SEGUIMIENTO DE LA PRESENCIA DE ROTAVIRUS A EN UN PROCESO DE

COMPOSTAJE REALIZADO A PARTIR DE RESIDUOS ORGNICOS

DOMICILIARIOS Y CONTENIDO RUMINAL.




MARA DEL PILAR BONILLA ARBELAEZ
MARIELA MOSQUERA RENTERIA



TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
para optar el ttulo de:


MICROBIOLGAS INDUSTRIALES Y MICROBIOLGAS AGRCOLAS Y
VETERINARIAS



MARA MERCEDES MARTNEZ. Directora
MARA FERNANDA GUTIERREZ. Codirectora



PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERAS DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Y MICROBIOLOGA AGRCOLA
Y VETERINARIA
Bogot, D.C.
Diciembre de 2007










Artculo 23 de la Resolucin No 13 de Julio de 1946

La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos
en sus trabajos de tesis. Solo velar porque no se publique nada contrario al dogma
y a la moral catlica y porque las tesis no contengan ataques personales contra
persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la
justicia.

SEGUIMIENTO DE LA PRESENCIA DE ROTAVIRUS A EN UN PROCESO DE
COMPOSTAJE REALIZADO A PARTIR DE RESIDUOS ORGNICOS
DOMICILIARIOS Y CONTENIDO RUMINAL.






MARA DEL PILAR BONILLA ARBELAEZ
MARIELA MOSQUERA RENTERA





APROBADO


__________________________ ___________________________

MARIA MERCEDES MARTINEZ MARA FERNANDA GUTIERREZ
MICROBILOGA MSc. BACTERILOGA PhD.
Directora Codirectora





___________________ __________________________
Dra. ADRIANA MATIZ Dr. JOS SALVADOR MONTAA
Jurado Jurado




SEGUIMIENTO DE LA PRESENCIA DE ROTAVIRUS A EN UN PROCESO DE
COMPOSTAJE REALIZADO A PARTIR DE RESIDUOS ORGNICOS
DOMICILIARIOS Y CONTENIDO RUMINAL.







MARIA DEL PILAR BONILLA ARBELAEZ
MARIELA MOSQUERA RENTERIA








APROBADO







______________________ ______________________
ANGELA UMAA MUOZ JANETH ARIAS PALACIOS
BIOLOGA M. Phil BACTERILOGA MSc.
Decana Acadmica Directora de Carrera




AGRADECIMIENTOS

A la Empresa Bioagrcola del Llano por la oportunidad de realizar este proyecto.

A la Dra. Mara Mercedes Martnez por su direccin, paciencia, apoyo y
oportunidades que nos brind para complementar los conocimientos en la
realizacin de este trabajo.

A la Dra. Carolina Galindo por su apoyo y colaboracin en la realizacin de este
trabajo.

A la Dra. Mara Fernanda Gutirrez por su oportuna colaboracin.

A Orlando Torres por su valiosa asesora.

A Miguel Pinzn por su contribucin en el anlisis estadstico.




















A Dios, por haberme permitido llegar hasta este punto, A mis padres porque simplemente sin ellos no hubiera sido posible A Dios, por haberme permitido llegar hasta este punto, A mis padres porque simplemente sin ellos no hubiera sido posible A Dios, por haberme permitido llegar hasta este punto, A mis padres porque simplemente sin ellos no hubiera sido posible A Dios, por haberme permitido llegar hasta este punto, A mis padres porque simplemente sin ellos no hubiera sido posible
llegar hasta donde he llegado y por estar siempre ah. llegar hasta donde he llegado y por estar siempre ah. llegar hasta donde he llegado y por estar siempre ah. llegar hasta donde he llegado y por estar siempre ah.

Dale tiempo al tiempo, pero no el suficiente como pa Dale tiempo al tiempo, pero no el suficiente como pa Dale tiempo al tiempo, pero no el suficiente como pa Dale tiempo al tiempo, pero no el suficiente como para que cuando quieras disfrutar del tiempo no lo puedas hacer ra que cuando quieras disfrutar del tiempo no lo puedas hacer ra que cuando quieras disfrutar del tiempo no lo puedas hacer ra que cuando quieras disfrutar del tiempo no lo puedas hacer

Mariela Mariela Mariela Mariela







Le doy gracias a Dios por abrirme puertas y darme oportunidades. A mis padres por apoyarme en todas mis Le doy gracias a Dios por abrirme puertas y darme oportunidades. A mis padres por apoyarme en todas mis Le doy gracias a Dios por abrirme puertas y darme oportunidades. A mis padres por apoyarme en todas mis Le doy gracias a Dios por abrirme puertas y darme oportunidades. A mis padres por apoyarme en todas mis
dediciones y a mi hermano, mi ejemplo de vida, dediciones y a mi hermano, mi ejemplo de vida, dediciones y a mi hermano, mi ejemplo de vida, dediciones y a mi hermano, mi ejemplo de vida, por las palabras de fuerz por las palabras de fuerz por las palabras de fuerz por las palabras de fuerza en los momentos difciles. a en los momentos difciles. a en los momentos difciles. a en los momentos difciles.


Mara del Pilar Mara del Pilar Mara del Pilar Mara del Pilar















TABLA DE CONTENIDO


1 INTRODUCCIN 1
2. MARCO TERICO 3
2.1 Rotavirus 3
2.1.1 Morfologa y Estructura 3
2.1.2 Taxonomia y clasificacin 6
2.1.3 Replicacin Viral 6
2.1.4 Epidemiologa 7
2.1.5 Morbilidad y Mortalidad 8
2.1.6 Dinmica Viral en el Medio Ambiente 9
2.1.7 Mtodos para la deteccin en lodos y compost 12
2.1.8 Mtodos de deteccin 15
2.2 Efecto de las Condiciones Medioambientales Sobre la Partcula Viral 18
2.2.1 Adsorcin Viral a Partculas Slidas 19
2.2.2 Virus en el suelo 19
2.2.3 Temperatura 21
2.2.4 pH 22
2.2.5 Radiacin Solar 22
2.2.6 Compuestos qumicos 23
2.3 COMPOSTAJE 24
2.3.1 Etapas del proceso de compostaje segn la temperatura 25
2.3.2 Factores que condicionan el proceso de compostaje 27
2.3.3 Calidad de Materias Primas 32
2.3.4 Patgenos en Compost 34
2.3.5 Control de calidad del producto final 35
3. Formulacin del problema y justificacin 40
4. Objetivos 41
4.1 Objetivo General 41
4.2 Objetivos especficos 41
5. MATERIALES Y MTODOS 42
5.1. Preparacin de inculo acelerador 42
5.2 Seguimiento de las Pilas y Muestreo 43
5.3 Anlisis Fisicoqumico de las muestras de compostaje 44

5.4 Estandarizacin del proceso de extraccin y concentracin de virus a partir de
muestras de compostaje
45
5.5 Montaje del control positivo y negativo del compost 46
5.6 Deteccin de rotavirus por Inmunocromatografa (ICT) 46
5.7 Deteccin de rotavirus por ELISA. 47
5.8 Modelo estadstico 48
6. RESULTADOS Y DISCUSIN 50
6.1. Preparacin de inculo acelerador 50
6.2 Seguimiento de las Pilas y Muestreo 51
6.3 Anlisis Fisicoqumico del compost 54
6.4 Estandarizacin del proceso de extraccin y concentracin 59
6.5 Montaje del control positivo y negativo del compost 59
6.6 Deteccin de rotavirus por Inmunocromatografa (ICT) y ELISA 62
7. CONCLUSIONES 70
8. RECOMENDACIONES 71
9. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 72
10. ANEXOS 90



























LISTA DE TABLAS


TABLA TITULO PAG.
1 Propiedades de las protenas constituyentes del rotavirus 5
2 Nmero de casos de la enfermedad causada por rotavirus en
nios menores de 5 aos a nivel mundial
9
3 Virus en lodos y residuos slidos urbanos 12
4 Comparacin de dos mtodos de recuperacin de virus en lodos 14
5 Tiempo de supervivencia de virus en el suelo 20
6 Dosis requeridas de luz UV para la inactivacin de virus 23
7 Principales caractersticas de algunos materiales orgnicos 28
8 Microorganismos patgenos asociados a compost 34
9 Patgenos que se pueden encontrar en el contenido ruminal 34
10 Indicadores microbiolgicos de calidad de compost. 36
11 Clasificacin de bioslidos segn la EPA 37
12 Parmetros microbiolgicos en la legislacin europea 38
13 Composicin de las pilas evaluadas. 43
14 Concentracin microbiana inicial del inculo acelerador 50
15 Actividad enzimtica del inculo mixto 51
16 Parmetros fsico qumicos de las pilas de compostaje 54
17 Proporcin de muestras positivas en el primer proceso de
compostaje por los dos metodos de deteccin (ELISA e ICT), pH y
temperatura promedio
61
18 Deteccin de rotavirus por ELISA e ICT para las materias primas 62














LISTA DE FIGURAS


FIGURA TITULO PAG.

1
Estructura del rotavirus 4
2 Mtodo de inmunocromatografa 17
3 Determinacin de temperatura 44
4 Determinacin de pH 44
5 Componentes de inmunocromatografa 46
6 Control positivo de la prueba. 47
7 Comportamiento de temperatura durante el proceso de
compostaje.
52
8 Comportamiento de pH durante el proceso de compostaje 52
9 Porcentaje de humedad, nitrgeno orgnico, potasio, magnesio
y calcio total de las pilas de compostaje del primer proceso y
segundo proceso

56
10 Determinacin colorimtrica de la presencia de rotavirus 60


















RESUMEN

Con el fin de realizar el seguimiento de la presencia de rotavirus en muestras de compost, se
realiz el diseo una tcnica de extraccin y concentracin viral a partir de la matiz
acompaada de una deteccin de rotavirus mediante ELISA e Inmunocromatografa (ICT).
Para ello, se realizaron dos procesos de compostaje a partir de residuos slidos urbanos
(RSU) del relleno sanitario Don Juanito, de la ciudad de Villavicencio con diferentes
porcentajes de podas, contenido ruminal, residuos de plaza y cascarilla de arroz.
En el montaje de las pilas se aplic un inoculo mixto termoflico con una actividad amiloltica
y proteoltica cuantificada a nivel de laboratorio arrojando resultados de 276UA y 246UP
respectivamente y una concentracin microbiana inicial de 10
23
UFC/ml. Durante los
procesos de compostaje que se obtuvo en 56 das se logr una temperatura mxima de 68.9
C y pH 8.86 y caractersticas fisicoqumicas adecuadas segn la NTC 5167.
En cuanto al seguimiento de la presencia de rotavirus en el proceso de compostaje se
modific la tcnica cualitativa usada por Ahmed y Sorensen, 1995 y Lewis y Metcalf, 1988
para la extraccin y concentracin de partculas virales. Consecutivamente se llev a cabo
la deteccin de rotavirus donde se encontraron muestras positivas para la primera, segunda,
quinta y octava semana del primer proceso de compostaje mediante ELISA y para la
primera, segunda y quinta semana mediante Inmunocromatografa (ICT). La muestra de
contenido ruminal del primer proceso de compostaje resulto positiva para rotavirus mediante
los dos test de deteccin a diferencia de las otras materias primas. En el segundo proceso
de compostaje las materias primas y las muestras del proceso fueron negativas para
rotavirus.
En conclusin, es evidente el efecto directo de la temperatura y del pH sobre las partculas
de rotavirus, sin embargo a pesar de encontrar este agente en las materias primas
destinadas a la produccin de compost y ocasionalmente en el producto final factores como
la heterogeneidad del material analizado, el limite de deteccin de los mtodos de
diagnostico existentes y sobre todo las caractersticas del rotavirus, no permiten considerarlo
como un indicador de eficiencia en un proceso de estabilizacin de materia orgnica como
es el compostaje.




ABSTRACT

In order to monitoring Rotavirus presence in compost samples, it was designed an extraction
technique and viral concentration starting from the matrix accompanied by a rotavirus
detection by means of ELISA and Inmunocromatography (ICT). For it, was carried out two
compostaje processes starting from urban solid residuals (RSU) of the sanitary filler Don
Juanito, of the city of Villavicencio with different percentages of prunings, ruminal content,
square residuals and husk of rice. In the assembly of the piles it was applied an mixed
termofilic inoculant with an amilolityc and proteolityc activity quantified at laboratory throwing
results of 276UA and 246UP respectively and population's recounts to an initial concentration
of 10
23
UFC/ml. During the composting processes that were obtained in 56 days with maxim
temperature of 68.6 C, pH value of 8.86.and physiochemical characteristics according with
NTC 5167.
As qualitative detection technique of the rotavirus presence in the composting process was
used Ahmed and Sorensen, 1995 test and Lewis and Metcalf, 1988 method, for the
extraction and concentration of viral particles was modified. Consecutively it was carried out
the rotavirus detection where they were positive samples for the first one, second, fifth and
eighth week of the first composting process by means of ELISA and for the first one, second
and fifth week by means of Inmunocromatography (ICT). The ruminal content sample of the
first composting process was positive for rotavirus by means of the two detection test
contrary to the other raw material. In the second composting process the raw material and
the samples of the process were negative for rotavirus.
In conclusion, is evident the direct temperature and pH effect and on rotavirus particles.
However, despite this agent is found in raw materials used to produce compost and
occasionally in the final product; factors such as heterogeneity of the analyzed material,
detection limit of existing diagnostic methods and especially the characteristics of rotavirus,
not allowed to consider it as an efficiency indicator in a stabilization process of organic matter
such as composting.











1. INTRODUCCIN

Bioagrcola del Llano SA EPSP, es una empresa dedicada a la investigacin para el
aprovechamiento integral de la fraccin orgnica de los residuos slidos mediante
alternativas como el compostaje. Este mecanismo facilita el control sobre el proceso de
biodegradacin de materia orgnica obteniendo abono orgnico conocido como compost de
buena calidad fisicoqumica y microbiolgica que se reincorpora al medio ambiente.

La calidad biolgica de este producto est determinada por la ausencia de microorganismos
fitopatgenos como Fusarium sp, Phytophtora sp, Sclerotinia sp, Salmonella sp,
enterobacterias, fagos somticos y huevos de helminto los cuales permiten verificar su
inocuidad al momento de ser utilizado, evidenciando as la total eliminacin de los patgenos
presentes.

Sin embargo, pese a cumplir la normatividad nacional con relacin a la bsqueda de
microorganismos patgenos establecida por el ICONTEC, 2004, se consider necesario
ampliar el rango de estos organismos y evaluar otros grupos microbianos para garantizar la
inocuidad del producto, en especial cuando se aplique en cultivos de consumo directo.

Desde el punto de vista de salud pblica, los virus entricos son uno de los grupos de
organismos patgenos ms crticos, debido a que la dosis mnima infecciosa es muy baja,
son muy resistentes a los sistemas de desinfeccin y su deteccin a nivel de laboratorio es
costosa. Adems, el Rotavirus causa prdidas econmicas por estar asociado a altos
ndices de morbilidad y mortalidad, haciendo que los costos por prevencin y tratamiento
sean de varios millones de dlares a nivel mundial. En cuanto a las campaas de
prevencin gubernamentales contra Rotavirus, el pas invierte aproximadamente 80.000
millones de pesos al ao en el sostenimiento del esquema oficial de vacunacin que incluye
a este virus. Por lo general tanto en Colombia como en otros pases, la deteccin de virus
entricos en abonos orgnicos no es llevada a cabo debido a la dificultad y elevados costos
de las tcnicas existentes, adems de la creencia de que no estn en los abonos. Dentro de
los virus entricos, se encuentran principalmente Rotavirus grupo A, Norovirus, Enterovirus,
Astrovirus y Poliovirus. Los Rotavirus pueden encontrarse en los residuos compostables
provenientes de animales y tambin en aquellos que han sido manipulados por el hombre
siendo el principal agente etiolgico causante de diarrea. Por las razones anteriormente

mencionadas, usualmente la deteccin de estos organismos est sujeta a la bsqueda de
indicadores virales de contaminacin fecal los cuales incluyen colifagos somticos, fagos F-
especficos y los bacterifagos que infectan Bacteroides fragilis en lugar de la bsqueda de
patgenos. Estos presentan tamao, estructura y supervivencia similar a la de los virus
entricos pero las tcnicas para su identificacin son ms rpidas, sencillas y econmicas.
A nivel mundial el Rotavirus ha sido el causante de 608.400 muertes en menores de 5 aos
y de un 39% de las hospitalizaciones por diarreas, en el caso particular de Amrica se han
producido 15.000 muertes en menores de 5 aos y 75.000 hospitalizaciones por enfermedad
diarreica aguda (EDA) (De Oliveira, 2006).

Los procesos de manejo de residuos slidos que involucran altas temperaturas favorecen la
eliminacin de patgenos ya que en estos la generacin de compuestos qumicos como el
amonio y cidos orgnicos causan la variacin del pH logrando la desestabilizacin de
agentes virales. Sin embargo luego de la ampliacin de estos procesos es posible detectar la
presencia de genomas virales siendo esta una evidencia de la resistencia viral en virus como
el Rotavirus y el Virus de Hepatitis A.

Dentro de los mtodos tradicionalmente utilizados para demostrar la presencia de Rotavirus
en muestras ambientales se encuentran kits comerciales basados en reacciones antgeno
anticuerpo como los mtodos de ELISA e inmunocromatografa, con un lmite de deteccin
aproximado de 4.10
5
partculas/mL. Sin embargo las mayores desventajas de estas tcnicas
son el no reconocimiento de partculas virales infectivas como tambin las variaciones
observadas en sensibilidad y especificidad relacionadas con factores inherentes al
procesamiento de las muestras.

Por lo anterior, el objetivo de este estudio fue evaluar la presencia de Rotavirus durante el
proceso de compostaje mediante la extraccin y concentracin del agente viral utilizando la
tcnica de elusin concentracin y posterior deteccin a travs de la prueba de ELISA
(Pathfinder Rotavirus kit test) e inmunocromatografa ICT.








2. MARCO TEORICO


2.1 ROTAVIRUS

2.1.1 Morfologa y estructura

El Rotavirus presenta simetra icosadrica, con un dimetro medio de 75 nm y no poseen
envoltura lipdica. Su genoma est formado por once segmentos de RNA de doble cadena
rodeado por tres capas proteicas concntricas que se denominan cpside interna o core,
cpside intermedia y cpside externa (Figura 1) (Chanock y Kapikian, 2001).

El core o cpside interna esta constituida por sesenta dmeros de protenas VP2 (102 kda)
VP1 y VP3 unidas al RNA viral de doble cadena (Chanock y Kapikian, 2001). La capa
intermedia esta constituida por 260 unidades de la protena trimrica VP6 mientras que la
capa externa contiene dos protenas VP7 y VP4 (Desselberg y Gray, 2000).

Existen tres tipos de partculas virales con diferentes caractersticas estructurales; la
partcula completa, que contiene las tres capas proteicas, llamada TLP (Triple-Layered
Particle), la cual es infecciosa ya que la presencia de la capa externa formada por las
protenas VP4 y VP7 le permite unirse y penetrar a su clula husped; la partcula que
contiene dos capas proteicas o DLP (Doble-Layered Particle); no infecciosa, pero
transcripcionalmente activa y las partculas que contienen una sola capa de protenas, o
nucleocpsides, que tienen la actividad de replicar el genoma viral (Estes et al., 2001).

























Figura 1. Estructura del Rotavirus
Fuente: Estes, 2001

El genoma del Rotavirus contiene once segmentos de dsRNA de cadena doble con un peso
molecular que oscila en un rango de 2 x 10
5
y 20.2 x 10
4
Daltons con un tamao de 0.6 a 3.3
Kilopares de bases. Los segmentos de RNA viral estn numerados segn la velocidad de
migracin que presentan en gel de poliacrilamida (Chanock y Kapikian, 2001).

El genoma evoluciona ya sea por mutacin puntual o por reorganizacin de los segmentos
entre diferentes cepas. Este ltimo mecanismo consiste en el intercambio de segmentos
genmicos entre dos cepas al infectar una misma clula; los virus resultantes podrn
entonces contener segmentos derivados de ambas cepas parentales (Jaimes et al.,2000)

El genoma de Rotavirus codifica para protenas estructurales que se encuentran en las
partculas virales y protenas no estructurales que se encuentran en clulas infectadas pero
no en partculas maduras. La nomenclatura de las protenas virales designa las protenas
estructurales como VP seguido por un nmero; van de VP1 a VP8, siendo VP1 la protena
de mayor peso molecular. Las protenas no estructurales se denominan NSP y van de 1-6.
Un resumen de las diferentes protenas del Rotavirus esta en la tabla 1.






Tabla 1. Propiedades de las protenas constituyentes del Rotavirus

Segmento
del Genoma
Protena Localizacin en
partculas
virales
No. De
molculas
por virin
Caractersticas y funcin
1 VP1 Core interna 12 RNA polimerasa, unin al ssRNA, unin
a VP3
2 VP2 Core interna 120 Unin al dsRNA, requerida para la
actividad replicasa de VP1
3 VP3 Core interna 12 Guanililtransferasa, metiltransferasa,
unin a ssRNA, unin con VP1
4 VP4 Cpside externa 120 Hemaglutinina, antgeno neutralizante,
potenciacin infectividad por proteasa,
virulencia, putativa regin de fusin,
adherencia a la clula, induce
proteccin
5 NSP1 No estructural Bsica, anillo de zinc, unin al ssRNA
6 VP6 Cpside interna 780 Hidrofbica, trimrica, antgeno de
subgrupo
7 NSP3 No estructural cida, dimrica, unin extremo 3
,
del
mRNA viral, inhibe traduccin del
husped
8 NSP2 No estructural Bsica, oligomrica, unin al ssRNA,
NTPasa
9 VP7 Cpside externa 780 Glicoprotena integrada en la
membrana del RER, trmrica, antgeno
neutralizante, 2 regiones hidrofbicas
NH2 terminales, induce proteccin
10 NSP4 No estructural Glicoprotena transmembranal RER,
participa en morfognesis, induce
proteccin
11 NSP5 No estructural Bsica, fosfoprotena, unin al ssRNA,
protena quinasa, interaccin con NSP2

Fuente: (Jaimes et al., 2000)




2.1.2 Taxonoma y clasificacin

El gnero Rotavirus hace parte de la familia viral Reoviridae, la cual se divide en seis
gneros Orthoreovirus, Colitivirus, Orbivirus, Fijivirus, Cypovirus y Rotavirus. El nombre de
Rotavirus proviene de la raz latina rota que significa rueda, debido a la apariencia redonda
de las partculas virales al ser visualizadas por tincin negativa en un microscopio
electrnico. Este gnero est dividido en siete grupos serolgicos (A a la G). Los grupos A, B
y C infectan a los humanos y los grupos restantes infectan especies animales (Ramig, 2004).
Hasta ahora, se han clasificado en 14 serotipos-G con base a la glicoprotena VP7 y en 11
serotipos-P con base a la protena VP4 (Chanock y Kapikian, 2001).

