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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Analyse microbiologique des vins et des mots
METHOD OIV-MA-AS4-01
Mthode Type IV
Analyse microbiologique des vins et des mots : detection, differenciation et denombrement des microorganismes
(OIV-Oeno 206-2010) L'analyse microbiologique a pour but de suivre les fermentations alcoolique et/ou malolactique et de dceler les risques d'altrations microbiennes, ce qui permet de dtecter toute anomalie, non seulement dans le produit fini, mais aussi pendant les diffrentes phases de sa fabrication. Remarque : Toutes les manipulations doivent tre faites selon les conditions aseptiques usuelles dans les travaux de microbiologie, en utilisant du matriel strilis, proximit de la flamme d'un bec Bunsen ou dans une chambre flux laminaire et en passant la flamme les orifices des pipettes, tubes, flacons, etc. Avant d'effectuer l'analyse microbiologique, il est ncessaire d'effectuer correctement le prlvement de l'chantillon analyser. Champ d'application : L'analyse microbiologique peut tre applique aux vins, mots, mistelles et tous produits similaires, mme lorsque ceux-ci sont altrs par une activit microbienne. Ces mthodes sont aussi adaptes l'analyse des prparations industrielles de microorganismes slectionns, levures LSA et bactries lactiques. Techniques d'analyse microbiologique : 1. 2. 3. 4. Ractifs et produits Installations et quipement chantillonnage Essais de tenue
4.1 objectif 4.2 principe 4.3 mode opratoire 4.3.1 essai de tenue l'air 4.3.2 essai de tenue l'tuve
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5. Techniques de microscopie pour la dtection, diffrenciation des micro-organismes et dnombrement direct des levures 5.1. Examen microscopique des liquides ou des dpts 5.2. Coloration de Gram pour la diffrentiation des bactries isoles partir de colonies (voir paragraphe 6) 5.3. Recherche de la catalase pour la diffrentiation des bactries isoles partir de colonies(voir paragraphe 6) 5.4. Dnombrement des cellules de levure hmocytomtrie 5.5. Dnombrement des cellules de levure Coloration au bleu de mthylne 6. Dnombrement des micro-organismes par culture 6.1 Dtection, diffrenciation et dnombrement des micro-organismes (numration sur plaque) 6.2. Culture en milieu liquide - "nombre le plus probable" (NPP).
1. RACTIFS ET PRODUITS quipement et appareillage courants de laboratoire, comme indiqu dans ISO 7218:2007 - Microbiologie des denres alimentaires et aliments pour animaux - Rgles gnrales relatives aux analyses microbiologiques. Le matriel suivant est recommand : - Matriel et verrerie de laboratoire courants, striles (striliss ou striles prts l'emploi). - Tubes (16x160 mm ou similaires) contenant 9 ml d'eau peptone strile (tryptone : 1 g/l) ou d'autres diluants utiliser pour les dilutions d'chantillons en srie. - thanol pour passer la flamme les taleurs et les brucelles. - Solution de peroxyde d'hydrogne 3 %. - Micropipette bouts striles : 1 ml et 0,2 ml. - Tiges de verre coudes en L ou de forme triangulaire (crosses de hockey) ou taleurs en plastique.
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- Brucelles en acier inoxydable, bords plats. - Membrane de porosit 0,2 et 0,45 m en ester de cellulose strile (ou quivalent), d'un diamtre de 47 ou 50 mm, si possible avec une grille imprime sur la surface, en conditionnement individuel. - prouvettes striles. - Pipettes striles de 10 ml. 2. INSTALLATIONS ET QUIPEMENT quipement et appareillage courants de laboratoire, comme indiqu dans ISO 7218:2007 - Microbiologie des denres alimentaires et aliments pour animaux - Rgles gnrales relatives aux analyses microbiologiques. Le matriel suivant est recommand : - Hotte microbiologique ou hotte flux laminaire. En l'absence de ce dispositif, travailler proximit (moins de 50 centimtres) d'un brleur gaz. - Balance, d'une prcision de 0,01 g. - Autoclave. - Incubateur, rglable de 25C 37C. - pH-mtre, prsentant une prcision de 0,1 unit pH et un seuil de mesure minimum de 0,01 unit pH. - Rfrigrateur(s), rgl(s) 5 3 C, et conglateur(s) dont la temprature devra tre infrieure -18C et de prfrence gale -24 2 C. - Bain thermostatique, rgl 45 1 C - Four micro-ondes. - Microscope optique. - Brleur gaz. - Dispositif de comptage de colonies. - quipement de culture en atmosphre modifie (fiole scelle dans laquelle l'anarobiose peut avoir lieu). - Appareillage de filtrage avec des filtres de diamtre 47 mm ou 50 mm (en cas de filtration sur membrane). - Agitateur vortex ou quivalent ; - Etuve pour la sterilisation sec ; - Centrifugeuse ; - Pompe vcue.
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3. CHANTILLONNAGE L'chantillon doit reproduire la microbiologie de la masse totale de mot ou de vin analyser.Dans la mesure du possible, la masse doit tre homognise avant chantillonnage, afin de remettre en suspension les micro-organismes qui tendent se dposer au fond du rcipient. Lorsqu'une homognisation n'est pas souhaite, les chantillons doivent tre prlevs l o les micro-organismes sont susceptibles (ou suspects) d'tre prsents (c.--d. en cas de recherche de levures au fond des rservoirs ou fts), mais dans ce cas les rsultats ne sont pas quantitatifs. Avant de prlever un chantillon provenant d'un robinet, ce dernier doit tre pass la flamme, et 2 3 litres de liquide doivent tre vacus. L'chantillon doit tre plac dans un rcipient strile L'chantillon doit tre maintenu au frais et analys le plus rapidement possible. Les quantits suivantes d'chantillons sont ncessaires pour l'examen microbiologique : Mot, ou mot en fermentation ou vin stock : pas moins de 250 ml ; Vin mis en bouteille ou emball : pas moins d'une unit, quelle que soit la capacit ; 4. ESSAIS DE TENUE 4.1 Objectif Ces essais ont pour but de dceler l'avance les risques d'altrations microbiennes. 4.2 Principe Cette technique est base sur les modifications organoleptiques et d'aspect (troubles, voiles, dpts, couleurs inhabituelles) prsentes par le vin quand il est soumis certaines conditions d'aration et de temprature pouvant induire une activit microbiologique. La nature de l'altration devra tre confirme par examen microscopique. 4.3 Mode opratoire 4.3.1 Essais de tenue l'air Un chantillon de 50 ml de vin aprs filtration sur papier filtre grossier strile est plac dans un Erlenmeyer strile de 150 ml bouch avec du coton
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et laiss temprature ambiante pendant au moins 3 jours. La limpidit, la couleur, la prsence ventuelle d'un trouble, d'un dpt, d'un voile sont examines au cours de cette priode. Un examen microscopique est ralis en cas de trouble, dpt, voile ou changement de couleur. 4.3.2 Essais de tenue l'tuve Un chantillon de vin de 100 ml aprs filtration sur papier filtre grossier strile est plac dans un Erlenmeyer strile de 300 ml, bouch avec du coton, mis dans une tuve 30 C et examin aprs au moins 72 h. Des altrations organoleptiques ou visuelles peuvent tre l'indice d'un dveloppement microbien. Un examen microscopique doit alors tre effectu.
5. TECHNIQUES MICROSCOPIQUES POUR LA DETECTION, LA DIFFERENCIATION DES MICRO-ORGANISMES ET LE DENOMBREMENT DIRECT DES LEVURES 5.1 Examen microscopique des liquides ou des dpts Objectif : L'examen microscopique l'tat frais a pour but de dceler et de diffrencier, par leur taille et leur forme, les levures des bactries ventuellement prsentes. L'observation microscopique ne permet pas de distinguer les micro-organismes vivants de ceux qui sont morts. Remarque : Une estimation des levures vivantes peut tre effectue l'aide d'une coloration approprie (voir plus loin).
Principe : Cette technique repose sur le grossissement au microscope permettant d'observer des micro-organismes dont la taille est de l'ordre du micron. Mode opratoire : L'examen au microscope peut tre effectu directement sur le liquide ou sur le dpt. L'observation directe sur le liquide n'est intressante que quand la population est suffisamment leve (plus de 5 x 10 5 cellules/ml).
