Bioprospeccao de Novas Celulases de Fungos Filamentosos

BIOPROSPECO DE NOVAS CELULASES DE FUNGOS PROVENIENTES DA FLORESTA AMAZNICA E OTIMIZAO DE SUA PRODUO SOBRE CELULIGNINA DE BAGAO DE CANA
Paulo Iiboshi Hargreaves
Dissertao Apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Tecnologia de Processos Quimicos e Bioqumicos para Obteno do Grau de Mestre em Cincias (Msc)
Orientadores: Nei Pereira Jr., PhD Leda Mendona-Hagler, DsC
Escola de Qumica
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Dissertao Apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos para Obteno do Grau de Mestre em Cincias (Msc)
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Escola de Qumica Universidade Federal do Rio de Janeiro


Dissertao submetida ao corpo docente do Programa de PsGraduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos da Escola de Qumica da Universidade Federal do Rio de Janeiro como parte dos requisitos necessrios para obteno do grau de mestre em cincias (MSc) Aprovada por:
Prof. Nei Pereira Jr. , PhD Orientador - Presidente
Prof Leda Mendona Hagler, DSc Orientadora
Prof Maria Antonieta Peixoto Gimenes Couto, DSc
Prof Rosalie Reed Rodrigues Coelho, DSc
Judith Liliana Solrzano Lemos, DSc iii
FICHA CATALOGRFICA
Hargreaves, Paulo Iiboshi Bioprospeco de novas celulases de fungos provenientes da floresta amaznica e otimizao de sua produo sobre celulignina de bagao de cana/ Paulo Iiboshi Hargreaves. Rio de Janeiro, 2008
xiii, 75 f, 29,7 cm. Dissertao (Mestrado em tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos) Universidade Federal do Rio de Janeiro-UFRJ, Escola de Qumica, Programa de Ps-Graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos, 2008. Orientadores : Nei Pereira Jr., PhD Leda Mendona-Hagler, DSc 1. 2. 3. 4. Bioprospeco Celulases Resduos Agroindustriais Hidrlise I. Pereira Jr., Nei (Orient.) II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Escola de Qumica. Programa de Ps-Graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos.
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Agradecimentos
Ao professor Nei Pereira Jr., orientador dessa dissertao, pela sabedoria e exigncia. Aceitou a proposta do projeto, acrescentando novas perspectivas e aparando arestas. Ratificando sua competncia como orientador e professor, participando de discusses, comentando e questionando diversos pontos deste projeto. professora Leda Mendona Hagler, orientadora, por sua ajuda e colaborao com seus conhecimentos para concluso dessa dissertao. Aos colegas do LADEBIO, pelas conversas sempre descontradas. Aos colegas do Lab. de Ecologia e Taxonomia e agregados, pelas conversas construtivas durante as reunies no horrio de almoo. Aos colegas de mestrado pela animao contagiante durante esses dois anos. coordenadora do Programa de Ps-Graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos, professora Oflia de Queirz Fernandes Arajo, por demonstrar tranqilidade ao resolver problemas acadmicos e burocrticos. Ao CENPES/Petrobrs, pelo suporte e parabenizando as oportunidades criadas por essa iniciativa de apoio com bolsas de pesquisa.
BIOPROSPECO DE NOVAS CELULASES DE FUNGOS PROVENIENTES DE SOLO DA FLORESTA AMAZNICA E OTIMIZAO DE SUA PRODUO SOBRE CELULIGNINA DE BAGAO DE CANA Resumo de Dissertao de Mestrado apresenta ao programa de PsGraduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos da Escola de Qumica da Universidade Federal do Rio de Janeiro Brasil Paulo Iiboshi Hargreaves O solo brasileiro fonte de inestimveis riquezas, flora e fauna que ainda esperam ser descritas, assim como uma fonte inesgotvel de potencial biotecnolgico, guardado por microrganismos nesse ecossistema e solos, os quais so ricos em material vegetal em decomposio. A celulose a estrutura polissacardica mais abundante em paredes celulares de plantas, sendo assim a fonte de energia que mais se acumula no planeta, em forma de tecidos mortos ou como resduos agroindustriais. A degradao microbiana da celulose o mais importante processo de decomposio desses detritos vegetais. Tendo conhecimento sobre essas atividades, possivel utilizar esse potencial em beneficio da tecnologia, para alm de produzir enzimas, utilizar os produtos dessa reao. O objetivo deste trabalho foi a bioprospeco de fungos filamentosos com potencial de produo de celulases com aplicao na hidrlise de material lignocelulsico. Aps isolamento inicial de quinze fungos em meio contendo apenas o carboximetil celulose (CMC) como substrato, foi realizado ensaio cup plate para seleo dos isolados com maior atividade, com halos de degradao alcanando 1,4 a 1,6 cm de raio. Cinco destes foram avaliados quanto produo de celulases em diferentes substratos: CMC, celulose cristalina e celulignina de bagao de cana. Sendo selecionado a celulignina e o isolado S47, posteriomente identificado como semelhante a Coniochaeta lignaria, documentado como potencial produtor de celulases em condies contendo inibidores como furfural e compostos fenlicos. A otimizao da produo foi realizada tendo como ferramenta o planejamento experimental e condies prximas as ideais (pH = 6,0, temperatura = 35 C, substrato 7,5 g/L e 10% de inculo v/v), sendo reproduzida em biorretador agitado mecanicamente a 150 RPM e aerado a 0,5 vvm, com produo de atividade FPsica de 0,484 UI/mL, CMCsica de 1,517 UI/mL, glucosidsica de 0,56613 UI/mL e a um teor protico de 150 mg/L. Aps concentrao do extrato bruto filtrado cerca de 20 vezes, em rotavapor foram alcanadas atividades FPsica de 3,357 UI/mL, CMCsica de 23,364 UI/mL, -glucosidsica de 3,4328 UI/mL e teor proteico de 3,483 g/L.
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BIOPROSPECTION OF NEW CELLULASES OF AMAZON FOREST SOIL FUNGI AND ITS PRODUCTION OPTIMIZATION ON SUGAR CANE BAGASSE CELULIGNIN Abstract of the M. Sc. Dissertation presented to the graduate program on Technology of Chemical and Biochemical Process of the Chemical High School of Federation University of Rio de Janeiro Brazil Paulo Iiboshi Hargreaves The Brazilian soil is a source of uncountable richness, flora and fauna, to be yet described, also as source of abundant biotechnological potential, maintained by microorganism from this ecosystem and soil which is rich on organic decomposing material. Cellulose is the most abundant component on plant cell walls, being the most abundant renewable source of energy, mainly as agro-industrial residues. The microbial activities on cellulose are the most important process on this residual biomass. Having knowledge about those activities, this potential can be taken in benefit of technology, producing enzymes and products from these biological processes. The aim of this study was the bioprospection of filamentous fungi with potential to produce cellulases with application for lignocellulosic substrates hydrolysis. After initial isolation of fifteen fungi on CMC medium, cup plate assay was carried out for selection of higher activity isolates, the degradation halos reach 1,4-1,6 cm radius, which five of them were evaluated for cellulose activity with different substrates, CMC, cristaline cellulose and sugar cane bagace cellulignin. Being selected the cellulignin and S47 isolate, posteriorly identified as Coniochaeta lignaria related, documented as potential cellulose producer under inhibitor presence as furfural and fenolic compounds. The production optimization was carried through experimental design, getting next conditions as ideals (pH = 6,0, temperature = 35 C, substrate 7,5 g/L and 10% of inoculum v/v), being reproduced in STR bioreactor at 150 RPM and 0,5 vvm of air injection, reaching activity production of 0,484 UI/mL FPasic, 1,517 UI/mL CMCasic, 0,56613 UI/mL -glucosidasic and 150 mg/L of protein, and after 20 fold concentration in rotavapor, 3,357 UI/mL FPasic activity, 23,364 UI/mL CMCasic, 3,4328 UI/mL -glucosidasic and 3,483 g/L protein concentration were reached.
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Sumrio Captulo 1 1. Introduo Captulo 2 2. Reviso bibliogrfica 2.1. Ecologia Microbiana no Solo 2.2. Diversidade Microbiana no Solo 2.3. Taxonomia de Fungos Filamentosos 2.4. Material Lignocelulsico
2.4.1 Celulose
1 1 4 4 4 5 7 7
8
2.5. Celulases
2.5.1. Produo de celulases 2.5.2. Ensaios de atividade celulsica
11
13 18
2.6. Aplicao da celulase

2.6.1. Indstria alimentcia 2.6.2. Indstria de bebidas e sucos 2.6.3. Indstria de rao animal 2.6.4. Indstria txtil
19
19 19 20 20
2.7. Biorrefinaria Captulo 3 3. Justificativa, hiptese e objetivos 3.1. Justificativa 3.2. Hiptese 3.3. Objetivos
3.3.1. Geral 3.3.2. Especficos
21 25 25 25 25 26
26 26
Captulo 4 4. Materiais e Mtodos 4.1. Diagrama esquemtico das atividades 4.2. Local da coleta 4.3. Coleta 4.4. Anlise Fsico-Qumica 4.5. Processamento laboratorial 4.6. Plaqueamento e Isolamento 4.7. Seleo por ensaio cup plate
27 27 27 28 28 28 29 29 30 viii
4.8. Composio de meios de cultura

4.8.1. Manuteno do microrganismo 4.8.2. Meio para ensaio cup plate 4.8.3. Meio de produo de celulase e pr-inculo
30
30 31 31
4.9. Processamento do bagao da cana-de-acar 4.10. Atividade Enzimtica

4.10.1. Atividade FPsica (Ghose, 1987) 4.10.2. Atividade CMCsica (adaptada de GHOSE, 1987) 4.10.3. Atividade -glucosidsica (adaptado de Ghose, 1987)
32 33
33 34 34
4.11. Quantificao de protena (Bradford, 1976) 4.12. Ensaio em frascos agitados

4.12.1. Seleo do isolado e substrato 4.12.2. Otimizao da produo de enzimas (planejamento fatorial)
35 35
36 36
4.13. Produo de enzimas em Biorreator STR instrumentado 4.14. Concentrao e avaliao do produto 4.15. Caracterizao do isolado
4.15.1. Morfologia 4.15.2. Extrao de DNA e seqenciamento
37 38 39
39 39
4.16. Caracterizao das enzimas