2.1.3 Replicacin viral

El Rotavirus inicia su ciclo de infeccin unindose a un receptor localizado en la superficie
celular. Luego de la unin al receptor, el virus penetra al interior de la clula y pierde la capa
externa, con lo cual se activa la transcripcin. La replicacin se lleva a cabo en el citoplasma
de la clula hospedera. La partcula completa, que contiene las tres capas proteicas, es
tambin llamada TLP; esta es la partcula infecciosa ya que la presencia de la capa externa
formada por las protenas VP4 y VP7 le permite unirse y penetrar a su clula husped; la
partcula que contiene dos capas proteicas o DLP no es infecciosa, pero es
transcripcionalmente activa. Luego de la unin a un receptor celular ocurren los siguientes
pasos en un transcurso de tiempo de 14 horas aproximadamente

1. Adsorcin de las protenas externas del virin VP4 y VP7 a un receptor celular.
2. Penetracin directa o por endocitosis.
3. La capa externa es removida como parte del proceso de entrada y permite activar la
transcripcin.
4. Produccin de mRNA en el citoplasma por DLPs
5. Una vez el mRNA emerge de las DLPs, el RNA de polaridad positiva es sintetizado por
la RNA polimerasa viral.
6. Simultneamente el mRNA es usado como molde para la traduccin de 6 protenas
virales estructurales y 5 protenas no estructurales.
7. Ensamblaje de la capa que contiene VP1, VP2, VP3 y 11 segmentos de RNAss,
formacin de agregados de DLPs en una estructura electrodensa llamada viroplasma.
8. Maduracin de los DLPs a TLPs:


a. Glicosilacin de VP7 en el retculo endoplasmtico rugoso (RER), NSP4
acta como un receptor intracelular para DLPs.
b. Envoltura transitoria de las partculas en el RER que contienen VP4 y VP7
c. Remocin de la envoltura

9. Liberacin de partculas infecciosas por lisis celular (Desselberg y Gray, 2000)

In vivo, el Rotavirus presenta un tropismo celular especfico; la infeccin viral slo se lleva a
cabo en los enterocitos diferenciados de las vellosidades del intestino delgado. In vitro, la
infeccin por Rotavirus est restringida a lneas celulares epiteliales de origen renal como las
MA104 de rin de mono, e intestinal como las clulas de cncer de colon, CaCo-2 (Estes et
al., 2001).

2.1.4 Epidemiologa

Dentro de la etiologa viral, el Rotavirus constituye la causa ms frecuente de diarrea, siendo
su frecuencia entre el 70-80% de los casos de EDA enfermedad diarreica aguda en nios
de pases desarrollados. Su distribucin geogrfica es universal y pueden ser ms
frecuentes en las regiones socioeconmicas ms pobres (Cceres et al., 2006).

Tanto en los pases desarrollados como en los pases en va de desarrollo casi todos los
nios han sido infectados por Rotavirus en los primeros aos de vida. Las primeras
infecciones despus de los tres meses de edad son generalmente sintomticas y la
incidencia de la diarrea disminuye hacia los 2 o 3 aos de edad. La incidencia de Rotavirus
en nios en pases en va de desarrollo ha sido definida por estudios prospectivos de
cohortes y vara entre 0,07 y 0,8 episodios por nio por ao (Bresee et al., 1999)

En los pases desarrollados, los Rotavirus constituyen el agente nico ms frecuente de
diarrea en los nios menores de 2 aos que necesitan asistencia mdica, concentrndose el
mayor nmero de casos entre los 3-12 meses de edad, con un claro predominio en los
meses invernales.

De igual forma el Rotavirus es la causa ms frecuente de hospitalizacin y deshidratacin
por EDA de nios en pases en vas de desarrollo, afectando aproximadamente al 50% de
los ingresos y causando la muerte por deshidratacin en el 0,75% de los nios menores de 2

aos afectados. Se estima que aproximadamente 600.000 casos de EDA existen en el
mundo cada ao (Ciarlet et al., 2002).

En pases desarrollados la diarrea por Rotavirus es principalmente una enfermedad que se
presenta en el invierno con muy pocos cuadros fuera de este pico estacionario; mientras que
en los pases en va de desarrollo la enfermedad ocurre durante todo el ao sin variaciones
segn las estaciones, aunque puede presentarse picos en los meses fros o secos o en el
invierno (Bresee, et al., 1999). En Colombia, segn Cceres, et al., 2006 el Rotavirus se
presenta con una variacin biestacional, con un primer pico en los meses entre Febrero y
Mayo y un segundo pico entre Septiembre y Noviembre mantenindose estable los meses
restantes, principalmente en las ciudades de Facatativa, Bogot, Medelln, Manizales,
Cartagena y Quibd donde se han hecho estudios de prevalencia para enfermedad
diarreica aguda (EDA).

La principal fuente de este agente viral son las heces de personas y animales infectados, la
liberacin de Rotavirus del tracto intestinal de un individuo infectado se produce antes de
manifestar la diarrea e incluso cuando la diarrea ha cesado, de hecho se ha documentado la
excrecin de virus sin presentar diarrea. Las heces fecales suelen contener 10
8
-10
10

partculas virales por mililitro, y la dosis infecciosa es de 10-100 partculas virales (Rzezutka
y Cook, 2004; OPS, 2007). El virus puede ser transmitido por va fecal oral, por agua,
alimentos contaminados, persona a persona y probablemente por secreciones respiratorias
aunque este ltimo hallazgo es circunstancial.

Con los conocimientos actuales y con las tcnicas presentes se dispone de un mejor
diagnstico de los agentes etiolgicos de las diarreas infantiles. En la actualidad, el agente
viral ms frecuentemente encontrado en nios menores de cinco aos con gastroenteritis
aguda son los Rotavirus grupo A, causantes del 25 al 65% de gastroenteritis graves
infantiles. El segundo agente encontrado son Calicivirus (7-22%), y el tercer lugar se lo
disputan Astrovirus y Adenovirus, con un 2-9% y 2-6% respectivamente (Simpson et al.,
2003)

2.1.5 Morbilidad y Mortalidad

A partir de datos del Banco Mundial se calcula que cada ao los Rotavirus causan
aproximadamente 111 millones de episodios de gastroenteirtis que requieren slo atencin
en casa, 25 millones que requieren la visita clnica, 2 millones que requieren hospitalizacin

y entre 352.000 y 592.000 defunciones en nios menores de 5 aos (Tabla 2). As, casi cada
nio menor de 5 aos tendr un episodio de gastroenteritis causada por Rotavirus, 1 de
cada 5 necesitar visita mdica, 1 de cada 65 ser hospitalizado y, aproximadamente, 1 de
cada 293 morir (Parashar et al., 2003).

La incidencia de la enfermedad causada por Rotavirus es similar en pases industrializados y
en pases en vas de desarrollo. Sin embargo, los nios de los pases en vas de desarrollo
mueren con ms frecuencia, posiblemente por un cmulo de factores cmo un peor acceso
a la terapia de rehidratacin y una mayor prevalencia de desnutricin. Se ha calculado que
1.205 nios mueren cada da debido a una gastroenteritis causada por Rotavirus y que el
82% de estas muertes ocurren en los pases ms pobres (Wilhelmi et al., 2003)

Tabla 2. Nmero de casos de la enfermedad causada por Rotavirus en nios menores de 5
aos a nivel mundial
Pases en vas de
desarrollo
Pases
industrializados
Total
Atencin en casa 104.280.000 7.122.000 111.402.000
Atencin clnica 23.233.000 1.781.000 25.017.000
Atencin
hospitalaria
1.920.000 223.000 2.143.000

Fuente: Parashar et al., 2003

2.1.6 Dinmica viral en el medio ambiente

Las vas de transmisin de los virus en el medio son muy diversas, por esta razn ha
provocado una creciente alarma al comprobarse que la poblacin est expuesta a una gran
variedad de posibilidades para adquirir una infeccin. Las distintas vas de transmisin
incluyen (Kittigul et al., 2001):

Ingestin de agua contaminada
La infeccin directa por virus de los agricultores y de sus contactos
Ingestin de moluscos bivalvos o mariscos crudos que hayan crecido en aguas
que reciben aporte de aguas residuales

Ingestin de vegetales que se han regado con aguas insuficientemente tratadas
o que se han cultivado en terrenos abonados con lodos de depuradora que
contenan virus infecciosos
Contaminacin por virus de las fuentes de agua potable como resultado de la
escorrenta de la fraccin de agua que corre por la superficie o de la infiltracin a
las aguas profundas
Contacto con aguas de bao que han recibido aporte de aguas contaminadas
Contacto con aerosoles generados a partir de aguas contaminadas

Los virus entricos humanos, ingresan a los ambientes acuticos a travs de las descargas
de aguas contaminadas con heces, se han detectado concentraciones significativas de virus
en las aguas vertidas al ambiente y en los bioslidos generados en plantas de tratamiento de
agua residual (Graffo et al.,1993; Hurst,1997) y, a pesar de que se considera que hay una
reduccin importante de la concentracin de virus, se ha estimado, a partir de los 100.000
enterovirus por litro frecuentemente detectados en el agua residual, que en una poblacin de
300.000 habitantes pueden liberarse al medio ambiente cantidades de 10
9
partculas vricas
en 24 horas en aguas residuales tratadas (Schwatzbrod, 1995, OMS, 1979)

Los virus entricos en agua pueden permanecer estables durante meses o incluso ms
tiempo si estn asociados a slidos y pueden acumularse en sedimentos donde persistirn
durante ms tiempo y desde donde pueden resuspenderse en la columna de agua por
diversos procesos naturales como lluvias fuertes, o por procesos artificiales, facilitando la
diseminacin viral (Rzezutka y Cock, 2004). De igual forma estos microorganismos han
demostrado ser ms estables en el ambiente que los indicadores bacterianos comnmente
utilizados para evaluar la contaminacin fecal (Bosch et al., 2006). La asociacin de
bacterifagos y virus animales con slidos, tiene un efecto protector resultando en la
resistencia a la inactivacin por cloro en tratamientos de agua y un aumento de la
sobrevivencia del virus en esta. Esto se debe a que los sedimentos no actan solo como
depsitos de virus entricos sino que estos pueden desprenderse de los slidos y llegar a la
columna de agua por degradacin de los sedimentos o lluvias (Chalapati, et al,. 1984).

Los virus pueden sobrevivir durante varios meses en el medio, pueden resistir los procesos
de tratamiento convencionales del agua, incluso la cloracin con un nivel de supervivencia
superior al de las bacterias, pudiendo as encontrarse lejos de la fuente original de
contaminacin, constituyendo un riesgo potencial de nuevas infecciones (OMS, 1979.,
Schwartzbrod, 1995).


En los sistemas de produccin agrcola los virus se encuentran asociados a los alimentos de
consumo directo irrigados con aguas contaminadas y tambin aquellos cultivos donde se
realiza fertilizacin orgnica con compost, lodos de plantas de tratamiento de aguas y
bioslidos. Los virus pueden ser transferidos a las superficies de vegetales y permanecer all
por varios das luego de la aplicacin de abono o del efluente contaminado con partculas
virales principalmente en las hojas de cultivos de tomate, pimentn y col de brucelas
(Raezuka y Cock, 2004). Se considera que en los vegetales con superficies hmedas como
la lechuga y el apio la supervivencia viral se incrementa convirtiendo a estos alimentos en
una fuente de transmisin viral; la lechuga es el mejor vehiculo para la trasmisin de
Rotavirus SA -11 de igual forma este virus puede sobrevivir a temperatura de refrigeracin
luego de la inoculacin directa sobre el alimento (Bosch et al., 2006, Seymour y Appleton,
2001).

La supervivencia de virus en vegetales de consumo directo est influenciada por parmetros
como temperatura, exposicin a la radiacin, humedad tipo de virus y tipo de vegetal. De
igual forma la conservacin de los vegetales a 4C impide la inactivacin viral e incrementa
el tiempo de supervivencia de partculas virales (Schwartzbrod, 1995).

Los residuos orgnicos que se producen a partir de la actividad agrcola, industrial y
domstica generalmente son sometidos a procesos de estabilizacin con el fin de mejorar
sus condiciones fisicoqumicas y biolgicas como tambin para permitir el aprovechamiento
y reincorporacin de estos al ecosistema como ocurre con la produccin de abonos
orgnicos.

Las partculas virales presentes en materiales como excrementos, aguas residuales,
desechos domiciliarios, etc., no son completamente destruidos luego de tratamientos como
digestin anaerobia, digestin aerobia y compostaje; y su supervivencia en lodos, compost,
bioslidos depender de las caractersticas propias de cada material y condiciones externas
como pH, temperatura, humedad, presencia de iones y slidos.

En el caso de lodos provenientes de plantas de tratamiento la supervivencia viral es mayor
en aquellos resultantes del proceso de digestin aerobia que en los procedentes de
procesos de digestin anaerobia, debido a la formacin de flculos y puntos muertos donde
se refuerza la adhesin viral a los slidos aumentando la retencin viral una vez son
aplicados al suelo (Lucena et al., 2005; Bitton et al., 1984)


Una vez los lodos y bioslidos han sido aplicados al suelo se crean aerosoles que favorecen
la dispersin de agentes bacterianos y virales. Segn, Gerba et al., 2004 debido a la baja
concentracin de enterovirus (1-2 UFP/g) los aerosoles virales no constituyen un problema
significativo, sin embargo se han encontrado la presencia de poliovirus, reovirus, echovirus y
coxsackievirus B cien metros despus del punto de aplicacin del bioslido siendo los
reovirus los indicadores potenciales de presencia de aerosoles de virus entricos (Carducci
et al., 2000).

Se espera que en el producto final del proceso de compostaje a partir de bioslidos no se
encuentren partculas virales viables ya que el principal factor que contribuye a la eliminacin
de este tipo de patgenos es la temperatura y su interaccin con las sustancias que se
producen durante el desarrollo del proceso. Normalmente los virus entricos pueden ser
encontrados en la primera fase del proceso pero el rango de temperatura entre (55 70C)
permite la reduccin de 3 unidades logartmicas en la concentracin viral por ruptura de la
cpside y liberacin del cido nucleico. La supervivencia de virus puede presentarse por un
manejo inadecuado de temperatura, contaminacin del rea y utensilios utilizados durante el
proceso y tambin por la distribucin heterognea de los materiales (Guardabassi et al,
2003; Monphoeho et al., 2004).

2.1.7 Mtodos Para la Deteccin de Virus en Lodos y Compost

En ocasiones los virus se encuentran en el suelo y en sistemas de tratamiento de residuos
slidos en rangos variables segn la clase de virus, causando diferentes patologas al
hombre (Tabla 3) y con un patrn de distribucin heterogneo debido a la distribucin
irregular de la materia orgnica y de los componentes coloidales del suelo.


Tabla 3. Virus en lodos y residuos slidos urbanos

Virus Enfermedad causada
Poliovirus Poliomielitis
Coxsackivirus Meningistis, neumona y hepatitis
Echovirus Meningitis, encefalitis y paralisis
Hepatitis A Hepatitis infecciosa
Rotavirus Gastroenteritis

Calicivirus humano Gastroenteritis
Hepatitis E Hepatitis
Astrovirus Gastroenteritis
Adenovirus Infecciones del tracto respiratorio y gastroenteritis

Fuente: (Gerba y Smith, 2005; Van Soelen,2007)

En relacin a los virus, el lodo crudo puede contener ms de 100 especies diferentes de
virus patgenos para humanos. Varios autores han examinado el lodo crudo en pases
desarrollados en diferentes reas geogrficas, demostrando que el nmero de virus
entricos puede variar desde 1000 hasta ms de 50000 unidades formadoras de placa por
litro (UFP/L). Los virus de la Hepatitis A y los Calicivirus son los de mayor preocupacin,
pero no se han desarrollado mtodos estandarizados para su aislamiento y deteccin. Estos
parsitos intracelulares son ms resistentes a los procesos de desinfeccin que los
organismos coliformes. Por lo tanto, los indicadores tradicionales de contaminacin
bacteriana no evalan de manera eficiente la presencia o ausencia de virus (Guzmn y
Campos, 2002)

Lo anterior hace necesario el desarrollo de mtodos de concentracin y constituye uno de
los problemas principales de la virologa ambiental. Safferman, 1989, describi un
procedimiento para la presencia de virus asociados a slidos (lodos, suelos, sedimentos y
otros). Su diseo implica la elusin del virus directamente del slido. Estas muestras son
evaluadas en cultivo celular por virus formadores de placa. El mtodo que describe la
EPA/625/R-92/013 (1999), detecta virus cultivables totales los cuales incluyen
principalmente el grupo de los enterovirus (Poliovirus, Coxsackievirus, Echovirus) y el grupo
de los Reovirus.

Aunque la fraccin de virus asociada con la porcin lquida usualmente es menor, esta
fraccin puede variar considerablemente en los diferentes tipos de lodos. Con el fin, de
corregir esta variacin la EPA recomienda tratar la muestra de forma tal que los virus
presentes en el lquido se unan a los slidos (mezclando la suspensin con AlCl
3
*6H
2
O,
0.05M), luego se eluyen los virus de los slidos (extracto de carne 10%, pH 7),
posteriormente se filtra la muestra por tamices de 47mm de dimetro y 3.0, 0.45 y 0.25
micras de dimetro de poro y se concentran para su identificacin. El ensayo permite
localizar el crecimiento de los virus por la unin de partculas virales infecciosas a la
monocapa de clulas. Las lesiones de las clulas muertas (placas) se visualizan con una

coloracin vital que colorea solo clulas vivas. El nmero de placas circulares no coloreadas
(UFP) es proporcional a la cantidad de partculas infecciosas inoculadas.

Los mtodos recomendados para la extraccin de virus en lodos son el mtodo de vaso
(Glass method) el cual consiste en la adicin de extracto de carne pH 9, seguido de una
sonicacin, centrifugacin, precipitacin viral usando Na
2
HPO
4
y cultivo celular para la
enumeracin de los virus y el mtodo de la EPA con AlCl
3
. Segn Lichtenberg, 1988 ambos
mtodos poseen problemas inherentes como se muestra en la tabla 4, pero ambos son
recomendados como mtodos estndar para la recuperacin de virus entricos en lodos.

Tabla 4. Comparacin de dos mtodos de recuperacin de virus en lodos

Factor Mtodo de vaso EPA /625/R-92/013
Volumen final de muestra
para el ensayo de
deteccin
Pequeo (aprox. 10ml) 50 a 100ml
Equipo especial o inusual
de laboratorio requerido
Sonicador Ninguno inusual
Contaminacin bacteriana
o fngica de la muestra a
analizar
No usual Frecuente
Facilidad para procesar un
alto nmero de muestras
simultneamente
Difcil Fcil
Volumen de muestra 800ml 300ml
Problemas operacionales Formacin de espuma en el
extracto de carne
Dificultad en el proceso de
filtracin, especialmente en
el caso de lodos primarios.
Fuente: (Lichtenberg, 1988)

El mtodo basado en infectividad en cultivo celular junto con el mtodo de deteccin
molecular con PCR seguido de la hibridizacin de cidos nuclecos son las tcnicas ms
utilizadas para la deteccin de enterovirus en muestras ambientales (Monpoeho, et al.,
2001). Estas muestras, en especial el lodo urbano, contienen numerosos compuestos
orgnicos e inorgnicos (cidos hmicos, polifenoles, metales pesados) que son txicos y

causan lisis en cultivos celulares (Hurst y Goyke, 1983). Adems estos compuestos pueden
formar complejos con los cidos nuclecos e inhibir las enzimas de amplificacin,
disminuyendo la efectividad de la PCR (Graff, et al., 1993)

La mayor parte de los mtodos de recuperacin de virus aprovechan las propiedades de los
virus como macromolculas proteicas. Los virus se comportan en el medio como un coloide
hidrfilo en el que la carga elctrica neta vara en funcin del pH y de la fuerza inica del
medio. Tienen, adems, la capacidad de adsorberse sobre partculas en suspensin o
soportes de cualquier tipo.

Un buen mtodo de concentracin debe ser simple, rpido y econmico. Debe proporcionar
altas tasas de recuperacin y ser aplicable a la recuperacin de diferentes virus. El
concentrado viral obtenido debe estar libre de posibles sustancias txicas o inhibidoras
presentes en las muestras para que pueda ser utilizado en los procesos de deteccin
subsiguientes. La metodologa debe escogerse en funcin de factores geogrficos y
climticos, tipo de residuo, ya que las variaciones en sus caractersticas fsico-qumicas y en
la cantidad de materia orgnica afectan a la capacidad de agregacin de los virus, as como
a la eficiencia de algunos mtodos; y tipo de virus, ya que ciertos mtodos podran provocar
su inactivacin (Mignotte et al., 1999).

Como se ha visto anteriormente la mayora de literatura existente se refiere a la recuperacin
de agentes virales a partir de lodos y suelo ms no a compost, sin embargo estos mtodos
pueden ser utilizados para la extraccin viral en este tipo de matriz.