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Quand le vin prsente une population infrieure de micro-organismes, il est ncessaire de concentrer l'chantillon. Environ 10 ml de vin homognis sont donc centrifugs 3000-5000 tr/mn pendant 5 15 minutes. Aprs dcantation du liquide surnageant, le dpt est remis en suspension dans le liquide restant au fond du tube de centrifugation. Pour raliser l'observation au microscope, une goutte de l'chantillon de liquide ou du dpt homognis est dpose sur une lame de verre propre l'aide d'une pipette Pasteur ou d'une anse strilise. Recouvrir avec une lamelle et placer la lame sur la platine du microscope. L'observation s'effectue en champ clair ou, de prfrence contraste de phase, ce qui permet de mieux observer les dtails des micro-organismes. Un grossissement optique de 400 x 1000 x est gnralement utilis. 5.2. Coloration de Gram pour la diffrentiation des bactries isoles partir de colonies (voir paragraphe 6) Objectif : La coloration de Gram a pour but de diffrencier les bactries lactiques (Gram positif) des bactries actiques (Gram ngatif) et d'observer galement leur morphologie. Remarque : Il convient de garder l'esprit que la coloration de Gram ne suffit pas conclure car d'autres bactries peuvent tre prsentes en plus des bactries lactiques et actiques. Principe : Cette coloration est base sur la diffrence de structure et de composition chimique des parois cellulaires. des bactries Gram positif et Gram ngatif Dans les bactries Gram ngatif, la paroi riche en lipides a une quantit trs rduite de peptidoglycane. Ceci permet la pntration de l'alcool et llimination du complexe violet de gentiane-iode en laissant la cellule incolore, laquelle sera ensuite recolore en rouge par la safranine. Au contraire, la paroi cellulaire des bactries Gram positif contient une grande quantit de peptidoglycane et une faible concentration de lipides. Ainsi, l'paisse paroi de peptidoglycane et la dshydratation produite par l'alcool ne permettent pas llimination de la coloration violette ou bleue fonce du complexe violet de gentiane-iode.
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La coloration de Gram perd sa signification si elle est ralise sur une culture trop ge. Ainsi, la bactrie doit tre dans une phase de croissance exponentielle de 24 48 heures. La coloration de Gram est ralise aprs isolement de colonies et mise en culture liquide. Solutions : L'eau utilise doit tre distille. 1. Solution de violet de gentiane Prparation : peser 2 g de violet de gentiane (ou cristal violet), introduire dans un Erlenmeyer de 100 ml et dissoudre dans 20 ml d'alcool 95 % vol. Dissoudre 0,8 g d'oxalate d'ammonium dans 80 ml d'eau distille. Mlanger les deux solutions et utiliser seulement aprs 24 heures. Filtrer sur papier au moment de l'emploi. Maintenir l'abri de la lumire dans un flacon fonc. 2. Solution de Lugol Prparation : dissoudre 2 g d'iodure de potassium dans une quantit minimale d'eau (4 5 ml) et, dans cette solution sature, dissoudre 1 g d'iode. Complter le volume 300 ml avec de l'eau distille. Maintenir l'abri de la lumire dans un flacon fonc. 3. Solution de safranine : Prparation : peser 0,5 g de safranine dans un Erlenmeyer de 100 ml, dissoudre avec 10 ml d'alcool 95 % vol. et ajouter 90 ml d'eau. Agiter. Maintenir l'abri de la lumire dans un flacon fonc. Mode opratoire : Prparation du frottis Faire un repiquage des bactries en milieu liquide ou solide. Recueillir les bactries des cultures jeunes dans le dpt (aprs centrifugation de la culture liquide) ou directement dans le milieu solide avec une anse ou un fil et mlanger dans une goutte d'eau strilise. Faire un frottis sur une lame en talant une goutte de la suspension microbienne. Laisser scher le frottis. Procder ensuite la fixation en passant rapidement la lame 3 fois sur la flamme d'un bec Bunsen ou par une technique quivalente. Aprs refroidissement, effectuer la coloration. Coloration Verser sur le frottis fix quelques gouttes de solution de violet de gentiane. Laisser agir pendant 2 minutes et laver avec de l'eau. Verser 1 2 gouttes de la solution de lugol. Laisser agir pendant 30 secondes. Laver avec de l'eau et scher sur papier filtre.
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Verser l'alcool 95 % vol., laisser agir pendant 15 secondes. Rincer avec de l'eau et scher sur papier filtre. Verser quelques gouttes de solution de safranine, laisser agir pendant 10 secondes. Laver avec de l'eau et scher sur papier filtre. Dposer sur le frottis color une goutte d'huile d'immersion. Observer au microscope avec l'objectif immersion en champ clair. Rsultats : Les bactries lactiques restent colores en violet ou bleu fonc (Grampositif). Les bactries actiques sont colores en rouge (Gram-ngatif). 5.3 Recherche de la catalase pour la diffrentiation des bactries isoles partir de colonies (voir paragraphe 6) Objectif : Cette recherche a pour but de faire la distinction entre les bactries actiques et les bactries lactiques. Les levures et les bactries actiques ont une raction positive. Les bactries lactiques donnent une rponse ngative. Remarque : Il convient de garder l'esprit que la recherche de la catalase ne suffit pas car d'autres bactries peuvent tre prsentes en plus des bactries lactiques et actiques. Principe : La recherche de la catalase est base sur la proprit qu'ont les microorganismes arobies de dcomposer le peroxyde d'hydrogne avec libration d'oxygne : 2H2O2 catalase 2H2O + O2
Ractif : Solution de peroxyde d'hydrogne 12 volumes (3%) Prparation : mesurer 10 ml de peroxyde d'hydrogne 30 volumes dans une fiole jauge de 100 ml et complter avec de l'eau distille rcemment bouillie. Agiter et conserver au rfrigrateur dans un flacon fonc. La solution doit tre frachement prpare. Mode opratoire : Dposer une goutte de peroxyde d'hydrogne 3 volumes sur une lame et ajouter un petit chantillon d'une colonie jeune. S'il y a libration de gaz, on peut en dduire que la culture possde lactivit catalase. Il est parfois
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difficile d'observer directement le dgagement gazeux, notamment avec les colonies de bactries ; il est donc conseill de faire l'observation au microscope (objectif 10 x). 5.4. Dnombrement des cellules de levure hmocytomtrie 5.4.1 Champ d'application Dtermination de la concentration en cellules de levure dans les mots ou vins en fermentation, et les LSA (levure sche active). Une concentration cellulaire leve est ncessaire : au moins 5106 cellules/ml. Les mots et vins en fermentation peuvent faire l'objet d'une numration directe, la levure sche active (LSA) doit tre dilue 1000 ou 10000 fois. Les mots ou vins contenant peu de cellules doivent tre centrifugs (3000 g, 5 minutes) et le sdiment remis en suspension dans un volume connu., 5.4.2 Principe Une goutte de suspension de cellules de levure est dpose la surface d'une lame comportant une cellule de comptage. La cellule de comptage a un volume dfini et est subdivise en carrs la surface de la lame. La numration est ralise sous microscope en champ clair. Le contraste de phase n'est pas indiqu si des cellules sont colores. 5.4.3 Ractifs et produits Hmocytomtre, double cellule, de prfrence pinces : Brker, Thoma, Malassez, Neubauer. Lamelle couvre-objets pour hmocytomtre : les lamelles couvreobjets ordinaires (largeur 0,17 mm) ne conviennent pas pour cette utilisation, car elles sont souples et ne garantissent pas une largeur de cellule constante. Pipettes bouts fins, d'un volume de 1 et 10 ml. Fiole jauge, 100 ml. Bcher, 250 ml. 5.4.4 Installations et quipement Microscope avec clairage fond clair : grossissement 250-500 x. Contraste de phase contre-indiqu. Barre magntique et agitateur.