4.16.1. SDS-PAGE 4.16.2. Gel de atividade enzimtica
41
41 42
Captulo 5 5. Resultados e Discusso 5.1. Ensaio cup plate 5.2. Seleo do isolado e substrato 5.3. Caracterizao do isolado 5.4. Caracterizao do extrato enzimtico 5.5. Otimizao da produo de celulases 5.6. Ensaio em biorreator instrumentado 5.7. Concentrao do extrato enzimtico Captulo 6 6. Concluses e Sugestes 6.1. Concluses 6.2. Sugestes Captulo 7 7. Referncias Bibliogrficas
44 44 44 45 49 50 51 56 59 61 61 61 62 63 63
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Lista de Figuras Figura 2.1. Estrutura da parede celular vegetal (fonte: www.ceres.net) 8 Figura 2.2. Representao estrutural da celulose, formada por celobiose 9 Figura 2.3. Representao das ligaes extramolecular das fibras de celulose (fonte: www.msm.cam.ac.uk) 9 Figura 2.4. Esquema da organizao de um celulossoma bacteriano (genomicsgtl.energy.gov) 11 Figura 2.5. Celulases excretadas por clulas (genomicsgtl.energy.gov) 11 Figura 2.6. Representao das plataformas bioqumicas: SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation), SSCF (Simultaneous Saccharification and Co-Fermentation) e CBP (Consolidated Bioprocessing) 24 Figura 4.1. Diagrama esquemtico resumido das atividades realizadas 27 Figura 4.2. Floresta Nacional do Tapajs 28 Figura 4.3. Biorreator utilizado para fermentao 38 Figura 4.4. Mapa da regio ITS 41 Figura 5.1. Visualizao do ensaio cup plate 45 Figura 5.2. Atividade FPsica dos diferentes isolados frente aos substratos 46 Figura 5.3. Atividade CMCsica dos diferentes isolados frente aos substratos 47 Figura 5.4. Atividade -glicosidsica dos diferentes isolados frente aos substratos 47 Figura 5.5. Atividade FPsica do isolado S47 frente a diferentes substratos 48 Figura 5.6. Teor protico do extrato bruto centrifugado dos produtos de fermentao do isolado S47 48 Figura 5.7. Seqencia ITS obtida do isolado S47 49 Figura 5.8. Microfotografia do isolado S47 crescido em cultura em lmina (A) e desenho esquemtico (B) de Coniochaeta lignaria (Garcia 2006) 49 Figura 5.9. Dendograma relacionando a seqencia do isolado com banco de dados do NCBI Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 50 Figura 5.10. Gel de atividades celulolticas (A) e de protenas (B) do extrato enzimtico bruto, de meios contendo diferentes fontes de carbono, produzido pelo isolado selecionado S47 50 Figura 5.11. Superfcie de resposta da atividade fpsica do planejamento experimental fatorial 52
Figura 5.12. Superfcie de resposta da atividade cmcsica do planejamento experimental fatorial 52 Figura 5.13. Superfcie de resposta da atividade -glucosidsica do planejamento experimental fatorial 52 Figura 5.14. Superfcie de resposta do teor protico do planejamento experimental fatorial 53 Figura 5.15. Superfcie de resposta da atividade FPsica do planejamento experimental central composto 54 Figura 5.16. Superfcie de resposta da atividade CMCsica do planejamento experimental central composto 55 Figura 5.17. Superfcie de resposta da atividade -glucosidsica do planejamento experimental central composto 55 Figura 5.18. Superfcie de resposta do teor protico do planejamento experimental central composto 55 Figura 5.19. Cintica da produo de celulases em biorreator STR utilizando como substrato celulignina de bagao de cana pelo isolado S47 57 Figura 5.20. Concentrao do extrato bruto da produo de celulase pelo isolado S47, tendo como substrato a celulignina de bagao de cana 60
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Lista de Tabelas Tabela 1.1. Grandes produtores de Etanol (milhes de litros). (Reneable Fuel Association, 2007) 2 Tabela 2.1. Composio de diferentes resduos lignocelulsicos 8 Tabela 2.2. Propriedades de algumas celuloses modelo (ZHANG, 2006) 10 Tabela 2.3. Alguns microrganismos produtores de celulases (FAO, 1997) 13 Tabela 2.4. Dados referentes produo de celulases por diversos microrganismos em diferentes condies de cultivo (adaptado de Castro, 2006) 16 Tabela 2.5. Dados referentes produo de celulases por diversos microrganismos em diferentes condies de cultivo (adaptado de Castro, 2006) continuao. 17 Tabela 4.1. Propriedades fsico-qumicas das amostras de solo (HARGREAVES, 2005) 29 Tabela 4.2. Composio do meio PDA 30 Tabela 4.3. Composio do meio GYMP 31 Tabela 4.4. Composio do meio Dubos 31 Tabela 4.5. Composio do meio de Mandels 32 Tabela 4.6. Variveis e nveis utilizados no planejamento fatorial completo 37 Tabela 4.7. Variveis e nveis utilizados no planejamento central composto 37 Tabela 4.8. Composio do meio fub de milho 39 Tabela 4.9. Composio do Gel SDS-PAGE 42 Tabela 4.10. Composio do gel de atividade 43 Tabela 5.1. Ensaio cup plate, dimetro e transparncia dos halos 44 Tabela 5.2. Atividade enzimtica e teor protico para o planejamento experimental fatorial completo 51 Tabela 5.3. Variveis e nveis utilizados no planejamento central composto 53 Tabela 5.4. Atividade enzimtica e teor protico para o planejamento experimental central composto 54 Tabela 5.5. Atividade enzimtica e teor protico mximos, atingidos no decorrer da fermentao em biorreator 58 Tabela 5.6. Valores das atividades enzimticas e teor protico do extrato bruto e das subseqentes concentraes 59 Tabela 5.7. Dados referentes atividade enzimtica de algumas enzimas comerciais (CARVALHO, 2007) 60
xii
Lista de Siglas e Abreviaturas ARDRA: Anlise de restrio de rDNA amplificado CBP: Bioproduo consolidada CMC: Carboximetil celulose DNA: cido desoxirribonucleico DNS: cido dinitrosaliclico FAME: Anlise de steres metlicos de cidos graxos FES:Fermentao em estado slido FS: Fermentao submersa IBAMA: Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renovveis ITS: Internal transcribed spacer PCR: Reao em cadeia de polimerase PCR-DGGE: Eletroforese em gel de poliacrilamida com gradiente desnaturante PDA: gar de extrato de batata e dextrose PLFA: Anlise de cidos graxos de fosfolipdeos rDNA: cido desoxirribonuclico ribossomal RISA: Anlise de espaadores intergnicos ribossomais RLFP: Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrio terminais SARST: Anlise seriada de etiquetas de seqncias ribossomais SDS-PAGE: Eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecil sulfato de sdio SHF: Fermentao e hidrlise separada SSCF: Co-fermentao e sacarificao simultnea SSCP: Polimorfismo de conformao de fita simples SSF: Fermentao e sacarificao simultnea STR: Agitado mecanicamente UI: Unidade internacional VVM: Razo volume por volume por minuto YM: Meio de extrato de levedura e malte
xiii
Hargreaves, P. I.
Introduo
Captulo 1
1. Introduo Com o inevitvel esgotamento das fontes de abastecimento de petrleo e a crescente preocupao internacional, associados ao impacto ambiental resultante da queima dos combustveis fsseis, o interesse em investimentos em fontes alternativas de energia, preferencialmente renovveis e no derivadas do petrleo, tem aumentado. Dentre os biocombustveis, as pesquisas cientficas tendem a escolher o etanol como um provvel substituto das atuais fontes utilizadas, visto que, em sua primeira etapa histrica, consistia na fermentao de acares prontamente disponveis, como no caso do caldo de cana-de-acar, assim como em outras vertentes utilizando hidrolisados de amido. O Brasil, importante produtor de etanol, ter importante papel na comercializao deste produto para os pases da Europa e outros pases como Japo e Estados Unidos, pois estas potncias econmicas tem seguido o modelo brasileiro que utiliza a mistura da gasolina com pequenas fraes de etanol, com o propsito de diminuir as taxas de emisses de gases poluentes que contribuem para o efeito estufa e diminuio do valor de comercializao. J os Estados Unidos, mesmo sendo grandes produtores de etanol, a sua tecnologia, que baseada na fermentao de amido de milho, vem sendo criticada por utilizar como fonte um produto alimentcio pressionando, assim, a alta nos mercados, por receber forte subsdio governamental. No caso do Brasil e dos Estados Unidos (tabela 1.1), lderes na produo de etanol, existe uma grande presso, alm de grandes oportunidades a serem aproveitadas, uma vez que os seus principais resduos 1
Hargreaves, P. I.
Introduo
podem ser utilizados para produo do etanol, neste caso, o bioetanol oriundo de biomassa vegetal.
Tabela 1.1. Grandes produtores de Etanol (milhes de litros). (Reneable Fuel Association, 2007)
Pas Estados Unidos Brasil China ndia
2007 24.564 18.974 1.837 196
2006 18.376 16.998 3.849 1.900
2005 16.139 15.999 3.800 1.699
Com essa viso, estudos para o aproveitamento de biomassa vegetal vm sendo realizados h mais de vinte anos, buscando novas alternativas fsico-qumicas para hidrlise desta matria-prima. Devido ao grau de impacto sobre esse material complexo, o processo produzia, alm dos acares, diversos compostos qumicos txicos tais como, furfural e hidroximetil furfural, inviabilizando o subseqente processo de fermentao. Nota-se que para uso em fermentao, o produto a ser fermentado deve ter baixa toxicidade, portanto, pesquisas a respeito de novas formas de tratamento deveriam ser realizadas. O enfoque das pesquisas volta-se para as enzimas, que podem agir sobre determinadas estruturas das fibras lignocelulsicas, liberando acares. A utilizao de enzimas combinadas a uma pr-hidrlise menos severa resultaria na liberao de acares com menos impurezas, este processo poderia ser, ento, utilizado a fim de obter uma fermentao mais eficiente. Essas idias unidas ao uso dos resduos agroindustriais, originados no mesmo local onde se produz o etanol de fonte sacarnea ou amilcea, estaria concretizando uma oportunidade: a idealizao da Biorrefinaria, autodependente, uma alternativa sustentvel para produo no s do
Hargreaves, P. I.
Introduo
bioetanol, como tambm para produo de qumicos, polmeros, produtos farmacuticos e outras fontes de energia. Considerando esse mercado em expanso, diversas empresas, que antes eram voltadas para indstria de papel e celulose, txtil e alimentos, esto investindo em pesquisa e produo de celulases, buscando novas formulaes tendo em vista o melhor desempenho sobre diferentes matrias lignocelulsicos.
Hargreaves, P. I.
Reviso Bibliogrfica
Captulo 2
2. Reviso bibliogrfica 2.1. Ecologia Microbiana no Solo Em todos os ecossistemas do planeta, assim como em ambientes agrcolas, os microrganismos so peas fundamentais na ciclagem de nutrientes, os disponibilizando para as plantas. Esse processo biolgico pode fornecer bases cientficas para a compreenso das reaes bioqumicas pelas quais os compostos orgnicos so levados a compostos inorgnicos e seus elementos constituintes, denominado mineralizao; os microrganismos so essenciais para essas transformaes qumicas (ATLAS e BARTHA, 1993, SALAMANCA, RAUBUCH e JOERGENSEN, 2002). O solo da floresta Amaznica, assim como outros solos, so habitats pouco explorados e com grande possibilidade de se isolar novas espcies microbianas. Nas florestas tropicais a riqueza do solo normalmente est concentrada na camada superficial, devido ao depsito de resduos vegetais, que so parcialmente decompostos e incorporados pelos microrganismos. Havendo disponibilidade de gua essa decomposio gera matria orgnica que retm nutrientes e que posteriormente so liberados lentamente para outros microrganismos do solo (BORNEMAN e TRIPLETI, 1997; MOUTINHO, 2002). A microbiota do solo atua sobre a matria orgnica,
predominantemente vegetal, convertendo as molculas orgnicas complexas em substncias simples. O dixido de carbono, sais minerais e cidos orgnicos so algumas dessas substncias que podem ser absorvidos pelas plantas. Segue-se a fase de humificao, na qual estes componentes simples se reorganizam espontaneamente sintetizando novos compostos hmicos (cidos 4
Hargreaves, P. I.
Reviso Bibliogrfica
hmicos, flvicos e huminas) dando origem ao hmus, a matria orgnica estvel (BROCK et al., 1997). Este processo de transformao confirma o importante papel dos microrganismos, em especial da biomassa concentrada na camada superior do solo de terra firme. A biomassa microbiana um constituinte da matria orgnica do solo, embora quantitativamente pouco representada de grande importncia. Os produtos desse metabolismo constituem uma das principais fontes de nitrognio mineral e fsforo para as plantas, uma vez que estes integram o processo de regenerao e fertilidade do solo (NEPSTAD et al., 1995).
2.2. Diversidade Microbiana no Solo Os microrganismos vivem nos mais variados habitats da terra; essa habilidade devido sua diversidade metablica, isto , diferentes micrbios podem usar uma variedade de fontes de energia e crescer sob diferentes condies fsicas. A diversidade de populaes microbianas indica que elas tiram proveito de qualquer nicho encontrado em seu ambiente, assim sendo, os microrganismos detm a maior proporo da diversidade gentica global estimada (TORTORA, FUNKE e CASE, 2003). A diversidade de bactrias e fungos ainda pouco conhecida, com exceo das espcies patognicas para humanos, animais domsticos e plantaes. A estimativa do nmero de espcies microbianas utilizando diferentes mtodos levou a um mesmo consenso de que existam entre um a um milho e meio de espcies de fungos e talvez trs milhes de bactrias, muitas delas ainda no cultivveis (HAWKSWORTH, 1991, 1993; HAMMOND, 1992; ROSSMAN, 1994; TRPER, 1992)
Hargreaves, P. I.
Reviso Bibliogrfica
O nmero de microrganismos encontrados no solo dependente do tipo do solo e suas condies fsicas, qumicas e nutricionais. As bactrias representam a maioria desses microrganismos com contagens entre 106 a 109 por grama de solo seco (WHITMAN, COLEMAN e WIEBE, 1998). Esses dados se referem apenas ao nmero de bactrias cultivveis, j que existe uma dificuldade em se reproduzir in vitro as condies ideais que supram as necessidades nutricionais da grande maioria desses microrganismos encontrados em ambientes naturais. O uso de tcnicas independentes de cultivo tais como: contagem direta de clulas em microscpio, anlise de cidos graxos de fosfolipdeos (PLFA), anlise de steres metlicos de cidos graxos (FAME), reao em cadeia da polimerase-eletroforese em gel com gradiente desnaturante (PCR-DGGE), polimorfismo de conformao de fita simples (SSCP), anlise de restrio de rDNA amplificado (ARDRA), polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrio terminais (TRLFP), anlise de espaadores intergnicos ribossomais (RISA), anlise seriada de etiquetas de seqncias ribossomais (SARST), sequenciamento de clones de rDNA e a hibridizao em microarranjos (GeneChips) confirmam que os microrganismos cultivveis representam apenas 0,1 a 1% de toda a biodiversidade microbiana existente (TORSVIK, GOKSOYR e DAAE, 1990; BAKKEN, 1997, LAMBAIS et al., 2005). Mtodos dependentes e independentes de cultivo, como todas as tcnicas empregadas, possuem vantagens e desvantagens. Quando so obtidos microrganismos isolados, por metodologias de cultivo, possvel efetuar estudos taxonmicos, genticos e fisiolgicos. A limitao principal a incapacidade atual de recriar todas as caractersticas do habitat natural, portanto, no sendo possvel a extrapolao de resultados para o ambiente (VIEIRA e NAHAS, 2005). J os mtodos independentes de cultivo possibilitam o estudo de grupos relacionados, considerando caractersticas 6
Hargreaves, P. I.
Reviso Bibliogrfica
taxonmicas, genticas e fisiolgicas, porm, sem ser possvel inferir os dados a um microrganismo especfico.
2.3. Taxonomia de Fungos Filamentosos Anteriormente estudada por botnicos, toda a taxonomia dos fungos era baseada na morfologia das estruturas e clulas, como era realizado com os vegetais, mas devido s caractersticas muito prprias, como ser heterotrfico, caractersticas bioqumicas e genticas, foi proposto um novo reino, o Fungi (CARLILE et al, 2001). Atualmente comum o uso de diferentes tcnicas, combinando a taxonomia clssica, avaliando as estruturas morfolgicas e bioqumicas, com o uso de ferramentas de biologia molecular, que teve uma evoluo no inicio da dcada de noventa, as quais analisam fragmentos amplificados do material gentico (CARLILE et al, 2001, WHITE et al, 1990)
2.4. Material Lignocelulsico Os materiais lignocelulsicos sero a base da cadeia produtiva da biorrefinaria, tanto para produo das enzimas como para a obteno dos acares fermentveis. O que torna essa tecnologia vivel economicamente o fato de que todo o material, atualmente, tratada como resduo agroindustrial, sem valor de mercado, geralmente utilizado apenas para queima ou uso parcial em rao animal. A composio bsica desse material uma organizao complexa de celulose, hemicelulose e lignina (Figura 2.1), em propores que variam entre 23%-53%, 20%-35% e 10%-30%, respectivamente, composio essa que se diferencia de acordo com a natureza do vegetal (tabela 2.1). 7
Hargreaves, P. I.
Reviso Bibliogrfica
Lignina
Celulose
Hemicelulo
Figura 2.1. Estrutura da parede celular vegetal (fonte: www.ceres.net)
Tabela 2.1. Composio de diferentes resduos lignocelulsicos