2.1.8 Mtodos de deteccin

El diagnstico de laboratorio de Rotavirus est basado fundamentalmente en su deteccin
en las heces, se emplean variadas tcnicas tales como son la microscopia electrnica (ME),
la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), la aglutinacin por ltex, el ELISA, la
hibridacin de cidos nuclecos, PCR (reaccin en cadena de la polimerasa) entre otras
(Ribas et al., 1996)
La ventaja de la ME frente a las otras tcnicas radica en la posibilidad de visualizar
directamente las partculas infecciosas aisladas de las muestras. Sin embargo, la
microscopia electrnica no permite hacer una diferenciacin entre los grupos de Rotavirus

involucrados y la identificacin de los virus mediante la visualizacin del ojo humano requiere
profesionales altamente capacitados y con gran experiencia, motivo por el cual ste es un
mtodo limitado como herramienta diagnstica (Rivern et al., 1989)
Las partculas virales de Rotavirus son detectadas por microscopa electrnica (ME) siempre
y cuando se encuentran en elevadas concentraciones en las heces, lo que con frecuencia
ocurre en las personas infectadas que presentan sintomatologa, aunque se estima que se
requiere del orden de 10
6
partculas vricas por gramo de muestra para poder ser
observadas. La inmunomicroscopa electrnica, utilizando antisueros o anticuerpos
monoclonales, incrementa la sensibilidad de la ME, y adems sirve para demostrar la
agregacin de partculas vricas por los anticuerpos especficos, una de las observaciones
consideradas como demostrativas del papel patgeno de los distintos virus. Estas tcnicas
continan siendo de gran utilidad en el diagnstico de las gastroenteritis vricas, siempre, por
supuesto, que se pueda disponer de un microscopio electrnico y de personal entrenado. La
gran ventaja de la microscopa electrnica respecto a otras tcnicas diagnsticas es que
permite encontrar cualquier virus, sin que el procedimiento limite la identidad del agente
detectado, como sucede con las tcnicas inmunolgicas o moleculares. La mayora de los
virus son reconocibles por su morfologa, y algunos virus se diagnostican principalmente por
este procedimiento (Torovirus, Coronavirus). Por microscopa electrnica se detectan,
adems, virus que en muchos laboratorios no se investigan por otras tcnicas (Rotavirus de
grupos B y C, Calicivirus, etc.) (Buesa et al., 2007)
La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) se fundamenta en la separacin
electrofortica de los segmentos del RNA del virin. Por otro lado, el inmunoensayo
enzimtico es el mtodo ms utilizado para confirmar la presencia de Rotavirus porque es
altamente sensible y no requiere equipos especializados. Los ensayos de ELISA para
Rotavirus utilizan anticuerpos (policlonales o monoclonales) en un inmunoensayo tipo
sndwich de fase slida para detectar el antgeno especfico de grupo (Kapikian y Chanock,
1996).
Un estudio realizado por Dahling et al., 1990 mostr que kits comerciales pueden ser usados
como pruebas presuntivas para demostrar la presencia de Rotavirus en muestras
ambientales. En el caso de los inmunoensayos las variaciones observadas en sensibilidad y
especificidad se relacionan aparentemente con factores tales como manejo de la muestra
(transporte, conservacin, tiempo entre coleccin y procesamiento), calidad de los

anticuerpos de captura, presencia en la muestra de enzimas que degradan protenas o
cidos nuclecos (Rivera, 1995).
Estudios realizados con anterioridad, demuestran la gran sensibilidad del Kit de ELISA frente
a las tcnicas de aglutinacin en ltex y la electroforesis de ARN. Sin embargo estas
tcnicas son ms especficas que ELISA (Rivera, 1995)
La inmunocromatografa es un inmunoensayo que en la actualidad es ampliamente utilizado
en la deteccin rpida de diversos antgenos; de igual forma se convierte en una de las
tcnicas de inmunodiagnstico ms modernas cuyas principales ventajas son la sencillez y
rapidez. En el diagnstico de enfermedades virales se ha trabajado en pruebas de cassette
inmunocromatogrficas para el Virus de la influenza A y B, Virus respiratorio Sincitial,
Adenovirus, Norovirus y Rotavirus y otros patgenos como Corynebacterium diphtheriae,
Mycobacterium tuberculosis, Triticum aestivum, Tenia solium entre otros (Crespo, 2000;
Skerritt

y Heywood, 2000, De frutos et al., 2004)
Esta tcnica permite visualizar la reaccin antgeno-anticuerpo por la acumulacin de oro
coloidal u otra sustancia indicadora del conjugado en zonas especficas del papel de
nitrocelulosa donde se fijan previamente anticuerpos de captura (Skerritt

y Heywood, 2000).

En primer lugar la muestra se pone en contacto con la zona del conjugado formado por un
anticuerpo especfico contra uno de los eptopes del antgeno a detectar y un reactivo de
deteccin. Si la muestra contiene el antgeno a detectar, ste se unir al conjugado
formando un complejo y migrar a travs de la membrana de nitrocelulosa, en caso contrario
migrarn el conjugado y la muestra sin unirse.

La zona de captura est formada por un segundo anticuerpo especfico contra otro eptope
del antgeno. Al llegar la muestra a esta zona, los complejos formados por la unin del
antgeno y conjugado quedarn retenidos y la lnea se colorear (muestra positiva). Si la
muestra no contena el antgeno no hay captura y la lnea quedara transparente en el caso
de una muestra negativa (De Frutos et al., 2004).

La zona control est formada por un tercer anticuerpo que reconoce al reactivo de deteccin.
Cuando el resto de muestra alcanza esta zona, el anticuerpo se unir al conjugado libre que
no ha quedado retenido en la zona de captura. Esta lnea es un control de que el ensayo ha
funcionado bien, porque se colorea siempre, con muestras positivas y negativas (Fig. 2).



Figura 2. Mtodo de inmunocromatografa.
Fuente: Martn, 2004
Los mtodos inmunolgicos detectan solamente Rotavirus del grupo A, ya que por el
momento no existen mtodos comercializados para detectar Rotavirus de grupos B y C. En
este caso particular el diagnstico de las infecciones por Rotavirus se realiza habitualmente
detectando la existencia de antgeno vrico en muestras de heces, con frecuencia la protena
VP6 (James et al., 1998).
El desarrollo de las tcnicas moleculares ha permitido la deteccin e identificacin de bajas
concentraciones de virus en muestras de diversos orgenes, proporcionando sensibilidad y
especificidad. Estas tcnicas detectan la presencia de RNA vrico, bien poniendo de
manifiesto segmentos de RNA bicatenario mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida
(PAGE), o bien amplificando por reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) (Monpoeho et
al., 2004; Coll, 1993).

El desarrollo de la tecnologa molecular ha provisto sensibilidad, especificidad y rpida
deteccin viral. El PCR se utiliza para detectar niveles de acido nucleico que estn presentes
en un nmero bajo de copias en las muestras ambientales (Soule et al., 2000). El PCR no
determina el estado infeccioso de un organismo solo puede determinar la presencia o
ausencia de secuencias de RNA o DNA especificas del patgeno. Una gran desventaja es la
sensibilidad de la polimerasa a la presencia de inhibidores los cuales pueden ser
concentrados con el virus (Gratacap-Cavallier et al., 2000)

Aunque las tcnicas anteriormente mencionadas son novedosas y especficas, el principal
problema que resulta de la aplicacin de las tcnicas de amplificacin genmica en
estudios ambientales, es la presencia de sustancias de diferente naturaleza qumica
capaces de inhibir la accin de las enzimas utilizados en la reaccin (Wilson, 1997).


Las expectativas estn enfocadas al desarrollo de tcnicas sensibles, especficas y de alta
reproducibilidad para la deteccin temprana de agentes virales que involucren un riesgo
para la comunidad, el trabajador y el medio ambiente.

2.2 EFECTO DE LAS CONDICIONES MEDIOAMBIENTALES SOBRE LA PARTCULA
VIRAL

La reutilizacin de lodos y compost para la agricultura implica un riesgo potencial para la
salud pblica debido a los virus y otros organismos patgenos provenientes de industrias,
hospitales e individuos afectados, que puedan estar presentes en los bioslidos y ser
potenciales contaminantes del ambiente, del hombre y de los animales.

La nica caracterstica que hace a un virus infectivo es la capacidad de producir una
progenie. Por consiguiente el efecto de las condiciones medioambientales sobre la partcula
viral implica la variedad de factores fsicos y qumicos que afectan su infectividad entre otras
caractersticas propias de estos agentes.

La tasa de sobrevivencia de virus es una consideracin importante en el tratamiento de
residuos slidos municipales, domsticos y animales la cual no ha sido evaluada
adecuadamente. Numerosos estudios de campo y a nivel de laboratorio han establecido que
la retencin y la sobrevivencia de los virus estn influenciadas por factores como el tipo de
material, pH, presencia de materia orgnica disuelta, concentracin total de slidos
disueltos, cationes polivalentes y orgnicos y caractersticas de la partcula viral como su
punto isoelctrico e hidrofobicidad (Williamson et al., 2005; Schwatzbrod, 1995, OMS, 1979).


2.2.1 Adsorcin viral a partculas slidas

Los virus entricos tienen una mayor estabilidad cuando estn adheridos a partculas
slidas, por lo tanto se espera que se concentren en lodos, residuos orgnicos, sedimentos y
suelos donde su permanencia en el tiempo ser mayor, aunque presentan diferencias con
respecto a la eficacia de adhesin, los slidos a los cuales se adsorben y las condiciones
que favorecen el proceso (Lucena et al., 2005).

La adsorcin viral a slidos se debe a la naturaleza anftera de las protenas virales
externas que permiten establecer interacciones electrostticas especialmente de tipo

hidrofbico. Estas interacciones son las responsables de la adsorcin de partculas virales a
superficies slidas y en la interfase aire agua. Las superficies virales pueden tener
dominios hidrfilos e hidrfobos. La parte hidrfoba de una partcula viral depende de cmo
estn sus dominios equilibrados y orientados en la superficie (Thompson et al., 1998).

El riesgo de contaminacin de aguas subterrneas a partir de bioslidos puede estar
asociado principalmente con el virus, debido a su tamao relativamente pequeo y a la
adsorcin variable a las partculas del suelo (Chauret et al., 1999).

2.2.2 Virus en el suelo

La supervivencia y destino de los virus entricos en el suelo es una consideracin importante
debido a los riesgos potenciales para el humano y los animales. Esta supervivencia se
encuentra influenciada por factores como el tipo de suelo, las caractersticas qumicas del
agua de riego, el pH, y las concentraciones de slidos totales disueltos, cationes
polivalentes y orgnicos (Sobsey, et al., 1980).

La textura del suelo determina la retencin y transporte de las partculas virales en el
ecosistema suelo. Los suelos arcillosos pueden retener mayor cantidad de agua que los
suelos arenosos, no obstante el fenmeno de evaporacin de agua ocurre a mayor
velocidad en las arcillas debido al alto contenido mineral. Lo mismo ocurre con la
concentracin de partculas virales ante la reduccin del contenido de agua disponible en el
suelo para la actividad biolgica (Straub et al., 1992). El fenmeno de adsorcin viral a las
fracciones de materia orgnica y arcilla tambin determina la viabilidad de los virus en el
suelo protegiendo a los viriones de la accin de enzimas lticas como nucleasas y de otros
factores antagnicos propios de este ecosistema (Sylvia et al., 2005).

Algunos virus estn adaptados para persistir en el suelo por varios aos siendo importante la
cantidad relativa de arcilla y materiales hmicos presentes que pueden mejorar la
supervivencia viral. Por lo tanto, al incrementar la cantidad de arcilla y materia orgnica en
un suelo la cantidad de virus presentes puede ser mayor (Straub et al., 1992). La presencia
de materia orgnica es un factor determinante en el transporte y retencin de virus en
medios porosos ya que inhibe la transferencia de partculas virales y promueve interacciones
hidrofbicas entre estas y la superficie granular del suelo (Zhuang y Jin, 2003). En el caso de
los virus entricos humanos entre los que se encuentra el Rotavirus, estn adaptados para
sobrevivir en el suelo por das o meses (Sylvia et al., 2005., Guardabassi et al., 2003).


Los virus presentes en aguas contaminadas, lodos y compost pueden pasar a travs del
suelo, alcanzar y contaminar aguas subterrneas. El fenmeno de migracin viral se hace
ms intenso en temporada de lluvia o por irrigacin excesiva de los cultivos de suelo, de
igual forma debido a que la supervivencia de los virus en el suelo est determinada por
diversos factores su tiempo de permanencia en este ecosistema varia de 11 a 180 das
(Tabla 5).

Tabla 5. Tiempo de supervivencia de virus en el suelo

Agente viral Tipo de suelo y tiempo de supervivencia
Poliovirus 91 das en suelos arenosos y condiciones hmedas; 180 das en suelos
arenosos saturados y compost
Hepatitis A 91 das en suelos arenosos y condiciones hmedas
Coxsackievirus
A
180 das en suelos arenosos saturados y compostaje
Coxsackievirus
B
180 das en suelos arenosos saturados y compostaje
Echovirus 3-33 semanas dependiendo de las condiciones del suelo

Fuente: (Schwartzbrod, 1995)
Keswick y Gerba (1980) evaluaron los factores que controlan la supervivencia de los virus y
pudieron comprobar que la desactivacin era mucho ms rpida cerca de la superficie del
perfil del suelo Esto se debera a los efectos dainos los microorganismos aerbicos del
suelo, a la evaporacn y a las elevadas temperaruras en las zonas prximas a la superficie.
As, la supervivencia de los virus aumentara segn el grado de penetracin de los suelos.
2.2.3 Temperatura

La temperatura es uno de los factores ms importantes que determinan la supervivencia del
virus y su persistencia. Esta persistencia puede ser afectada por temperaturas elevadas por
medio de varios mecanismos como denaturacin de la protena de la cpside, dao del RNA
e influencia microbiana o actividad enzimtica (Len et al., 2005). Algunos estudios han
indicado, que una de las razones para la inactivacin viral a temperaturas altas es el dao en

las protenas del virus, mientras en temperaturas bajas cercanas a la congelacinlos virus
persisten por periodos ms largos. Yeager y 0'Brien (1979) constataron que el perodo de
supervivencia del virus de polio dependa de la temperatura: en suelos saturados y a una
temperatura de 37C, los virus sobrevivan cerca de 12 das; al reducirse la temperatura a
22C el lapso de supervivencia alcanzaba 92 das, l legando hasta 180 das cuando la
temperatura era de 4C.

Las temperaturas ms bajas generalmente refuerzan la supervivencia del virus y la mayora
de estos pueden permanecer en temperaturas de congelacin manteniendo su infectividad
por periodos largos de tiempo (Sobsey y Meschke, 2003).

La temperatura est implicada en la destruccin de Rotavirus fuera de la clula hospedera,
la inactivacin a altas temperaturas produce daos principalmente en la porcin proteica del
virin (Ashley y Ward, 1978). Un ejemplo de esto es el compostaje, el cual es un proceso de
estabilizacin dependiente del calor, y las temperaturas alcanzadas durante el tratamiento
(55 70C) parecen ser suficientemente altas para eliminar los microorganismos entricos
siendo capaces de disminuir la cantidad viral entre 3 y 4 unidades logartmicas.

Se ha demostrado que el Rotavirus es capaz de ser infectivo, despus de ser mantenido 7-9
meses a temperatura ambiente (18-20C), en heces (Ramos et al., 1998). La deshidratacin
tambin juega un rol importante en la inactivacin viral por ruptura de la cpside del virus y la
remocin del cido nucleico (Monpoeho et al., 2004)

Con la temperatura interactan otros factores como el contenido de humedad del material a
compostar y la presencia de sustancias qumicas. Los virus son menos sensibles a la
inactivacin por calor en ambientes con humedad reducida. La disminucin en el contenido
de humedad de lodos por evaporacin reduce significativamente las tasas de inactivacin
por calor de Enterovirus y Reovirus (Ashley y Ward, 1978).

Aunque 60C puede ser la temperatura adecuada para la denaturacin de protenas y
conducir a la inactivacin de la cepa viral, las poblaciones de Rotavirus son heterogneas y
pueden incluir viriones termorresistentes (Ciartlet et al., 2002).





2.2.4 pH

El pH del suelo, adems de seleccionar los organismos adaptados a vivir en un pH
concreto, determina la carga neta de sustancias anfteras y condiciona la adsorcin de los
organismos al complejo adsorbente del suelo. A valores de pH menores a cinco los virus se
adsorben como cationes a las partculas coloidales cargadas en el suelo, cuando el pH
supera este valor la carga elctrica viral se hace menos positiva y la adsorcin se reduce.
Generalmente el proceso de adherencia se incrementa cuando el pH decrece y aumenta la
salinidad de la solucin de suelo (Sobsey y Meschke, 2003).

Las partculas de Rotavirus son estables en un rango de pH de 5 a 9, en general no son
sensibles al cido y por lo tanto pueden sobrevivir con valores de pH entre 3 y 5. En
contraste la exposicin a valores elevados de pH puede resultar en la inactivacin viral por
prdida de protenas (Ciartlet et al., 2002).

2.2.5 Radiacin solar
El principal factor inactivador en sistemas a cielo abierto es la radiacin solar. Segn
Campos, 2003 la radiacin solar es un factor inactivador relevante, sin dejar de lado que la
inactivacin natural se produce como la suma de varios factores (predacin por protozoos,
estrs osmtico, adsorcin a partculas y deficiencias de nutrientes).
En un estudio realizado por Gerba, et al., 2002 se determinaron las dosis de radiacin
ultravioleta para inactivar virus entricos hasta en tres unidades logartmicas, y se encontr
que los virus con dsDNA (DNA de doble cadena) son ms resistentes en comparacin con
otros virus a la inactivacin por rayos UV (Tabla 6).







Tabla 6. Dosis requeridas de luz UV para la inactivacin de virus

Virus 90% 99% 99.9% 99.99%
Echovirus 8 16.5 25 33
Coxsackievirus 9.5 18 27 36
Poliovirus 8 15.5 23 31
Adenovirus 40 78 119 160
Fuente: (Gerba, et al., 2002)
La inactivacin se presenta como un fenmeno integrado, debido a fenmenos de foto-
oxidacin generados por la radiacin solar, materia orgnica y catalizada por el oxgeno.
Adems esta influenciada por el color tal como ocurre en los residuos urbanos y en el caso
de aguas por su turbidez que permite la absorcin de la radiacin solar (Knight, 1975). Este
fenmeno unido a fluctuaciones del pH, induce cambios conformacionales de la cpside de
las partculas virales alterando su infectividad.
La luz ultravioleta causa la inactivacin viral sin ocasionar la ruptura de las cadenas de
polinucletidos sino por modificaciones en las mismas tales como formacin de enlaces
covalentes en los residuos de timina en el DNA viral o en los residuos de uracilo en el caso
del RNA formando dmeros de nucletidos en ambas cadenas, formacin de derivados de 5
hidroxi, 6 hidroxi en las molculas de pirimidinas, lo cual es de suma importancia en la
inactivacin de virus (Knight, 1975).

2.2.6 Compuestos qumicos

Los principales agentes qumicos que inactivan virus incluyen enzimas como fosfolipasas y
proteasas, protenas denaturantes, agentes oxidantes, cidos y bases y agentes que afectan
los grupos amino primarios como el formaldehido y el cido nitroso (Sobsey, 1986).

La concentracin y el tipo de sales presentes en el ambiente tambin influyen sobre el
transporte y sobrevivencia de virus entricos. Los cationes, en especial aquellos que son
multivalentes como el calcio (Ca
2+
) y el magnesio (Mg
2+
) tienen la capacidad de formar
Exposicin UV (mW/cm
2
) necesaria para inactivacin viral

puentes entre las superficies slidas y los virus mejorando significativamente la adsorcin.
De igual forma determinan el nmero de sitios disponibles para el enlace como tambin el
nmero de puentes que pueden ser formados entre estas dos superficies (Bitton y Harvey,
1992; Simoni et al., 2000).

La materia orgnica disuelta disminuye la adsorcin viral ya que compite por los sitios de
unin sobre el material particulado debido a la similitud de las cargas elctricas entre este
material y los virus (Williamson et al., 2005).


2.3 COMPOSTAJE

El compostaje es una tcnica utilizada desde hace mucho tiempo en la agricultura,
consistente en el apilamiento de diferentes tipos de residuos tales como residuos urbanos,
restos de cosecha, excrementos animales entre otros, con el fin de obtener un producto
aprovechable para el suelo.

Uno de los principales objetivos del proceso es estabilizar la materia orgnica presente en
los residuos orgnicos que comprenden una amplia gama de diferentes materiales, desde
los mas sencillos como las protenas, grasas y azucares, hasta los mas complejos y
recalcitrantes como celulosa, hemicelulosa y lignina (Avendao, 2003).

Inicialmente, la materia orgnica seleccionada es atacada por microorganismos
descomponedores cuyo crecimiento exotrmico eleva la temperatura de la masa hasta los
75C. En esta fase se seleccionan microorganismos t ermfilos y aerobios debido a los
sucesivos volteos de la masa en la zona de fermentacin. Durante esta primera fase
termfila con una duracin aproximada de 15 das (vara de acuerdo con los residuos) se
espera que los patgenos, larvas de insectos y semillas de malezas sean eliminados,
garantizando de esta forma sanitariamente el producto final obtenido (Sylvia et al., 2005). La
eliminacin total de los patgenos concluye con la accin antibitica generada por
numerosos hongos y actinomycetes aerobios (Avendao, 2003). Finalmente, el producto
comienza la fase de maduracin hasta que se obtiene un producto estable de color oscuro.

Adems de la temperatura, la reduccin de patgenos en el compostaje es posible tambin
por competencia con otros organismos ms adaptados al ambiente en el compost. Aunque
durante el proceso de compostaje se alcanza una alta temperatura, en ocasiones esto no

garantiza la eliminacin total de los patgenos presentes tales como huevos de helminto y
Salmonella sp y estructuras reproductivas de hongos. Adicionalmente luego de una
desinfeccin del compost existe el riesgo de reaparicin o multiplicacin de patgenos; este
riesgo es drsticamente reducido si el material a compostar es tratado aerbica o
anaerbicamente antes de ser incorporado al proceso (Bjorklund et al., 2003).

Los residuos orgnicos ocupan en el mundo un lugar prioritario ya que constituyen
entre el 30 y el 65 % de los residuos domiciliarios y ms del 85% de los residuos
considerados agrcolas (Sztern y Pravia, 1999). Es por esta razn que la tendencia actual es
la reduccin sustancial del volumen de los residuos cuya fraccin orgnica ser la materia
prima de los procesos de compostaje.