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Des hmocytomtres sont disponibles avec diffrentes cellules de comptage : Thoma, Malassez, Brker, Neubauer. Confirmer le type et le volume de la cellule de comptage utiliser. Les cellules de Brker, Thoma et Neubauer ont une profondeur de 0,1 mm , la cellule de Malassez 0,2 mm. La cellule de Thoma possde un grand carr central (1 mm2), ce qui fait que son volume est de 0,1 mm3 (10 -4 ml). Ce grand carr est subdivis en 16 carrs, eux mmes subdiviss en 16 petits carrs. Les petits carrs ont 0,05 mm de ct et une profondeur de 0,1 mm, de sorte que le volume de chaque petit carr est de 0,00025 mm3 (25 x 10-8 ml). Il est galement possible de compter dans les carrs moyens. Chaque carr moyen a 16 petits carreaux de 0,2 mm de ct, et d'un volume de 0,004 mm3 soit 4 x 10-6 ml. La cellule de Brker contient 9 grands carrs de 1 mm de ct, diviss en 16 carrs moyens de 0,2 mm de ct par des doubles lignes espaces de 0,05mm. La surface de chacun de ces carrs moyens est de 0,04 mm et le volume de 0,004mm3. Les petits carrs forms par les double lignes ont une surface de 0,025mm.. Les grands, moyens et petits carrs des cellules de Neubauer, de Thoma et de Brker sont de mme taille. Les carrs moyens des cellules de Brker ne contiennent pas d'autres lignes l'intrieur ; ce sont donc probablement les plus faciles compter. 5.4.5 Mthodes d'examen La cellule de comptage et la lamelle couvre-objets doivent tre propres et sches avant utilisation. Il peut tre ncessaire de frotter la surface quadrille, car des cellules sales ont une incidence sur le volume de l'chantillon. Nettoyer l'eau dminralise, ou l'thanol, et scher avec un papier doux. En cas de numration de levure floculante, le milieu de suspension doit tre de l'acide sulfurique 0,5 %, afin d'viter la floculation, mais ceci interdit la possibilit de coloration au bleu de mthylne et le comptage des cellules viables et des cellules mortes. La remise en suspension peut tre effectue par sonication. Dposer l'chantillon sur la lame l'aide d'une pipette bout fin, en suivant l'un des deux modes opratoires noncs ci-dessous. Mode opratoire 1 Bien mlanger la suspension de levure. Si des dilutions sont ncessaires, procder par dilutions dcimales, comme d'habitude. En cas de coloration au
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bleu de mthylne, effectuer la coloration sur l'chantillon le plus dilu en mlangeant 1 ml d'chantillon avec 1 ml de solution de bleu de mthylne. Agiter en permanence la suspension de levure. Prlever un chantillon avec une pipette bout fin, vacuer 4-5 gouttes de suspension et dposer une petite goutte de suspension de levure (dilue au besoin) sur chacune des deux zones quadrilles de la lame. Recouvrir avec la lamelle couvre-objets dans les 20 secondes qui suivent et presser fermement avec les pinces. La zone de numration doit tre compltement remplie, mais aucun liquide ne doit s'couler dans la rigole. Mode opratoire 2 Disposer la lamelle couvre-objets rigide de sorte que les deux cellules de comptage soient galement couvertes. Utiliser les pinces pour presser la lamelle couvre-objets sur le support jusqu' ce qu'une irisation apparaisse (anneaux de Newton). En l'absence de pinces, ne pas dplacer la lamelle couvre-objets en remplissant la cellule. Agiter en permanence la suspension de levure. Prlever un chantillon avec une pipette bout fin, vacuer 4-5 gouttes de suspension et laisser une petite goutte d'chantillon couler entre l'hmocytomtre et la lamelle couvreobjets. Procder de mme dans l'autre partie de la lamelle. La zone de numration doit tre compltement remplie, mais aucun liquide ne doit s'couler dans la rigole. Laisser la lame prpare reposer pendant trois minutes, de faon ce que les cellules de levure se dposent, et la placer sous le microscope. Compter 10 carrs moyens dans chaque zone quadrille. Des procdures normalises doivent tre dfinies, afin d'viter de compter deux fois le mme carr. Les cellules en contact avec ou reposant sur les lignes de dlimitation suprieure ou droite ne sont pas prises en compte, celles en contact avec ou reposant sur les lignes de dlimitation infrieure ou gauche sont comptes. Les cellules de levure en bourgeonnement sont comptes comme une seule cellule si la taille du bourgeon est infrieure la moiti de celle de la cellule mre, dans le cas contraire les deux cellules sont comptes. Pour obtenir une numration prcise des cellules, il est recommand de compter en moyenne au minimum un total de 200 500 cellules de levure. L'cart de numration entre les deux cts de la lame doit tre infrieur
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10 %. Si une dilution est utilise, le facteur de dilution doit tre intgr dans le calcul. 5.4.6 Expression des rsultats C tant le nombre moyen de cellules comptes dans un carr moyen de 0,2mm de ct, la population T totale dans l'chantillon est : Exprime en cellules/ml T = C X 0,25 x 106 x facteur de dilution C tant le nombre moyen de cellules comptes dans un petit carr de 0,05mm de ct, la population T totale dans l'chantillon est : Exprime en cellules/ml T = C X 4 x106 x facteur de dilution 5.4.7 Rfrences European Brewery Convention. Analytica Microbiologica EBC. Fachverlag Hans Carl, 2001 5.5 Dnombrement des cellules de levure Coloration de cellules de levure au bleu de mthylne 5.5.1 Champ d'application Cette mthode permet une estimation rapide du pourcentage de cellules viables (non colores), car les cellules mortes sont colores en bleu. La mthode est applicable tous les chantillons contenant des levures, except aux mots contenant plus de 100 g de sucre par litre. Les bactries sont trop petites et leur coloration n'est pas visible avec cette mthode. Remarque : il faut bien focalis les cellules en differents profodeurs, pour bien visualiser leur coloration avec le bleu de mthylne. 5.5.2 Principe Le bleu de mthylne est transform en son driv incolore par lactivit rductrice des cellules de levure viables. Les cellules de levure mortes seront colores en bleu. La viabilit est calcule partir du rapport entre le nombre de cellules viables et le nombre de cellules total. La mthode surestime la viabilit "relle" lorsque les cellules viables reprsentent moins de 80 % du nombre de cellules total, car elle ne distingue pas les cellules "vivantes" des cellules aptes se reproduire (Cellules viables mais non cultivables). Si la concentration en sucre est suprieure 100 g/l, la plupart des cellules sont bleu clair, cette mthode est donc dconseille.
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Dans le cas d'un vin faible pH et fortement tamponn, le colorant ne peut pas oprer correctement. Dans ce cas, la numration doit tre applique au moins la premire dilution dcimale. 5.5.3 Ractifs et produits Solution A : Bleu de mthylne, en solution dans de l'eau distille, 0,1 g/500 ml. Solution B : KH2PO4, en solution dans de l'eau distille, 13,6 g/500 ml. Solution C : Na2HPO4 x 12 H2O, en solution dans de l'eau distille, 2,4 g/100 ml Solution D : 498,75 ml de solution B + 1,25 ml de solution C. Solution E : Mlanger les 500 ml de solution D aux 500 ml de solution A pour obtenir la solution tamponne finale de bleu de mthylne d'un pH approximatif de 4,6. 5.5.4 Installations et quipement Microscope, avec grossissements de 250-500 x. Le contraste de phase est contre-indiqu. Lames de microscope et lamelles couvre-objets, ou hmocytomtre (cellule de Thoma, de Brker ou de Neubauer). Tube essai et agitateur. Pipettes bout fin. 5.5.5 Mthodes d'examen Dtermination de la viabilit Diluer la suspension de levure avec la solution de bleu de mthylne dans un tube essais jusqu' ce que la suspension comporte approximativement 100 cellules de levure dans un champ microscopique. Dposer une petite goutte de suspension bien mlange sur une lame de microscope et la recouvrir d'une lamelle couvre-objets. Examiner au microscope sous un grossissement de 400 x, dans les 10 minutes suivant la mise en contact avec le colorant. Compter un total de 400 cellules, en notant le nombre de cellules mortes, casses, ratatines et plasmolyses. Les cellules de levure en bourgeonnement sont comptes comme une seule cellule si la taille du bourgeon est infrieure la moiti de celle de la cellule mre. Si la taille du bourgeon est gale ou suprieure la moiti de celle de la cellule mre, les
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deux cellules sont comptes. Les cellules de couleur bleu clair doivent tre considres vivantes. 5.5.6 Expression des rsultats Si T est le nombre total de cellules et C le nombre de cellules colores en T C bleu, alors le pourcentage des cellules viables est x100 T 5.5.7 Rfrences European Brewery Convention. Analytica Microbiologica EBC. Fachverlag Hans Carl, 2001
6. DENOMBREMENT DES MICRO-ORGANISMES PAR CULTURE Objectif : Le dnombrement des micro-organismes par culture a pour but d'valuer le niveau de contamination de l'chantillon, c'est--dire d'estimer la quantit de micro-organismes cultivables. Selon les milieux de culture utiliss et les conditions de culture, quatre types de micro-organismes peuvent tre dnombrs : levures, bactries lactiques et bactries actiques et moisissures. Principe : Le dnombrement par culture est bas sur le fait que les micro-organismes vivants sont capables de se multiplier en milieu nutritif et conditions dincubation appropris pour former des colonies sur le milieu solidifi par de la glose, ou un trouble dans le milieu liquide. Sur milieu glos une cellule produit par multiplication un amas de cellules visible lil nu appel colonie. 6.1 Dtection, diffrenciation et dnombrement des micro-organismes (numration sur plaque). 6.1.1 Champ d'application Cette norme formule des recommandations gnrales pour le dnombrement des levures, moisissures et bactries lactiques et bactries actiques viables