Fonte Bagao de Palha de cana2 Sabugo de milho1 Palha de arroz3 Jornal impresso2 Madeira (pinheiro)1
1OLSSON
Celulose 36 36 36 33 40-55 44
Composio (%) Hemicelulose Lignina 28 21 28 26 25-40 26 20 16 16 7 18-30 29
Outros 6-11 27 4-10 20 -
cana1
& HAHN-HGERDAL (1996); 2SHLESER (1994); 3AWAFO (1997).
2.4.1 Celulose As fibras de celulose se encontram imersas numa matriz complexa, protegida pela rede de hemicelulose e lignina. Esse homopolissacardeo, de ocorrncia natural, composto por cadeias com grau de polimerizao de 4.000 a 15.000 unidades de glicose, cada unidade une a outra por ligaes glicosdicas do tipo (1-4) e cada par dessa hexose definida como celobiose
Hargreaves, P. I.
Reviso Bibliogrfica
(figura 2.2), unidade conformacional mnima da celulose e, a glicose a unidade fundamental da cadeia homopolimrica.
Figura 2.2. Representao estrutural da celulose, formada por celobiose
A resistncia do substrato a hidrlise ser definida pelo grau de polimerizao e pelo ndice de cristalinidade entre cada fibra de celulose, estabilizada por inmeras pontes de hidrognio, intra e extramolecular (figura 2.3).
Figura 2.3. Representao das ligaes extramolecular das fibras de celulose (fonte: www.msm.cam.ac.uk)
Algumas das celuloses usadas em ensaios laboratoriais, listados na tabela 2.2, ilustram as diferentes caractersticas, as quais favorecem, ou dificultam a ao das celulases, cujos resultados podem indicar a atividade de determinadas enzimas.
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Tabela 2.2. Propriedades de algumas celuloses modelo (ZHANG, 2006)

Substrato Celodextrina CMC Algodo Papel de filtro Whatman n 1 Celulose cristalina Celulose bacteriana Substratos lignocelulsicos pretratados IC N.D. N.D. 0,8-0,95 ~0,45 0,5-0,6 0,8-0,95 0,4-0,7 GP 2-6 100-2000 1000-3000 750-2800 150-500 600-2000 400-1000 FA (%) 100 100 0,2 1,8 0,6 6,0 0,6
(IC) ndice de cristalinidade, (GP) grau de polimerizao, (FA) frao de ligao glicosdica acessvel celulases.
A degradao, ou hidrlise da celulose pode ser realizada com tratamento fsico-qumico ou enzimas celulolticas. A hidrlise fsico-qumica consiste na combinao do uso de cidos e/ou bases (diludos ou no), presso e temperatura, sendo que o valor de cada um desses componentes varia de acordo com o substrato. Submetendo o substrato a temperaturas de 140 a 200 C em cido diludo, possvel extrair cerca de 80-90% da hemicelulose, e 30-50% da lignina susceptvel a extrao alcalina. Este pr-tratamento eficaz em material lignocelulsico a fim de reduzir as concentraes de cinza, pois possui um efeito tamponante, o que torna essa metodologia vivel para o processamento de bagao de cana (PITARELO, 2007).
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2.5. Celulases As celulases so um grupo de enzimas produzidas principalmente por bactrias (figura 2.4) e fungos (figura 2.5) capazes de hidrolisar a celulose.
Figura 2.4. Esquema da organizao de um celulossoma bacteriano (genomicsgtl.energy.gov)
Figura 2.5. Celulases excretadas por clulas (genomicsgtl.energy.gov)
Na hidrlise enzimtica, a catlise mediada por um complexo enzimtico. No caso de fungos filamentosos, esse processo composto por trs grupos enzimticos: endoglucanases, exoglucanases e -glucosidase, que possuem atividade em condies brandas de presso e temperatura. aceito que para hidrlise enzimtica da celulose (figura 2.6) ocorre a ao sinrgica das endoglucanases, exoglucanase ou celobiohidrolase e glucosidase (LYND et al, 2002).
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Figura 2.6. Esquema de ao das celulases no complexadas (ZHANG et al, 2006)
As endoglucanases hidrolisam as ligaes -1,4-glicosdicas das cadeias de celulose de forma aleatria, produzindo assim quebras na fibra. Nas extremidades tanto redutora como no redutoras da cadeia, as exoglucanases podem se ancorar e em seqncia liberar celobioses ou glicoses solveis. Ento as -glucosidases podem hidrolisar as celobioses e assim eliminar a inibio por substrato das enzimas. Estas reaes, esquematizadas na figura 2.6, ocorrem simultaneamente (ZHANG e LYND, 2004). As celulases so enzimas relativamente caras e a reduo de seu custo ser importante para o uso comercial em biorefinarias. A estratgia baseada na celulase para que se torne economicamente vivel inclui: aumento volumtrico da produtividade, produo de enzimas com substratos mais baratos, produo de preparados enzimticos com maior estabilidade para cada processo especfico e maior atividade especifica sobre substratos slidos (MOREIRA, 2005).
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2.5.1. Produo de celulases Existe na natureza uma grande variedade de microrganismos produtores de celulases (tabela 2.3), mas apenas alguns a produzem na forma livre. Dentre estes os principais produtores so os fungos filamentos, sendo necessrio citar os gneros Trichoderma e Aspergillus, que j possuem enzimas comercializveis, com propores entre endoglucanase, exoglucanase e glicosidade distintas, sendo esta ultima a mais baixa para o Trichoderma, e no caso do Aspergillus, a exoglucanase se encontra em menor proporo.
Tabela 2.3. Alguns microrganismos produtores de celulases (FAO, 1997)

Microrganismo
Aspergillus acculeatus Aspergillus fumigatus Aspergillus niger Fusarium solani Irpex lacteus Penicillium funmiculosum Phanerochaete chrysosporium Schizophyllum commune Sclerotium rolfsii Sporotrichum cellulophilum Talaromyces emersonii Thielavia terrestris Trichoderma koningii Trichoderma reesei Trichoderma viride
Microrganismo
Bactrias Actinomicetos
Acremonium cellulolyticus
Clostridium thermocellum Ruminococcus albus
Fungos
Streptomyces sp. Thermomonospora curvata Thermoactinomyces sp.
A viabilidade para uso comercial das celulases depende: do alto ttulo e grande atividade enzimtica, do baixo custo de produo e que a produo em massa seja praticvel. A produo industrial de enzimas se faz, principalmente pelo processo de fermentao submersa (FS), que envolve o crescimento de microrganismos num meio apropriado e com concentraes de oxignio equilibradas. Devido ao desenvolvimento de tecnologias de fermentao em grande escala, a 13
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produo de enzimas microbianas representa uma parcela significativa nas indstrias de biotecnologia. As fermentaes em meio lquido podem ser divididas em diversas fases: preparao de inculo, formulao do meio de cultura e condies de fermentao (TAVARES, 2006). Os processos mais utilizados para a produo so os processos de fermentao contnua, batelada alimentada e a batelada simples. Parmetros operacionais como temperatura, pH, taxa de alimentao, consumo de oxignio e formao de dixido de carbono so medidos e controlados para otimizar o processo de fermentao. O primeiro passo para a remoo da enzima do meio a remoo das clulas, que normalmente feito por centrifugao ou filtrao. A maioria das enzimas industriais so extracelulares e permanecem no meio fermentado aps a remoo da biomassa. A enzima remanescente concentrada por evaporao, filtrao por membrana ou cristalizao, dependendo da sua aplicao, e posteriormente, comercializada. Por outro lado, as enzimas tambm podem ser produzidas por fermentaes em estado slido (FES). Esse processo ocorre em materiais insolveis em gua. O mais tradicional processo para a produo de enzimas o Koji, que foi desenvolvido a partir da arte oriental de fermentao de gros de cereais e de soja, por fungos(PANDEY et al, 1999, TAVARES, 2006). Apresenta como vantagens a simplicidade, a reduo nos custos energticos e no volume do fermentador, facilidade em arejamento e a pequena quantidade de gua usada permite a obteno de metablitos de forma concentrada, tornando a recuperao dos mesmos, mais rpida e econmica, e devido baixa atividade de gua, dificulta a contaminao. Entretanto, apresenta os seguintes inconvenientes: lentido, dificuldade em
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dissipar energia, em controlar a homogeneidade e parmetros de funcionamento e de operao contnua (PANDEY et al, 1999). Nos ltimos anos, diversas pesquisas vm sendo realizadas com o propsito de buscar alternativas na produo, principalmente para o uso de diferentes biomassas como substrato, selecionando microrganismos e condies para obter os melhores rendimentos (tabela 2.4).
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Tabela 2.4. Dados referentes produo de celulases por diversos microrganismos em diferentes condies de cultivo (adaptado de Castro, 2006)
Microrganismo Substrato Condio de cultivo: temperatura C; pH FS; 30; 4,8
2 1
Atividade mxima
Referncia
T. reesei QM 9414
Avicel 2 Bagao 2 Bagao tratado Bagao de cana Solka Floc

2
163 UI PF/L (68 h) 85 UI PF/L (68 h) 90 UI PF/L (44 h) 110 PF/L (7 d); 1200 UI EG/L (7 d) 4250 UI PF/L (7 d) 3200 UI EG/L; 1100 UI PF/L; 250 UI BG/L (72 h) 4200 UI EG/L; 1250 UI PF/L; 550 UI BG?L (80 h) 14 UI PF/g; 80 UI/g; 17 UI BG/g (120 h) 26,8 UI/g (12 d) 2500 UI PF/L (96 h); 60000 UI EG/L (120 h); 16000 UI BG/L (192 h) 130 PF/g (6 d) 13600 PF/L (7 d) 1390 PF/L; 1450 UI BG/L (4 d) 4250 UI PF/L; 45000 UI EG/L; 140 UI BG/L (9 d) 600 UI PF/L (7 d); 40 UI BG/L (6 d) 180 UI EG/g (168 h); 0,08 UI BG/g (168 h); 4 UI CBH/g (120 5,5 PF/g; 79 UI BG/g; 1709 UI EG/g; 4 UI CBH/g 2250 UI EG/L (24 h) 1660 UI BG/L (24 h)
AIELLO et al., 1996 EL-NAWWI e ELKADER, 1996 VELKOVSKA et al., 1997 RAJOKA e MALIK, 1997 GUTIERREZ-COOREA e TENGERDY, 1997 PRASERTSAN et al., 1997 UMIKALSON et al., 1998 XIA e CEN, 1999 HAYWARD et al., 2000 BOLLK e RCZEY, 2000 SHIN et al., 2000 MASSADEH et al., 2001 PANNAGIOTOU et al., 2003 KALOGERIS et al., 2003 KOTCHONI et al., 2003
A. terreus T. reesei RUT C30
FS; 35; 4,0 FS; 28; 4,8
Cellulomonas biazotea Cultura mista T. reesei LM-UC4 e A. phoenicis QM 329
CMC 1 Palaha de trigo Bagao de cana
FS; 30; 7,3
FES; 30
1
A.
Nger ATCC 6275
Torta de palmeira Cacho de palmeira
FES; 35; 6.1 FS; 30; 5,5 FES; 30; 4,5 FS; 30; 4,8 FS; 30; 5,5-6,0 FS; 30; 5,0 FES; 30; 5,5 FES; 30; 6,0 FES; 49; 4,0 FS; 37; 6,0
Chaetomium globosum T. reesei ZU-02 T. Reesei L27 T. reesei RUT C30 T. reesei RUT C30 Cultura mista T. reesei QM 9414 e A. terreus SUK-1 Fusarium oxysporum F3 Thermoascus aurantiacus IMI 216529 Cultura mista de B. pumilus selvagem e mutante CRI 6
Sabugo de milho e farelo de trigo 2 Solka Floc