Actualmente, el uso de inoculantes termoflicos es una alternativa viable en el tratamiento
de residuos vegetales y residuos slidos orgnicos. La gran estabilidad que presentan las
enzimas de estos microorganismos frente a temperaturas extremas, garantiza una capacidad
de degradacin mayor que la obtenida por gneros microbianos mesfilos. La utilizacin de
inoculantes biolgicos a partir de microorganismos mesfilos y termfilos ha trado grandes
beneficios en compostacin de residuos agrcolas, domsticos, industriales y hospitalarios.
As lo demuestran experiencias realizadas en varias zonas del pas, obteniendo un
rendimiento ptimo en la tasa de degradacin de cada tipo de residuos a tratar, sin alterar de
modo alguno la calidad del producto final; por el contrario, se logra la produccin de un
compost con alto contenido en elementos como nitrgeno, fsforo y potasio, que ayudan a
incrementar la viabilidad de los suelos (Moreno, 2001).

2.3.1 Etapas del proceso de compostaje segn la temperatura

La temperatura es un factor importante en el proceso de compostaje, refleja la actividad
biolgica de los microorganismos, siendo una de las condiciones ambientales determinante
de la rapidez con la cual los materiales son metabolizados. Es fundamental en la maduracin
del compost, ya que el aumento de la temperatura durante el proceso refleja una actividad
microbiana ptima y un equilibrio entre la aireacin, humedad y composicin de la mezcla
(Labrador, 1996).

La retencin y la continua generacin de calor estn influenciadas por las temperaturas
ambientales lo que se relaciona con el tamao de la pila, contenido de agua y relacin

Carbono/Nitrgeno de sus constituyentes, los de menor relacin Carbono/Nitrgeno
alcanzan mayores temperaturas (Mathur, 1991).

Durante el proceso se pueden encontrar cuatro fases de gran importancia dependiendo de la
actividad metablica de los microorganismos; la primera es la mesoflica, la segunda la
termoflica, la de enfriamiento y finalmente la de maduracin (Trautmann y Olynciw, 1999;
Coyne, 2000)

Inicialmente los residuos se encuentran a temperatura ambiente (fase de latencia), pero una
vez superado el tiempo de adaptacin de los microorganismos al medio, estos crecen y la
temperatura sube considerablemente alcanzando a los pocos das los 40C, esta primera
fase se denomina mesoflica, actan especialmente bacterias mesfilas, las cuales degradan
el material de fcil descomposicin produciendo cidos orgnicos que hacen bajar el pH
(Kent, 1991, Pez et al., 2000, Alfaro et al., 2001, Espaa y Barreto, 2002).

La temperatura sigue subiendo hasta alcanzar valores comprendidos entre 60-70C (fase
termoflica), aqu la microflora mesfila es sustituida por la termfila y el material ms difcil
de descomponer comienza a ser degradado. Si existen condiciones ptimas de humedad y
ventilacin se producen visibles emanaciones de vapor de agua. Estos microorganismos
transforman el nitrgeno en amoniaco y el pH del medio se hace alcalino, a los 60C los
hongos termfilos cesan su actividad y aparecen bacterias esporgenas y actinomicetos
(Avendao, 2003, Beffa et al., 1996, Arnedo et al., 2002, Nakamura et al., 2004). Adems se
produce una disminucin del carbono presente en el material, provocando el descenso de la
relacin C/N ya que se degradan sustancias como celulosa y lignina (Forgarty y Tuovinen,
1991) tambin en esta fase la mayora de los microorganismos patgenos, parsitos,
fitotoxinas y semillas de malas hierbas son destruidos (Avendao, 2003, Arnedo et al., 2002,
Dvila et al., 2002).

La temperatura mxima en la fase termoflica no debe superar los 70C, la configuracin
geomtrica de las pilas es un factor importante que afecta el comportamiento de la
temperatura, si esta es inadecuada se pueden alcanzar temperaturas demasiados altas,
siendo necesario reducir las dimensiones para permitir la prdida de calor y controlar la
evolucin de la temperatura (Madrid y Castellanos, 1997). El manejo de la temperatura
requiere cuidado y control, ya que as como la alta temperatura es capaz de sanitizar
patgenos, tambin puede terminar con la flora benfica, las enzimas responsables de la

degradacin se desnaturalizan y se convierten en no funcionales, provocando que los
microorganismos no puedan nutrirse de manera adecuada (Graves, 2000)

El CO
2
se produce en volmenes importantes que difunden desde el centro a la superficie de
la pila. Este gas, juega un papel fundamental en el control de larvas de insectos, dado que
concentraciones altas de CO
2
resultan letales para las larvas (Graves, 2000).

La etapa de maduracin o de estabilizacin, se encuentra marcada por una baja tasa de
actividad microbiana, al agotarse los sustratos se produce una cada gradual de la
temperatura, la cual es igual a la del medio ambiente, lo que indica el trmino de la
elaboracin del compost. (Avendao, 2003, Arnedo et al., 2002).

Durante esta etapa los productos resultantes de la etapa termoflica del compostaje se
estabilizan, lo que involucra una descomposicin ms avanzada de cidos orgnicos, una
disminucin de los compuestos resistentes y la formacin de compuestos hmicos. Se debe
continuar con un manejo apropiado de la humedad y oxgeno para mantener la actividad
microbiana (Graves, 2000).

2.3.2 Factores que condicionan el proceso de compostaje

Relacin Carbono / Nitrgeno (C/N)

La relacin C/N, expresa las unidades de Carbono por unidades de Nitrgeno que contiene
un material. El Carbono es una fuente de energa para los microorganismos y el Nitrgeno
es un elemento necesario para la sntesis proteica. Una relacin adecuada entre estos dos
nutrientes, favorecer un buen crecimiento y reproduccin.

La proporcin C/N es considerada crtica en la determinacin del grado de descomposicin y
debe ser establecida con base al carbono disponible. En general, una relacin de 30:1 es
considerada ideal, pues altas proporciones tienden a retardar el proceso de descomposicin,
mientras que proporciones menores a 25:1 pueden generar problemas de olores. Cuando el
nitrgeno se encuentra en exceso, este se pierde como amoniaco gaseoso causando olores
indeseables en el mismo compost, ya que hay una produccin de cadaverina y putrescina
causantes de este fenmeno por desaminacin, en contraste al haber poco nitrgeno se
reduce la poblacin microbiana y al mismo tiempo la velocidad de compostaje (Avendao,
2003; Sztern y Pravia, 1999).


El compost final debe tener una relacin de C:N 15 a 20:1 (EPA, 1995). Mientras la
compostacin ocurre, la concentracin (C/N) decrece gradualmente de 30:1 a 10:1-15:1 para
la terminacin de los productos del compostaje. Esto se debe a que en cada tiempo en que
la materia orgnica es consumida por los microorganismos, dos terceras partes del carbono
son desprendidas como dixido de carbono y la tercera parte restante es incorporada junto
con el nitrgeno en las clulas microbianas lo que refleja la descomposicin de la materia
orgnica y su estabilizacin (Trautmann y Olynciw, 1999; Jrgen et al., 1992).

Los residuos de origen vegetal presentan por lo general una relacin C/N elevada. Las
plantas y montes contienen ms nitrgeno cuando son jvenes y menos en su madurez. A
diferencia de los residuos de origen animal que comnmente presentan una baja relacin
C/N (Tabla 7).
Tabla 7. Principales caractersticas de algunos materiales orgnicos
Material %N C:N Humedad %
Estircol Vacuno 1.5 4.2 11 30 67 87 Residuos de origen animal
Contenido ruminal 9.6 85.8
Plaza 1.9 2.9 14 16 69 Residuos Municipales
Cascarilla de arroz 1.9 6.2
Cortes de pasto 2.0 6.0 9 25 -
Hojas 0.5 1.3 40 80 -
Residuos vegetales
Cortes de poda 1.5 25 - 30 20 30
Fuente: (Avendao, 2003, Ministerio de Minas y Energa, 1990, Falla Cabrera, 1995)

Oxgeno

El compostaje es considerado un proceso aerbico, por lo cual requiere oxigeno. Las
condiciones anaerobias con deficiencias de oxgeno pueden producir olores. La
descomposicin puede ocurrir bajo ambas condiciones aerobia y anaerobia, sin embargo la
descomposicin aerbica ocurre mucho ms rpido.

El oxgeno es esencial para el metabolismo y la respiracin de los microorganismos
aerobios, para oxidar las molculas orgnicas presentes en los residuos, por lo tanto es un
parmetro a controlar. La aireacin tiene varios objetivos, mezclar los materiales, evitar
compactacin, crear nuevas superficies de ataque para los microorganismos, aportar el

oxgeno suficiente y permitir al mximo la evacuacin del dixido de carbono producido.
(Avendao, 2003)

La concentracin de oxgeno depende de la textura, humedad del material a compostar,
frecuencia de volteo y tasas de utilizacin, y suministro si se controlan estos factores se
favorecer la proliferacin de bacterias, hongos y actinomycetes disminuyendo as la
presencia de microorganismos anaerobios (Pez et al., 2000). Entre el 10 y el 15 % en
concentracin de oxgeno es considerado adecuado, aunque una concentracin del 5%
puede ser suficiente. Si la concentracin de oxigeno es ms alta, puede afectar
negativamente el proceso de compostaje causando problemas como la remocin del calor y
el enfriamiento de la pila, tambin puede promover el exceso de evaporacin, lo cual hace
ms lento el proceso (EPA, 1995).

La pila de compost debe tener suficientes espacios vacos para permitir el libre movimiento
del aire, el ingreso del oxgeno que viene de la atmsfera y la liberacin del dixido de
carbono y otros gases. En algunas operaciones de compost, el aire puede ser inyectado
mecnicamente o empujado hacia las pilas para mantener los niveles adecuados de
oxgeno. En otras situaciones la pila es volteada frecuentemente para exponer los
microorganismos a la atmsfera y tambin para crear ms espacios vacos en la pila.

La aireacin es la forma ms rpida y econmica de garantizar el flujo de oxigeno, de la
misma manera, la forma de la pila es importante para una lograr una buena aireacin porque
de ella depende el flujo de oxigeno hacia el interior de la masa. El volteo adems intenta que
todas las zonas de la pila tengan una temperatura uniforme favoreciendo la descomposicin
y elimina malos olores (Martnez-Almela et al., 2001; EPA, 1995; Dvila et al., 2002)

Humedad

Debido al carcter aerbico del proceso de compostaje, exige una relacin entre la
estructura de los materiales que van a transformarse y la humedad, ya que un exceso de
agua puede desplazar el aire necesario para la actividad microbiana, dando paso a una
descomposicin anaerbica (EPA, 1995).

Los microorganismos requieren agua para la formacin de biomasa. Se necesita una
humedad alta al iniciar el proceso cuando la actividad es ms intensa y un poco menos a
medida que se avanza en la descomposicin. Se busca inicialmente de 30 70% de

humedad y ello se alcanza con la humedad propia de la mezcla o aadiendo agua. En los
procesos donde se hacen volteos para reactivar el proceso, se acostumbra rehumedecer y
entonces la temperatura se eleva de nuevo. Para aprovechar el agua de descomposicin del
proceso se propone el compostaje solarizado que consiste en tapar la pila con un plstico
que permita aireacin y de paso evita el lavado de nutrientes en pilas colocadas a la
intemperie (Gmez, 2002).

Porcentajes de humedad superiores a los valores indicados produciran un
desplazamiento del aire entre las partculas de la materia orgnica, con lo que el medio se
vera anaerobio, favoreciendo los metabolismos fermentativos y las respiraciones
anaerbicas. Si la humedad se sita en valores inferiores al 10%, desciende la actividad
biolgica general y el proceso se vuelve extremadamente lento (Galindo et al., 2005).

El contenido en humedad de los desechos orgnicos crudos es muy variable, tal es el caso
de la excretas y estircoles, donde el contenido en humedad est relacionado con la dieta.
Si la humedad inicial de los residuos crudos es superior a un 50%, se debe buscar la
forma de que el material pierda humedad, antes de conformar las pilas

El contenido de humedad en el caso de los residuos vegetales (tallos, fibras, cutculas,
cscaras, bagazos, rastrojos, restos de podas, frutas) es relativo dependiendo de varios
factores como: caractersticas de las especies cultivadas, ciclo del cultivo, tiempo de
exposicin a los factores climticos y manejo (Sztern y Pravia, 1999).

pH

El compostaje puede desarrollarse dentro de un amplio rango de pH (311), se consideran
ptimos los valores de pH comprendidos entre 5 y 8. Las bacterias prefieren un medio casi
neutro, mientras que los hongos se desarrollan mejor en medios ligeramente cidos (Graves,
2000).

El pH afecta la cantidad de nutrientes disponibles para los microorganismos, la solubilidad
de metales pesados y en la actividad metablica de la poblacin microbiana. El pH puede
ser ajustado con cal y azufre si es necesario disminuir o aumentar la acidez. Durante el
proceso se produce dixido de carbono, el cual, cuando se combina con agua produce cido
carbnico. El cido carbnico puede reducir el pH del compost. A medida que el proceso de

compostaje progresa, la variacin del pH final depende del tipo especfico del material usado
y las condiciones de operacin (EPA, 1995).


Tamao de partcula

El tamao de partcula del material a compostar es decisivo. A medida que se desarrollan las
fases del compostaje, se presenta un proceso natural de reduccin del tamao, debido a que
las partculas ms pequeas usualmente tienen mayor rea superficial facilitando la
actividad microbiana y por consiguiente una rpida descomposicin. Sin embargo, si todas
las partculas son picadas finamente, se aglomeran y disminuyen los espacios vacos,
dificultando la circulacin del aire y la respiracin de los microorganismos (EPA, 1995).

El tamao de las partculas promueve la difusin de oxgeno. La mezcla de diferentes
tamaos de partculas permite la aireacin y puede ser efectiva en el establecimiento y
mantenimiento de un contenido apropiado de humedad para el compostaje. La cascarilla de
arroz, la viruta de madera y trozos de cartn son agentes espumantes comunes (Sylvia et
al., 2005). El tamao ideal es de 2 a 5 cm.

2.3.3 Calidad de Materias Primas

El manejo de residuos orgnicos ha adquirido especial importancia, principalmente para la
produccin de abonos orgnicos con el objetivo de suplementar los nutrientes que las
plantas son capaces de obtener por s mismas.

En virtud de la aplicacin de estos productos en sistemas de cultivo dedicados al consumo
humano y teniendo en cuenta la presencia de materiales orgnicos de origen animal, es
importante realizar un seguimiento de parmetros qumicos y biolgicos que permitan
evaluar la estabilidad e inocuidad del producto final. Lo anterior atendiendo a lo estipulado
por el Instituto Colombiano Agropecuario (ICA) y el Instituto Colombiano de Normas
Tcnicas y Certificacin (ICONTEC), quienes establecen que todo producto cuyo origen
declarado sea materia orgnica fresca debe ser sometido a procesos de transformacin que
aseguren su estabilizacin agronmica tales como: compostaje o fermentacin. (Barreto,
2003).


Dentro del proceso de compostaje pueden utilizarse material vegetal como la cascarilla de
arroz, producto residual resultante del procesamiento del grano de arroz, el cual constituye
aproximadamente un 21% de la cosecha de arroz. Esta posee caractersticas qumicas,
fsicas, energticas y bromatolgicas que dificultan en algunas ocasiones su manejo y
aprovechamiento (Arbelez, 2001).

La cascarilla de arroz se ha convertido en un problema ambiental significativo, puesto que se
generan volmenes inmanejables de este subproducto (en Colombia anualmente se genera
alrededor de 288.398 toneladas de cascarilla de arroz) para los cuales existe una demanda
insuficiente de su aprovechamiento (Ministerio de minas y energa, 1990). Es un residuo de
difcil biodegradacin debido a su alto contenido de celulosa (37.2 43.4% en peso) y cuya
relacin C/N es de 113 1120 (Ministerio de Minas y Energa, 1990; Rodrguez, 2000).

Dentro del compostaje este material permite neutralizar el exceso de humedad y una
adecuada descomposicin de los residuos al tener un bajo contenido de agua.
Adicionalmente mejora la estructura fsica del producto final, facilitando la aireacin,
absorcin de la humedad de la filtracin de nutrientes en el suelo, favorece el incremento de
la actividad macro y microbiolgica del abono y puede alcanzar, en muchos casos, hasta
una tercera parte del total de los componentes de los abonos orgnicos (Rodrguez, 2000).

Los residuos de plaza son residuos orgnicos provenientes de actividades agropecuarias
mientras que las podas son generadas en parques y reas verdes. En general, los
materiales que son verdes y hmedos (cortes de pasto, residuos de frutas y verduras)
poseen alta concentracin de nitrgeno y los que son leosos y secos (hojas de otoo,
virutas de madera, aserrn, papel, entre otros) una alta concentracin de carbono.

Dentro de los materiales de origen animal puede mencionarse el contenido ruminal; uno de
los contaminantes con mayor impacto ambiental ya que produce una alta carga orgnica en
fosas spticas, basureros municipales y aguas residuales. Es un producto obtenido de la
matanza en los mataderos y representa el alimento ingerido por los animales poligstricos
que es desechado al momento del sacrificio (Uicab-Brito et al., 2003).

Es una mezcla de material no digerido de consistencia blanda, de color amarillo verdoso y
un olor caracterstico muy intenso cuando est fresca, adems posee gran cantidad de flora
microbiana y productos de la fermentacin ruminal (Cadavid, 2001). De igual forma su
composicin qumica es poco variable, debido a que la alimentacin de los bovinos es

bsicamente de pasto y ciertas combinaciones con melazas, por lo que se encontrara alta
concentracin de celulosa, hemicelulosa, lignina y un bajo contenido en grasas, protena y
ceras.

2.3.4 Patgenos en compost
En el compostaje se pueden encontrar gran variedad de patgenos, los cuales son
eliminados a una temperatura promedio entre 55 y 65C en intervalos de tiempo que van de
24 horas a tres das (Negro et al., 2003).
Uno de los factores ms importantes que afectan los microorganismos entricos
inactivndolos es la temperatura (Sesay et al., 1998). Entre los patgenos ms importantes
que representan un riesgo para animales y humanos se encuentran Salmonella sp y E. coli,
los cuales son eliminados en las pilas de compost a una temperatura de 60C durante 3
semanas fcilmente cuando hay una aireacin suficiente. Sin embargo, la uniformidad de la
preparacin del abono no ha sido bien investigada o documentada en las aplicaciones
prcticas. Adems, investigaciones preliminares demuestran que el recrecimiento de
poblaciones indetectables es posible si los residuos no han sido transformados
completamente en abono (Droffner y Brinton, 1995).

Nuevos organismos patgenos han despertado el inters en el campo de los abonos
orgnicos y lodos incluyendo bacterias como E. coli O157:H7, Listeria sp y Helicobacter;
virus como Poliovirus, Coxsackievirus, Echovirus, Hepatitis A y Rotavirus y parsitos como
Cryptosporidium, Cyclospora, Toxoplasma, Microsporidia y Giardia. La presencia y
persistencia de los patgenos anteriormente mencionados depende de regmenes de
tratamiento, incluyendo su supervivencia en el suelo y en los cultivos luego de la aplicacin
de los residuos tratados (Gerba y Smith, 2005). Por esta razn, se hace necesario la
estandarizacin y validacin de los mtodos microbiolgicos para su deteccin.
Se han detectado en plantas de compostaje elevadas concentraciones ambientales, en
forma de bioaerosoles, de esporas fngicas, bacterias gram negativas, actinomicetos
termfilos y endotoxinas, por lo que la principal va de exposicin es la inhalatoria.
Los distintos estudios ambientales realizados muestran que las concentraciones de hongos
halladas en distintas partes del proceso varan entre 10
5
y 10
7
UFC (unidades formadoras de
colonias) por m
3
; las concentraciones de bacterias Gram negativas que se han determinado
en la mayora de estudios superan las 10
4
UFC/m
3
; en cuanto a actinomicetos termfilos, se

han determinado concentraciones entre 10
5
y 10
8
UFC/m
3
. Las concentraciones de
endotoxinas en aire se hallan en la mayora de estudios alrededor de 30-40 ng/m
3
aunque en
algn caso se han superado los 3000 ng/m
3
(Alonso et al., 2007)
La destruccin de patgenos durante la fase termfilica permite la obtencin de un abono
orgnico no contaminante. En la Tabla 8 se muestra la temperatura y el tiempo necesarios
para la destruccin de algunos patgenos y parsitos ms comunes que pueden estar
presentes en el residuo a compostar (Negro et al., 2003). Adems, los patgenos no se
destruyen solamente por la temperatura, sino tambin por la competencia de nutrientes y las
interacciones antagnicas microbianas (Ministerio del Medio Ambiente, 1999).
Es importante hacer una prueba de calidad al compost final pues todo fertilizante o
acondicionador orgnico de origen no pedogentico, deber demostrar ausencia Salmonella
sp en el producto final y menos de 100 UFC/g de enterobacterias totales. Adems, si alguna
de las materias primas es de origen vegetal, debern estar exentos de fitopatgenos de los
gneros Fusarium sp, Botrytis sp, Rhizoctonia sp, Phytophtora sp y huevos de helminto
(ICONTEC, 2004).

Tabla 8. Microorganismos patgenos asociados a compost
Microorganismo Gneros Temperatura y tiempo
de exposicin
Virus Rotavirus, Parvovirus, Adenovirus, Hepatitis
A, Poliovirus, Echovirus, Coxsachivirus,
Calicivirus, Astrovirus
Umbral ms alto que
otros microorganismos
Bacterias Salmonella, sp, Shigella sp, Mycobacterium
tuberculosis, Vibrio cholerae, Escherichia
coli, Yersinia enterocolitica, Clostridium
perfringens, Clostridium botulinum, Listeria
monocytogenes
55 60C durante una
hora de exposicin
Hongos Candida sp, Aspergillus fumigatus 55 70C durante una
hora de exposicin
Protozoarios Entamoeba sp, Giardia lamblia, Balantidium
coli, Criptosporidium parvum
Umbral ms alto que
otros microorganismos

Helmintos Ascaris lumbricoides, Ancylostoma sp,
Trichuris trichura, Tenia saginata
Mueren en menos de una
hora a temperaturas
superiores a 55 C.
Fuente: (Los Autores, 2007, Adaptado de Muoz, 2005)

Por otro lado, los patgenos que se encuentran en los excrementos de los rumiantes
utilizados como materia prima de compostaje, sobreviven en el medio ambiente segn
caractersticas propias del suelo, temperatura y humedad, estos pueden sobrevivir en el
suelo por un ao o ms (Tabla 9).