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dans les mots, les mots concentrs, les mots partiellement ferments, les vins (vins mousseux y compris) pendant leur laboration et aprs la mise en bouteilles, par comptage des colonies cultives sur un milieu solide aprs une incubation approprie. Le but de l'analyse microbiologique est de contrler le processus de vinification et d'viter l'altration microbienne des mots ou des vins. 6.1. 2 Termes et dfinitions Les termes "plaque" et "bote de Petri" sont employs comme synonymes. UFC = Units formant colonies. 6.1. 3 Mthode Le nombre de micro-organismes viables prsents dans des mots ou des vins est dtermin en talant un petit volume connu d'chantillon la surface d'un milieu de culture ou en lajoutant selon la mthode de incorporation (voir 6.1.7.4), et en laissant incuber les plaques le temps ncessaire, dans les conditions les plus favorables la croissance. Chaque cellule, ou groupe de cellules, se divise et se rassemble en un groupe qui devient visible en tant que colonie. Le nombre de colonies prsentes la surface d'une plaque est une indication du nombre de cellules prsentes dans l'chantillon original. Les rsultats sont par consquent exprims en UFC. Si le nombre de cellules dans un chantillon est cens tre lev, des dilutions dcimales en srie sont ralises afin d'obtenir un nombre de colonie compris entre 10 et 300 par plaque. Si le nombre d'UFC dans un chantillon est cens tre bas, elles sont collectes sur un filtre strile de 0,45 0,88 m pour les levures et 0, 22 0,45 m pour les bactries, qui est ensuite plac dans la bote de Petri sur la surface du milieu de culture. La plage de mesure de cette mthode va de < 1 UFC/ (volume analys) 109 UFC/ml ou 1010 UFC/g dans l'chantillon original. 6.1.4 Ractifs et produits Ceux indiqus au paragraphe 1 de la rsolution, plus : Tubes (16x160 mm ou quivalents), contenant 9 ml d'eau peptone strile (Tryptone : 1 g/l) ou d'autres diluants utiliser pour la dilution des chantillons ( Annexe 4). Le nombre indicatif de tubes ncessaires pour les chantillons suivants est prcis ci-dessous :
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Mots non ferments : 4 / chantillon. Mots de fermentation : 7 / chantillon. Vins stocks : 2 / chantillon. Micropipette bouts striles : 1 ml et 0,2 ml. Tiges de verre coudes en L ou de forme triangulaire (tiges de Digralsky)) ou taleurs en plastique. Botes de Petri de 90 mm de diamtre (avec 15-20 ml de milieu de culture) (56 cm2) pour la technique sur plaques, et de 90 mm ou 60 mm (avec 6-8 ml de milieu de culture) pour la technique de filtration sur membrane, remplies 1824 h l'avance avec 15-20 ml de milieu de culture (simple ou en dupliqu botes sont ncessaires pour chaque chantillon test) : Pour le comptage des levures et moisissures, utiliser : YM, YEPD, glose nutritive WL, glose levure ou glose TGY (trypticase-glucose-extrait de levure) ou quivalant si valid. Plaques de glose de lysine et de glose diffrentielle WL (annexe 1) ou quivalant si valid en cas de recherche de levures non Saccharomyces. (Annexe 5 milieux de culture) Pour le comptage des bactries actiques, utiliser : Glose GYC, milieu G2 ou Kneifel (Annexe 5 milieux de culture) ou quivalant si valid Pour le comptage des bactries lactiques, utiliser : MRS additionn de 20 % de jus de tomate (ou de pomme ou de raisin), ou glose ATB (bouillon de tomate acide) modifie (milieu pour Oenococcus oeni), ou bouillon de jus de tomate (TJB) plus glose, ou milieu Lafon-Lafourcade, milieu 104 ou glose MTB (Annexe 5 milieux de culture) ou quivalant si valid Pour le comptage des champignons filamenteux, utiliser de la glose Czapek-Dox modifie, de la glose DRBC (dichloran-rose Bengalechloramphnicol) ou de la MEA additionne de ttracycline (100 mg/l) et de streptomycine (100 mg/ l) (Annexe 5 milieux de culture) ou quivalant si valid Il convient d'ajouter des antibiotiques pour effectuer un comptage slectif, tant donn que tous les micro-organismes sont prsents ensemble dans le vin. (Voir Annexe I milieux de culture) 6.1.5 Installations et quipement Comme indiqu au paragraphe 2 de la rsolution. 6.1. 6 chantillonnage Comme indiqu au paragraphe 3 de la rsolution
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Les quantits suivantes d'chantillons sont exiges pour la numration sur plaques : Mot ou mot en fermentation ou vin stock : pas moins de 250 ml ; Vin en bouteille ou conditionn : pas moins d'une unit, quelle que soit la capacit ; 6.1. 7 Mthodes d'examen 6.1.7.1 Conditions pralables requises Tous les produits et quipements utiliss au cours des essais doivent tre striles, et des conditions aseptiques doivent tre maintenues tout au long des oprations. La hotte flux laminaire doit tre mise en marche 5 minutes avant de commencer le travail, afin d'avoir un flux d'air strile et stable. 6.1.7.2 Strilisation Les milieux de culture doivent tre striliss en autoclave 121C pendant au moins 15 minutes (20 minutes pour de grands volumes). Le matriel et la verrerie striles usage unique doivent tre ouverts et utiliss sous la hotte flux laminaire. Les brucelles et les taleurs doivent tre plongs dans l'thanol et flambs avant utilisation. Les entonnoirs en acier inoxydable doivent tre flambs avec de l'thanol aprs chaque utilisation. Les entonnoirs en verre et en polycarbonate doivent en revanche tre passs l'autoclave avant utilisation, leur nombre doit par consquent tre gal celui des chantillons tester. 6.1.7.3 Dilution des chantillons (Annexe 1) Un ml d'chantillon est introduit la pipette dans un tube contenant 9 ml d'eau peptone strile. Le tube est mis en agitation pendant 20 secondes au moyen d'un agitateur vortex. C'est la premire dilution (dcimale), dont 1 ml est transfr dans le tube suivant de 9 ml d'eau peptone strile, ce qui constitue la deuxime dilution. Aprs 20 secondes d'agitation, l'opration est rpte autant de fois que ncessaire. Le nombre indicatif de dilutions en srie ncessaires pour les chantillons suivants est indiqu ci-dessous : Mots non ferments : 4 dilutions dcimales. Mots de fermentation : 7 dilutions dcimales.
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Vins non-filtrs pendant le vieillissement (comptage des levures) 2 dilutions dcimales. Vins non filtrs pendant le vieillissement (comptage des bactries lactiques) 6 dilutions dcimales. Vins filtrs ou vins conditionns (mis en bouteille) Auc une dilution. Mots concentrs Diluer 10 ml dans 100 ml d'eau peptone (ou 100 ml dans 1000 ml). Les vins en bouteille ou filtrs, et les mots concentrs aprs dilution dans de l'eau peptone strile, sont analyss selon la technique de filtration sur membrane. 6.1.7.4 Prparation des plaques Les dilutions en srie ncessaires sont prpares en fonction du nombre d'chantillons taler sur des plaques. De multiples dilutions en srie peuvent tre prpares, si un grand nombre d'chantillons doivent tre tals sur des plaques, mais toute dilution devra tre utilise dans un dlai de 20 minutes. Inoculer chaque plaque avec 0,1 ou 0,2 ml des trois dilutions les plus faibles ayant t prpares, en procdant comme indiqu ci-dessous : Mots non ferments dilutions -2 ; -3 ; -4. Mots de fermentation dilutions -5 ; -6 ; -7. Vins non filtrs pendant le vieillissement dilutions 0 ; -1 ; -2. Dans le doute, inoculer un nombre plus lev de dilutions, jamais un nombre infrieur. Dans des conditions aseptiques (de prfrence sous une hotte flux laminaire), avec une tige de verre coude strile (tige de Digralsky) ou usage unique, taler l'chantillon la surface des milieux de culture avant absorption du liquide (gnralement en 1-2 minutes). Utiliser une nouvelle " tige de Digralsky " pour chaque plaque ou procder en allant de l'chantillon le plus dilu jusqu'au moins dilu. Laisser les plaques quelques minutes sous le flux d'air strile, jusqu' ce que le liquide soit absorb.
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Note 1 : Le fait d'utiliser 0,2 ml au lieu de 0,1 ml, comme frquemment indiqu, facilite l'talement et prolonge le dlai d'utilisation. Ces lments doivent tre pris en compte dans les calculs. Note 2 : Pour le dnombrement des levures, le dveloppement bactrien est inhib en ajoutant 50 mg/l de chloramphnicol (ou quivalant si valid) au milieu de croissance, aprs passage dans l'autoclave, et le dveloppement des moisissures en ajoutant 150mg/l de diphnyle (ou quivalant si valid). Note 3 : Pour le dnombrement des bactries lactiques, le dveloppement des levures est inhib en ajoutant de la natamycine (pimaricine) (0,1 g/l) (ou quivalant si valid) et le dveloppement des bactries actiques par incubation anarobie. Note 4 : Pour le dnombrement des bactries actiques, le dveloppement des levures est inhib en ajoutant de la natamycine (pimaricine) (0,1 g/l) (ou quivalant si valid) et celui des bactries lactiques par ajout de pnicilline (12,5 mg/l) (ou quivalant si valid). L'ajout d'antibiotiques est effectu aprs la strilisation en autoclave. Pour une recherche spcifique de levures non Saccharomyces, inoculer, comme indiqu prcdemment, trois plaques de glose de lysine et trois plaques de glose diffrentielle WL avec les dilutions appropries - Mthode de incorporation (mthode alternative). Prparer et striliser 15 ml de milieu dans des tubes, et maintenir les tubes dans un bain d'eau (ou quivalant si valid) 471 C. Verser 1 ml d'chantillon ou de dilution dans une bote de Petri vide. Ajouter 15 ml de milieu de culture et remuer doucement la bote de Petri, afin d'obtenir une rpartition homogne des micro-organismes dans la masse du milieu. Laisser refroidir et se solidifier en plaant les botes de Petri sur une surface horizontale frache (le temps de solidification de la glose ne devra pas excder 10 minutes).
