:
Espectrofotmetro UNICAM UV/Vis UV2, microelectrodo combinado de pH HANNA HI1330B adosado a un equipo convencional de pH ORION modelo 370.

Determinacin de Fsforo Inorgnico:

El fsforo inorgnico presente en la muestra forma, en presencia de molibdato de sodio, un compuesto denominado fosfomolibdato de sodio, el cual, por reduccin, se convierte en azul de molibdeno, determinable por espectrofotometra a 750 nm. La cantidad de azul de molibdeno que se forme ser proporcional a la cantidad de fsforo inorgnico en la muestra. Se sigui el siguiente esquema: 50 l de muestra, 1 ml de solucin bisulfito-borato (0.19M-5.2x10-2M), 20 l de solucin reductora sulfato p-

Reactivos:
1. Determinacin de calcio: Kit para determinacin de calcio HUMAN. 2. Determinacin de fsforo: Bisulfito-borato (0.19M-5.2x10-2 M), sulfato pmetilaminofenol-bisulfito (0.1M-2.6N), sulfito-carbonato (deproteinizadora) (5.5x102M-0.4M), fosfato (5 mg/100 ml).

Determinacin de pH:
La determinacin del pH se realiz directamente en el medio de incubacin usando un microelectrodo combinado de pH (mtodo potenciomtrico), adosado a un equipo convencional de pH.

Determinacin de Calcio:
La determinacin de calcio se realiz utilizando una tcnica que no incluye

Mtodos Estadsticos:
Todos los datos fueron analizados por el Test-t para varianzas desiguales con una significancia estadstica de un 95% (p<0.05).

Resultados
La incubacin de premolares con EDTA produce desmineralizacin de las piezas dentales con liberacin de protones al medio de incubacin, la cintica de liberacin de hidrogeniones se puede ver en la Figura 1, en la grfica se observa una disminucin del pH del EDTA en los tres medios de incubacin a medida que el tiempo de incubacin aumenta. Las grficas para los distintos pH de incubacin muestran pendientes diferentes
Volumen 93. N1 - Pgina 18

entre ellos, siendo mayor la pendiente para el pH ms cido, las diferencias entre las pendientes son significativas (p<0.5). No se observan diferencias significativas al comparar premolares sanos con premolares cariados en los tres medios de incubacin. Al cuantificar la liberacin total de hidrogeniones a las 180 horas de incubacin entre el EDTA y los premolares se obtiene la Fig. 2, en ella se observa que la mayor diferencia de pH (pH final menos pH inicial) se

produce en el medio de incubacin ms cido (pH 5,7), siendos estas diferencias significativas entre los medios de incubacin. Al comparar premolares sanos con premolares cariados se observa una mayor diferencia de pH en las piezas sanas, pero las diferencias no son significativas. En el proceso de incubacin de los premolares con EDTA se produce liberacin de iones fosfatos, los que son cuantificados como mM fsforo. La cintica de liberacin

Revista Dental de Chile

del fsforo desde las piezas dentales es graficada en la Figura 3. Se puede apreciar un fuerte incremento inicial del fsforo durante los primeros 30 minutos de la liberacin para despus disminuir progresivamente. Esta forma de curva se repite para todos los pH del EDTA y no hay diferencias significativas entre los pH de incubacin ni entre piezas sanas y cariadas. La liberacin acumulativa de fsforo (Fig. 4), desde la superficie del diente por efecto del EDTA, nos muestra una leve disminucin de la concentracin del fsforo liberado a medida que el pH del EDTA se alcaliniza, siendo estas diferencias no significativas entre los pH de incubacin del

EDTA (p>0.5). Al analizar el comportamiento entre piezas cariadas y sanas frente al proceso de desmineralizacin por parte del EDTA se observa una mayor liberacin de fsforo desde los premolares sanos, pero las diferencias no son significativas (p>0.5). Durante la incubacin de las piezas dentales con EDTA se produce liberacin al medio de iones calcio, los que fueron cuantificados como mM calcio. La velocidad de liberacin del calcio desde los premolares, es graficada en la Fig. 5. Se puede observar un fuerte incremento inicial del calcio similar al fsforo, pero de mayor cuanta durante los primeros 30 minutos de la liberacin para despus disminuir len-

tamente. La forma de curva se repite para todos los pH del EDTA usados y no hay diferencias significativas entre los pH de incubacin ni entre piezas sanas y cariadas. La liberacin acumulativa del calcio (Fig. 6), por efecto del EDTA, nos muestra una concentracin aproximada de 2 mM de calcio a las 180 horas, que disminuye levemente a medida que el pH del EDTA se basifica, siendo estas diferencias no significativas entre los pH (p>0.5). Entre piezas cariadas y sanas frente al proceso de desmineralizacin se observa una mayor liberacin desde los premolares sanos, sobre todo a pH 6.8, pero las diferencias no son significativas (p>0.5).