Los bacterifagos que han sido aislados del fluido ruminal infectan bacterias como:
Streptococcus durans, Streptococcus bovis, Serratia sp, Bifidobacterium ruminale,
Methanobrevibacter sp y Fusobacterium necrophorum. Adicionalmente se han encontrado
fagos parsitos obligados de Streptococcus bovis similares a fagos lambda de Escherichia
coli (Bauchop y Klieve, 1988).

Tabla 9. Patgenos que se pueden encontrar en el contenido ruminal

Patgenos Supervivencia en suelo Supervivencia en pastos
Listeria sp. 2 semanas 4 aos 128 das
Escherichia coli 1 mes 1 ao 99 das
Cryptosporidium parvum 1 mes 1 ao 30 das
Salmonella sp. 2 semanas 1 mes 63 das
Campylobacter sp. 1 mes -

Fuente: (Crohn et al., 2007)

Finalmente es tradicional el uso del proceso de compostaje para la estabilizacin de
excrementos animales como porquinaza, caprinaza y gallinaza considerados como
subproductos de explotacin porcina, caprina y avcola respectivamente donde es de vital
importancia la identificacin de microorganismos propios de cada uno de estos materiales y
que representen un riesgo para humanos y animales.





2.3.5 Control de calidad del producto final

El compost es un producto reconocido para su uso en agricultura y jardinera como fuente de
materia orgnica, nutrientes y oligoelementos de liberacin lenta. Usualmente se utilizan
parmetros fsico-qumicos y microbiolgicos como ndices o requerimientos de calidad del
compost.

Una vez el proceso de compostaje ha finalizado se espera llegar a obtener ndices
especficos para garantizar la calidad de un abono orgnico, definido como un producto
slido obtenido a partir de la estabilizacin de residuos slidos urbanos o mezcla de los
anteriores que contiene materia orgnica como carbono orgnico (ICONTEC, 2004).

Los anlisis qumicos y fsico-qumicos ms comunes incluyen pH, conductividad elctrica,
amonio, C y N total o solubles en agua, capacidad de intercambio catinico y cidos grasos
voltiles. En el caso de los parmetros microbiolgicos, son utilizados como medida de
garanta higinica y sanitaria para el uso del compost y para verificar la eficiencia del
proceso de compostaje. Se basan en la eleccin de una serie de microorganismos con
carcter de indicador y test, habindose determinado con carcter previo una correlacin
entre la presencia y concentracin de los mismos con el conjunto o la mayora de las
especies patgenas (Fernndez et al., 2004).

Dentro de los parmetros que en Colombia se requieren para la determinacin de este
producto se incluyen prdidas por volatilizacin (ND), contenido de cenizas (mx. 60%),
contenido de humedad (mx. 35%), contenido de carbono oxidable total (min. 15%),
capacidad de intercambio catinico (min. 30meq/100g), pH (<4 y >9), densidad (mx.
0.6g/cm
3
), conductividad elctrica ds/m (ND), capacidad de retencin de humedad (su propio
peso), relacin C/N (ND) y N, P, K (< 1%) (ICONTEC, 2004).

Los abonos orgnicos incorporados, que han sido parte de la materia orgnica presente,
son uno de los factores ms importantes para determinar la productividad del suelo en
forma sostenible, convirtindose en el factor principal a ser considerado cuando se plantea
un manejo ecolgico del suelo; es por esto que se recomienda un anlisis de
caracterizacin, que permita conocer los componentes fisicoqumicos y sanitarios del
producto, mostrando los elementos de calidad que permitan su uso a nivel agroindustrial. En
la tabla 10 se especifican los parmetros fsicos, qumicos y microbiolgicos que debe tener
el producto compostado segn las diferentes normativas nacionales e internacionales.


La normatividad existente para definir la calidad de abonos orgnicos en el pas no incluye
dentro de sus parmetros microbiolgicos la bsqueda y deteccin de virus entricos. Por tal
razn y teniendo en cuenta la normatividad de la Agencia de Proteccin Ambiental EPA
1999, es de vital importancia ampliar el rango de patgenos que deben ser identificados
dentro de las enmiendas orgnicas y acondicionadores de suelo; entre ellos virus entricos.


Tabla 10. Indicadores microbiolgicos de calidad de compost.

PARAMETRO ICONTEC ICA CHILE
Coliformes fecales

- Ausencia < 1000 NMP/g de compost Base Seca
Estreptococos fecales - - -
Enterobacterias totales < 100
Salmonella s.p Ausencia Ausencia Ausencia
Huevos de helminto
viables
- - Ausencia
Virus MS-2 - - Densidad mxima < 1 UFP/4g de compost
Base Seca
Listeria monocytogenes - - Ausencia
Clostridium perfringens - - 10
3
/g de compost

Fuente: (ICONTEC NTC 5167 2004; Norma Chilena de calidad de compost NCh2880. 2003)

En consecuencia a los vacos existentes en la normatividad colombiana, la mayora de las
veces se hace necesario acudir a las normas extranjeras para garantizar altos estndares de
calidad en el producto final, tal como ocurre con los bioslidos generados a partir de las
plantas de tratamiento de aguas residuales. Los bioslidos han sido utilizados como
enmienda orgnica debido a la alta cantidad de nutrientes y materia orgnica contribuyendo
as a la fertilidad del suelo y reduciendo la necesidad de uso de nutrientes inorgnicos. Sin
embargo, su aplicacin est limitada por la presencia de metales pesados, sustancias
txicas y microorganismos patgenos, los cuales estn regulados por la Norma 503 de la
Agencia de Proteccin Ambiental (EPA, 1999).

Cuando en el proceso de compostaje se recurre al uso de bioslidos, la clasificacin del
compost se hace segn su calidad en clase A y clase B. El compost clase A es un producto
de alta calidad que no presenta restricciones de uso ya que ha sido sometido a un proceso

de humificacin y a una temperatura de 55a 65C e n un espacio de tiempo de 24 horas a 3
das eliminando los patgenos pero no los microorganismos necesarios y benficos. Por otro
lado el compost clase B es un producto de nivel intermedio de calidad y presenta algunas
restricciones de aplicacin, adems este compost requiere ser mezclado con otros
elementos adecuados a diferencia del compost clase A. Cualquiera de las clases de
compost mencionadas anteriormente deber cumplir con los parmetros microbiolgicos
estipulados en la Norma Chilena NCh 2880.

Segn la Norma 503 de la Agencia de Proteccin Ambiental (EPA) de 1999, Estndares
para la aplicacin y disposicin de lodos de aguas residuales, define dos tipos de bioslidos
con respecto a la reduccin de agentes patgenos. Clase A y clase B segn el grado de
tratamiento que los lodos hayan recibido (Tabla 11).

Tabla 11. Clasificacin de bioslidos segn la EPA.

Norma EPA 503
Estndares para la Aplicacin y Disposicin de Lodos de Aguas Residuales

BIOSOLIDO CLASE A
Parmetros Unidades Limites
Coliformes fecales NMP/g de peso seco 1000
Salmonella sp NMP/4g de peso seco 3
Virus entricos UFP/4g de peso seco <1
Huevos de helminto Huevos viables/ 4g de peso seco <1
BIOSOLIDO CLASE B
Parmetros Unidades Limites
Coliformes fecales NMP o UFC/g de peso seco < 2 x 10
6
Virus entricos UFP/4g de peso seco >1
Huevos de helminto Huevos viables/ 4g de peso seco 10
6
NMP: nmero ms probable
UFC: unidad formadora de colonia
UFP: unidad formadora de placa
Fuente: EPA, 1999


En el caso de Europa las limitaciones microbiolgicas para el uso agrcola de productos
orgnicos incluyen indicadores microbiolgicos como E. coli, Salmonella sp, y otros
microorganismos tales como Clostridium perfringens, Campylobacter sp, Yersinia sp y
Listeria sp (Tabla 12).

Tabla 12. Parmetros microbiolgicos en la legislacin europea


Fuente: (Los Autores, 2007. Adaptado de Guardabassi et al., 2003; Gmez y Estrada de Luis, 2005)

Dentro del control de calidad de bioabonos contemplado en la legislacin francesa se tiene
en cuenta el conteo de partculas de enterovirus en cultivo celular al igual que la necesidad
de la validacin de mtodos para su deteccin en este tipo de materiales. A pesar de los
vacos existentes dentro de la legislacin de abonos orgnicos, con la aparicin de
patgenos emergentes se ha hecho evidente la necesidad de ampliar el rango de
patgenos.

En el ao 2001 la comisin de expertos de la USEPA y USDA en el tema de Agentes
infecciosos emergentes y aspectos relacionados con abonos animales, bioslidos y
subproductos, identificaron la necesidad de desarrollo, validacin y estandarizacin de
Salmonella Coliformes
fecales
E.coli Clostridium
perfringens
Otros
Austria Ausencia - - - Campylobacter
Yersinia
Listeria
Espaa Ausencia en
25 g
- < 1*10
3
Ausencia en 1 g -
Italia Ausencia en
25 g
< 1*10
3
- - -
Ecoetiqueta
UE
Decisin
Comisin
94/923/CE 14
Nov
Ausencia en
25 g
- < 1.000
UFC/g
- -
UE 2 Draft
D. Biolog
Waste
Ausencia en
50 g
- - Ausencia en 1 g -

mtodos microbiolgicos para la deteccin de patgenos emergentes como
Cryptosporidium, Cyclospora, Toxoplasma, Virus de la Hepatitis, Poliovirus, Adenovirus y
Rotavirus (Gerba y Smith, 2006).
































3. FORMULACIN DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIN



El compost como producto de la oxidacin de la fraccin orgnica de los residuos ha sido
tradicionalmente evaluado en su calidad desde el punto de vista fsico y qumico y
nicamente tiene importancia, por lo menos en Colombia, la Salmonella sp. como patgeno
humano. Esta caracterstica hace que la presencia de otros patgenos bacterianos o virales,
en especial aquellos presentes en materias primas de origen animal, puedan dar lugar a la
contaminacin de los productos de consumo directo y/o de las fuentes de aguas, por lo que
su aplicacin constituye un peligro para la salud pblica y una amenaza para el medio
ambiente por la exposicin a microorganismos patgenos que esto representa. La presencia
de contaminantes patgenos en el compost puede ser considerado un riesgo ocupacional y
reduce drsticamente el valor del compost obtenido, llegando a imposibilitar su uso en
agricultura.

Debido a su amplia distribucin en el medio ambiente y a su supervivencia en lodos,
sedimentos y bioslidos en comparacin con otros patgenos como Salmonella sp,
Escherichia coli y coliformes, la deteccin de virus entricos debe tenerse en cuenta en el
control de calidad de los bioinsumos. No obstante actualmente esta prctica no es llevada a
cabo, en consecuencia de los costos elevados, su alto nivel de dilucin y a la dificultad de
las tcnicas para la deteccin viral a partir de lodos, bioslidos y compost.

El Rotavirus es el principal agente etiolgico de diarreas en nios menores de cinco aos a
nivel mundial principalmente en pases subdesarrollados. Este virus ocasiona cada ao
millones de episodios de gastroenteritis e igualmente afecta a especies animales de
importancia econmica para el hombre. El impacto econmico y de salubridad que ocasiona
el Rotavirus se manifiesta de manera clara en los sistemas agrcolas de consumo directo
como frutas y hortalizas donde el uso de abonos contaminados, podra acarrear problemas
de salud en los consumidores finales, siendo necesaria su identificacin y eliminacin de las
posibles fuentes de contaminacin. Gran parte de los patgenos presentes en los
materiales que se utilizan para compostaje son eliminados durante el proceso como
resultado de complejas interacciones microbianas y principalmente por el aumento de
temperatura; los virus y hongos suelen ser ms resistentes a elevadas temperaturas que las
bacterias como el caso del Virus de la Hepatitis A, Poliovirus y Rotavirus.


Finalmente es de vital importancia la deteccin de virus entricos que causen enfermedad
tanto en hombres como en animales a travs de pruebas comerciales y mtodos sencillos y
reproducibles que permitan su extraccin y concentracin.


































4. OBJETIVOS


4.1 Objetivo general

Realizar el seguimiento de la presencia de Rotavirus en un proceso de compostaje realizado
a partir de residuos orgnicos domiciliarios y contenido ruminal

4.2 Objetivos especficos

Preparar pilas de compost a partir de la fraccin orgnica de los residuos domiciliarios y
contenido ruminal y realizar el seguimiento del pH y temperatura

Estandarizar el mtodo de extraccin y concentracin viral en matriz compost y materias
primas.

Determinar la presencia de Rotavirus en las materias primas, proceso y producto final
mediante prueba de ELISA e inmunocromatografa (ICT) comparando los dos mtodos
de deteccin viral.


















5. MATERIALES Y METODOS

El proceso de compostaje fue realizado en el relleno sanitario Don Juanito en la ciudad de
Villavicencio manejado por la empresa Bioagrcola del Llano S.A. E.P.S.P. por medio de
ensayos in vivo en nueve pilas de compostaje elaboradas a partir de residuos slidos
urbanos (RSU)
5.1 Preparacin de inculo termoflico y montaje de las pilas de compostaje
Para el montaje de las pilas de compostaje fue necesaria la produccin de un inculo
termoflico mixto usado tradicionalmente para obtener en la empresa Bioagrcola del Llano,
un abono orgnico de buena calidad y nutrientes en menor tiempo con caractersticas
apropiadas para la aplicacin en campo. El inoculante fue producido a partir de la
reconstitucin del banco de cepas amilolticas y proteolticas, obtenidas y evaluadas en el
estudio realizado por Galindo et al (2005) provenientes del Laboratorio de Biotecnologa
Aplicada de la Pontificia Universidad Javeriana.
Para la reconstitucin de las cepas se prepararon 100 ml de caldo leche para cada una de
las cepas proteolticas y 100 ml para las cepas amilolticas teniendoa en cuenta las cepas
que comparten actividad. Posteriormente se tomaron dos viales de cada cepa y se
reconstituyeron en 100 ml del caldo correspondiente.
Una vez las cepas fueron reconstituidas, se llevaron 100mL de inculo (10%) a 900 mL de
caldo almidn leche 1%(p/v) incubando por 48 horas a 55C (Anexo 1). A continuacin, se
determin la biomasa inicial en UFC/ml en agar almidn y leche y se determin la actividad
proteoltica y amiloltica cuantitativamente mediante las tcnicas de cido tricloroactico y
cido 3,5-dinitrosaliclico (DNS) (Miller, 1959) (Anexo 2 y 3). Una unidad amiloltica se define
como la enzima capaz de liberar 1 mol de glucosa por minuto por litro (UA/min.L) mientras
que una unidad proteoltica se define como la enzima capaz de liberar 1mol de tirosina por
minuto por litro (Pedroza et al., 2004).
Por otro lado, el montaje de las pilas se realiz utilizando dos tratamientos con 50% y 60%
de residuos de plaza, podas, contenido ruminal y cascarilla de arroz (Tabla 13). Los
tratamientos se eligieron atendiendo las solicitudes del relleno sanitario. El tamao de las
pilas fue de aproximadamente 2m de base x 1.5m de altura x 6m de largo; y un peso total
de cuatro toneladas.




Tabla 13. Composicin de las pilas evaluadas.
Rplicas Tipo de residuos Porcentaje
(%)
Toneladas
Plazas 50 2
Podas 20 0.8
Contenido ruminal 20 0.8
P1, P2, P3
Cascarilla de arroz 10 0.4
Plazas 60 2.4
Podas 10 0.4
Contenido ruminal 20 0.8
P1, P2, P3
Cascarilla de arroz 10 0.4
Fuente: (Autores, 2007)
Se construyeron nueve pilas evaluadas de manera independiente, tres de ellas con el 50%
de residuos de plaza y las otras seis con 60% de residuos de plaza. El montaje de las
primeras seis pilas fue llevado a cabo en el mes de noviembre de 2006; mientras que las
ltimas tres pilas de compostaje fueron montadas en el mes de junio de 2007 en las zonas
destinadas al compostaje de materia orgnica, con pisos y estructuras metlicas con
cubiertas de cloruro de polivinilo para evitar la interferencia de las condiciones atmosfricas
sobre el proceso. Para la inoculacin de las pilas se emple el inculo termoflico acelerador.

5.2 Seguimiento de las pilas y muestreo

Se tom una muestra de 500g compuesta de 5 submuestras puntuales tomadas de
diferentes secciones de cada pila con un tubo de PVC de 70 cm de largo x 3 de dimetro.
Para ello, se retir la poda que cubre las pilas, quedando descubierta una parte del compost.
Las muestras obtenidas fueron transportadas en bolsas sellopack dentro de una nevera de
icopor a 4C.
Las muestras fueron tomadas desde el da cero incluyendo cada materia prima, cada ocho
das (52 das totales del proceso), para un total de 52 muestras en el caso del primer
proceso de compostaje y 28 muestras en el caso del segundo compostaje. Finalmente, las
muestras fueron conservadas a una temperatura de -10C, en un congelador del laboratorio
de Microbiologa ambiental de la Pontificia Universidad Javeriana durante seis meses hasta
su procesamiento.

Con el fin de registrar las temperaturas durante el proceso, en cada pila de compostaje se
determin la temperatura aleatoriamente en 5 puntos diferentes utilizando un termmetro de
punzn de 70cm de largo con receptor digital de datos (Galindo et al., 2005) (Figura 3) . sta
se midi internamente enterrando el termmetro completamente en la pila de compost. La
medicin fue realizada semanalmente durante un perodo de dos meses (ocho semanas).

Figura 3. Determinacin de temperatura
Por otro lado, el pH fue determinado mediante el mtodo de pasta de saturacin, segn
ICONTEC, 2004 que consiste en tomar cinco submuestras de cada pila, completando 500g.
Posteriormente se Agregaron 500mL de agua destilada y la muestra fue homogenizada y
sedimentada durante 5 minutos tomando el valor de pH sobre el extracto lquido superficial
(Figura 4)


Figura 4. Determinacin de pH
5.3 Anlisis fsico qumico de las muestras de compostaje
Para los anlisis fisicoqumicos se enviaron 500g de las muestras de la octava semana del
primero y segundo proceso de compostaje a AGRILAB LTDA. All, se llevaron a cabo las

pruebas correspondientes de carbono total, nitrgeno orgnico, el porcentaje de humedad, y
la concentracin de otros elementos importantes como el fosforo, el hierro, el azufre y el
potasio.
5.4 Estandarizacin del proceso de extraccin y concentracin de virus a partir de
muestras de compostaje
La tcnica utilizada para la extraccin del agente viral, fue la tcnica de elusin descrita por
Ahmed y Sorensen (1995) y modificada para este trabajo. Para tal fin se diluyeron 5g de
compost y materia prima en 30 ml de extracto de carne al 10% (pH 9) (Anexo 6) los cuales
fueron sometidos a vortex diez veces durante 1 minuto.

Despus se realiz un proceso de sonicacin en hielo a 37 Hz durante cinco minutos en
intervalos de un minuto. Este proceso consiste en la aplicacin de ultrasonido a una
suspensin. La intensa agitacin producida destruye las membranas celulares en este caso
particular del tejido vegetal y animal proveniente de residuos de plaza y contenido ruminal
respectivamente. La sonicacin fue llevada a cabo en frio para evitar el sobrecalentamiento
de las muestras que podra provocar la desnaturalizacin de las protenas virales.
Seguido a esto las diluciones en los tubos falcon se agitaron en shaker durante 5 minutos a
500 rpm. La suspensin resultante fue centrifugada durante 1 h, 4C a 5000g, con el fin de
eliminar los desechos del compost y recuperar las partculas virales suspendidas. El pH del
sobrenadante obtenido fue ajustado a 7.2 con HCl 1M.
La tcnica utilizada para la concentracin de la partcula viral fue la descrita por Lewis y
Metcalf 1988 y modificada por Mignotte et al., 1999. El polietilenglicol es una molcula de
alto peso molecular que en solucin forma dos fases inmiscibles una acuosa y otra
polimrica, en cuyos poros son retenidas las partculas virales mediante enlaces covalentes
(Kittigul, 2001; Lewis y Metcalf 1988). Al sobrenadante obtenido en el paso anterior se
adicion polietilenglicol 6000 (PEG 6000) en buffer fosfato 7.2 hasta una concentracin final
de 8% p/v. La mezcla anterior fue llevada a agitacin en shaker 1.5 2 horas a 4C 150
200 rpm, y conservada a 4C durante toda la noche. Posteriormente, fue centrifugada a
5000 x g por 90 minutos a 4C. El pellet fue suspendido en 2.5 ml de buffer fosfato 7.2
(Anexo 6).



5.5 Montaje del control positivo y negativo del compost
Con el fin de verificar la eficiencia del proceso de estandarizacin de extraccin y
concentracin viral, se llevo a cabo el montaje de un control positivo y negativo del compost.
Inicialmente 10g de compost de la octava semana del primer proceso de compostaje, fueron
esterilizados en autoclave durante 15 minutos, 15psi a 121C. En el caso del control positivo,
se utilizo 1ml de materia fecal positiva para rotavirus por PCR suministrado por el Instituto
Nacional de Salud y diluido en 2 mililitros de buffer fosfato pH 7.2. Posterior a esta dilucin,
se adicion una alcuota de 1ml a 5g de compost estril y se incub durante 1hora a 37C. El
control negativo fueron 5g de compost sin adicin de materia fecal ni otra sustancia.
Los dos controles fueron sometidos al proceso de extraccin y concentracin descritos en
los numerales 5.3 y 5.4 y posteriormente se determin la presencia de rotavirus mediante la
prueba de ELISA e ICT.
5.6 Deteccin de Rotavirus por inmunocromatografa (ICT)

A partir de las muestras de los dos procesos de compostaje llevados a cabo en la empresa
Bioagricola del Llano en los meses de Noviembre-Diciembre de 2006 y Junio-Julio de 2007
(Figura 5), se tomaron 150 ul de la solucin obtenida en el proceso de concentracin y
extraccin viral y se transfirieron al frasco R2 del dispositivo ICT que contiene el tampn de
dilucin. Posterior a esto, se homogenizo vigorosamente y se rompi el embudo del frasco
R2 con la muestra diluida, manteniendo este frasco en posicin vertical se depositaron dos a
tres gotas en el pocillo de la muestra (S) evitando la formacin de burbujas. La lectura se
realizo diez minutos despus de haber depositado la muestra y solo en aquellos dispositivos
donde apareci la lnea de control (C).