2
Salgueiro pr-tratado a vapor 1 Carvalho pr-tratado a vapor 2 Bagao de cana Sabugo de milho Palha de trigo CMC Celobiose
1 1 2 1
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Tabela 2.4. Dados referentes produo de celulases por diversos microrganismos em diferentes condies de cultivo (adaptado de Castro, 2006) continuao.
P. decumbens 1 Bacillus SP. JCM 9156 T. reesei RUT C30 T. reesei ZU-02 Cultura mista T. reesei RUT C30 e Aspergillus phoenicis QM 329 T. reesei RUT C30 Penicillium pinophilum IBT 4186 P. persicium IBT 13226 P. brasilianum IBT 20888 T. reesei RUT C30 T. reesei QM 9414 T. reesei RUT C30 Neurospora crassa 4335 Penicillium citrinum Penicillium echinulatum
1
Palha e farelo de trigo CMC 1 Solka Floc 2 Sabugo de milho Esterco Esterco
1 1 2
FES; 30 FS; 37; 10,5 FS; 30; 5,0 FS; 30; 4,8 FS; 27; 5,5 FS; 25,5; 5,7 FS; 30; 5,0 FS; 25; 5,0 FS; 30; 5,0 FS; 28; 5,8
1
15,2 PF/g (4 d); 50,6 UI BG/g (4 d) 46 UI EG/L (30 h) 1300 PF/L (50 h) 5000 UI PF/L; 240 UI BG/L (4 d) 1540 FP/L (10 d); 640 UI BG/L (9 d) 1,72 PF UI/mL 280 PF/L (221 h) 800 PF/L (236 h) 750 PF/L (229 h) 1200 PF/L (6 d); 1350 UI BG/L (7 d) 280 UI PF/L; 9529 UI EG/L; 640 UI BG/L 350 PF UI/L; 9350 EG UI/L; 730 BG UI/L (8 d) 1,33 PF UI/mL 1,72 FP UI/mL; 1,89 EG UI/mL 0,64 FP UI/mL; 2,04 EG UI/mL 1,14 FP UI/mL; 0,93 EG UI/mL 0,27 PF UI/mL; 1,53 EG UI/mL (8 d)
MO et al., 2004 ZHANG et al., 2004 JUHSZ et al., 2004 LIMING e XUELIANG, 2004 WEN el al., 2005a WEN et al., 2005b JRGENSEN et al., 2005 JUHSZ et al., 2005 LI et al., 2005 ROMERO et al., 1999 DUTTA et al., 2008 MARTINS et al., 2008
Solka Floc Solka Floc
Fibra de milho pr-tratada Palha de trigo 1 Farelo de trigo Farelo de arroz Palha de arroz celulose microcristalina
2
FS; 28; 4,8 FS; 30; 6,5 FES; 30
FS; 37
Experimentos conduzidos em frascos cnicos; Experimentos conduzidos em biorreator; (FS) Fermentao submersa; (FES) Fermentao em estado slido; (PF) Atividade em Papel de Filtro; (EG) Atividade Endo-glucansica; (BG) Atividade -glucosidsica.
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2.5.2. Ensaios de atividade celulsica Existem vrias formas de quantificar as atividades de determinadas enzimas, seja avaliando as enzimas individualmente (endoglucanase, exoglucanase e -glucosidase), ou fazendo uma quantificao da atividade total. No caso da endoglucanase, o CMC freqentemente usado, por ser solvel em gua, ter alto grau de polimerizao e suas cadeias estarem expostas para a ao da enzima, que pode ser avaliada quanto reduo da viscosidade ou liberao de acares redutores (WOOD e BHAT, 1988). A atividade da endoglucanase facilmente detectada por avaliao de halos de degradao em placas de meio solido, usando CMC como substrato, corado com vermelho congo e lavado. Essa tcnica freqentemente utilizada para screening, quanto maior o halo, maior a atividade. Porem, a tcnica apenas avalia a ao sobre substrato solvel. A capacidade de hidrlise sobre substrato insolvel deve ser realizada posteriormente (ZHANG, 2004). Para avaliao da exoglucanase, a celulose cristalina vem sendo usada por possuir baixas concentraes de fibra amorfa, tornando-se menos acessvel s endoglucanases, por possuir baixo grau de polimerizao. (WOOD e BHAT, 1988; ZHANG e LYND, 2004). As -glucosidases hidrolisam celobioses solveis para liberao de glicose, essas enzimas podem hidrolizar cadeias de at seis anidroglicoses, mas a taxa de atividade reduz-se drasticamente com o aumento do grau de polimerizao (ZHANG e LYND, 2004). Tomando-se vantagem do fato de que a celobiose no hidrolisada por endoglucanase ou exoglucanase, esse substrato utilizado para quantificao da atividade de -glucosidase, quantificando a glicose liberada no ensaio (GHOSE, 1987).
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A atividade celulsica total ser determinada pela ao sinrgica dos trs grupos de celulases. Para esses ensaios sempre se usa substratos insolveis, como celuloses puras (ex.: papel de filtro) ou lignocelulose pr-tratada (ZHANG, 2006).
2.6. Aplicao da celulase 2.6.1. Indstria alimentcia As celulases so usadas na extrao de suco de frutas e leos de gros, na clarificao de sucos, para aumentar a absoro da gua dos cereais, remoo da camada protetora da soja na produo de alimentos fermentados como molho de soja (shoyu) e da pasta de soja para sopas (miso), gelatinizao de algas e extrao do gar. Alm da parte produtiva, as celulases podem favorecer a qualidade nutritiva dos alimentos, para melhorar a rehidradao de alimentos desidratados e sopas prontas, e para remoo da parede celular de vegetais e frutas, facilitando a liberao do sabor e aroma, enzimas, polissacardeos e protenas (MANDELS, 1985).
2.6.2. Indstria de bebidas e sucos Na indstria de cerveja e vinhos as celulases so usadas para hidrolisar -1,4 glucanas presentes no trigo, ajudam na filtrao da cerveja e proporcionam melhora no aroma de vinhos (BEGUIN e AUBERT, 1994). As celulases promovem a hidrlise das celuloses e -glucanas associadas s paredes celulares, diminuindo a viscosidade da polpa e beneficiando a recuperao do suco, alm de converter as fibras em aucares solveis,
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Hargreaves, P. I.
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promovendo a melhora na recuperao total dos slidos do suco (TOLAN e FOODY, 1999). O tratamento com as enzimas favorece tambm a clarificao da polpa, por solubilizar pequenas partculas. Esse processo permite a extrao dos compostos flavorizantes da polpa (TOLAN e FOODY, 1999).
2.6.3. Indstria de rao animal Para melhorar a digestibilidade da rao para animais, o material lignocelulsico pode ser pr-tratado a capa protetora dos cereais pode ser hidrolisado por celulases (MANDELS, 1985). As enzimas celulsicas tambm podem ser adicionadas diretamente na forma liquida ou de pequenos gros na rao, tendo ao direta sobre a rao ou melhorando FOODY, 1999). o rendimento do crescimento animal, por estar disponibilizando mais acares do material lignocelulsico (TOLAN e
2.6.4. Indstria txtil A aplicao das celulases na indstria txtil baseia-se na remoo do excesso de corante em jeans (para dar efeito de tecido gasto, biostoning), remoo de microfibras que se prendem as malhas de algodo aps os ciclos de lavagem e restaurar a maciez e brilho (MANDELS, 1985; TOLAN e FOODY, 1999).
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2.7. Biorrefinaria A indstria qumica tem descoberto o valor das molculas contidas nos materiais lignocelulsicos e devido a sua gerao abundante na forma de resduo, o mercado tem visado o seu uso. Assim, uma rea promissora se desenvolveu, e esse conceito vem sendo chamado de Biorrefinaria (Pereira Jr., 2008). A biorrefinaria um conceito relativamente novo, se referindo ao uso de materiais renovveis (biomassas) e seus resduos, numa forma mais integrada e diversificada para produo de combustveis, produtos qumicos e energia, com a mnima gerao de dejetos e emisses poluentes (Pereira Jr., 2008). O conceito da biorrefinaria anlogo a refinaria de petrleo atual, a qual produz diversos combustveis e produtos a partir do petrleo, e onde um segmento da indstria funciona como um plo gerador de matria prima para outras. Nesse contexto, a biorrefinaria apresenta uma rota promissora para criao de uma indstria baseada em biomassas, onde os produtos, produtos secundrios e resduos da agricultura e agroindstria, sero base para diferentes processos (Pereira Jr., 2008). Apesar das biorrefinarias no serem economicamente viveis no patamar tecnolgico atual, diversas plantas pilotos esto operando e outras esto sendo construdas para buscar as respostas necessrias para a implantao dessas unidades em escala industrial de produo do bioetanol de segunda gerao. O alicerce da biorrefinaria ser o uso de material lignocelulsico, basicamente todos os resduos agroindustriais, que tem como vantagens no competir com reas agriculturveis e apresentam, baixo, ou nenhum valor comercial por se tratar de um resduo. Porm, para que o processo se torne 21
Hargreaves, P. I.
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vivel, ideal que as biorrefinarias estejam alocadas prximas as fontes de biomassa. As fontes de biomassa podem ser divididas em trs grupos: resduos florestais (madeireiras e indstrias de papel e celulose), resduos da agricultura e resduos secundrios (resduos domsticos, esterco, resduos de indstria de alimentos) (HOUGHTON et al, 2006). Segundo estimativa do IBGE, 2008, o cultivo e produo de etanol brasileiro produzir cerca de 140 milhes de toneladas de rejeito, somando a palha seca e o bagao seco. Um ponto importante para o aproveitamento dessas biomassas a liberao dos acares, mas por serem extremamente recalcitrantes atividade enzimtica, se faz necessrio um tratamento para desmembrar as fibras desse material e tornar possvel a separao das fraes que compe o material celulsico (TOLAN e FOODY, 1999). Aps a obteno destas fraes (44% de celulose, 30% hemicelulose e 26% lignina, aproximadamente), a celulose pode ser separada e hidrolisada por enzimas comerciais, ou por enzimas produzidas na prpria refinaria, liberando a glicose a ser fermentada. Mas esse processo de hidrlise para posterior fermentao (SHF, Separate Hydrolysis and Fermentation) limitado pela inibio da atividade da endoglucanase pela celobiose, devido inibio da glucosidase pelo acmulo de glicose no meio. Para contornar essa limitao enzimtica, realizada uma fermentao durante o processo de hidrlise, com sigla de SSF (simultaneous saccharification and fermentation), diminuindo a concentrao de glicose, possibilitando a atividade ininterrupta da glucosidase e por conseguinte, das outras celulases (TOLAN e FOODY, 1999; MIELENZ, 2001, TAN et al, 2008). No entanto existe uma incompatibilidade para a eficincia deste processo, a principal desvantagem do
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Hargreaves, P. I.
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processo SSF consiste-se na diferena da temperatura tima da sacarificao (50 C) e de fermentao (35C). Para contornar essa limitao tecnolgica, existe a pesquisa de celulases eficientes a temperaturas mais baixas, microrganismos com capacidade de fermentao em temperaturas mais elevadas, ou ento uma convergncia em temperatura intermediria, com combinao diferente de fermentadores e celulases. Apesar da desvantagem mencionada anteriormente, o processo possui vantagens: a converso imediata da glicose diminui a inibio das enzimas, conseqentemente o processo requer menor quantidade de celulases, alm de possuir menor risco de contaminao devido baixa concentrao de aucares disponvel e a presena do etanol, processo com menos etapas e uma maior produtividade (HARI KRISHNA et al, 2001). Enquanto o SSF trata apenas da fermentao da frao celulsica (hexoses), uma fermentao paralela deve ocorrer para converso da frao hemicelulsica (pentoses), em lcool, em reator independente e utilizando um microrganismo diferente. Visando a reduo de custos, estuda-se unir os dois processos, uma fermentao simultnea, ou co-fermentao (SSCF, Simultaneous Saccharification and Co-Fermentation), com uso combinado de microrganismos competentes a fermentao de hexoses e pentoses (HAHNHGERDAL et al, 2006). Como indica a figura 2.6, toda a idealizao da aplicao da biomassa passou por um processo evolutivo, visando diminuir o numero de etapas da cadeia produtiva. Dessa forma foi efetuado o corte gastos, com o objetivo de alcanar o processo bioqumico consolidado, realizando conjuntamente a produo de enzimas, a hidrlise da biomassa e conseqente fermentao das hexoses e pentoses em um nico reator. Em uma projeo realizada por 23
Hargreaves, P. I.
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LYND et al, 2005, os custos de produo de bioetanol por Bioprocesso Concolidado (CBP) pode chegar a menos de 25% do custo total do SSCF com o custo de produo das enzimas, mas o microrganismo para tal tarefa ainda no foi descoberto.
SSCF
Biomassa
SSF
Fermentao C6 Hidrolise Enzimtica Fermentao C5 Bioetanol Destilao
Pr-tratamento
Produo de enzimas
CBP
Figura 2.6. Representao das plataformas bioqumicas: SSF (Simultaneous Saccharification and Fermentation), SSCF (Simultaneous Saccharification and Co-Fermentation) e CBP (Consolidated Bioprocessing)
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Hargreaves, P. I.
Justificativa, Hipteses e Objetivos
Captulo 3
3. Justificativa, hiptese e objetivos 3.1. Justificativa Alm da capacidade produtiva de combustveis, tanto de fonte sacarnea, ou das biomassas, o Brasil conta com um grande potencial em explorar a diversidade natural, mais especificamente a microbiana. Uma nfima parte dessa biodiversidade conhecida e explorada, h muito a se fazer para avaliar o potencial na produo de enzimas, no s no setor de combustveis, mas em outras reas onde elas podem ser empregadas. Neste contexto, fica claro o papel das pesquisas nacionais em explorar os diferentes ecossistemas, especialmente o da floresta amaznica, encontrar solues para problemas presentes e manter o Brasil como um lder no setor em que foi pioneiro, a produo de bioetanol. Por esses motivos, o presente trabalho busca encontrar ferramentas para aplicao, tanto na bioprospeco, como nos ensaios de seleo e na produo de enzimas celulolticas, utilizando fungos da floresta amaznica sobre celulignina de bagao de cana.
3.2. Hiptese Devido grande diversidade pouco explorada em nossas florestas e matas, com uso de metodologias simples de plaqueamento, esperado isolar diferentes fungos celulolticos com potencial para produo de enzimas para hidrlise de material lignocelulsico.
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Hargreaves, P. I.
Justificativa, Hipteses e Objetivos
3.3. Objetivos 3.3.1. Geral * Avaliar o potencial produtor de celulases de fungos isolados de solo da Floresta Amaznica 3.3.2. Especficos * Avaliar a respostas de produo de alguns isolados frente a diferentes substratos. * Identificar o fungo com potencial produtor. * Otimizar a produo de celulases do fungo filamentoso com melhores respostas. * Analisar as respostas das atividades enzimticas do extrato bruto concentrado.
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Hargreaves, P. I.
Materiais e Mtodos
Captulo 4
4. Materiais e Mtodos Neste captulo esto descritos os meios de cultura utilizados e as metodologias e ensaios realizados durante o projeto.
4.1. Diagrama esquemtico das atividades
Figura 4.1. Diagrama esquemtico resumido das atividades realizadas
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Hargreaves, P. I.
Materiais e Mtodos
4.2. Local da coleta As amostras de solo foram coletadas na Floresta Nacional do Tapajs (figura 4.2), localizada nos municpios de Santarm, Aveiro e Belterra, Estado do Par, e administrada pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renovveis. Situa-se entre os paralelos de 2o 40 a 4o 10 de latitude sul e os meridianos de 54o 45' e 55o 00' de longitude oeste de Greenwich. (Cunha, Machado & Filho, 2002).
Figura 4.2. Floresta Nacional do Tapajs.
4.3. Coleta Foram coletadas cinco amostras de solo (compostas de quatro subamostras). Depois da remoo da serrapilheira (camada superficial de material vegetal em decomposio), as amostras foram retiradas de uma poro superficial de 0-10 centmetros. As amostras combinadas de cada ponto foram acondicionadas em sacos impermeveis e estocadas em temperatura de 4 oC at o processamento.
4.4. Anlise Fsico-Qumica As anlises do solo (tabela 4.1) coletado foram realizadas pela Empresa Brasileira de Pesquisas Agropecurias (Embrapa), Setor Solos.
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Hargreaves, P. I.
Materiais e Mtodos
Tabela 4.1. Propriedades fsico-qumicas das amostras de solo (HARGREAVES, 2005)