Fig 1. Cintica de liberacin de hidrogeniones al incubar premolares con EDTA

Fig 2. Diferencias de pH a las 180 horas al incubarse EDTA con premolares

Fig 3. Cintica de liberacin del fsforo al incubarse EDTA con premolares

Fig 4. Fsforo total liberado a las 180 horas de incubacin de premolares en EDTA

Fig 5. Cintica de liberacin de Calcio al incubarse Premolares con EDTA

Fig 6. Liberacin de Calcio a las 180 horas de incubacin

Volumen 93. N1 - Pgina 19

Discusin
Desde que stby (1957) propone la utilizacin de una solucin acuosa de la sal del EDTA a pH 7.3(1), para la instrumentacin de conductos radiculares, muchos trabajos se han realizado en: descalcificacin de estructuras seas; propiedades fsico-qumicas del EDTA, as como sus asociaciones con otras sustancias buscando reducir su tensin superficial(10), o disminuir las cantidades de smear layer en su uso alternado con hipoclorito de sodio(11). Se sabe que el EDTA quela de modo general iones metlicos, y que la quelacin es ms especfica para uno u otro ion dependiendo del pH. Segn Vogel, la quelacin del ion calcio por EDTA comienza a ser eficiente sobre pH 8, debido a la estabilidad del complejo formado(12). La liberacin de iones hidrgeno desde la superficie del diente es una medida de la desmineralizacin del esmalte y dentina en contacto con el EDTA(13), esto se comprueba en la reaccin entre el EDTA y la hidroxiapatita del esmalte y dentina, donde se produce la liberacin de hidrogeniones segn la reaccin (I): Ca10 (PO4)6 (OH)2 + 10 [H2-EDTA]210 [Ca-EDTA]2- + 6HPO42- + 12H+ + 2H2O El pH de las soluciones de EDTA afecta su eficacia y capacidad de quelacin del ion calcio. Cuando el pH se incrementa la disponibilidad de iones calcio desde hidroxiapatita para quelacin disminuye por disminucin de la solubilidad de la apatita. Al mismo tiempo la gran disociacin del EDTA produce un incremento en la capacidad quelante por el calcio. A la inversa, un bajo pH incrementa la disponibilidad de iones calcio desde la hidroxiapatita por aumento de su solubilidad para quelacin, pero la eficacia quelante del EDTA disminuye. El pH es el principal factor que determina la relacin entre formas inicas y no ionizadas de EDTA, as como limita las concentraciones de uso(14). Al tenor de los resultados obtenidos, la mayor desmineralizacin se producira a pH 5.7, el ms cido de los pH usados, esto por la pendiente de la curva en la liberacin de hidrogeniones como por las diferencias de pH medidas. Pero al analizar la cintica de liberacin del calcio y del fsforo acumulado a las 180 horas de incubacin, esta mayor desmineralizacin al pH ms cido no es tan clara, pues a pesar que hay mayor liberacin de calcio y fsforo a pH 5.7 las diferencias con los otros pH de incubacin no son significativas. Estas diferencias las podramos explicar en funcin de las constantes de disociacin (pKa) de los protones del EDTA que son 2.0, 2.67, 6.16 y 10.26, respectivamente, lo que implica que a pH 5.7 tener una mayor proporcin del EDTA como [H2 EDTA]2- lo que explicara la mayor liberacin de protones a ese pH. A pH mayores (6.1 y 6.8) la estructura del EDTA tendra una mayor proporcin de [H-EDTA]3-, lo que explicara la menor liberacin de hidrogeniones. La mayora de los productos comerciales de EDTA tienen pH 7.3 y a ese pH el 99% del EDTA est como la sal trisdica donde la reaccin de quelacin es un mol de calcio por mol de EDTA(15). A pH neutros la unin de los iones calcio al EDTA tiende a incrementar la disociacin de la hidroxiapatita y su tendencia a la quelacin. La quelacin continuar hasta que el EDTA presente en la solucin est agotado. Las reacciones involucradas son las siguientes (II): Ca 10 (PO 4 ) 6 (OH) 2 + [H-EDTA]Na 3 [Ca-EDTA]Na + 2Na + + 9Ca2+ + 6HPO 4 2- + 2OHEsta ecuacin nos da cuenta, por un lado, de la menor produccin cida en la reaccin entre la hidroxiapatita y el EDTA, y por otro lado, de la liberacin de iones calcio y fosfato a pH neutros, lo que explicara las no diferencias en la liberacin inica a los distintos pH de incubacin, porque lo ms probable es que a los pH usados las dos reacciones (I y II) estn ocurriendo simultneamente, predominando la primera a pH ms cidos y la segunda a pH ms neutros.