Figura 5. Componentes de inmunocromatografa.


Para la interpretacin de los resultados, la muestra es positiva para Rotavirus si hay
presencia de una lnea azul en R y aparece la lnea de control (Figura 6).



Figura 6. Control positivo de la prueba. Se observa la lnea azul, la cual indica la presencia
de Rotavirus y la lnea roja del control, la cual indica la validez de la prueba


5.7 Deteccin de Rotavirus por ELISA

El kit de macro ELISA PATHFINDER ROTAVIRUS (BIORAD, 2006). Este sistema de
deteccin directa de antgenos, es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas cualitativo
para la identificacin del antgeno de Rotavirus humano.

Las partculas virales presentes en la muestra de compost se unen a los anticuerpos
policlonales anti - Rotavirus que tapizan el tubo de ELISA. Un anticuerpo monoclonal
conjugado a peroxidasa soluble unido al Rotavirus aadido al tubo se une al antgeno vrico.
El anticuerpo monoclonal es especfico del antgeno del Rotavirus comn especificado por el
sexto gen vrico (VP6). El control positivo de la prueba ser compost inoculado con Rotavirus
y el control negativo ser compost estril sin inocular.

Un sustrato de peroxidasa aadido produce un color azul si el virus est en la muestra. La
observacin de color azul indica muestra positiva para el antgeno de Rotavirus; las
muestras que no presenten color azul son negativas para el antgeno en cuestin (Biorad,
2006).


Una vez la determinacin colorimtrica fue realizada se detuvo la reaccin aadiendo cido
sulfrico 1N y las absorbancias fueron ledas en espectrofotmetro a 450 nm; utilizando
como blanco agua destilada. Posterior a esto se calcul el valor de corte y la zona gris.

El valor de corte se define como el valor de Absorbancia del control negativo ms 0.075 con
el cual se hace posible el clculo de la zona gris, la cual se defina como +/- 10% del valor de
corte.

Un valor de absorbancia igual o superior al valor de corte superior de la zona gris son
muestras positivas para el antgeno de Rotavirus en la muestra de compost. De igual forma
un valor de absorbancia inferior o igual al valor de corte inferior de la zona gris son muestras
negativas para el antgeno de Rotavirus.


5.8 Modelo estadstico

Se determin la presencia de Rotavirus durante el primer proceso de compostaje. Para ello
se evaluaron estadsticamente los resultados obtenidos con el kit de ELISA e
inmunocromatografa haciendo una correlacin entre la proporcin de muestras positivas por
semana en cada uno de los ensayos, el pH y la temperatura. Adems se llevo a cabo una
comparacin entre los dos test de deteccin y entre los procesos de compostaje en cuanto a
diferencias en composicin de las pilas en relacin con la presencia del virus.

El test Shapiro Wilk permiti observar la distribucin no normal de los datos y por
consiguiente se realiz una prueba de Mann-Whitney, con el fin de identificar diferencias
entre ELISA e inmunocromatografa como pruebas de deteccin de Rotavirus. Posterior a
esto, con el objetivo de hallar diferencias entre tratamientos en cuanto a composicin y su
relacin con el nmero de muestras positivas de Rotavirus se llevo a cabo un test de
Kruskal-Wallis.

Las pruebas anteriormente mencionadas fueron llevadas a cabo en el programa estadstico
Past program y en Excel. Las hiptesis propuestas fueron:

Efecto de la temperatura y pH


Ho: La temperatura y el pH tienen efecto sobre la proporcin de muestras positivas para
Rotavirus.
Hi: La temperatura y el pH no tienen efecto sobre la proporcin de muestras positivas
para Rotavirus.

Comparacin entre las dos tcnicas para deteccin viral
Ho: La proporcin de muestras positivas por ELISA es igual a la proporcin de muestras
positivas por inmunocromatografa en las pilas del primer proceso de compostaje

Ha: La proporcin de muestras positivas por ELISA difiere de la proporcin de muestras
positivas por inmunocromatografa en las pilas del primer proceso de compostaje

Diferencias entre los tratamientos en nmero de muestras positivas de Rotavirus
debido a la composicin de las pilas

H
0
: La proporcin de muestras positivas en las pilas con 50% de residuos de plaza es igual a
la proporcin de muestras positivas en las pilas con 60% de residuos de plaza, mediante la
tcnica de inmunocromatografa

H
i
: La proporcin de muestras positivas en las pilas con 50% de residuos de plaza difiere a la
proporcin de muestras positivas en las pilas con 60% de residuos de plaza, mediante la
tcnica de inmunocromatografa





6 RESULTADOS Y DISCUSIN

6.1 Preparacin del inculo acelerador


Al determinar la concentracin microbiana inicial del inculo mixto, se encontr una
poblacin de 10
21
UFC/mL para las cepas amilolticas y 10
23
UFC/mL para las cepas
proteolticas (Tabla 14). Lo anterior permiti una mayor degradacin durante el proceso de
compostaje a medida que la poblacin aumentaba. Esto permiti considerar, que la
poblacin proteoltica se expres en mayor proporcin que la amilolitica; debido a que los
residuos nitrogenados son ms accesibles por su composicin sencilla y de fcil
degradacin permitiendo el aumento de la poblacin con capacidad proteoltica en todos los
tratamientos.

Tabla 14. Concentracin microbiana inicial del inculo acelerador



Fuente: (Autores, 2007)

En simultaneo se realiz la tcnica de DNS con el fin de evaluar cuantitativamente la
actividad enzimtica amiloltica medida en concentracin de azcares reductores, arrojando
un valor de 276 UA considerado ms alto en relacin a los valores de 118.8 UA, 114.5 UA Y
172.69 UA obtenidos en estudios anteriores (Galindo et al., 2005, Rodrguez et al., 2007;
Granados et al., 2007). Las amilasas producidas por los microorganismos del inculo se
encargan de la hidrlisis de compuestos amilceos presentes en los residuos de plaza,
podas y cascarilla de arroz; la actividad enzimtica observada fue debido a la alta
produccin de enzimas durante el tiempo de fermentacin.

La evaluacin de la actividad proteoltica permiti demostrar la produccin de proteasas
como enzimas responsables de la degradacin de compuestos proteicos, los cuales son
hidrolizados hasta aminocidos libres. La determinacin fue realizada mediante la tcnica
del cido tricloroactico, arrojando un valor de 246 UP, considerado ptimo en relacin al
valor de 101.3 UP, 98.5 UP y 157.38 UP obtenidos en estudios anteriores (Tabla 15). La
expresin enzimtica observada se debi a la produccin de grandes cantidades de enzimas
durante el tiempo de fermentacin del inculo mixto como tambin a la presencia de un
nmero mayor de cepas con actividad enzimtica sobre sustratos proteicos que para este
caso estuvieron representados por el contenido ruminal.

Tabla 15. Actividad enzimtica del inculo mixto

Cepas amilolticas 10
21
UFC/ml
Cepas proteolticas 10
23
UFC/ml
Actividad amiloltica
cuantitativa
276 UA
Actividad proteoltica
cuantitativa
246 UP





1 UA se define como la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar un mol de glucosa por minuto por litro.
1 UP se define como la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar un mol de tirosina por minuto por litro.
Fuente: (Autores, 2007)

Al correlacionar los valores de actividad enzimtica amiloltica y proteoltica con el recuento
de poblacin del inoculante permite inferir la adaptacin de los microorganismos del inculo
y por ende una degradacin ms rpida y eficiente de los residuos orgnicos presentes en
las pilas logrando el objetivo principal del compostaje como tratamiento biolgico de residuos
al oxidar el contenido orgnico, en este caso el sustrato de los microorganismos.

Es importante anotar que las alta actividad enzimtica del inculo producido en comparacin
con las obtenidas en estudios anteriores puede ser debido a la alta densidad de poblacin
microbiana presente en el inculo descartando errores experimentales en las
determinaciones correspondientes.

6.2 Seguimiento de las pilas y muestreo

La temperatura de las pilas con 50% de residuos de plaza al inicio del proceso fue de
38.5C, siendo la ms baja en comparacin con las p ilas de 60% de contenido de residuos
de plaza, lo cual es un indicativo de una fase mesoflica ms prolongada (Figura 7). Lo
anterior es consecuencia de que una de las pilas no fue inoculada el da de su montaje sino
que su degradacin se dio por la flora microbiana natural de los residuos retardando la
mineralizacin de los componentes. Sin embargo, en el transcurso del tiempo hasta la
semana ocho las pilas de 50% de residuos de plaza conservaron temperaturas ms altas
respecto a las otras pilas y adicionalmente una etapa termoflica de mayor rango trmico que
inici a partir de la segunda semana (temperatura superior a 40C) con una duracin de 52
das. Lo anterior en consecuencia a que la proporcin de material celulsico representado en
podas fue mayor contribuyendo a la retencin de calor en la pila. Al ser las podas un material
de mayor porosidad permite la entrada de oxgeno y por ende aumenta el metabolismo
microbiano aerobio de carcter exotrmico.


Comportamiento de Temperatura
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tiempo (Semanas)
T
e
m
p
e
r
a
t
u
r
a

C
50% Residuos plaza
DS 10,33
60% Residuos plaza
(1 Proceso) DS 5,86
60% Residuos plaza
(2 Proceso) DS 4,93


Figura 7. Comportamiento de temperatura durante el proceso de compostaje.

Tanto en el en el primer proceso como en segundo proceso de compostaje no hubo un
descenso significativo del pH (Figura 8). Lo anterior debido a la aplicacin de cal directa a
los residuos de plaza en cantidad suficiente para neutralizar los cidos producidos durante la
descomposicin, excepto en la fase mesoflica de las pilas control durante la cual se da la
mayor produccin de cidos orgnicos. Para este caso el valor mnimo de pH fue de 5,62;
valor que a pesar de ser cido es tendiente a la neutralidad ya que el material fermentable
produce una reaccin alcalina debido a la formacin de amonio resultante de la degradacin
de protenas y aminocidos por procesos de amonificacin como desaminacin oxidativa y
la descomposicin de otros residuos nitrogenados como la urea (Comando, 2006).


Figura 8. Comportamiento de pH durante el proceso de compostaje.

Tanto en el las pilas del primer y segundo compostaje con un contenido de residuos de
plaza del 60% no fue evidente la fase mesoflica del compostaje teniendo como

temperaturas de inicio 50.6 y 47.6C respectivament e (Figura 7), sin descenso de pH por los
factores anteriormente mencionados. Lo anterior indica una baja supervivencia de los
microorganismos mesofilos. Estas temperaturas favorecieron la activacin de
microorganismos termofilcos propios del inculo con la ulterior expresin de la actividad
enzimtica, la degradacin de los residuos y el aumento sbito de la temperatura (Rueda et
al., 2001). La temperatura y el pH varan segn el perfil de los residuos a compostar
(Tchobanoglous et al., 1996). La ausencia de una fase mesoflica en los tratamientos con
60% de residuos de plaza se debe a que la proporcin de residuos de plazas fue mayor que
en las otras pilas que contenan 50% de este tipo de residuo. Los residuos de plaza poseen
fuentes sencillas de azcares y protenas accesibles tanto para los microorganismos del
inculo como para la flora microbiana nativa del residuo.

Al trmino del proceso se observ que el compost no alcanz su fase de estabilizacin y/o
maduracin, pues hasta la semana ocho las temperaturas fueron caractersticas de una
etapa termoflica aunque en la semana seis la temperatura descendi 10C en promedio. De
esto se infiere, que en este proceso de compostaje fueron predominantes microorganismos
termfilos entre bacterias esporoformadoras y actinomycetes termoflicos encargados de
degradar la celulosa, almidn y protenas. Adems, tambin se puede concluir que por el
alto contenido de residuos de plaza (ricos en carbono) en la semana ocho an se
encontraban remanentes de este tipo sin degradar y por esta razn la temperatura no
decreci. Lo anterior coincide con la alta actividad amiloltica del inoculo utilizado indicando
actividad microbiana an a esta temperatura.

La relacin existente entre el pH y la temperatura del proceso es confirmada con el
coeficiente de correlacin para las pilas del primer proceso de compostaje con valores de
0.90 y 0.45 respectivamente, los cuales indican una correlacin positiva entre los dos
parmetros (Anexo 6). Para las variables de temperatura y pH el valor de desviacin
estndar de las pilas correspondientes al 50% de residuos de plaza fue mayor (DS 10.31;
1.14) con respecto a las pilas con un 60% de residuos de plaza; debido a la fase mesoflica
que se present en la primera semana de proceso. Lo anterior refleja que la adicin de una
menor cantidad de material orgnico en las pilas tiene un efecto directo sobre el desarrollo
de la flora microbiana responsable de la biodegradacin y por ende sobre el aumento de
temperatura que debe presentarse ante la adicin del inculo acelerador. Los valores de
desviacin estndar de las pilas del 60% de residuos de plaza tanto del primer como del
segundo proceso son menores respecto al promedio de los datos confirmando que la adicin
de un porcentaje mayor de materia orgnica promueve la multiplicacin de los

microorganismos con actividad enzimtica especfica para este tipo de residuos y por ende
el inicio temprano de la fase termoflica.

6.3Anlisis fsico qumico del compost

En el anlisis de resultados se evaluaron los parmetros de humedad, nitrgeno orgnico,
fsforo, calcio, magnesio y potasio en las pilas del primer y segundo compostaje. Estos
parmetros fueron comparados con los valores establecidos segn Gmez, 2000 y la
ICONTEC, 2004 (Tabla 16).

Tabla 16. Parmetros fsico qumicos de las pilas de compostaje.

Parametro 50% residuos
de plaza
60% residuos de plaza
(1 proceso)
60% residuos de plaza
(2 proceso)
Valor establecido
Humedad % 48,6 49,3 42 Mximo 35%
ICONTEC, 2004
Nitrogeno
total %
2,83 2,42 1,62 ND (2-3% Gmez,
2000)
Fosforo
P2O5%
1,55 1,46 1,03 ND (1% Gmez,
2000)
Calcio CaO% 4,08 5,71 3,31 ND (6% Gmez,
2000)
Magnesio
MgO%
1,14 1,87 1,04 ND (0.6% Gmez,
2000)
Potasio K2O% 2,77 2,54 2,01 ND (0.5% Gmez
2000)

Fuente: ICONTEC, 2004., Gmez, 2000 y Autores, 2007.

Las pilas de compostaje del primer y segundo proceso exceden el porcentaje de humedad
establecido por el ICONTEC para su venta (35%) (Tabla 16). Esto se debe a que en pocas
lluviosas y donde la temperatura ambiente es menor no se favorece la perdida de humedad
por evaporacin de agua, sin embargo, no se descarta que las diferencias entre de los
materiales de soporte hayan tenido efecto sobre la humedad. Pues en el momento del
montaje de las pilas tanto como la cascarilla de arroz como las podas estaban hmedas
debido tambin al fenmeno invernal.

Por otro lado, el nitrgeno total esta constituido por nitrgeno orgnico e inorgnico. El
porcentaje de nitrgeno orgnico, el cual constituye la mayor parte del elemento en el suelo
supera el 98%, por esta razn es posible asumir el nitrgeno total como nitrgeno orgnico.
Un abono orgnico de buena calidad posee entre el 2 y el 3% de nitrgeno orgnico
(Gmez, 2000) (Tabla 16). Por esta razn, se puede inferir que todas las pilas del primer y
segundo proceso de compostaje tienen un porcentaje ptimo de nitrgeno orgnico. Solo las
pilas del segundo proceso tienen un promedio de 1.62%, el cual es muy cercano a 2.

De igual forma, el analisis fisico quimico incluye la concentracin de macronutrientes de
interes en el compost como fosforo, potasio, magnesio y calcio (Figura 9) Segn Gmez,
2000 el porcentaje de fosforo debe ser 1% (Tabla 16) y en el compostaje se encontraron
valores superiores. El fosforo, luego del nitrgeno, es el macronutriente que en mayor
medida limita el rendimiento de los cultivos agrcolas. Interviene en numerosos procesos
bioqumicos a nivel celular y se lo considera un nutriente esencial para las plantas (Berardo,
1999).Por otro lado, el valor de potasio en el compost debe ser del 1%. En las pilas del
primer compostaje se observaron valores superiores a 1%, mientras que en las pilas del
segundo compostaje se observo el valor sugerido por Gmez, 2000. El potasio interviene
fisiolgicamente en los siguientes procesos: sntesis de azcar y almidn, traslado de
azucares, sntesis de protenas en interviene en la estimulacin enzimtica (Rodrguez,
1992). No hay excesos de potasio que produzcan toxicidad en la planta, puesto que seran
necesarias cantidades muy grandes de abono. Los abonos potsicos no tienen efecto sobre
el pH del suelo, pero niveles excesivos de potasio inhiben la rapidez con la que el Calcio,
Magnesio y Manganeso puedan ser absorbidas por la planta (Lazcano-Ferrat y Herrera,
2007)


El magnesio tiene una dinamica muy compleja en el suelo y de modo general se puede
lixiviar ms fcilmente que el calcio, por lo que si proviene de abonos orgnicos tiene menos
peligro de prdida. En los tejidos vegetales el contenido de magnesio es mayor que el calcio
(Gmez, 2000). Segn Gmez, 2000 el magnesio en las pilas de compostaje no debe
sobrepasar el 0,6% (Tabla 16) y las pilas de compostaje del primer y segundo proceso
superan este valor. Sin embargo, el porcentaje de potasio de las pilas del segundo
compostaje es el mas cercano al valor establecido (Figura 9). Fisiolgicamente, el magnesio
forma parte de la clorofila interviniendo en los proceso fotosinteticos de la planta (Lazcano-
Ferrat y Herrera, 2007). El exceso de desplaza otros cationes, calcio ypotasio (Ca, K) sobre
todo, y provoca la compactacin de los suelos, que a menudo tienen tendencia a perder su
cohesin y a convertirse en cenagosos. Adems el exceso de magnesio frena la absorcin
del nitrgeno (Porta, et al., 1994)

El porcentaje sugerido para calcio en compostaje es de 6% segn Gmez, 2000 (Tabla
16).En este caso, las pilas del segundo proceso de compostaje tuvieron un porcentaje bajo
en comparacin con las del primer proceso (Figura 9). El calcio, adems de ser un elemento
esencial para las plantas vasculares, juega un papel importante en la estructura del suelo.
Se encuentra muy bien vinculado a partes estructurales de los tejidos vegetales, por lo que
es de mediana disponibilidad, vinculado entonces a la fraccin soluble de los recursos
orgnicos (Rodriguez, et al., 2006)

% Humedad % Nitrgeno orgnico
5
0
%

r
e
s
i
6
0
%

r
e
s
i
6
0
%

r
e
s
i 20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
%

H
u
m
e
d
a
d

5
0
%

r
e
s
i
6
0
%

r
e
s
i
6
0
%

r
e
s
i 0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
2,1
2,4
2,7
3
%

n
it
r

g
e
n
o

o
r
g

n
ic
o



% Fsforo % Potasio
Desviacin
Estndar 17,5 15,6 17,3
P: 0.84
Desviacin
Estndar 0,08 0,17 0,81
P: 0.056


5
0
%

r
e
s
i
6
0
%

r
e
s
i
6
0
%

r
e
s
i 0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
%

f

s
f
o
r
o

5
0
%

r
e
s
i
6
0
%

r
e
s
i
6
0
%

r
e
s
i 0
0,4
0,8
1,2
1,6
2
2,4
2,8
3,2
3,6
4
%

p
o
t
a
s
io

% Calcio


% Magnesio % Calcio
5
0
%

r
e
s
i
6
0
%

r
e
s
i
6
0
%

r
e
s
i
1,2
1,8
2,4
3
3,6
4,2
4,8
5,4
6
6,6
%

c
a
lc
io

5
0
%

r
e
s
i
6
0
%

r
e
s
i
6
0
%

r
e
s
i 0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
2,1
2,4
2,7
3
%

m
a
g
n
e
s
io



Figura 9. Porcentaje de humedad, nitrgeno orgnico, potasio, magnesio y calcio total de las pilas de
compostaje del primer proceso y segundo proceso

Finalmente, al calcular las desviaciones estndar para cada tratamiento, se observ como
generalidad que los datos pertenecientes al tratamiento con 60% de residuos de plaza en el
segundo proceso de compostaje, poseen datos extremos en todos los parmetros fsico
qumicos. Es decir, los valores para cada parmetro en el segundo proceso se encontraron
ms alejados de la media aritmtica en comparacin con los datos del primer compostaje
(Figura 9). Al llevar a cabo un ANOVA con el fin de comparar los tratamientos evaluados
(Anexo 6), se observo que existen diferencias estadsticamente significativas en el
contenido de nitrgeno orgnico entre las pilas del primer y segundo compostaje
probablemente por prdidas por volatilizacin (Rodriguez et al., 2006). Sin embargo, este
parmetro no fue medido al momento del procesamiento de la muestra. Eghball et al. 1997
refieren que el 92 % de las perdidas de nitrgeno se deben a la volatilizacin del amonaco.
Desviacin
Estndar 0,09 0,10 0,61
P: 0,24
Desviacin
Estndar 0,31 0,45 0,92
P: 0.36
Desviacin
Estndar 0,42 1,14 2,06
P: 0.17
Desviacin
Estndar 0,19 0,53 0,59
P: 0.15

El ascenso del pH, las elevadas temperaturas y la deshidratacin de la masa de residuos
ocurridas hacia el final del proceso, favorecieron estas perdidas (Atallah et al., 1995)

Por otro lado, los tratamientos no tuvieron diferencias estadsticamente significativas en
cuanto a porcentaje de humedad, fsforo, calcio, magnesio y potasio (Anexo 6) a diferencia
del estudio de Rodrguez et al., 2007 donde se encontraron diferencias significativas en el
fsforo, nitrgeno total, humedad y potasio en pilas con el 55% de residuos de plaza y
fsforo, potasio y nitrgeno en pilas con el 50% de residuos de plaza.