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6.1.7.5 Dnombrement avec concentration par filtration sur membrane La porosit de la membrane doit tre de 0,45 ou 0,8 m pour le dnombrement des levures ; 0,2 ou 0,45 m pour celui des bactries. La surface de la membrane doit de prfrence tre quadrille, afin de faciliter le dnombrement des colonies. Les plaques, sur lesquelles sont places les membranes, peuvent contenir un milieu nutritif glos ou un tampon, dans lequel le milieu sec est dispers et qui doit tre imbib d'eau strile juste avant utilisation. Certains fournisseurs proposent des plaques striles contenant un tampon strile, sur lequel sont verss juste avant utilisation 2 ml de milieu liquide strile usage unique. Assembler le matriel de filtration de manire aseptique, et relier au systme qui permettra de faire le vide. Plonger les brucelles dans l'thanol et les flamber : une fois la flamme teinte, attendre quelques secondes et mettre la membrane, avec les brucelles, sur son support dans l'unit de filtration. Avant d'ouvrir la bouteille, bien lagiter, renverser le goulot et le plonger dans l'thanol (1-2 cm), puis flamber pour le striliser. Prlever trois volumes de chaque chantillon : 10 ml avec une pipette strile de 10 ml, 100 ml avec une prouvette cylindrique strile de 100 ml, et le reste directement de la bouteille si applicable. Pour filtrer, verser le vin dans l'entonnoir, puis activer le vide. Lorsque la quantit de vin dsire a t filtre, casser le vide, flamber les brucelles, ouvrir l'entonnoir, maintenir la membrane avec les brucelles, placer sa face oppose sur le milieu solide d'une plaque et la faire adhrer la surface du milieu en vitant que des bulles ne se forment en-dessous. 6.1.7.6 Incubation des chantillons Incuber les plaques l'envers, en conditions arobies, pour les levures ou pour les bactries actiques, pendant 4 jours 25 2C. Si la temprature est infrieure 23C, prolonger l'incubation d'un jour, si elle est infrieure 20C prolonger de trois jours supplmentaires. La temprature maximale ne doit pas excder 28C. En cas de comptage portant sur des levures Brettanomyces (ou Dekkera), doubler le temps d'incubation. En cas de comptage de BL (bactries lactiques), mettre les plaques dans une fiole ou un sac anarobies, et incuber les plaques l'envers pendant 10 jours 30 2C. Si la temprature est infrieure 28C prolonger l'incubation
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d'un jour ; si elle est infrieure 25C, prolonger de trois jours supplmentaires. La temprature maximale ne doit pas excder 33C. 6.1. 8 Expression des rsultats 6.1.8.1 Dnombrement des colonies de levure et bactries : Compter les colonies dveloppes en 4 jours pour les levures et les bactries actiques (8 jours pour les levures Brettanomyces/Dekkera), et 10 jours pour les bactries lactiques au besoin l'aide d'un compteur de colonies, en ignorant la morphologie diffrente des colonies en cas de comptage total des levures, ou en la prenant en compte s'il y a lieu. Les milieux et les conditions dincubation sont suffisamment spcifiques pour que les colonies visibles lil nu permettent le comptage des diffrents types de micro-organismes. 6.1.8.2 Calcul des rsultats. Les rsultats les plus fiables proviennent du comptage de plaques contenant de 10 300 colonies (ISO 7218:2007 - Microbiologie des denres alimentaires et aliments pour animaux - Rgles gnrales relatives aux analyses microbiologiques). Calculer le nombre N de micro-organismes prsents dans l'chantillon d'essai sous forme de moyenne pondre de deux dilutions dcimales successives, en utilisant l'quation suivante : N o :
V 1,1 d
est la somme des colonies comptes sur les deux botes conserves
aprs deux dilutions dcimales successives, dont une au moins contient au minimum 10 colonies. V est le volume d'inoculum plac dans chaque bote, en millilitres. d est la dilution correspondant la premire dilution retenue [d = 1 quand le produit liquide non dilu (chantillon d'essai) est retenu]. En d'autres termes, si les plaques de deux dilutions dcimales conscutives contiennent 10-300 colonies, calculer le nombre d'UFC/ml pour chaque
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dilution, et ensuite la moyenne des deux valeurs : c'est la valeur d'UFC/ml de l'chantillon. Si une valeur est suprieure au double de l'autre, garder la valeur infrieure comme UFC/ml. Arrondir les rsultats au deuxime chiffre significatif seulement au moment de la conversion en UFC/ml, et rapporter les rsultats sous la forme d'un nombre compris entre 1,0 et 9,9 multiplis par la puissance 10 approprie (ISO 7218:2007 - Microbiologie des denres alimentaires et aliments pour animaux - Rgles gnrales relatives aux analyses microbiologiques). Si les chantillons ont t inoculs en double, et si une ou deux plaques inocules avec la mme dilution contiennent des colonies, calculer le nombre moyen de colonies et multiplier par l'inverse du facteur de dilution, pour obtenir le nombre d'UFC/ml. Si aucune plaque ne contient 10-300 colonies, et que toutes les plaques contiennent plus de 300 colonies, compter celles comportant le moins de colonies. Si elles contiennent moins de 10 colonies/cm, compter 12 carrs de 1 cm2 et multiplier la moyenne par 56 (la surface d'une plaque de 90 mm de diamtre) ; si les colonies sont plus denses, compter 4 carrs de 1 cm2 et multiplier la moyenne par 56. Exprimer les rsultats en tant que "Valeur UFC/ml estime". Dans la mesure du possible, ne pas rapporter les rsultats sous la forme TNTC [too numerous to count (trop nombreux pour tre compts)]. Si les seules plaques prsentant des colonies contiennent moins de 10 colonies, mais au moins 4, calculer le rsultat comme indiqu dans le cas gnral, et le rapporter en tant que "Valeur UFC/ml estime". Si le total est compris entre 3 et 1, la prcision du rsultat est trop faible, et le rsultat sera rapport sous la forme "(les micro-organismes recherchs) sont prsents mais en quantit infrieure 4 d UFC/ml". Si les plaques de toutes les dilutions d'un chantillon ne prsentent aucune colonie, rapporter le rsultat sous la forme "moins de 1/d UFC/ml", mais tenir compte de la prsence ventuelle d'inhibiteurs dans l'chantillon. En cas d'application de la technique de filtration sur membrane, exprimer les rsultats par rapport la quantit de liquide filtre, par exemple UFC/bouteille, UFC/100 ml ou UFC/10 ml.
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6.1.9 Incertitude de la mesure 6.1.9.1 Critres de contrle des rsultats. Pour chaque lot de milieu, une plaque est utilise comme tmoin de strilit aprs strilisation. Une plaque, par milieu de culture utilis lors des tests, est laisse ouverte sous la hotte flux laminaire tout au long des oprations afin de contrler la strilit de l'environnement de travail. Cette plaque sera incube comme les plaques inocules. Priodiquement, un chantillon est inocul en double, et le Kp exprimental est calcul au moyen de l'quation suivante : | C1 C 2 | C1 C 2
Kp
dans laquelle C1 et C2 sont les rsultats des deux comptages. Si Kp < 1,96 2,0 les rsultats sont acceptables : la moyenne des deux comptages peut tre utilise comme rsultat. Si 2,0<Kp 2,576 2,6 la diffrence des deux comptages est critique et doit tre soigneusement value avant d'accepter les rsultats comme moyenne des deux comptages. Si Kp > 2,6 la diffrence des deux comptages est anormale. Le rsultat est rejet et le test doit tre rpt. Dans ces circonstances, le responsable du laboratoire doit examiner tous les rsultats obtenus aprs les derniers rsultats acceptables. 6.1.9.2 Incertitude de la mesure Si le nombre de colonies comptes sur la plaque pouvant l'tre est infrieur 10, le rsultat est acceptable, mais la population des colonies est considre conforme la loi de Poisson. Le niveau de confiance de 95 %, et par consquent l'incertitude de la mesure du comptage estimatif ralis sur une seule bote de Petri, est rapport dans le tableau suivant.
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Nombre colonies
de Limite de confiance au niveau Pourcentage d'erreur de la limite 95 % * Infrieure Suprieure Infrieure Suprieure 1 <1 6 -97 457 2 <1 7 -88 261 3 <1 9 -79 192 4 1 10 -73 156 5 2 12 -68 133 6 2 13 -63 118 7 3 14 -60 106 8 3 16 -57 97 9 4 17 -54 90 10 5 18 -52 84 11 6 20 -50 79 12 6 21 -48 75 13 7 22 -47 71 14 8 24 -45 68 15 8 25 -44 65 re * Par rapport au dnombrement des micro-organismes (1 colonne) Si le nombre de colonies est > 10, la limite de confiance un seuil de probabilit p est calcule au moyen de l'quation suivante : C = Ci Kp Ci, dans laquelle Ci est le nombre de colonies de la plaque, et Kp est le facteur de couverture. Gnralement, le facteur de couverture est 2 ou 1,96. La valeur de C est calcule partir de chaque plaque et multiplie par le nombre de dilutions ainsi que par le rsultat du comptage.
6.2. Culture en milieu liquide - "nombre le plus probable" (NPP) 6.2.1 Objectif Cette technique a pour but d'valuer le nombre de micro-organismes viables dans les vins ayant des teneurs leves en particules solides en suspension et/ou des indices levs de colmatage.