Amostra Seca Primria Textura argilosa argilosa pH 4,1 4,0 Al 1,8 2,0 Ca+Mg Ca cmol/dm3 0,7 0,6 Mg P K mg/ dm3 4,0 15,0 5,0 15,0 C % 2,04 2,23 3,52 3,85 M.O
4.5. Processamento laboratorial As amostras de solo foram combinadas formando uma amostra composta. 5 gramas dessa mistura foram adicionadas em um erlenmeyer contendo 45 mL de soluo de dissociao (0,1% pirofosfato de sdio e 0,1% tween 80), junto com 5 gramas de esferas de vidro (5mm) e mantidas sob agitao de 150 rpm por 30 minutos a temperatura ambiente, obtendo-se uma diluio inicial.
4.6. Plaqueamento e Isolamento A partir da diluio inicial, foram realizadas as diluies seriadas, obtendo o solo diludo nas concentraes 10-2, 10-3, 10-4, ento 100 L de cada diluio foram plaqueadas por espalhamento em meio slido Dubos (meio contendo apenas sais minerais essenciais) enriquecido com carboximetil celulose (CMC) (sendo este a nica fonte de carbono). Essas placas foram incubadas em estufas a temperatura de 30 C, at o aparecimento das primeiras colnias (entre 5-7 dias). As colnias de fungos filamentosos que se desenvolveram nesse processo foram plaqueadas em meio PDA, para isolamento e manuteno da cultura com repiques semanais.
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Materiais e Mtodos
4.7. Seleo por ensaio cup plate Baseado no ensaio cup plate descrito por Dingle, Reid e Salomons (1953), os isolados foram inoculados, na forma de dois pequenos discos cortados do meio PDA, em meio de cultura para induo de celulases, tendo como base o meio Dubos, acrescido de CMC como fonte de carbono. Os meios foram acondicionados em erlenmeyers contendo 50 mL de meio, incubados por 5 dias e ento filtrados. A seguir, alquotas de cada um dos frascos foram aplicadas em pequenos poos individuais previamente identificados, em meio contendo apenas Agar e CMC, sendo este ultimo o substrato susceptvel a hidrlise das enzimas produzidas. As placas ento foram incubadas a 37 C, por 24 horas. Aps a difuso do extrato enzimtico em cada um dos poos, as placas foram coradas com soluo 0,1% de vermelho congo, que se fixa ao CMC. Nas regies onde as enzimas tiveram atividade, o substrato foi hidrolisado, com uso de uma soluo descorante, o corante foi removido, revelando halos transparentes, sendo estes avaliados quanto ao dimetro e transparncia.
4.8. Composio de meios de cultura 4.8.1. Manuteno do microrganismo A manuteno foi feita por repiques peridicos em meio agar batata dextrose (PDA)(tabela 4.2). A conservao das culturas foi feita em tubos com meio GYMP inclinado (tabela 4.3), o qual aps o crescimento das culturas foi coberto com leo mineral esterilizado e conservado a 4 C.
Tabela 4.2. Composio do meio PDA
Componente Infuso de batata Dextrose gar Concentrao 200 20 15
g/L
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Tabela 4.3 Composio do meio GYMP

Componente Glicose Extrato de Malte Extrato de Levedura NaH2PO4 gar Concentrao 20 20 5 2 15
4.8.2. Meio para ensaio cup plate O meio de cultura para induo de produo de celulase foi baseado no meio de Dubos (tabela 4.4), que contm sais minerais, e apenas a CMC, como fonte de carbono indutor.
Tabela 4.4. Composio do meio Dubos
Componente NaNO3 K2HPO4 KCl MgSO4 Fe(SO4)3 Concentrao 0,5 1,0 0,5 0,5 Traos
4.8.3. Meio de produo de celulase e pr-inculo O meio base para o pr-inculo e ensaios de produo de celulase, foi o meio de Mandels (MANDELS & WEBER, 1969), utilizado em diversos trabalhos dessa rea. Sua composio est descrita na tabela 4.5, sendo que o meio de princulo contm glicose em concentrao de 10 g/L, diferente dos meios para produo de celulases, estes elaborados com CMC, celulose cristalina e celulignina, dependendo do ensaio realizado.
g/L
g/L
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Tabela 4.5. Composio do meio de Mandels

Componente Uria (NH4)2SO4 KH2PO4 CaCl2 MgSO4 Peptona Extrato de levedura Tween 80 FeSO4 MnSO4 ZnSO4 CoCl2 Concentrao 0,3 1,4 2,0 0,4 0,3 0,75 0,25 2,0 ml 10,0 3,2 2,8 4,0
4.9. Processamento do bagao da cana-de-acar O processo de deslignificao do bagao de cana-de-acar foi dividido em duas etapas, uma hidrlise cida e outra alcalina, para ento obter a celulignina deslignificada, utilizada como substrato para produo de celulases. Na primeira etapa, o bagao modo foi borrifado com uma soluo de 1,0%(v/g) de cido sulfrico, na proporo 1:1 (g/mL), o produto umidificado foi acondicionado em frascos erlenmeyers de 500mL, fechado com papel alumnio e tratado trmicamente em autoclave por uma hora a 121 C. Todo esse material foi prensado para remoo da frao hemicelulsica, obtendo-se assim a celulignina (BETANCUR, 2005). Para a remoo da lignina foi realizada a hidrlise alcalina, na proporo 1:4 (g/mL). A celulignina foi misturada com uma soluo de 4%(g/mL) de hidrxido de sdio e a seguir a mistura foi acondicionada em erlenmeyers para ser tratada em autoclave por 30 minutos a 121 C. Aps esse processo, todo o material foi prensado novamente. Para ajuste do pH do material, a celulignina foi colocada de molho em cido clordrico, at alcanar pH entre 5-6. Atingindo essa marca, a celulignina foi lavada com gua diversas vezes e depois levada para estufa a 60 C (VASQUEZ, 2007).
mg/L
g/L
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4.10. Atividade Enzimtica Para as quantificaes enzimticas, as atividades foram expressas em unidades internacionais por mililitro de extrato enzimtico (UI/mL). UI = n mols de produto liberado / min, nas condies especificadas para cada atividade. 4.10.1. Atividade FPsica (Ghose, 1987) Em um tudo de ensaio com capacidade mnima de 25 mL, inseriu-se uma tira enrolada de papel de filtro Whatman n 1 de 1x6 cm, 1 mL de tampo citrato de sdio 0,5 M, pH 5,0 e 0,5 mL do extrato enzimtico, diludo em tampo de acordo com a necessidade (a concentrao de enzima pode gerar resultados acima do limite da metodologia). Em seguida o tubo foi incubado por uma hora a 50 C. Depois do tempo reacional, adicionou-se 3 mL de reagente DNS. Ento o tubo foi levado a banho fervente por 5 minutos. Acrescentando 20 mL de gua destilada e ento homogeneizado, a leitura da intensidade foi realizada em espectrofotmetro a 540 nm. O branco reacional acompanha todo o processo, sendo acrescentando o extrato enzimtico juntamente com o DNS na etapa de banho fervente. A curva padro foi elaborada adicionando-se nos tubos 0,5 mL de solues de glicose com concentraes na faixa de 1,0 a 10 mM, 1 mL de gua destilada e 3 mL de reagente DNS. Os tubos foram incubados a 100 C por 5 minutos, como no ensaio. A partir dessa curva obteve-se a equao que relaciona valores de absorvncia aos de atividade. Y = 1,133x - 0,040 (R = 0,997 )
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Materiais e Mtodos
4.10.2. Atividade CMCsica (adaptada de GHOSE, 1987) Em microtubos de 2 mL, adicionaram-se 50 L de extrato enzimtico diludo em tampo citrato de sdio 05,M, pH 5,0, e 50 L de soluo de CMC (2%). Incubou-se por 30 min a 50 C, e ento adicionou-se 300 L de DNS para ento levar a banho fervente por 5 min. Ao fim desta etapa, acrescentouse 1,5 mL de gua e em seguida foi homogeneizado para leitura. A intensidade da cor foi quantificada em espectrofotmetro a 540 nm. O branco reacional foi obtido nas mesmas condies do tubo de atividade, no entanto, o extrato enzimtico foi adicionado juntamente com o DNS antes de serem levados para o banho fervente. A curva padro foi obtida ao incubar 100 L de soluo de glicose com concentraes na faixa de 0,1 a 1 nm e 300 L de reagente DNS, a 100 C, por 5 min. A partir dessa curva, foi calculada a equao que relaciona valores de absorvncia aos de atividade. Y = 0,81588x - 0,03282 (R = 0,99885)
4.10.3. Atividade -glucosidsica (adaptado de Ghose, 1987) Em microtubos de 2 mL, adicionaram-se 50 L de extrato enzimtico diludo em tampo citrato de sdio 0,5 M pH 5,0, e 50 L de soluo de celobiose. Incubou-se por 30 min a 50 C, para logo ento coloc-los em banho fervente por 10 min para inativao das enzimas. Em seguida, adcionou-se 1 mL do reativo enzimtico para dosagem de glicose (glicose oxidase), seguido de incubao por 15 min a 37 C. Para realizar a leitura a 505 nm, foi adicionado 1 mL de gua ao tubo. O branco reacional foi obtido quando o extrato enzimtico foi adicionado momentos antes da etapa de banho fervente.
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Materiais e Mtodos
A curva padro foi construda incubando-se 100 L de solues de glicose, com concentraes na faixa de 0,1 a 1 mg, e 1 mL de reativo por 15 min a 37 C. Obtendo-se assim a curva que relaciona valores de absorvncia aos de atividade. Y = 0,175x (R2 = 0,996)
4.11. Quantificao de protena (Bradford, 1976) Em microtubos de 2 mL, incubou-se 800 L de amostra previamente diluda, com 200 L do reagente Bio-RAD, baseado no corante coomassie azul brilhante G-250, a temperatura ambiente, por 5 min. A intensidade colorimtrica foi quantificada em espectrofotmetro a 595 nm aps adicionar 1 mL de gua ao tubo. O branco reacional foi obtido nas mesmas condies da amostra, apenas substituindo os 800 L de amostra, por gua. A curva padro foi construda utilizando-se uma soluo de albumina bovina srica (BSA) com concentraes na faixa de 5 a 50 mg/L. Teor protico = 0,033066x -0,025989 (R2 = 0,988)
4.12. Ensaio em frascos agitados Para avaliao inicial das respostas dos isolados frente a diferentes substratos, assim como os ensaios de planejamento experimental, foram realizados experimentos em frascos agitados. Foram usados frascos erlemeyers de 250mL, com 100 mL de meio de cultura, nas condies de fermentao iniciais de temperatura a 30 C e rotao de 150 rpm.
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Materiais e Mtodos
4.12.1. Seleo do isolado e substrato Para avaliao do potencial de produo de celulases, os isolados foram submetidos a ensaios de fermentao submersa avaliando suas respostas frente a trs substratos celulsicos: celulose cristalina (avicel), CMC e celulignina. Nesse estudo foi utilizado o meio Mandels, modificando apenas o substrato empregado, mantendo a concentrao de 10 g/L. Os isolados foram crescidos em meio PDA. Os esporos foram suspendidos do meio com auxilio de soluo salina estril e uma ala, a suspenso foi quantificada em cmara de Neubauer quanto ao nmero de esporos. Cerca de 107 esporos foram inoculados em 200 mL de meio e incubados a 150 rpm a 30 C, por 5 dias, processo realizado em duplicata. Ao final desse perodo de incubao, foram avaliadas as atividades FPsicas, CMCsica e -glucosidsica.
4.12.2. Otimizao da produo de enzimas (planejamento fatorial) Para otimizao da produo enzimtica, tendo j estabelecido o isolado para estudo, foram realizados dois planejamentos, sendo um fatorial completo com quatro fatores, dois nveis e quatro pontos centrais (tabela 4.6) e o segundo um planejamento central composto (tabela 4.7). As variveis estudadas no planejamento fatorial foram: temperatura, pH, concentrao de substrato (g/L) e concentrao de pr-inculo (% v/v) e para o planejamento central composto apenas a concentrao de substrato e pr-inculo. O tempo de crescimento do pr-inculo foi de 48 horas e o de fermentao de 72 horas, tendo como respostas avaliadas as atividades enzimticas e o teor protico.
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Materiais e Mtodos
Devido necessidade de manuteno do pH no meio de fermentao, as reaes foram realizadas em condies tamponadas por tampo citrato (GOROMI, 1955).
Tabela 4.6. Variveis e nveis utilizados no planejamento fatorial completo