6.4 Estandarizacin del mtodo de extraccin-concentracin

Para la deteccin de Rotavirus por la tcnica de ELISA e inmucromatografa primero fue
necesario llevar a cabo un proceso de extraccin y concentracin viral. Primero se tomaron
5 gramos de cada pila de compostaje para llevar a cabo la evaluacin individual de cada una
de ellas. Esta cantidad de muestra no se considera representativa teniendo en cuenta el
tamao de las pilas. Segn Lichtenberg, 1988 el tamao de muestra para la extraccin de
virus en muestras de lodos municipales y sedimentos debe ser de 300 a 800ml y para la
recuperacin de virus a partir de suelo recomienda 50g de muestra.

En la extraccin de las partculas virales se utiliz extracto de carne al 10%, las protenas del
extracto de carne van a ocupar el sitio de unin de los virus, por lo que posteriormente en el
proceso de concentracin los virus no quedan unidos al compost y se obtiene una mayor
cantidad de estos en el sedimento. En una serie de experimentos comparativos llevados a
cabo por Landry et al., 1978 usando agua contaminada con poliovirus tipo 1, la elucin con
extracto de carne fue superior al proceso de elucin llevado a cabo con glicina con
porcentajes de recuperacin entre 60 y 91%; mientras que el porcentaje de recuperacin con
glicina fue de 35%.
El extracto de carne juega un papel importante en la elusin de virus mediante interacciones
hidrofbicas con sustancias orgnicas; es una molcula orgnica de gran tamao capaz de
romper las interacciones entre partculas virales y superficies de la muestra. De igual forma
el pH alcalino (9) aumenta la repulsin electrosttica entre los virus y superficies mediante la
deprotonizacin de los sitios ionizables de ambos. (Williamson et al., 2003; Lucena et al.,
1999).

En el estudio de Ahmed y Sorensen, 1999 donde se evalan diferentes tcnicas de
extraccin y concentracin viral en lodos demuestran que las tcnicas donde se logra la
mayor recuperacin viral son aquellas donde se utiliza el extracto de carne en diferentes
concentraciones en cada una de ellas (10, 7, 3%) demostrando que este compuesto
contribuye a la recuperacin de agentes virales. Posterior a la adicin de extracto de carne
a pH alcalino, se llev a cabo vortex y una sonicacin en frio la cual ayuda a la elusin viral,
al rompimiento de floculos, partculas y clulas presentes en la muestra (Lichtenberg, 1988).
Despus, se llev a cabo una centrifugacin a 4C c on el fin de clarificar la solucin que
contiene el virus eluido por sedimentacin de las partculas presentes en la muestra, como
restos de podas y materia prima del compostaje.

Posterior al proceso de extraccin se llev a cabo la concentracin viral de las muestras
usando polietilenglicol 6000 (PEG 6000). El polietilenglicol es qumicamente inerte, no txico,
soluble en agua y con capacidad de precipitar protenas; este compuesto acta como una
esponja inerte que excluye protenas de un solvente, incrementando su concentracin
hasta que excede la solubilidad causando la precipitacin proteica (Lewis y Metcalf, 1988).
Las protenas ms cargadas o hidrofbicas son ms fciles de precipitar en comparacin a
las de menor carga con lo cual se puede inferir que las protenas de mayor tamao pueden
ser precipitadas a bajas concentraciones de polietilenglicol. La protena VP6 detectada por
las pruebas comerciales de ELISA e ICT, es altamente hidrofbica (Rodrguez, 2005), y el
polietilenglicol la precipita con facilidad concentrndola en el sedimento. Esta tcnica ha
sido ampliamente utilizada para la recuperacin de agentes virales a partir de aguas, ostras,
sedimentos, lodos y bioslidos (Belguith et al., 2006; Ahmed y Sorensen, 1999; Lewis y
Metcalf, 1988). El polietilenglicol en concentraciones por encima del 8%, concentra la
mayora de virus infecciosos en la fase del sedimento y solo una pequea cantidad de virus
biolgicamente activos quedan en el sobrenadante (Sarmiento et al., 1999).

Se puede inferir, que el proceso de extraccin y concentracin fueron efectivos puesto que
se detecto Rotavirus mediante la prueba de ELISA e ICT posteriormente

6.5 Montaje del control positivo y negativo del compost

Posterior al proceso de extraccin y concentracin llevado a cabo con los controles, se
determinaron las absorbancias del control negativo y positivo en la prueba de ELISA
encontrndose una absorbancia de 1.653 la cual es mayor al lmite superior de la zona gris
(0.15) indicando un resultado positivo para rotavirus; mientras que el control negativo arrojo

un valor de 0.05, el cual es menor al lmite inferior de la zona gris (0.13), sugiriendo que el
compost sin inocular fue negativo para rotavirus. De igual forma, en la prueba de ICT, el
control positivo del compost fue positivo para rotavirus y el control negativo fue negativo
para rotavirus.

De lo anterior, se deduce que el mtodo de extraccin descrito por Ahmed y Sorensen, 1995
y el mtodo de concentracin descrito por Lewis y Metcalf, 1988 y modificado para nuestro
estudio, son mtodos con los cuales se logra la recuperacin de rotavirus a partir de
muestras de compost. Adems, el montaje del control positivo y negativo del compost, le da
validez a los resultados obtenidos por ELISA e ICT ya que fueron usados como puntos de
comparacin en los resultados del primer proceso de compostaje

6.6 Deteccin de Rotavirus por Inmunocromatografa y ELISA

Para la deteccin de Rotavirus en las muestras de compostaje analizadas se utiliz una
tcnica de anlisis inmunoenzimtico (PATHFINDER
TM
Rotavirus BIORAD) con anticuerpos
monoclonales que detectaron determinantes antignicos (VP6) del Rotavirus del grupo A. Se
ha reportado que esta prueba detecta aproximadamente 10
5
partculas virales/ml (Nusetti, et
al., 2001). Este dato es importante teniendo en cuenta que se sabe que la dosis mnima
infecciosa de Rotavirus reportada es de 10
2
partculas virales/ml (Richards, 1999; Beuret et
al., 2002; Lodder y Roda Husman, 2005). El kit de ELISA detecta aproximadamente 10
5

partculas/g; por lo que no se puede asegurar que las muestras analizadas estaban libres de
estos patgenos; ya que el Rotavirus pudo estar presente en concentraciones bajas,
menores de 10
5
partculas virales/g.

El anlisis de virus entricos en el compost se realiz buscando la presencia de Rotavirus
del grupo A, que de acuerdo a la literatura, es el virus entrico de mayor prevalencia a nivel
mundial y que ataca tanto hombres como animales. El hecho de que muchos de los
antgenos de neutralizacin de las cepas de rotavirus humanos del grupo A se hayan
encontrado tambin en animales y la posibilidad de que algunas cepas de rotavirus de
origen animal puedan infectar humanos y viceversa ha hecho que se considere a la
transmisin interespecie y la subsecuente reasociacin de segmentos genmicos una de las
fuerzas impulsoras de la evolucin de estos virus. La infeccin de humanos a partir de
animales sera un evento ms bien raro aunque en algunas zonas geogrficas restringidas,
cepas originadas de la reasociacin humano-animal pueden ser muy prevalentes como las
humano-bovino de la India y las humano-cerdo de Brasil (Gouvea, 1994).

Este es el virus entrico que ms fcilmente se determina con pruebas comerciales. Para la
deteccin viral se utiliz un kit de ELISA (PATHFINDER
TM
Rotavirus BIORAD), que al
detectar las partculas virales produca un color azul en caso de que el anticuerpo
reaccionara con la protena VP6 presente en la cpside viral siendo esta una evaluacin
colorimtrica cualitativa de la presencia de Rotavirus (Figura 9).



Figura 10. Determinacin colorimtrica de la presencia de Rotavirus. (a) resultado positivo (b) resultado
negativo

Durante la primera semana del primer proceso de compostaje se obtuvo un 100% de
muestras positivas en las pilas con 50 y 60% de residuos de plaza, indicando que la
temperatura y el pH en esta semana no son suficientes para la destruccin viral (Tabla 17).
En el caso de las pilas con 50% de residuos de plaza, la temperatura alcanzada de 38.5C y
el pH de 5.6 no tienen un efecto significativo sobre las partculas de Rotavirus, ya que este
agente puede retener su infectividad hasta siete meses a temperatura ambiente (Morris et
al., 1975) y su supervivencia a pH cido y neutro es mayor que a pH alcalino teniendo en
cuenta las caractersticas de las partculas virales. Las condiciones ptimas para el
compostaje estn dadas por niveles de pH de 5.5- 8.0 y contenidos de humedad entre el 40
y 60% (Avendao, 2003). Estos factores ambientales juegan un papel secundario en la
inactivacin viral durante el compostaje ya que las condiciones anteriormente mencionadas
no son perjudiciales para los virus entricos. Teniendo en cuenta lo anterior, el pH y el
contenido de humedad pueden afectar la supervivencia viral solo al influenciar la
multiplicacin y subsiguiente actividad metablica de las bacterias y hongos nativos del
compostaje que al degradar material proteinceo producen amonio. El amonio en altas
concentraciones puede afectar la viabilidad viral incrementando el pH durante el proceso de
estabilizacin orgnica (Guardabassi et al., 2003). Para las pilas con 50% de residuos de
plaza existe una correlacin negativa entre la presencia viral y el pH con coeficientes de
correlacin de -0.88 y -0.96 para la prueba de ELISA e Inmunocromatografa
respectivamente (Anexo 6). Lo anterior indica que un aumento de pH causa un descenso en
la presencia viral. De igual forma sucede en el caso de las pilas con 60% de residuos de

plaza durante el primer proceso; donde se presentan coeficientes de correlacin de -0.63 y -
0.32 que indican una correlacin dbilmente negativa en comparacin con las anteriores.

Tabla 17. Proporcin de muestras positivas en el primer proceso de compostaje por los dos
metodos de deteccin (ELISA e ICT), pH y temperatura promedio

Semana
1
Semana
2
Semana
3
Semana
4
Semana
5
Semana
8
ELISA 6/6* 1/6 0/6 0/6 1/6 3/6
Inmunocromatografa 6/6 1/6 0/6 0/6 1/6 0/6
Temperatura C 44.5 60.6 67.2 65.5 67.3 58.2
pH 6.46 7.25 7.9 8.15 8.08 8.22
*Nmero de muestras positivas/Nmero de muestras analizadas

Adems de la temperatura y el pH, la actividad microbiana del compostaje puede ser un
factor importante en la inactivacin viral. Como resultado de la presencia de compuestos
orgnicos nitrogenados durante el proceso de biodegradacin; la flora microbiana del
compostaje libera enzimas proteolticas que en determinado momento pueden alcanzar las
cpsides virales compuestas por protenas y por ende son susceptibles a esta accin
enzimtica. Desafortunadamente no hay datos sobre la susceptibilidad de las protenas
virales a las condiciones prevalentes en las pilas de compost, sin embargo segn Van
Soelen, 2007 los virus pueden convertirse en una fuente proteica para bacterias.

Durante las seis semanas siguientes de compostaje el pH fue tendiente a la alcalinidad en
un rango entre 7.8 8.8. En este rango los iones NH
4
+
liberan un protn causando la
volatilizacin de amonio. La combinacin de los altos valores de pH y la produccin de
amonio reducen los ttulos virales de poliovirus y Rotavirus en al menos cuatro unidades
logartmicas (Monphoeho et al., 2004; Ahmed y Sorensen, 1995). La inactivacin por amonio
a pH mayores a 8 causa la fragmentacin del RNA como fue demostrado por Monphoeho et
al., 2004 quien sugiere que el mecanismo de accin del amonio est limitado a la protelisis
de la cpside viral y su infiltracin en el genoma, sin descartar la accin otras sustancias
capaces de degradar el RNA. De igual forma a pH cido hay un aumento en el fenmeno de
adsorcin viral por la presencia de cationes monovalentes o divalentes (Sobsey et al., 1980).
La inactivacin de virus durante el proceso de compostaje est determinada por una
combinacin de factores qumicos, fsicos y biolgicos. La causa ms importante de
inactivacin viral es el calor generado durante la fase termoflica de compostaje (Monphoeho

et al., 2004) y en menor grado la inactivacin se debe a degradacin microbiana y
produccin de amonio. Los mecanismos anteriores interactan de manera simultnea
durante el compostaje; atribuyendo as la inactivacin viral a una relacin sinrgica entre
ellos, ms que a una accin individual de cada mecanismo (Guardabassi et al., 2003).

Es importante anotar que esta prueba de ELISA no es cuantitativa, motivo por el cual se
informa positivo o negativo, sin embargo, su lectura se realiza en unidades de absorbancia.
Al examinar los resultados, los controles positivos sobrepasan las 1.5 unidades, la semana 1
los valores estn entre 1 y 1.5 unidades y para la semana 4 los valores ya estn cercanos al
punto de corte, lo cual hace sospechar de una disminucin progresiva de la cantidad de
partculas virales (Anexo 7).

En el montaje de las pilas fue necesaria la adicin de cal (CaOH
2
) con el fin de contrarrestar
la acidificacin excesiva del material compostar. El agregar este compuesto mantiene el pH
en un rango de neutro a alcalino y pudo tener un efecto virucida tal como se reporta en el
estudio de Mohaibes et al., 2004 quien plantea la adicin de hidrxido de calcio como un
mtodo de eliminacin de patgenos.

La concentracin de calcio es directamente proporcional a la tasa de inactivacin de virus; el
tratamiento con cal reduce el nmero de microorganismos y partculas virales ya que se une
al material slido facilitando la floculacin y sedimentacin sumado al aumento de pH
(Hansen et al., 2007). Por lo tanto se infiere en los lixiviados que se generan a partir de las
pilas de compostaje en el relleno sanitario se pueden encontrar virus entricos. De igual
forma este mismo autor sugiere el uso de la estabilizacin con cal para la reduccin de
adenovirus tipo 5, Rotavirus Wa y bacterifagos en lodos y en el bioslido resultante. Sin
embargo, segn el estudio de Parreo en el 2003 el Rotavirus mantiene su infecciosidad
durante meses en ambientes hmedos, a temperaturas entre los 4 y 20C y en presencia de
iones calcio que estabilizan su capside externa.

Para ambos mtodos de deteccin hay una correlacin negativa entre la presencia viral y la
temperatura, es decir, estos dos ltimos son inversamente proporcionales. En el caso de las
pilas control los coeficientes de correlacin son de -0.98 y -0.96 para la prueba de ELISA e
Inmunocromatografa respectivamente. Lo anterior tambin ocurre en las pilas del 60% de
residuos de plaza en el primer proceso donde los coeficientes de correlacin son de -0.66 y -
0.90 expresando una mayor correlacin en contraste con la correlacin con el parmetro de
pH (Anexo 6). Esto establece la existencia de un efecto directo de la temperatura y del pH

aunque en menor proporcin de este ltimo sobre la presencia de Rotavirus en el proceso
de compostaje.

Se ha demostrado que temperaturas de 50C simuladas en equipos de pasteurizacin, son
suficientes para reducir un titulo viral de Rotavirus (1.410
7
PFU/ml) en una unidad
logartmica, el valor D (tiempo de reduccin decimal) a esta temperatura es de 8 minutos
(Mahony et al., 2000). Esto explica la positividad de las muestras tomadas a esta
temperatura sumado a la existencia de compuestos que protegen las partculas virales. Un
grupo de componentes presentes en los lodos y que son concentrados por desecacin son
los detergentes los cuales han mostrado proteger los virus entricos del calor. Sin embargo,
el compostaje causa una reduccin considerable en la concentracin de detergentes
provenientes de la materia orgnica luego de varias semanas de proceso (Ward y Ashley,
1978; Monphoeho et al., 2005).

En el rango de temperatura mesoflica otro factor que contribuye a la supervivencia viral es la
adsorcin de las partculas virales a los slidos. Los compuestos orgnicos solubles
compiten con los virus por los sitios de unin en las superficies minerales, mejorando el
movimiento de las partculas virales (Chu et al., 2003).

En la segunda semana del primer proceso de compostaje solo se obtuvo un 17% de
positividad para Rotavirus siendo este un indicativo de que los procesos fsicos y qumicos
propios del compostaje tienen efecto sobre la viabilidad viral. A partir de esta semana es
evidente un aumento de la temperatura con valores de 58.13C para las pilas con 50% de
residuos de plaza y 63.03C para las pilas del primer compostaje con 60% de residuos de
plaza mostrando una reduccin del 93% en las muestras positivas. Posteriormente en las
semanas 3 y 4 la totalidad de las muestras fueron negativas, lo cual indica que el proceso
logr la denaturacin de la protena de la cpside afectando la viabilidad de las partculas
virales.

La destruccin viral dentro del compostaje pudo presentarse por la produccin de sustancias
como cidos y fitotoxinas resultado de la actividad microbiana que eliminan una parte de las
poblaciones de patgenos o bien por la accin de enzimas proteolticas liberadas por los
microorganismos que actan sobre la cpside viral durante la degradacin de los residuos
(Turner, 2001; Guardabassi et al., 2003).


En la semana 5 y 8 reaparecen muestras positivas (Tabla 16) lo cual sugiere la
contaminacin del compost por herramientas de trabajo en el proceso de los volteos
manuales, ya que al ser las ltimas semanas del proceso donde la temperatura se ha
mantenido por encima de los 50C la probabilidad de detectar Rotavirus es baja. Sin
embargo, la ubicacin de la zona de compostaje dentro del relleno sanitario favorece el
descenso de las aguas lluvias que provienen de la zona de acumulacin de los residuos
municipales como tambin la formacin de aerosoles dentro de la misma.

En el relleno sanitario de Bioagrcola del Llano EPSP se lleva a cabo la recepcin de toda
clase de residuos. En caso de precipitacin la lluvia se infiltra en el relleno sanitario
arrastrando consigo las partculas virales entre otros microorganismos; en ocasiones se
presentaron zonas inundadas cerca de la zona de compostaje siendo estas posibles
contaminantes de las pilas de compost. Los patgenos como los virus entricos pueden
persistir en el agua, no crecen ni se proliferan en ella pero pueden acumularse en
sedimentos, que despus se movilizan cuando la corriente de agua aumenta (Gratacab,
2000).

Igualmente dentro del relleno sanitario y como consecuencia de la acumulacin de basuras
es posible que se hayan generado bioaerosoles los cuales en determinado momento
pudieron contribuir a la aparicin de muestras positivas. De manera general los hongos y los
virus son ms resistentes a la inactivacin que las bacterias y que el contenido lipdico de los
virus tiende a ser ms estable en condiciones de baja humedad relativa (Brooks et al., 2004)
sumado a que pueden asociarse al material particulado segn el lugar de origen ; por lo
tanto se puede afirmar que el Rotavirus puede utilizarse como indicador de generacin de
aerosoles ya que los reovirus han sido constantemente hallados constituyndose as como
posibles indicadores de los virus entricos aerozolizables (Carducci et al., 2000).

Debido a su capacidad de adsorcin a materiales porosos y no porosos, las herramientas de
trabajo utilizadas para los volteos manuales de las pilas de compost pueden ser un medio de
transporte de partculas virales siendo est otra posible causa de las muestras positivas
encontradas en las ltimas semanas del proceso.

En cuanto a la comparacin de muestras positivas en las pilas del primer proceso de
compostaje; segn la probabilidad (0.5318; p=0.05) no existen diferencias estadsticamente
significativas entre los porcentajes de residuos de plaza utilizados en cada uno de ellos.
(Anexo 6).


En las materias primas utilizadas en el primer proceso de compostaje, el rumen fue positivo
para Rotavirus a diferencia de las otras materias primas utilizadas (Tabla 18) esto puede ser
atribuido a la naturaleza de los componentes del contenido ruminal. Este residuo est
compuesto en su mayora por materia orgnica y en menor proporcin fue posible observar
restos de tejido en los cuales el Rotavirus puede adsorberse a las clulas y permanecer all
sin replicarse pero manteniendo su viabilidad. De igual manera pueden sobrevivir fuera de
las clulas mediante fenmenos de adsorcin a slidos; los virus no pueden multiplicarse
fuera de una clula husped (enterocitos) pero son capaces de permanecer por largos
periodos de tiempo si no se aplica un proceso de estabilizacin adecuado a este tipo de
residuos. El Rotavirus puede sobrevivir en residuos de origen animal a temperatura
ambiente por ms de seis meses (Constantini et al., 2005).

Tabla 18. Deteccin de Rotavirus por ELISA e ICT para las materias primas

MATERIAS
PRIMAS
Cascarilla de
arroz
Podas Contenido
Ruminal
Residuos de
Plaza
ELISA Negativo Negativo Positivo Negativo
ICT Negativo Negativo Positivo Negativo
Fuente: Autores, 2007

Rotavirus bovino grupo A fue identificado, caracterizado y confirmado como agente causal
de diarreas en terneros, por primera vez, por Mebus et al., 1969. Actualmente se lo
considera el principal agente patgeno productor de diarreas en terneros menores de tres
semanas de vida, en todo el mundo. Respecto de los otros grupos, se ha reportado la
circulacin de Rotavirus grupo B y C en bovinos de Japn y Estados Unidos Rotavirus grupo
B ha sido detectado en terneros y espordicamente asociado con diarrea neonatal pero se
encuentra especialmente involucrado en brotes de diarrea epizotica en ganado adulto y
finalmente Rotavirus grupo C fue aislado a partir de un caso de diarrea en bovinos adultos
en Japn. Segn lo anterior las probabilidades de encontrar Rotavirus en contenido ruminal
son mayores que las probabilidades de encontrar el virus en residuos de plaza porque los
animales enfermos excretan grandes cantidades de Rotavirus (del orden de 10
8
-10
10

partculas infecciosas/ml) en sus heces sobreviviendo en estos excrementos y medio
ambiente durante largos periodos de tiempo gracias a mecanismos anteriormente
mencionados. Se ha comunicado mayor prevalencia del grupo A en los bovinos en donde
pueden causar desde infecciones asintomticas hasta cuadros de diarrea con prdida

abundante de lquido y desbalance electroltico. La diferente presentacin se atribuye a la
variacin en la virulencia de las cepas, edad de los animales, estado inmunolgico, dosis
infectante, estrs ambiental, as como infecciones asociadas (Valdivia et al., 2000)

Otro factor a tener en cuenta es el almacenamiento y conservacin de las materias primas;
Pesaro et al., 1995 afirma que es posible obtener una reduccin en la carga viral mediante el
almacenamiento de materias primas animales siempre y cuando se recurra a un tiempo de
almacenamiento prolongado. Esto especialmente para virus no envueltos como picornavirus,
adenovirus, parvovirus y Rotavirus, siendo este ltimo ms resistente a la inactivacin por
almacenamiento de materias primas animales explicando as la aparicin de Rotavirus en el
contenido ruminal utilizado en el primer proceso de compostaje. El almacenamiento del
rumen, se lleva a cabo en Bioagrcola del Llano en un contenedor donde permanece por un
tiempo mximo de 15 das, el cual no es considerado un tiempo de almacenamiento
suficiente para obtener una reduccin en la carga viral.