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6.2.2 Principe Cette technique est base sur l'estimation du nombre de micro-organismes viables en milieu liquide, en partant du principe d'une rpartition normale dans l'chantillon. 6.2.3 Diluants et milieux de culture liquides (Annexes 4 et 5) 6.2.4 Mode opratoire Plusieurs solutions quantitatives et successives sont prpares et, aprs incubation, une certaine proportion d'essais ne donneront lieu aucun dveloppement (essais ngatifs), tandis que d'autres commenceront se dvelopper (essais positifs). Si l'chantillon et les dilutions sont homognes et si le nombre de dilutions est suffisamment lev, il est possible de faire un traitement statistique des rsultats en utilisant des tables appropries (tables reposant sur les calculs de probabilit de McCrady) et d'extrapoler ce rsultat l'chantillon initial. 6.2.5 Prparation des dilutions En partant d'un chantillon de vin homognis, prparer une srie de dilutions dcimales (1/10) dans le diluant. Prlever 1 ml de vin et ajouter 9 ml de diluant dans le premier tube. Homogniser. Prlever 1 ml de cette dilution pour l'ajouter 9 ml de diluant dans le deuxime tube. Continuer ce protocole de dilution jusqu' la dernire dilution requise, selon la population microbienne prsume, en utilisant des pipettes striles pour chaque dilution. Les dilutions doivent tre ralises jusqu' extinction, c'est--dire l'absence de dveloppement dans les dilutions les plus faibles (annexe 2). 6.2.6 Prparation des inoculations Inoculer 1 ml de vin et 1 ml de chacune des dilutions homognises lors de leur prparation, dans trois tubes avec le milieu de culture appropri (annexe 5). Bien mlanger. Incuber les tubes inoculs dans l'tuve 25 C, pour les levures (pendant 3 10 jours), en arobiose et, pour les bactries lactiques, en anarobiose ou microarophilie (pendant 8 10 jours), en faisant des observations priodiques jusqu'au dernier jour d'incubation.
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6.2.7 Rsultats Sont considrs positifs tous les tubes qui prsentent un dveloppement microbien se traduisant par la formation d'un sdiment blanchtre, plus ou moins vident et/ou par un trouble plus ou moins accentu. Les rsultats doivent tre confirms par observation au microscope. Prciser la dure d'incubation. La lecture des tubes se fait en notant le nombre de tubes positifs ou ngatifs de chaque combinaison de trois tubes (de chaque dilution). Par exemple, "31-0" signifie : trois tubes positifs dans la dilution 100 (vin), un dans la dilution 10-1 et zro dans la dilution 10-2. Pour un nombre de dilutions suprieur trois, seuls trois de ces rsultats sont significatifs. Pour slectionner les rsultats adopter dans la dtermination du "NPP", il est ncessaire de dterminer le "nombre caractristique" conformment aux exemples figurant dans le tableau suivant : Tableau
Nombre de tubes positifs pour chaque Nombre caractristique dilution 10 10 10 10 3-1-0 Exemp 10 le a 3 3 3 1 0 3-2-0 a 3 3 2 0 0 3-2-1 a 3 2 1 0 0 3-0-1 a 3 0 1 0 0 3-2-3 b 3 2 2 1 0 3-2-3 b 3 2 1 1 0 3-2-2 c 2 2 2 2 0 2-2-2 d 0 1 0 0 0 0-1-0 Exemple a : prendre la plus grande dilution pour laquelle tous les tubes sont positifs et les deux suivantes. Exemple b : si un rsultat positif est not pour une dilution plus grande que la dernire ainsi choisie, il faut lajouter celle-ci. Exemple c : si aucune dilution ne fournit trois tubes positifs, prendre les dilutions correspondantes aux trois derniers tubes positifs. Exemple d : cas ou le nombre de tubes positifs est trs rduit, choisir le nombre caractristique de faon ce que la dilution positive occupe le rang des dizaines
Adapt de Bourgeois, C.M. et Malcoste, R. in : Bourgeois, C.M. et Leveau, J.Y. (1991). OIV-MA-AS4-01 : 2010 26
Calcul du nombre le plus probable (NPP) Le NPP est dtermin l'aide du Tableau A (Annexe 3) reposant sur les calculs de probabilits de McCrady, en tenant compte du nombre caractristique obtenu et de la dilution effectue. Si la srie de dilutions est 100, 10-1, 10-2, la lecture est directe. Si la srie de dilutions est 101, 100, 10-1, la lecture correspond 0,1 fois cette valeur. Si la srie de dilutions est 10-1, 10-2, 10-3, la lecture correspond dix fois cette valeur. Remarque : S'il est ncessaire d'augmenter le niveau de dtection, une concentration de vin de 101 peut tre utilise. Pour obtenir cette concentration de microorganismes dans 1 ml, centrifuger 10 ml de vin et prlever 1 ml de dpt (aprs avoir enlev 9 ml du liquide surnageant) inoculer selon la procdure dcrite prcdemment. 6.2.8 Expression des rsultats La teneur en micro-organismes du vin doit tre prsente en germes par millilitre, en notation scientifique une dcimale. Si la teneur est infrieure 1,0 cellule par millilitre, le rsultat doit tre prsent sous la forme "< 1,0 cellule par ml". (voir les annexes en pages suivantes) 7. Bibliographie ISO 4833:2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs Horizontal medium for the enumeration of microorganisms Colony count technique at 30C. ISO 7218:2007 - Microbiology of food and animal feeding stuff General rules for microbiological examinations. ISO 7667:1983. Microbiology - Standard layout for methods of microbiological examination. Pallman, C., J. B. Brown, T. L. Olineka, L. Cocolin, D. A. Mills and L. F. Bisson. 2001. Use of WL medium to profile native flora fermentations. American Journal of Enology and Viticulture 52:198-203 ; A. Cavazza, M. S. Grando, C. Zini, 1992. Rilevazione della flora microbica di mosti e vini. Vignevini, 9-1992 17-20.ANDREWS, W. et MESSER, J. (1990). Microbiological Methods. in : AOAC Official
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Methods of Analysis, 15th edition, 1, 425-497, Association of Analytical Chemist, Washington. BIDAN, P. (1992). Analyses Microbiologiques du Vin. F.V. O.I.V. n 910, Paris. BOURGEOIS, C.M. et LEVEAU, J.Y. (1991). Techniques d'analyse et de contrle dans les industries agro alimentaires, 2me dition, 3. Le Contrle Microbiologique Lavoisier, Tec. & Doc., APRIA Ed. Paris. CARR, J. G. (1959). Acetic acid bacteria in ciders. Ann. Rep. Long Ashton Res. Sta., 160. DE MAN, J. C. (1975). The probability of most probable number. European Journal of Applied Microbiology, 1, 67-78. LAFON-LAFOURCADE, S. et al. (1980). Quelques observations sur la formation d'acide actique par les bactries lactiques. Conn. Vigne Vin, 14, 3, 183-194. MAUGENET, J. (1962). Les Actobacter du cidre. Identification de quelques souches. An. Technol. Agric., 11, 1, 45-53. PLARIDIS et LAFON-LAFOURCADE, S. (1983). Contrle microbiologique des vins. Bull. O.I.V., 618, 433-437, Paris. RIBREAU-GAYON, J. et PEYNAUD, E. (2004). Trait d'nologie, Tome 2, Librairie Polytechnique CH. Branger, Paris et Lige. Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water (1976). 14th edition, American Public Health Association, Incorporated, New York. Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water (1985). 16th edition, American Public Health Association, DC 20005, Washington. VAZ OLIVEIRA, M., BARROS, P. et LOUREIRO, V. (1995). Analyse microbiologique du vin. Technique des tubes multiples pour l'numration de micro-organismes dans les vins - "Nombre le plus probable" (NPP), F.V. O.I.V. n 987, Paris. VAZ OLIVEIRA, M. et LOUREIRO, V. (1993). L'numration de micro-organismes dans les vins ayant un indice de colmatage lev, Compte rendu des travaux du groupe d'experts "Microbiologie du Vin" de l'O.I.V., 12me session, annexe 2, Paris. VAZ OLIVEIRA, M. et LOUREIRO, V. (1993). L'numration de micro-organismes dans les vins ayant un indice de colmatage lev, 2me partie, Doc. Travail du groupe d'experts "Microbiologie du Vin" de l'O.I.V., 13me session, Paris.
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Annexe 1
Prparation des dilutions et inoculations
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Annexe 2
Prparation des dilutions et inoculations
Dilution
chantillon
Dilution obtenue Inoculation des botes

chantillon
Quantit d'chantillon
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Annexe 3 TABLEAU A "Nombre le plus probable" (NPP) pour 1 ml d'chantillon en utilisant 3 tubes contenant 1 ml, 0,1 ml et 0,01 ml Tubes positifs Tubes positifs Tubes positifs 1 0,1 0,01 NPP 1 0,1 0,01 NPP 1 0.1 0,01 NPP ml ml ml 1 ml ml ml ml 1 ml ml ml ml 1 ml 0 0 0 0,0 2 0 2 2,0 1 1 1 7,5 0 0 1 0,3 2 1 0 1,5 3 1 2 11,5 0 1 0 0,3 2 1 1 2,0 3 1 3 16,0 0 1 1 0,6 2 1 2 3,0 3 2 0 9,5 0 2 0 0,6 2 2 0 2,0 3 2 1 15,0 1 0 0 0,4 2 2 1 3,0 3 2 2 20,0 1 0 1 0,7 2 2 2 3,5 3 2 3 30,0 1 0 2 1,1 2 2 3 4,0 3 3 0 25,0 1 1 0 0,7 2 3 0 3,0 3 3 1 45,0 1 1 1 1,1 2 3 1 3,5 3 3 2 110,0 1 2 0 1,1 2 3 2 4,0 3 3 3 >140, 0 1 2 1 1,5 3 0 0 2,5 1 3 0 1,6 3 0 1 4,0 2 0 0 0,9 3 0 2 6,5 2 0 1 1,4 3 1 0 4,5 Adapt de Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water (1976)
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Annexe 4 Diluants : Les diluants sont indiqus titre d'exemple. L'eau utiliser doit tre distille, bidistille ou dsionise, sans traces de mtaux, d'inhibiteurs ou d'autres substances antimicrobiennes. 1. Eau physiologique Prparation : peser 8,5 g de chlorure de sodium dans une fiole jauge de 1000 ml. Aprs dissolution dans l'eau, ajuster au volume de rfrence. Bien mlanger. Filtrer. Rpartir 9 ml dans les tubes essais. Boucher avec du coton card et placer en autoclave pendant 20 mn 121 C. 2. Solution de Ringer 1/4 Prparation : dans une fiole jauge de 1000 ml, peser 2,250 g de chlorure de sodium, 0,105 g de chlorure de potassium, 0,120 g de chlorure de calcium (CaCl2.6H2O), 0,050 g d'hydrognocarbonate de sodium. Aprs dissolution dans de l'eau, ajuster au volume de rfrence. Bien mlanger. Rpartir 9 ml dans les tubes essais. Boucher avec du coton card et placer en autoclave pendant 15 mn 121 C. (cette solution est disponible dans le commerce) 3. Eau peptone Prparation : dans une fiole jauge de 1000 ml, peser 1g de peptone. Aprs dissolution dans l'eau, ajuster au volume de rfrence. Bien mlanger. Rpartir 9 ml dans les tubes d'essai. Boucher avec du coton card et placer en autoclave pendant 20 mn 121 C.