Fatores Temperatura (C) pH Substrato (g/L) Pr-inculo (% v/v) Nvel inferior 25 4 5,0 1,0 Nvel superior 35 6 15,0 10,0
Tabela 4.7. Variveis e nveis utilizados no planejamento central composto

Fatores Substrato (g/L) Pr-inculo (%v/v) Nvel axial 0,34 0,34 Nvel inferior 2,0 2,0 Nvel superior 10,0 10,0 Nvel axial + 11,66 11,66
Aps analise dos resultados obtidos deste conjunto de ensaios, foram ajustadas as condies de produo em biorreator agitado mecanicamente (STR).
4.13. Produo de enzimas em Biorreator STR instrumentado Utilizando o meio de Mandels nas condies estabelecidas por planejamento experimental, foi realizada a fermentao em biorreator (operado por Biostat. B, fabricado pela B. Braun Biotech International)(figura 4.3), em vaso reacional de 5 L, contendo 2 L de meio de fermentao.
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Materiais e Mtodos
Figura 4.3. Biorreator utilizado para fermentao
O processo foi monitorado e controlado para manuteno do pH em 6,0 e a temperatura a 35 C, com rotao de 150 rpm e aerao de 0,5 vvm. Foram retirados pontos logo aps o inculo do meio de fermentao e a cada 24 horas subseqentes, para avaliao das atividades enzimticas e teor protico.
4.14. Concentrao e avaliao do produto Para avaliar o potencial do extrato enzimtico em hidrlise de material lignocelulsico, o produto da fermentao em biorreator foi concentrado utilizando-se um rotavapor. Para a concentrao do extrato, o material foi filtrado com filtro de fibra de vidro e ento cada alquota de 250 mL foi concentrada a temperatura de 45 C, com bomba de vcuo exercendo presso negativa de 760 mm de mercrio, at alcanar a concentrao desejada (cerca de 1,5 hora). Foram realizadas avaliaes das atividades e teor protico de uma concentrao parcial e final do extrato enzimtico.
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Materiais e Mtodos
4.15. Caracterizao do isolado Aps seleo, o isolado com melhor potencial para produo de celulases foi submetido a anlise morfolgica e trecho de seu DNA cromossomal seqenciado.
4.15.1. Morfologia Para a anlise comparada das estruturas celulares do fungo, foram feitas culturas em lminas, que se constitu no cultivo do fungo sobre o meio fub de milho (tabela 4.8), tendo como suporte uma lmina, que favoreceu o crescimento de miclio e esporulao.
Tabela 4.8. Composio do meio fub de milho
Componente Infuso de fub de milho gar Concentrao 15 15
O fungo foi cultivado em uma lmina, onde foram realizadas pequenas estrias sobre a fina camada de meio agarizado para inoculao e, logo em seguida, foi posicionada uma lamnula na superfcie da mesma. A cultura foi observada em microscpio no momento em que foi possvel a visualizao do crescimento. As vantagens desta metodologia so: o meio fub de milho favorece tanto a formao de hifas, quanto a de esporos, e alm de manter a estrutura miceliar integra, possvel observar as caractersticas morfolgicas do fungo, sem nenhuma alterao.
4.15.2. Extrao de DNA e seqenciamento Para o procedimento de extrao de DNA (modificado de VILGALYS & HESTER, 1990; VALENTE 1996), o fungo foi crescido em meio PDA, com o objetivo de obter massa celular. Aps cerca de cinco dias, a placa foi 39
g/L
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Materiais e Mtodos
raspada com auxilio de uma ala e soluo salina, a suspenso foi coletada e acondicionada em microtubos resistentes a choque trmico e fsico. O tubo foi submetido forte variao de temperatura, entrando em contato com nitrognio lquido e banho-maria a 65 C, aps cada congelamento (cerca de 2-3 segundos) (num total de dois) o material foi macerado com auxilio de um pilo para liberao do material intracelular. Aps adicionar o tampo de extrao, esse material foi incubado por uma hora em banho-maria a 65 C. A seguir foi adicionada uma mistura de fenol/clorofrmio/lcool iso-amlico, na proporo 25:24:1 e centrifugados a 14.000 rpm por 15 minutos, para ento remover a parte aquosa, evitando misturar as fases (essa etapa pode ser repetida para melhor pureza na extrao). Dando continuidade, a mistura foi transferida para um novo microtubo, ao qual adicionou-se 500 L de lcool iso-proplico, centrifugando a 14.000 rpm por 30 min. Foi removido cuidadosamente todo o lcool, para a adio da soluo 70% de etanol gelado (-4 C), centrifugando novamente a 14.000 rpm por 10 minutos. Nessa etapa final de extrao, se remove completamente todo vestgio de etanol, inicialmente com pipeta, para depois secar o excesso aquecendo o tubo a 80 C por 2 minutos, para ento ressuspender o DNA com gua deionizada (25, ou 50 L). Aps obter o DNA, esse material foi amplificado com iniciadores ITS1f (5 CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA 3) (figura 4.4), 3) em e ITS4 (5 TCCTCCGCTTATTGATATGC termociclador
GeneAMP PCR system 9700, fabricado pela Applied Biosystems, utilizando a programao : 5 min de desnaturao inicial a 95 C, prosseguido por 25 ciclos de, 95 C por 30s, 55 C por 30s, 72 C por 60s, finalizando com a fase de extenso final de 72 C por 10 min.
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Materiais e Mtodos
Figura 4.4. Mapa da regio ITS
O material obtido foi submetido reao de seqenciamento, utilizando o kit BigDye da Applied BioSystems e ento analisado pelo seqenciador ABI PRISM 3100, tambm do mesmo fabricante. As seqncia obtidas foram analisadas no software Bioedit, verso7.0.9, oferecido gratuitamente por Ibis BioSciences (www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/BioEdit.html). Nesta anlise foi construda a seqncia que foi comparada com o banco de dados do NCBI, atravs do software integrado pgina (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).
4.16. Caracterizao das enzimas Para a avaliao do potencial de cada um dos substratos foram confeccionados gis SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis), possibilitando a visualizao do perfil de produo de protenas, influenciado por cada um dos substratos.
4.16.1. SDS-PAGE Esta metodologia (LAEMML, 1970) permite observar protenas totais encontradas no extrato bruto do meio fermentado. Para avaliao do perfil de protenas totais, o extrato bruto dos ensaios de seleo de substrato foi centrifugado e o sobrenadante coletado. Uma alquota do sobrenadante foi fervida juntamente com agente desnaturante, ento aplicado no gel (tabela 4;8). A corrida foi realizada a 100 V, por cerca de
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Materiais e Mtodos
2,5 horas, e ento realizada a colorao por nitrato de prata segundo WRAY et al. (1981), para revelar as bandas. A segunda parte da metodologia consistiu em lavar o gel recm corrido em uma soluo de metanol 50%, acido actico 12% e 50 l de formamida, por no mnimo, um perodo de uma hora. Aps lavagem, o gel foi imerso em soluo de tratamento por quinze minutos. Essa soluo consiste de 4 mL de nitrato de prata 2% (g/mL), adicionado a 21 mL de hidrxido de sdio 0,36% (g/mL) e 1,4mL de 14,8M hidrxido de amnio. A adio da soluo de Nitrato de prata foi realizada sempre com agitao e gota a gota. Seguindo o tratamento, lavou-se o gel em gua por 5 minutos. Aps lavagem, o gel foi colocado em soluo reveladora (2,5 mL de cido Ctrico 1%(g/mL) e 0,25 mL de Formaldedo 37%(v/v)) completada com gua at um volume de 500 mL. As bandas usualmente apareceram at 10 minutos aps o gel ser colocado na soluo reveladora. O processo de revelao foi interrompido em soluo de metanol 50%.
Tabela 4.9. Composio do Gel SDS-PAGE
Gel empacotamento Bis-acrilamida Tris HCl pH 8,8 1,5M APS SDS 10% TEMED gua destilada 0,83 mL 1,25 mL 80 L 50 L 10 L 2,82 mL Gel de separao 10% Bis-acrilamida Tris HCl pH 8,8 1,5M APS SDS 10% TEMED gua destilada 4,0 mL 3,0 mL 120 L 120 L 15 L 3,26 mL
4.16.2. Gel de atividade enzimtica O perfil de produo das celulases da estirpe selecionada foi estudado atravs da utilizao do extrato enzimtico bruto obtido da produo com diferentes substratos.
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Materiais e Mtodos
Para a eletroforese em SDSPAGE, foi preparado um gel de poliacrilamida (10% para o gel de separao e 3% para o gel de empacotamento) (tabela 4.9), contendo 2% de CMC. A corrida foi processada a 100 V, durante 3 horas a 4 C. Ao fim da corrida, o gel foi revelado para a deteco da atividade de CMCase. A revelao realizada por meio da incubao do gel a 50C em tampo citrato de sdio 50mM pH 4.0, durante 30 minutos. Aps a incubao, o gel foi corado em soluo 0,1% de Vermelho Congo durante 10 minutos, e o excesso de corante foi removido por lavagens sucessivas em NaCl 1M (Csar & Mirsa, 1996). As bandas foram visualizadas em transluminador.
Tabela 4.10. Composio do gel de atividade
Gel de empacotamento gua Bis-acrilamida 30% Tampo Tris HCl (pH 6,8) SDS 10% APS 10% TEMED 1,7 mL 0,5 mL 0,75 mL 30 L 30 L 3 L Gel de separao (10%) gua Bis-acrilamida 30% Tampo Tris HCl (pH 8,8) CMC 0.2 % SDS 10% APS 10% TEMED 2,3 mL 3 mL 2,25 mL 1,25 mL 125 L 125 L 12,5 L
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Resultados e Discusso
Captulo 5
5. Resultados e Discusso 5.1. Ensaio cup plate Os 15 fungos, inicialmente selecionados do isolamento em meio CMC, foram avaliados quanto produo de celulase nesse ensaio de difuso enzimtica. A tabela 5.1 indica o raio do halo de degradao e o grau de transparncia produzida avaliada por inspeo visual. Na figura 5.1 mostrada a visualizao do ensaio cup plate.
Tabela 5.1. Ensaio cup plate, dimetro e transparncia dos halos
Isolado S51 P52 S33 P43 S42 S44 S43 S47 P35 P44 P51 P54 P32 P33 P53 Dimetro do halo (cm) 1,4 1,6 1,6 1,5 1,4 1,5 1,5 1,6 1,1 1,2 1,0 1,0 1,0 1,2 1,0 Transparncia do halo ** *** * ** * * * * ** ** ** ** ** ** *
* transparncia baixa; ** transparncia media; *** transparncia alta
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S42
P43 S33
S44
S51 P52
S43 S47
Figura 5.1. Visualizao do ensaio cup plate
Com base resultados da tabela 5.1, mas tambm evitando avaliar isolados com caractersticas morfolgicas semelhantes, j que alguns desses fungos apresentaram tambm atividades semelhantes, poderiam se tratar da mesma espcie, alguns fungos que no apresentaram os melhores resultados foram escolhidos. Os isolados selecionados foram: P33, P44, P52, S33 e S47. Comparado com isolados do semi-rido baiano apresentados no trabalho de SENA, (2006), os resultados expostos na tabela 5.1 possuem maior dimetro. No entanto estes resultados no so conclusivos, j que a quantidade de extrato adicionada em cada poo pode variar, assim como a espessura do meio em cada placa.
5.2. Seleo do isolado e substrato Aps avaliao inicial e escolha de cinco isolados, foram realizados ensaios em frascos agitados, para tambm selecionar um substrato que fosse capaz de induzir a produo de celulases.
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Para investigao do substrato com melhor induo a produo de celulases, foram avaliados: carboximetilcelulose, celulose cristalina e celulignina de bagao de cana, observando tambm a resposta de cada um dos isolados frente a esses compostos celulsicos. Os grficos das figuras 5.2, 5.3 e 5.4 indicam as atividades enzimticas (FPsica, CMCsica e -glucosidsica) de cada um dos isolados fngicos frente a cada um dos substratos. Aps 5 dias de fermentao, observa-se que o isolado S47, respondeu bem a todos os substratos, e em especial celulignina (figuras 5.2 e 5.4) para as atividades FPsica e -glucosidsica, respectivamente.
Atividade FPsica
0,35 0,3 0,25 U/mL 0,2 0,15 0,1 0,05 0 S33 S47 P33 isolados P44 P52 cmc celulignina avicel
Figura 5.2. Atividade FPsica dos diferentes isolados frente aos substratos
Observa-se na figura 5.3, a resposta diferenciada do isolado S47 em relao a endoglucanase , com o substrato CMC , onde este foi colocado em evidencia diante dos outros substratos.
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Atividade CMCsica
0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 S33 S47 P33 isolados P44 P52 cmc celulignina avicel
Figura 5.3. Atividade CMCsica dos diferentes isolados frente aos substratos
Atividade -glucosidsica
1,2 1 U/mL 0,8 0,6 0,4 0,2 0 S33 S47 P33 isolados P44 P52 cmc celulignina avicel
Figura 5.4. Atividade -glicosidsica dos diferentes isolados frente aos substratos
Devido s melhores repostas, principalmente frente celulignina, o isolado S47 foi selecionado para avaliao aprofundada, assim como o substrato, devido ao baixo valor agregado e tambm por estar inserido na cadeira produtiva das biorrefinarias. Para reavaliao da atividade FPsica, que indica uma atividade celulsica total do extrato bruto centrifugado, os ensaios foram repetidos somente com o isolado S47, acrescentando a glicose como novo substrato para avaliao, uma vez que a mesma constitui num controle negativo de produo de enzimas celulolticas (figura 5.5). 47
U/mL
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Atividade FPsica
0,25 0,2 UI/mL 0,15 0,1 0,05 0 Celulignina Celulose Cristalina CMC Glicose
Figura 5.5. Atividade FPsica do isolado S47 frente a diferentes substratos
Como indica a figura 5.5, a atividade celulsica total decresceu juntamente com a complexidade do substrato. Fato semelhante tambm ocorreu na avaliao de fontes de carboidratos para produo de celulases por Phlebia gigantea, conduzida por Niranjane (2007) e colaboradores, sendo que os pesquisadores no avaliaram o uso de material lignocelulsico. Outro fato semelhante foi a concentrao final do teor protico (figura 5.6), atingindo maiores valores com substratos de menor complexidade (glicose e CMC), o que justificvel, j que a glicose prontamente metabolizada e o CMC, por causa da sua estrutura amorfa, hidrolisado mais facilmente, liberando taxas maiores de celobiose e, em seqncia de glicose.
Teor Protico
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Celulignina Celulose Cristalina CMC Glicose
Figura 5.6. Teor protico do extrato bruto centrifugado dos produtos de fermentao do isolado S47
mg/L
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5.3. Caracterizao do isolado Aps os ensaios iniciais de avaliao dos isolados, o fungo codificado como S47 foi escolhido para estudo mais aprofundado de produtividade. Alm dessas determinaes, com o objetivo de melhor comparao e avaliao do desempenho com estirpes da literatura, o isolado foi encaminhado para um estudo taxonmico, tanto pela vertente da micologia clssica, quanto da biologia molecular. Obtendo a seqncia ITS de 536 pares de bases (figura 5.7) e a enviando para anlise no banco de dados, foram retornadas diferentes estirpes do gnero Coniochaeta com possibilidade de ser a identificao do isolado S47. Tendo como base essa informao, alm da comparao morfolgica da estrutura do fungo (figura 5.8) com as encontradas na literatura (Garcia, 2006), deduz-se que o isolado est bastante relacionado estirpe Coniochaeta lignaria. Contudo, devido ao baixo ndice de similaridade da seqncia ITS (cerca de 96%) (figura 5.9), o isolado pode se tratar de uma espcie ainda no descrita na literatura.
>>S47 ATCATTATTACAAGCCGAAAGGCTACTTAAAACCATCGCGAACTCGTCCAAGTTGCTTCGGCGGCGCGGCCTCCCTGACGGGGGC GCCGCAGCCCCGCCTCTCCGGAGGCTTGGGGCGCCCGCCGGAGGTACGAAACTCTGTATTATAGTGGCATCTCTGAGTAAAAAAC AAATAAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGC AGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCTAGTACTCTAGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAAC CCTCAAGCCCTGCTTGGTGTTGGGGCCCTACGGCTGCCGTAGGCCCTGAAAGGAAGTGGCGGGCTCGCTACAACTCCGAGCGTA GTAATTCATTATCTCGCTAGGGACGTTGCGGCGCGCTCCTGCCGTTAAAGACCATCTTTAACTCAAGGTTGACCTCGGATCAGGTA GGGAATACCCGCTGAACTTAAGCT
Figura 5.7. Seqencia ITS obtida do isolado S47
Figura 5.8. Microfotografia do isolado S47 crescido em cultura em lmina (A) e desenho esquemtico (B) de Coniochaeta lignaria (Garcia 2006)
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Figura 5.9. . Dendograma relacionando a seqencia do isolado com banco de dados do NCBI Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