Implicancias Clnicas:
La principal implicancia clnica obtenida es que pareciera que las concentraciones de EDTA utilizadas al interior del conducto radicular son excesivas, porque se obtienen desmineralizaciones de tejidos ms duros, como es el esmalte con concentraciones mucho ms bajas de EDTA, adems que debiera reestudiarse el pH al cual se utiliza este descalcificante, porque el ptimo segn lo ltimo descrito en la literatura no estara a pH 7.3.

Bibliografa
1. stby, NB. Chelation in root canal therapy. Ethylenediamine tetra-acetic acid for cleasing and widening of root canals. Odont. Tidskrift, 65(.2): 3-11, 1957. 2. Patterson, SA. In vivo and in vitro studies of the effect of disodium salt of ethylenediamine tetra-acetate on human dentine and its endodontic implications. Oral Surg., 16(1): 83-103, 1963. 3. Seidberg, BH; Schilder, H. An evaluation of EDTA in Endodontics. Oral Surg., 37(4): 609-20, 1974. 4. Jussila, O; Photo, M. Uber lie Esweitining von engen wurzelkanlen mittels chemischer verfahren. Finska Tand. Forhandlingar, 50(.3): 122, 1954. 5. Cury, JA; Bragotto, C; Vandrighi, L. The demineralizing efficiency of EDTA solutions on dentin. Oral Surg., 52(.4): 446-8, 1981. 6. Prez, VC; Crdenas, MEM; Planells, SP. The possible role of pH changes during EDTA demineralization of teeth. Oral Surg., 68(.2): 220-2, 1989. 7. Cafati. P et al. Estudio del efecto del ion zinc del esmalte en la adhesin con resina compuesta. Tesis Facultad de Odontologa, U. de Chile, 1995. 8. Fries, J. Anlisis de trazas. Ed. Merck, Darmstad 38, 1971. 9. Chen, PS; Toribara, TY; Wagner, H. Microdetermination of phosphurus. Anal Chem 28: 1.756-1.758, 1956. 10. Fairbanks, DCO. Avaliao da capacidade quelante do EDTA, do EDTAC e do EDTA-T pela anlise da microdureza da dentina radicular. Ro de Janeiro, 1995, 82 p, Dissertaao de Mestrado - Faculdade de Odontologia da Universidade do Estado do Rio de Janeiro. 11. Yamada, RS; Armas, A; Goldman, M; Lin, SP. A scanning electron microscopic comparison of a high volume final flush with several irrigating solutions. Part 3, J. Endodont., V. 9, N 4, p 137-42, 1983. 12. Voguel, A. Anlise Inorgnica quantitativa, 4 ed. Rio de Janeiro, Guanabara, p 197-8, 1981. 13. Calvo, V. Desmineralizacin de hidroxiapatita y dentina por EDTA. Rev. Fac. Odont. Univ. de Chile 4(2), 1986. 14. OConnell, MS; Morgan, LA; Beeler, WJ; Baumgartner, JC. A comparative study of smear layer removal using different salts of EDTA. J Endodon 26(12): 739-743, 2000. 15. Dwyer, FP; Mellor, DP. Chelating agents and metal chelates. New York Academic Press, 1964: 95-141, 283333.

Volumen 93. N1 - Pgina 20