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Annexe 5
Milieux de culture Les milieux de culture et les antimicrobiens sont indiqus titre d'exemple. L'eau utiliser doit tre distille, bidistille ou dsionise, sans traces de mtaux, d'inhibiteurs ou d'autres substances antimicrobiennes.
1. Milieux de culture solides En l'absence d'indication contraire, le pH de tous les milieux doit tre ajust entre pH 5,5 et pH 6,0 1 MILIEUX POUR LE DNOMBREMENT DES LEVURES 1.1 YM Glucose 50 g Peptone 5g Extrait de levure 3g Extrait de malt 3g Agar-agar 20 g Eau : jusqu' 1000 ml Ajouter au besoin 100 mg de chloramphnicol pour inhiber le dveloppement bactrien et 150 mg de diphnyle pour inhiber le dveloppement des moisissures. 1.2 YEPD Glucose 20 g Peptone 20 g Extrait de levure 10 g Agar-agar 20 g Eau : jusqu' 1000 ml Ajouter au besoin 100 mg de chloramphnicol pour inhiber le dveloppement bactrien et 150 mg de diphnyle pour inhiber le dveloppement des moisissures.
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1.3 Glose nutritive WL Glucose Peptone Extrait de levure Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4) Chlorure de potassium (KCl) Chlorure de calcium (CACL2) Sulfate de magnsium (MgSO4) Chlorure ferrique (FeCl3) Sulfite de manganse (MnSO4) Vert de bromocrsol Glose bactriologique Eau : jusqu' pH
50 g 5g 4g 0,55 g 0,425 g 0,125 g 0,125 g 0,0025 g 0,0025 g 0,022 g 12 g 1000 ml 5,5
La glose diffrentielle est produite en ajoutant 4 mg/l de cycloheximide la glose nutritive WL. Ajouter au besoin 100 mg de chloramphnicol pour inhiber le dveloppement bactrien. 1.4 Glose de lysine ASBC Solution A : Base carbone de levure 2,35 g Eau : jusqu' 100 ml Striliser par filtration sur membrane. Solution B : Lysine-HCl 0,5 g Agar-agar 4g Eau : jusqu' 100 ml Striliser pendant 20 mn 121 C. Ajouter au besoin 100 mg de chloramphnicol pour inhiber le dveloppement bactrien.
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2 MILIEUX LACTIQUES
POUR
LE
DNOMBREMENT
DES
BACTRIES
2.1 M.R.S. + jus de tomate (ou pomme). Glucose 20 g Peptone 10 g Extrait de buf 8g Extrait de levure 4g Phosphate de potassium, dibasique (KH2PO4) 2g Actate de sodium 3H2O 5g Citrate d'ammonium 2g Sulfate de magnsium 6H2O 0,2 g Sulfate de manganse 4H2O 0,05 g "Tween 80" 1 ml Agar-agar 12 g Jus de tomate (ou jus de pomme ou de raisin) 200 ml Eau jusqu' 1000 ml Ajouter 100 mg/L de natamycine (pimaricine) pour inhiber le dveloppement des levures, aprs passage l'autoclave, juste avant utilisation. 2.2 Glose au jus de tomate Jus de tomate (extrait sec de 400 ml) 20 g Peptone 10 g Lait peptonis 10 g Agar-agar 14 g Eau : jusqu' 1000 ml pH 6,1 Ajouter 100 mg/L de natamycine (pimaricine) pour inhiber le dveloppement des levures, aprs passage l'autoclave, juste avant utilisation.
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2.3 Milieu ATB modifi, ou milieu Oenococcus oeni (anciennement milieu Leuconostoc oenos). Solution A : Glucose Extrait de levure Peptone Sulfate de magnsium Sulfate de manganse Jus de tomate (ou jus de pomme ou de raisin) Agar-agar Eau Striliser l'autoclave pendant 20 mn 121 C. Solution B : Cystine HCl Eau : jusqu' pH Striliser par filtration sur membrane. Ajouter 100 mg/L de natamycine (pimaricine) dveloppement des levures, juste avant utilisation. 10 g 5g 10 g 0,2 g 0,050 g 250 ml 12 g 750 ml
1g 100 ml 4,8 pour inhiber le
Ajouter 1 ml de la solution B dans 20 ml de solution A au moment de l'utilisation 2.4 Milieu Lafon-Lafourcade Glucose Extrait de levure Extrait de buf Peptone Actate de sodium Citrate de tri-ammonium Sulfate de magnsium 6H2O Sulfate de manganse 4H2O "Tween 80" Agar-agar Eau : jusqu' pH
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20 g 5g 10 g 10 g 5g 2g 0,2 g 0,05 g 1 ml 20 g 1000 ml 5,4

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Ajouter 100 mg/L de natamycine (pimaricine) pour inhiber le dveloppement des levures, aprs passage l'autoclave, juste avant utilisation. 2.5 Milieu Dubois (milieu 104) Jus de tomate 250 ml Extrait de levure 5g Peptone 5g Acide malique 3g Sulfate de magnsium 6H2O 0.05 g Sulfate de manganse 4H2O 0.05 g Agar-agar 20 g Eau : jusqu' 1000 ml pH 4,8 Ajouter 100 mg/L de natamycine (pimaricine) pour inhiber le dveloppement des levures, aprs passage l'autoclave, juste avant utilisation. 2.6 MTb. Glucose 15 g Poudre Lab-Lemco (Oxoid) 8g Casine hydrolyse 1g Extrait de levure 5g Jus de tomate 20 ml Actate de sodium 3g Citrate d'ammonium 2g Acide malique 6g Sulfate de magnsium 0,2 g Sulfate de manganse 0,035 g "Tween 80" 1 mg TC Vitamins Minimal Eagle, 100x (BD-Difco) 10 ml * pH (avec KOH) 5,0 Eau jusqu' 1000 ml * ajouter aprs strilisation. Ajouter 100 mg/L de natamycine (pimaricine) pour inhiber le dveloppement des levures, aprs passage l'autoclave, juste avant utilisation.
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3 MILIEUX POUR LE DNOMBREMENT DES BACTRIES ACTIQUES 3.1 GYC Glucose Extrait de levure Carbonate de calcium (CaCO3) 50 g 10 g 3g
Glose 25 g Eau : jusqu' 1000 ml Ajouter 100 mg/L de natamycine (pimaricine) pour inhiber le dveloppement des levures, et 12,5 mg/L de pnicilline pour liminer la croissance des bactries lactiques, aprs passage l'autoclave, juste avant utilisation. 3.2 Milieu G2 Extrait de levure 1,2 g Phosphate d'ammonium 2g Jus de pomme 500 ml Glose 20 g Eau : jusqu' 1000 ml pH 5,0 Ajouter 100 mg/L de natamycine (pimaricine) pour inhiber le dveloppement des levures, et 12,5 mg/L de pnicilline pour liminer la croissance des bactries lactiques, aprs passage l'autoclave, juste avant utilisation. 3.3 Milieu Kneifel Extrait de levure thanol Glose Vert de bromocrsol 2,2 % Eau : jusqu'
* ajouter aprs strilisation.
30 g 20 ml * 20 g 1mL 1000 ml
Ajouter 100 mg/L de natamycine (pimaricine) pour inhiber le dveloppement des levures, et 12,5 mg/L de pnicilline pour liminer la croissance des bactries lactiques, aprs passage l'autoclave, juste avant utilisation.