5.4. Caracterizao do extrato enzimtico Corroborando com os ensaios de produo de enzimas em frascos, os substratos ubstratos mais complexos induziram com om maior eficincia a produo de celulases, neste caso indicado pela figura (5.10A), (5.10 ), a ao das endo-glucanases endo e a represso total da produo dessas enzimas pela glicose. Como indicao extra da produo de enzimas mais complexas e de maior massa molecular, molecu o gel de protenas totais (5.10B), (5.10 ), demonstra forte capacidade de induo pela celulignina e pela celulose cristalina. A total ausncia de bandas indicativas para a glicose, juntamente com o elevado teor protico favorecido por esse e substrato (figura 5.10B), .10B), ), indica o baixo peso molecular das protenas, (as molculas no ficaram retidas pela malha do gel) produzidas em meio contendo glicose como nica fonte de carbono.
CL
CC
CMC
GLI
CL
CC CMC GLI
97 kDa 66 kDa 45 kDa
30 kDa
20 kDa
CL: celulignina; CC: celulose cristalina; CMC: carboximetil-celulose; carboximetil Gli: glicose; icose; P: padro de massa molar (Amersham)
Figura 5.10. . Gel de atividades celulolticas (A) e de protenas (B) do extrato enzimtico bruto, de meios contendo diferentes fontes de carbono, produzido pelo isolado selecionado S47
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5.5. Otimizao da produo de celulases Com o propsito de aumentar o rendimento de produo de celulases, foram realizados experimentos baseados no planejamento experimental. Os resultados apresentados na tabela 5.2 foram obtidos por planejamento experimental fatorial completo, adequado para avaliar a influencia de cada um dos fatores sobre a produo de celulase. Para este experimento, as atividades enzimticas e teor protico foram determinados aps 96 horas de fermentao.
Tabela 5.2. Atividade enzimtica e teor protico para o planejamento experimental fatorial completo
Exp. Temperatura pH 1 25.00 4.00 2 35.00 4.00 3 25.00 6.00 4 35.00 6.00 5 25.00 4.00 6 35.00 4.00 7 25.00 6.00 8 35.00 6.00 9 25.00 4.00 10 35.00 4.00 11 (c) 30.00 5.00 12 25.00 6.00 13 35.00 6.00 14 25.00 4.00 15 35.00 4.00 16 25.00 6.00 17 35.00 6.00 18 (c) 30.00 5.00 19 (c) 30.00 5.00 20 (c) 30.00 5.00 (c)pontos centrais, 123 respostas ignoradas Inculo (%) 1.00 1.00 1.00 1.00 10.00 10.00 10.00 10.00 1.00 1.00 5.50 1.00 1.00 10.00 10.00 10.00 10.00 5.50 5.50 5.50 Substrato g/L 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 15.00 15.00 10.00 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 10.00 10.00 10.00 Atividade FPsica 0.0345003 0.0608828 0.121258 0.0974125 0.072552 0.155251 0.0806697 0.150178 0.0329782 0.0598681 0.0365297 0.0644343 0.0273973 0.0502283 0.0771182 0.0908168 0.122273 0.0999493 0.133942 0.0994419 Atividade CMCsica 0.518863 0.52683 0.300694 0.827119 0.827119 0.954589 0.341754 0.950299 0.512735 0.394458 0.514573 0.0512698 0.163419 0.449613 0.350333 0.890241 0.612014 0.52254 0.6981 0.750515 Atividade -glucosidsica 0.0910053 0.0772487 0.141799 0.157672 0.116402 0.0904762 0.0306878 0.155026 0.068254 0.156614 0.021164 -0.010582 0.168254 0.0730159 0.0867725 0.224339 0.198942 0.160317 0.168254 0.132275 Teor protico 45.9653 62.75 71.5203 102.216 70.9154 97.0752 75.7542 89.2122 68.3448 78.0224 75.3006 50.8041 45.9653 83.1637 90.7243 97.9825 159.526 97.5289 92.2364 95.324
Neste trabalho, os experimentos de planejamento experimental, foram analisados objetivando a maior atividade celulsica total, ou seja, priorizando o aumento da atividade FPsica. Sendo assim, os experimentos 6, 8, e 17, obtiveram as maiores respostas, em temperatura de 35 C e inculo a 10% v/v (tabela 5.2). A influncia positiva do pH e temperatura so indicadas nos modelos grficos em terceira dimenso (figuras 5.11, 5.12, 5.13), com excesso para -glucosidse, cuja temperatura favorvel est mais prxima dos 25 C.
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Figura 5.11. Superfcie de resposta da atividade fpsica do planejamento experimental fatorial
Figura 5.12. Superfcie de resposta da atividade cmcsica do planejamento experimental fatorial
Figura 5.13. Superfcie de resposta da atividade -glucosidsica do planejamento experimental fatorial
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Hargreaves, P. I.
Figura 5.14. Superfcie de resposta do teor protico do planejamento experimental fatorial
Avaliando as respostas dos grficos e constatado a influencia positiva do aumento do pH at 6,0 e a temperatura em 35 C, porem constatando uma impreciso para definio da influencia do substrato, decidiu-se a fixao destes pontos fsico-qumicos, para melhor avaliao da influencia da celulignina na produo de celulases. Podemos observar que a faixa de pH indicada como tima por esse experimento diferente do pH obtido para solo (tabela 4.1), o que pode indicar diferenas de valores de pH tanto para a produo como para a atividade das enzimas produzidas. Foi constatado tambm que em todas as reaes o pH inicial foi mantido equilibrado pelo tampo citrato at o final do processo. Fixando-se os fatores pH e temperatura em 6,0 e 35 C respectivamente, foi elaborado um segundo planejamento experimental, sendo esse um central composto (tabela 5.3).
Tabela 5.3. Variveis e nveis utilizados no planejamento central composto
Fatores Substrato (g/L) Pr-inculo (%v/v) Nvel axial 0,34 0,34 Nvel inferior 2,0 2,0 Nvel superior 10,0 10,0 Nvel axial + 11,66 11,66
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Seguindo a proposta do planejamento central composto, com a concentrao de substrato e o volume de inculo como variveis, foram obtidas as respostas indicadas na tabela 5.4, bem como as superfcies de resposta das atividades FPsica, CMCsica e -glucosidsica nos grficos das figuras 5.15, 5.16, 5.17.
Tabela 5.4. Atividade enzimtica e teor protico para o planejamento experimental central composto
Exp. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 (c) 10 (c) 11 (c) Inculo (%v/v) 2.00 10.00 2.00 10.00 0.34 11.66 6.00 6.00 6.00 6.00 6.00 Substrato (g/L) 2.00 2.00 10.00 10.00 6.00 6.00 0.34 11.66 6.00 6.00 6.00 Atividade FPsica 0.10429 0.216331 0.157844 0.286797 0.117679 0.341056 0.0394611 0.102881 0.212808 0.176166 ignorado Atividade CMCsica 0.807649 1.82337 0.635147 2.00154 0.152823 1.94026 1.31267 1.15606 1.78478 1.80067 1.49879 Atividade -glucosidsica 0.0365079 0.174603 0.0904762 0.606349 0.0380952 0.544444 0.139683 0.193651 0.307937 0.314286 0.363492 Teor protico (mg/L) 37.9511 79.5346 36.7414 97.9825 83.7685 95.7143 48.3847 46.1166 70.3106 69.7057 59.7257
Figura 5.15. Superfcie de resposta da atividade FPsica do planejamento experimental central composto
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Hargreaves, P. I.
Figura 5.16. Superfcie de resposta da atividade CMCsica do planejamento experimental central composto
Figura 5.17. Superfcie de resposta da atividade -glucosidsica do planejamento experimental central composto
Figura 5.18. Superfcie de resposta do teor protico do planejamento experimental central composto
Ao final da avaliao dos grficos de respostas, observou-se a influncia positiva do volume de inculo na sua maior concentrao, sobre as atividades enzimticas, assim como no teor protico final. Entretanto no que concerne a atividade CMCsica e ao teor protico, a influncia do substrato foi 55
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desprezvel, uma vez que o resultado mostrou-se favorvel ao longo de todas as concentraes empregadas. Foi estipulado o volume de inculo em 10% para observao do comportamento do isolado em biorreator por um perodo maior de fermentao e avaliao da cintica de produo de enzimas. Em relao ao substrato, mantendo a prioridade de maximizar a atividade FPsica, foi sinalizada a concentrao prxima do timo, indicada pela figura 5.15, onde o ponto mais alto da curva , como tambm apresentado na figura 5.18, referente ao teor protico, foi a concentrao de 7,5 g/L de celulignina. Ao final dos ensaios de otimizao, foram estipuladas as condies de produo em biorreator: meio tamponado em pH 6,0, temperatura regulada em 35 C, concentrao de celulignina 7,5 g/L e inculo a ser acrescentado ao meio de 10 % do volume reacional.
5.6. Ensaio em biorreator instrumentado Utilizando as condies otimizadas em frascos agitados, foi realizada uma fermentao em biorreator agitado mecanicamente (figura 5.19), com a velocidade de agitao em 150 rpm e aerao 0,5 vvm. Como observado anteriormente nos ensaios de otimizao em frascos, o meio tamponado foi capaz de estabilizar o pH durante todo o processo, sendo assim possvel o desligamento do controle automtico da dosagem de cido e base do sistema.
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1,8 1,6 1,4 Atividade UI/mL 1,2 1
200 180 160 mg protena / L 140 120 100
0,8 80 0,6 0,4 0,2 0 0 24 48 72 96 120 60 40 20 0
Horas de incubao Fpsica CMCsica -glucosidsica Teor protico
Figura 5.19. Cintica da produo de celulases em biorreator STR utilizando como substrato celulignina de bagao de cana pelo isolado S47
Avaliando a cintica das atividades da figura 5.19, nota-se o sinergismo das diferentes enzimas, assim como a maior taxa de produo de enzimas endoglucansicas, representadas pela atividade CMCsica. As endoglucanases foram produzidas primariamente para liberar as celobioses, para que estas molculas, por sua vez, estimulassem a produo das -glicosidases, indicada pela atividade -glucosidsica. A curva do teor protica apresenta o pico inicial elevado, j que o inculo inicial rico em protenas como foi observado no ensaio com os resultados da figura 5.6, que foi preparado com glicose como substrato de cultivo. Essa curva logo se declina, j que as protenas produzidas neste meio no so utilizadas e logo degradadas e possivelmente metabolizadas pelo fungo, para ento aps as 48 horas de fermentao, foi observada o aumento do teor protico, indicando possivelmente as enzimas celulolticas.
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Na tabela 5.5 esto apresentadas a atividade enzimtica e o teor protico mximo, atingidos na fermentao em biorreator.
Tabela 5.5. Atividade enzimtica e teor protico mximos, atingidos no decorrer da fermentao em biorreator
Atividades enzimticas (UI/mL) FPsica mxima 0,48410 CMCsica mxima 1,51761 -glucosidsica mxima 0,56613 Teor de Protena (mg/L) 150,75
Com base nos resultados finais de fermentao em biorreator, concluise que os ensaios para otimizao favoreceram o aumento da atividade FPsica, priorizada neste estudo. No entanto, a produo enzimtica em biorreator tambm colaborou com a melhora na produo da -glucosidase e no aumento do teor protico. Para esses resultados, a melhor homogeneizao do meio e a aerao mais eficiente tambm colaboraram para esse avano. Comparando os resultados de atividade FPsica obtidos com trabalhos da literatura que tambm utilizaram materiais lignocelulsicos, a atividade atual encontra-se abaixo dos melhores resultados, principalmente em relao ao Trichoderma reesei, fungo modelo de estudo, que obteve 1,55 UI/mL, utilizando salgueiro pr-tratado com vapor (SZENGYEL e ZACCHI, 2000) e 1,72 UI/mL com uso de esterco bovino (WEN et al, 2005). Apesar de no ter sido priorizado a otimizao da atividade CMcsica obteve-se uma melhora do resultado, comparado com a atividade do fungo relacionado, Coniochata ligniaria, que foi empregado na avaliao de enzimas degradadoras de materiais celulsicos. O isolado S47 obteve pico de atividade em 3 dias (1,51 UI/mL), contra os 10 do trabalho de Lopez et al., (2007), atingindo 0,34 UI/mL, utilizando celulose cristalina como substrato em fermentao submersa em frasco.
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O trabalho de Lopez (2007) indicou o uso de fungos degradadores para tratamento de biomassa, considerando que muitos desses microrganismos eram colonizadores de matria vegetal em decomposio, e que alm da capacidade de produo de celulases, produziam tambm enzimas lignolticas (lacase, lignina peroxidase). Os referidos fungos, alm de tolerantes a presena de inibidores como: compostos fenlicos, furanos, furfural e hidroximetil furfural, so capazes de degrad-los, podendo ser empregados no processo de detoxificao. Devido a essas caractersticas, esses fungos poderiam ser utilizados no pr-tratamento de compostos lignocelulsicos para uso dos hidrolisados para produo de bioetanol. Esse processo com Coniochaeta lignaria, possui patente nos Estados Unidos, sob cdigo 7067303 (NICHOLS, 2006).
5.7. Concentrao do extrato enzimtico Com o uso do rotavapor foi possvel concentrar o extrato em cerca de 20 vezes e, monitorando a temperatura do banho-maria, foi obtido um produto em que as enzimas no foram drasticamente afetadas durante o processo, assim como indicado pelo grfico do processo de concentrao (figura 5.20). As taxas de concentrao protica foram acompanhadas com alguma perda pelas atividades enzimticas (valores indicados na tabela 5.6).
Tabela 5.6. Valores das atividades enzimticas e teor protico do extrato bruto e das subseqentes concentraes
Atividade enzimtica (U/mL) Fpsica CMCsica -glucosidsica Teor Protico (g/L) Extrato bruto 0,351 1,311 0,222 0,176 Concentrado 6x 1,182 7,325 1,307 1,081 Concentrado 20x 3,357 23,364 3,432 3,483
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4 Atividade Fpsica U/mL Ativididade -glucosidasica U/mL Teor Protico g/L 3,5
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20 3 2,5 2 1,5 1 5 0,5 0 extrato bruto concentrao 6x concentrao 20x 0 10 15
Figura 5.20. Concentrao do extrato bruto da produo de celulase pelo isolado S47, tendo como substrato a celulignina de bagao de cana
Apesar de certa estabilidade apresentada, ainda preciso aprimorar as tcnicas de concentrao, assim como o rendimento na produo das enzimas, para igualar-se aos preparados comerciais (tabela 5.7).
Tabela 5.7. Dados referentes atividade enzimtica de algumas enzimas comerciais (CARVALHO, 2007)
Atividade enzimtica (UI/mL) Fpsica CMCsica -glucosidsica Teor Protico (g/L) Celluclast 1.5 L FG 77,426 485,445 17,147 54,461 Spezyme 11,714 665,456 37,054 51,770 GC220 10,370 1373,329 125,594 9,099 Extrato Concentrado 20x 3,357 23,364 3,432 3,483
Atividade CMcsica U/mL
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Concluses e Sugestes
Captulo 6
6. Concluses e Sugestes
6.1. Concluses Baseando-se nos dados apresentados no capitulo anterior, possvel obter as seguintes concluses: - Foi possvel isolar 15 fungos celulolticos a partir da suspenso e dissociao do solo e plaqueando em meio de cultura contendo apenas CMC como substrato. - O ensaio de cup plate pode confirmar a capacidade de produo de enzimas degradadoras de CMC, mas no foi capaz de apresentar dados conclusivos quanto capacidade de cada um dos isolados, devido suscetibilidade a variveis intrnsecas ao mtodo. - A celulignina de bagao de cana-de-acar favoreceu a melhor induo de produo de enzimas celulolticas para o isolado selecionado. - Os dados do seqenciamento e morfologia indicam que o isolado relacionado espcie Coniochaeta lignaria. - Com o uso da ferramenta do planejamento experimental foi possvel reduzir o nmero de ensaios, assim como indicar as condies mais propcias de produo com esse substrato, sendo determinado a temperatura em 35 C, pH de 6,0, concentrao de substrato 7,5 g/L e volume de inculo 10% v/v. - O extrato bruto respondeu bem metodologia de concentrao, atingindo 3,357 UI/mL de atividade FPsica, no entanto, para a sua aplicao preciso um produto bruto com maior atividade, assim como uma forma mais eficiente de concentrao, sem tornar o processo oneroso. 61
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Concluses e Sugestes
6.2. Sugestes Sugestes e observaes quanto continuidade dos trabalhos relacionados a essa dissertao. - possvel isolar mais fungos celulolticos com uso de diferentes tcnicas, uma delas a de enriquecimento, favorecendo sua proliferao em microambiente, tornando as condies mais propcias aos fungos que se encontram em propores mais reduzidas. - Avaliar a possibilidade do emprego do bagao de cana sem pr-tratamento. - Avaliar as condies timas de temperatura e pH de atividade celulsica do extrato enzimtico, bem como a estabilidade trmica. - Avaliar um possvel enriquecimento dos compostos enzimticos comerciais com extratos enzimticos concentrados preparados em laboratrio, visando melhorar rendimento de sacarificao sobre diferentes materiais lignocelulsicos, com enzimas mais especficas.
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Hargreaves, P. I.
Referncias Bibliogrficas
Captulo 7
7. Referncias Bibliogrficas
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BIOPROSPECO DE NOVAS CELULASES DE FUNGOS PROVENIENTES DA FLORESTA AMAZNICA E OTIMIZAO DE SUA PRODUO SOBRE CELULIGNINA DE BAGAO DE CANA