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Colonies bleues : Acetobacter, Gluconacetobacter Colonies vertes : Gluconobacter 4 MILIEUX POUR LE DNOMBREMENT DES MOISISSURES 4.1 Czapek-Dox, Modifi Sucrose 30 g NaNO3 3g K2HPO4 1g MgSO4 0,5 g KCl 0,5 g 0,01g FeSO4 Glose 15 g pH final ( 25 C) 7,3 0,2 Ajouter 10 mg/l de cycloheximide pour inhiber le dveloppement des levures (le dveloppement des levures rsistantes au cycloheximide est gnralement plus lent que celui des moisissures). Remarque : Ce milieu permet la croissance uniquement des moisissures se dveloppant en prsence de nitrates. Ajouter de la ttracycline (100 mg/l) et de la streptomycine (100 mg/l) pour inhiber la croissance des bactries. 4.2 Glose dichloran-rose Bengale-chloramphnicol (glose DRBC) Glucose 10 g Peptone 5g KH2PO4 1g MgSO4 0,5 g Rose Bengale 0,025 g Dichloran (2,6 dichloro-4-nitroaniline) 0,002g Solution de chloramphnicol (0,1 g/10ml) * 10 ml Glose 15 g pH final ( 25 C) 5,6 0,2 * ajouter aprs strilisation.
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4.3 Glose l'extrait de malt (MEA) Glucose 20 g Extrait de malt 20 g Peptone 5g Glose 15 g pH final ( 25 C) 5,5 0,2 Ajouter de la ttracycline (100 mg/l) et de la streptomycine (100 mg/l) pour inhiber la croissance des bactries.
2. Milieux de culture liquides 2.1. Pour les levures Milieu YEPD (extrait de levure, peptone, dextrose) + chloramphnicol Prparation : Peser 10,0 g d'extrait de levure (Difco ou quivalent), 20 g de peptone, 20 g de glucose et 100 mg de chloramphnicol. Dissoudre, complter le volume avec de l'eau jusqu' 1000 ml et mlanger. Verser des portions de 5 ml de ce milieu dans les tubes et placer en autoclave pendant 15 mn 121 C. 2.2. Pour les bactries lactiques Milieu MTJ (50 % de milieu MRS "bouillon pour lactobacilles selon Man, Rogosa et Sharpe"+ 50 % de milieu TJB "bouillon de jus de tomate") + actidione Prparation : Peser 27,5 g de MRS "bouillon pour lactobacilles selon Man, Rogosa et Sharpe" (Difco ou quivalent). Ajouter 500 ml d'eau, porter bullition pour permettre la dissolution totale et ajouter 20,5 g de TJB "bouillon de jus de tomate" (Difco ou quivalent). Ajouter 50g d'actidione. Dissoudre avec de l'eau de faon obtenir 1000 ml de solution aprs avoir corrig le pH 5,5 avec une solution d'acide chlorhydrique 1N et mlanger. Verser des parties de 10 ml de ce milieu3) dans les tubes et placer en autoclave pendant 15 minutes 121C.
3) On utilise un volume de 10 ml au lieu de 5 ml comme dans le cas des levures, en raison de la plus grande sensibilit des bactries lactiques l'oxygne.
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ANNEXE 6 : IDENTIFICATION DE MICRO-ORGANISMES SPCIFIQUES 6.1 Identification de colonies de levure sur glose nutritive WL. L'utilisation de ce milieu ne prtend pas constituer une mthode d'identification des espces, mais peut offrir aux laboratoires non spcialiss un moyen rapide et bon march de prvoir le genre des levures viables et cultivables. Aprs incubation de 4 jours, valuer la morphologie des colonies comme suit (Pallman, C., J. B. Brown, T. L. Olineka, L. Cocolin, D. A. Mills et L. F. Bisson. 2001. Use of WL medium to profile native flora fermentations. American Journal of Enology and Viticulture 52:198-203 ; A. Cavazza, M. S. Grando, C. Zini, 1992. Rilevazione della flora microbica di mosti e de vini. Vignevini, 9-1992 17-20) : Saccharomyces spp. : Se dveloppe bien en 4 jours sur glose nutritive WL, en formant des colonies circulaires de couleur crme lgrement verdtre. Les diffrentes nuances de couleur n'indiquent pas ncessairement la prsence de diffrentes souches, mais la prsence de lgres mutations ; les colonies prsentent une protubrance, ont une surface lisse et mate, et leur consistance est butyreuse. Ne se dveloppe pas sur la glose de lysine. Torulaspora spp. : Les colonies sont semblables celles de Saccharomyces spp. Se dveloppe sur la glose de lysine. Hanseniaspora spp. (Kloeckera spp.) : Se dveloppe sur la glose nutritive WL en 4 jours, donnant des colonies plates, lisses et butyreuses de couleur vert fonc. Se dveloppe sur la glose de lysine et sur la glose diffrentielle WL. Candida stellata : Se dveloppe sur la glose nutritive WL en 4 jours, donnant des colonies vert pois, lisses et butyreuses qui, avec le temps, deviennent plus fonces au centre. Se dveloppe sur la glose de lysine. Saccharomycodes spp. : Se dveloppe sur la glose nutritive WL en 4 jours, donnant des colonies convexes, lisses et butyreuses de couleur vert clair. Se dveloppe sur la glose de lysine, pas sur la glose diffrentielle WL. Remarque : Ses cellules, observes au microscope, sont trs grandes (jusqu' 25 m).
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Schizosaccharomyces pombe : Se dveloppe sur la glose nutritive WL en 4 jours, donnant des colonies lisses, de la taille d'une pointe d'aiguille et de couleur vert fonc. Se dveloppe sur la glose de lysine. Remarque : Ses cellules, observes au microscope sont facilement identifiables en raison de leur division caractristique par scission. Rhodotorula spp. : Se dveloppe sur la glose nutritive WL en 4 jours, donnant des colonies butyreuses, la surface lisse et muqueuse, et de couleur rose fonc. Se dveloppe sur la glose de lysine. Metschnikowia spp. : Se dveloppe sur la glose nutritive WL en 4 jours, donnant de petites colonies claires, lisses et butyreuses. Un pigment rougetre se rpand dans le milieu au-dessous des colonies. Se dveloppe sur la glose de lysine. Pichia membranifaciens : Se dveloppe sur la glose nutritive WL en 4 jours, donnant des colonies convexes, la surface grossire et pulvrulente, et de couleur gristre ou bleutre. Se dveloppe sur la glose de lysine. Pichia anomala (anciennement Hansenula anomala) : Se dveloppe sur la glose nutritive WL en 4 jours, donnant des colonies de couleur crme ou bleutre, nettement bleutre aprs 8 jours. Les colonies circulaires, la surface lisse ont une consistance butyreuse mais parfois clairement muqueuse. Se dveloppe sur la glose de lysine. Dekkera spp. ou Brettanomyces spp. : Se dveloppe sur la glose nutritive WL en 8 jours, donnant de petites colonies lisses et butyreuses, en forme de dme et de couleur crme. Produit une grande quantit d'acide actique, nettement perceptible l'odeur, qui fait virer le milieu au jaune. Se dveloppe sur la glose de lysine et sur la glose diffrentielle WL. La croissance sur ce dernier milieu permet de la distinguer de Zygosaccharomyces bailii. Remarque : Une confirmation est possible par examen microscopique : Dekkera possde des cellules de petite taille, dont certaines ont une forme ogivale caractristique. Zygosaccharomyces bailii : Se dveloppe sur la glose nutritive WL en 4 jours, donnant de petites colonies lisses et butyreuses, de forme circulaire et de couleur crme. Se dveloppe sur la glose de lysine mais pas sur la glose diffrentielle WL. Un halo jauntre est souvent prsent autour des jeunes colonies. Remarque : en cas de dveloppement dans du vin mis en bouteille, produit des groupes bruns de 0,5 - 1 mm. Ses cellules ne sont pas de forme ogivale.
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Bactries actiques : Se dveloppent sur la glose nutritive WL, en donnant des colonies brillantes et intensment vertes, d'une taille allant de petite celle d'une pointe d'aiguille, et qui sont fortement positives au test la catalase. (Remarque ce milieu n'est pas appropri leur comptage). Bactries lactiques : Se dveloppent sur la glose nutritive WL en 10 jours, en donnant des colonies catalase-ngatives claires de la taille d'une pointe d'aiguille. (Remarque ce milieu n'est pas appropri leur comptage).
6.2 Identification des colonies de bactries lactiques. Les colonies de BL sont translucides et d'une taille allant de celle d'une pointe d'aiguille quelques mm. Elles sont Gram-positif et catalasengatives. Oenococcus oeni se dveloppe sous forme de courtes chanes, les pdiocoques forment des ttrades et diplocoques, les lactobacilles forment des bacilles longs ou courts. 6.3 Identification des colonies de bactries actiques. Les colonies de BA sont catalase-positives et Gram ngatif, et sont fortement acidognes : ceci se traduit par une zone claire autour de leurs colonies dans les milieux contenant du carbonate de calcium ou par une couleur diffrente si le milieu contient un indicateur de pH. Leurs cellules sont des coques ou des bacilles, en gnral lgrement plus grandes que celles des BL.
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RECUEIL DES METHODES INTERNATIONALES D'ANALYSES OIV Analyse microbiologique des vins et des mots

Dilution obtenue Inoculation des botes

50 g 5g 4g 0,55 g 0,425 g 0,125 g 0,125 g 0,0025 g 0,0025 g 0,022 g 12 g 1000 ml 5,5

1g 100 ml 4,8 pour inhiber le

20 g 5g 10 g 10 g 5g 2g 0,2 g 0,05 g 1 ml 20 g 1000 ml 5,4

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