Paulo Iiboshi Hargreaves

Orientadores: Nei Pereira Jr., PhD Leda Mendona-Hagler, DsC

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Paulo Iiboshi Hargreaves

Escola de Qumica Universidade Federal do Rio de Janeiro

Paulo Iiboshi Hargreaves

Prof. Nei Pereira Jr. , PhD Orientador - Presidente

Prof Leda Mendona Hagler, DSc Orientadora

Prof Maria Antonieta Peixoto Gimenes Couto, DSc

Prof Rosalie Reed Rodrigues Coelho, DSc

Judith Liliana Solrzano Lemos, DSc iii

2.6. Aplicao da celulase

4.8. Composio de meios de cultura

4.9. Processamento do bagao da cana-de-acar 4.10. Atividade Enzimtica

4.11. Quantificao de protena (Bradford, 1976) 4.12. Ensaio em frascos agitados

4.16. Caracterizao das enzimas

Pas Estados Unidos Brasil China ndia

2007 24.564 18.974 1.837 196

2006 18.376 16.998 3.849 1.900

2005 16.139 15.999 3.800 1.699

Figura 2.1. Estrutura da parede celular vegetal (fonte: www.ceres.net)

Tabela 2.1. Composio de diferentes resduos lignocelulsicos

Composio (%) Hemicelulose Lignina 28 21 28 26 25-40 26 20 16 16 7 18-30 29

Outros 6-11 27 4-10 20 -

& HAHN-HGERDAL (1996); 2SHLESER (1994); 3AWAFO (1997).

Figura 2.2. Representao estrutural da celulose, formada por celobiose

Tabela 2.2. Propriedades de algumas celuloses modelo (ZHANG, 2006)

Figura 2.4. Esquema da organizao de um celulossoma bacteriano (genomicsgtl.energy.gov)

Figura 2.5. Celulases excretadas por clulas (genomicsgtl.energy.gov)

Figura 2.6. Esquema de ao das celulases no complexadas (ZHANG et al, 2006)

Tabela 2.3. Alguns microrganismos produtores de celulases (FAO, 1997)

Clostridium thermocellum Ruminococcus albus

Streptomyces sp. Thermomonospora curvata Thermoactinomyces sp.

Avicel 2 Bagao 2 Bagao tratado Bagao de cana Solka Floc

A. terreus T. reesei RUT C30

FS; 35; 4,0 FS; 28; 4,8

Cellulomonas biazotea Cultura mista T. reesei LM-UC4 e A. phoenicis QM 329

CMC 1 Palaha de trigo Bagao de cana

FS; 30; 7,3

Nger ATCC 6275

Torta de palmeira Cacho de palmeira

Sabugo de milho e farelo de trigo 2 Solka Floc

Solka Floc Solka Floc

FS; 28; 4,8 FS; 30; 6,5 FES; 30

Justificativa, Hipteses e Objetivos

Justificativa, Hipteses e Objetivos

4.1. Diagrama esquemtico das atividades

Figura 4.1. Diagrama esquemtico resumido das atividades realizadas

Figura 4.2. Floresta Nacional do Tapajs.

Tabela 4.1. Propriedades fsico-qumicas das amostras de solo (HARGREAVES, 2005)

Tabela 4.3 Composio do meio GYMP

Tabela 4.5. Composio do meio de Mandels

Tabela 4.6. Variveis e nveis utilizados no planejamento fatorial completo

Tabela 4.7. Variveis e nveis utilizados no planejamento central composto

Figura 4.3. Biorreator utilizado para fermentao

Figura 4.4. Mapa da regio ITS

* transparncia baixa; ** transparncia media; *** transparncia alta

Figura 5.1. Visualizao do ensaio cup plate

Figura 5.5. Atividade FPsica do isolado S47 frente a diferentes substratos

Figura 5.7. Seqencia ITS obtida do isolado S47

97 kDa 66 kDa 45 kDa

Figura 5.11. Superfcie de resposta da atividade fpsica do planejamento experimental fatorial

Figura 5.12. Superfcie de resposta da atividade cmcsica do planejamento experimental fatorial

* transparncia baixa; transparncia media; * transparncia alta