Por el contrario no se encontr Rotavirus en otras materias primas como son los residuos de
plaza, cascarilla de arroz y podas siendo esto un indicativo de que las materias primas de
origen vegetal no aportan carga viral al proceso de compostaje como si lo hacen las
materias primas de origen animal.

Teniendo en cuenta los resultados estadsticos (p: 0,6889 para el 50% de residuos de plaza
y p: 0,7488 para el 60% de residuos de plaza con un p: 0.05) se afirma que no existen
diferencias estadsticamente significativas al utilizar la tcnica de ELISA o de
inmunocromatografa para la deteccin de Rotavirus en matriz compost. Sin embargo, para
el caso de la inmunocromatografa hubo muestras negativas que por ELISA fueron positivas
como es el caso de la semana ocho y de una muestra de la semana dos del primer proceso
de compostaje. Esto se debe a que los ciclos de congelacin/descongelacin son
indeseables considerando que disminuyen la viabilidad del virus. Segn Regional Meeting
for the Americas Assesses Progress Against Rotavirus en el 2004, las muestras
sospechosas para Rotavirus deben ser transportadas al laboratorio entre 4 y 8C y
mantenerlas en este rango de temperatura si la muestra va a ser procesada en un lapso de
siete das a partir de la toma de la muestra. Si el laboratorio va a llevar a cabo, los test de
deteccin dentro de los dos primeros meses a partir de la recoleccin, es recomendable
guardar las muestras a -20C. Pero si las muestras van a ser procesadas despus de dos
meses, estas deben ser conservadas a una temperatura de -70C con el fin de que el virus
no pierda su viabilidad. En este caso, las muestras fueron conservadas a -10C durante

aproximadamente seis meses, adems se llevaron a cabo dos ciclos de
congelacin/descongelacin porque la prueba de ELISA y la inmunocromatografa no se
realizaron de manera simultanea. La temperatura de transporte de las muestras fue la
correcta, pero la conservacin hizo que el virus perdiera su viabilidad y por esta razn las
muestras positivas para ELISA fueron negativas en inmunocromatografa haciendo as ms
confiable los resultados obtenidos por la tcnica de ELISA. Sumado a que el valor calculado
por Biomerieux S.A para el lmite de deteccin de la prueba de ICT es de 4.10
5
partculas/mL
de Rotavirus siendo este valor similar al exponente reportado para la tcnica de ELISA la
cual fue utilizada por Crehalet et al., 2007 como mtodo de referencia para determinar la
sensibilidad y la especificidad de este mtodo. Esto confirma que no existen diferencias en el
uso de una tcnica u otra para la deteccin de Rotavirus utilizando como matriz compost y
que la prueba de ELISA puede ser utilizada como confirmatoria para la deteccin de este
agente viral.

Por otro lado, hubo una muestra de la semana dos en el primer proceso de compostaje, que
fue positiva por inmunocromatografa pero no por ELISA, sin embargo el resultado fue
dudoso por la poca pigmentacin rosada de la lnea de Rotavirus y al repetir la prueba para
confirmar el resultado fue negativo. Esto se debe a contaminacin de las herramientas de
trabajo y no a una deficiencia en la especificidad de la prueba. En un estudio llevado a cabo
por Marugn et al., 2006, la deteccin de Rotavirus por la tcnica de ICT en heces, tuvo una
sensibilidad de 89.3% y una especificidad de 100% usando RT-PCR (reaccin en cadena de
la polimerasa- transcriptasa reversa) como estndar de referencia. Por esta razn se
considera que el falso positivo observado en el procesamiento de las muestras no pudo
haberse debido a interferencias y reacciones cruzadas de la ICT. La tcnica de ELISA es
muy sensible para determinar Rotavirus, aunque requiere un mayor tiempo de
procesamiento de la muestra, un laboratorio ms equipado y un personal ms entrenado.
Mientras que la inmunocromatografa es rpida, fcil de realizar e interpretar, constituyendo
una tcnica accesible para los laboratorios de todo tipo de complejidad (Cuffia et al., 2006).
Actualmente la inmunocromatografa es un mtodo tan utilizado como el ELISA, confirmado
a travs de estudios comparativos realizados por otros autores como Wilhelmi et al., 2001.

Es posible que en los muestreos, la muestra sometida a los ensayos (5 gramos por pila), no
contuviera virus, lo cual no excluye que este estuviera en otros lugares del compost teniendo
una distribucin desigual del virus en la muestra. Esta variabilidad puede ser atribuida a la
estructura heterognea de la matriz utilizada y a la no homogeneidad en la distribucin de

los microorganismos dentro del compost los virus entricos infectivos presentes a
concentraciones que van desde 2 a 16 mpncu/g al inicio del compostaje (Comando, 2006).

Con respecto al segundo proceso de compostaje, todas las muestras incluyendo las
materias primas fueron negativas para Rotavirus mediante la tcnica de
inmunocromatografa. Posiblemente para el caso del segundo proceso de compostaje, la
presencia de Rotavirus se encontraba en una concentracin ms baja de 10
4
partculas
virales/g, la cual es la concentracin mnima a la cual los test de ELISA e ICT detectan el
agente viral. Tambin la ausencia de virus en las pilas de compostaje, pudo deberse a las
practicas culturales adoptadas por la empresa despus de los resultados positivos del primer
proceso de compostaje, consistentes en la limpieza de las herramientas de trabajo.

Se han estudiado varios grupos de bacterifagos de bacterias entricas (colifagos
somticos, colifagos F-especficos, fagos de Bacteroides fragilis) y de virus de origen
humano (enterovirus y adenovirus humanos) (Puig et al., 1994). Todos ellos presentan
buenas posibilidades pero tambin inconvenientes para realizar su funcin como indicador.
Los enterovirus no son excretados de forma regular por la poblacin, y en ausencia de
brotes la mayora de los enterovirus presentes en el ambiente son poliovirus de origen
vacunal, para los cuales se administra una vacuna oral a edades muy tempranas. Los virus
que se multiplican en el intestino se excretan en las heces y se eliminan en los paales que
son tratados como residuos slidos considerados como material no apto para compostar
(Roben, 2002).

Por otro lado, la recuperacin de virus a partir de lodos y bioslidos es difcil debido a la
asociacin de los viriones a los componentes de estas matrices (Hansen et al., 2007) y las
tcnicas de extraccin, concentracin y deteccin son costosas en comparacin a otras
tcnicas para organismos indicadores de contaminacin fecal. Las caractersticas que debe
cumplir un organismo para poder ser utilizado como indicador fueron descritas por Berg en
1978, entre las cuales se incluye el costo de la metodologa para su deteccin y
cuantificacin, la especificidad del test de deteccin y adems afirma que el organismo
indicador no ha de ser patgeno ni comportar riesgo alguno para la salud humana. Adems,
para detectar y enumerar virus en muestras ambientales se utiliza cultivo celular o PCR, esta
ultima no determina infectividad y usualmente los nmeros de virus son demasiado bajos
para seguir el desarrollo de procesos de desinfeccin, potabilizacin, depuracin, entre otros
(Pina, 2000). Por lo anterior, el Rotavirus no debe considerarse como un indicador de la
eficiencia de un proceso de estabilizacin de materia orgnica como lo es el compostaje.



































7.CONCLUSIONES




Se confirm que el uso de un inoculante termoflico con actividad amiloltica y
proteoltica incrementa la tasa de degradacin de los residuos orgnicos presentes
en las pilas de compostaje obteniendo un abono orgnico segn los estndares
establecidos.

El uso de extracto de carne y polietilenglicol 6000 en las tcnicas de extraccin y
concentracin viral permite la recuperacin y deteccin de partculas de Rotavirus A
por ELISA e inmunocromatografa utilizando como matriz compost.

Existe una relacin inversamente proporcional entre la presencia viral y los
parmetros de temperatura y pH del compostaje ya que temperaturas en el rango de
termoflia y valores de pH alcalino causan la inactivacin viral, siendo ms marcado el
efecto de la temperatura que del pH sobre Rotavirus A.

Las temperaturas de mesoflia y el pH cido dentro del proceso de compostaje no
tienen efecto sobre las partculas virales de Rotavirus A.

Las materias primas de origen animal utilizadas dentro del proceso de compostaje
aportan carga viral al proceso en comparacin con materias primas de origen vegetal.

El Rotavirus A no debe considerarse como un indicador de eficiencia de un proceso
de compostaje.

La presencia de rotavirus en el primer proceso de compostaje no es un indicativo de
la infectividad de las partculas detectadas mediante ELISA e ICT







8. RECOMENDACIONES


Se sugiere evaluar mtodos de esterilizacin para obtener un control positivo libre de
antgenos.
Es necesario estudiar la disminucin de ttulos virales durante el proceso de
compostaje.
El uso de mtodos de deteccin que determinen la infectividad de las partculas de
rotavirus como el cultivo celular.


























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10. ANEXOS


ANEXO 1. MEDIOS DE CULTIVO


Caldo leche al 1% (p/v):

Leche en polvo descremada suplementada con calcio 10g/L, extracto de levadura 2.5 g/L,
peptona universal 2.5 g/L, sulfato de amonio 0.5 g/L, cloruro de calcio 0.5 g/L, fosfato
monobsico de potasio 0.1 g/L, fosfato dibsico de potasio 0.1 g/L,, pH final 7.0 +/- 0.2.
Autoclavar a 7Lb de presin por 7 minutos. (Pedroza et al., 2004).

Caldo almidn al 1% (p/v):

Almidn 10 g/L, extracto de levadura 2.5 g/L, peptona universal 2.5 g/L, sulfato de amonio
0.5 g/L, cloruro de calcio 0.5 g/L, fosfato monobsico de potasio 0.1 g/L, fosfato dibsico de
potasio 0.1 g/L, pH final 7.0 +/- 0.2. Autoclavar a 7Lb de presin por 7 minutos. (Pedroza et
al., 2004).

Caldo almidn/leche al 1% (p/v):

Leche en polvo descremada suplementada con calcio 5 g/L, almidn 5 g/L, extracto de
levadura 2.5 g/L, peptona universal 2.5 g/L, sulfato de amonio 0.5 g/L, cloruro de calcio 0.5
g/L, fosfato monobsico de potasio 0.1 g/L, fosfato dibsico de potasio 0.1 g/L, pH final 7.0
+/- 0.2. Autoclavar a 7Lb de presin por 7 minutos. (Pedroza et al., 2004)












ANEXO 2. PROTOCOLO CIDO TRICLOROACTICO

1. Preparacin de buffer fosfato 0.1M

Preparar cada fosfato por separado de la siguiente manera: pesar 14.2g de Na
2
HPO
4
,
disolver en 200mL de agua destilada y pese 12g de NaH
2
PO
4
, disolver en 200mL de agua
destilada, mezclar posteriormente, ajustar pH 7.0 +/- 2.0 y enrasar a 1000mL con agua
destilada en baln umtrico.

2. Preparacin de solucin de casena hidrolizada

Pesar 10g de casena para 1000mL de Buffer fosfato 0.1M, disolver en bao termostatado a
37C durante 1 hora.

3. Preparacin del cido tricloroactico
Pesar 15g de cido tricloroactico y disolverlo en 100mL de agua destilada.

4. Protocolo de estandarizacin de la tcnica del cido tricloroactico
Preparacin de la solucin stock de tirosina 100mol/mL

Pesar 0.01g de tirosina en balanza analtica, 0.0052g de NaH
2
PO
4
y 0.0022g de
Na
2
HPO
4
.
Disolver en agua destilada los anteriores compuestos hasta obtener 50mL.
Enrasar hasta 100mL con agua destilada.
La soluciones de concentracin mas baja (de 10 en 10 hasta 100) se preparan de
acuerdo a la aplicacin de la formula V
1
C
1
= V
2
C
2
, teniendo en cuenta que el volumen
final de cada una es de 3 ml.


Tabla 1. Preparacin de soluciones de tirosina

CONCENTRACIONES
SOLUCIN STOCK DE TIROSINA
(mL)
AGUA DESTILADA
(mL)
10 0.3 2.7
20 0.6 2.4
30 0.9 2.1
40 1.2 1.8
50 1.5 1.5
60 1.8 1.2
70 2.1 0.9
80 2.4 0.6
90 2.7 0.3
100 3.0 0
Fuente: (Galindo et al., 2005).

Como blanco de la prueba se utiliza una solucin que contiene 1mL de solucin de casena
1% (p/v), 1mL de TCA (cido tricloroactico) y 1mL de Buffer fosfato 0.1M; posteriormente la
mezcla se centrfuga a 5000rpm por 5 minutos. La prueba se lee a 280nm en
espectrofotmetro de luz U.V (Galindo et al., 2005).























ANEXO 3. CURVA PATRN DE TIROSINA (ATC)

Se elaboraron tres replicas de la misma solucin stock de tirosina con el fin de obtener datos
significativos.

Tabla 1. Curva patron de tirosina

Promedio de las tres rplicas
Concentracin (g/L) Absorbancia (280nm)
10 0,3483
20 0,4670
30 0,5320
40 0,6227
50 0,7320
60 0,8310
70 0,9080

Fuente: Autores, 2007





Fuente: Autores, 2007





ANEXO 4. PROTOCOLO TCNICA DEL CIDO DINITROSALISLICO (DNS)
(Miller et al., 1959)

1. Actividad Amiloltica

Preparacin del cido 3,5- dinitrosaliclico (DNS)

Depositar en un beaker de 250mL, 50mL de agua destilada, adicione 1.6g de hidrxido
de sodio y disolver mediante agitacin continua en plancha magntica a temperatura
ambiente. Posteriormente adicionar lentamente 43.8g de tartrato de sodio y potasio
hasta que se disuelva por completo. Recubrir el vaso de precipitado con papel aluminio y
agregar lentamente el DNS (1g). Completar con agua destilada hasta 100mL en un
baln aforado. Deje en agitacin toda la noche en un frasco oscuro (Miller, et, al 1959).

Preparacin de la solucin stock de glucosa 2g/l

Pesar 2g de glucosa anhidra en balanza y disolver en 500mL de agua destilada
utilizando baln umtrico de 1000mL, homogenizar y completar hasta 1000mL con agua.
La solucin stock se puede alcuotar y congelar a -20C (Miller, et, al 1959).

Preparacin de las soluciones de concentracin conocida 0.5 2g/l

Empleando la formula de V
1
C
1
= V
2
C
2
. Se preparan seis soluciones que tengan un umen
final de 2mL

Tabla 1. Preparacin de las soluciones de glucosa

Concentracin g/L Solucin concentrada de glucosa en mL Agua destilada mL
0.5 0.5 1.5

0.7 0.7 1.3
1 1 1
1.5 1.5 0.5
1.7 1.7 0.3
2 2 0
Fuente: (Miller et al., 1959)

A partir de cada una de las soluciones de concentracin conocidas deposite 0.25 mL de
cada una en tubos de 13 x 100 mm y siga el protocolo descrito de la tabla 2.
Tabla 2. Curva de calibracin de Glucosa

CONCENTRACIN g/L
REACTIVO BLANCO
0 1 1/2 2 4 6 ..
Glucosa (mL) - 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
Agua (mL) 0.25 - - - - - -
Reactivo DNS (mL) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
Ebullicin por 5 minutos y frenar reaccin colocando los tubos en hielo
Agua 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
Proteja los tubos de luz y realice las lecturas en espectrofotmetro a 540 nm contra blanco
DNS
Fuente: (Miller et al., 1959)

2. Preparacin de almidn al 1% (p/v) en Buffer fosfato 0.1M

Pesar 1g de almidn hidrosoluble y disolverlo lentamente en 50mL de Buffer fosfato 0.1M,
caliente la solucin en horno microondas por 1 minuto, ajustar el pH 7.0 +/- 2.0 y enrasar a
100mL con Buffer fosfato 0.1M, en baln volumtrico.

2.1 Reaccin Enzimtica de Almidn al 1% (p/v) en buffer fosfato O.1M

Tomar 3mL del extracto crudo correspondiente a las horas de fermentacin a determinar, y
realizar el protocolo presenta en la (tabla 3).
Tabla 3. Reaccin enzimtica con almidn al 1% p/v en buffer fosfato 0.1M


REACTIVO
REPLICA 1 REPLICA 2 REPLICA 3
Almidn al 1% p/v Buffer fosfato 0.1M 1mL 1mL 1mL
Extracto crudo 1mL 1mL 1mL
Incubar las muestras por 30 minutos a 37 C. Frenar la reaccin depositando los tubos en hielo por 5min
Centrifugar por 10min a 5000rpm para separar el almidn no hidrolizado por la enzima

Fuente: (Miller et al., 1959)

A partir del sobrenadante tomar 0.250mL de cada hora de fermentacin y se transferir a los
tubos que contienen 0.250mL de DNS. Continuar con el protocolo que se describe en la
(tabla 4) (Miller et al., 1959).

Tabla 4. Actividad Amiloltica cuantitativa

CONCENTRACIN g/L
REACTIVO BLANCO
0 1 1/2 2 4 6 ..
Sobrenadante de la tcnica
enzimtica (mL)
- 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
Agua (mL) 0.25 - - - - - -
Reactivo DNS (mL) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25
Ebullicin por 5 minutos y frenar reaccin colocando los tubos en hielo
Agua 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
Proteja los tubos de luz y realice las lecturas en espectrofotmetro a 540 nm contra blanco
DNS

Fuente: (Miller et al., 1959)

Una vez obtenidas los valores de las absorbancias por la tcnica anteriormente mencionada,
se halla la concentracin de azucares reductores en g/l. con el resultado anterior se realiza
una relacin estequiomtrica para determinar en mol la cantidad de enzima por el tiempo
de incubacin empleado para obtener la reaccin enzimtica. Finalmente se define la unidad
amiloltica que es la cantidad de enzima necesaria para hidrolizar un mol de glucosa por
minuto (UA/min), bajo condiciones constantes de la prueba (Miller et al., 1959).











ANEXO 5. CURVA PATRN DE GLUCOSA PARA DETERMIANCIN DE AZCARES
REDUCTORES (DNS)

Se elaboraron tres replicas de la misma solucin stock de glucosa con el fin de obtener
datos significativos.

Tabla 1. Curva patron de glucosa

Promedio de las tres rplicas
Concentracin
(g/L)
Absorbancia
(540nm)
0,5 0,237
0,7 0,292
1 0,526
1,5 0,642
1,7 0,804
2 0,94

Fuente: Autores, 2007




Fuente: Autores, 2007




ANEXO 6. ANLISIS FISICOQUMICO DEL COMPOST OBTENIDO

Tabla 1. Anlisis Fisicoqumico del primer proceso de compostaje


Control: 50% residuos de plaza; T: 60% residuos de plaza
(AGRILAB LTDA, 2007).























Tabla 2. Anlisis fsico qumico del segundo proceso de compostaje















ANEXO 7. PREPARACIN DE EXTRACTO DE CARNE AL 10% Y BUFFER FOSFATO 7.2



Extracto De Carne Al 10% (p/v)

Extracto de carne en polvo 10g/100ml, hidrogeno fosfato de sodio heptahidratado Na
2
HPO
4

7H
2
O 1.34g/100 ml y cido ctrico 0.12 g/100 ml. pH final 9. Disolver por agitacin
magntica y autoclavar la solucin por 15 minutos a 121C, 15 psi (Ahmed y Sorensen,
1995)

Buffer fosfato 7.2

Dihidrgeno fosfato de Sodio NaH
2
PO
4
H
2
O 2 g/L, hidrogeno fosfato de sodio Na
2
HPO
4
13
g/L, cloruro de sodio NaCl 87g/L (Ahmed y Sorensen, 1995).
























ANEXO 8. PRUEBAS ESTADISTICAS



Mann- Whitney: Comparacin entre el mtodo de ELISA e inmunocromatografa


Tabla 1. Pilas con 50% de residuos de plaza

Elisa 6 datos
Inmunocromatografa 6 datos
P 0,7488
T=Ub 15,5


Tabla 2. Pilas con 60% de residuos de plaza

Elisa 6 datos
Inmunocromatografa 6 datos
P 0,6889
T=Ub 15

Kruskal Wallis: Efecto de las diferencias en composicin entre las pilas de
compostaje en la proporcin de muestras positivas para Rotavirus

Tabla 3. Comparacin de las proporciones de resultados positivos para Rotavirus mediante
Inmunocromatografa del primero y segundo proceso de compostaje P: 0,5318.

50% residuos
de plaza
60% residuos de
plaza (1 proceso)
60% residuos de
plaza (2 proceso)
50% residuos de
plaza
0,9362 0,3785
60% residuos de
plaza (1 proceso)
1 0,3785
60% residuos de
plaza (2 proceso)
1 1



Coeficiente de correlacin presencia de Rotavirus-pH-temperatura de las pilas
evaluadas con ELISA.

Tabla 4. Coeficiente de correlacin para pilas con 50% de residuos de plaza.

Presencia de Rotavirus pH Temperatura
Presencia de Rotavirus 1
pH -0,883777363 1
Temperatura -0,985109606 0,90791727 1


Tabla 5. Coeficiente de correlacin para pilas con 60% de residuos de plaza.

Presencia de Rotavirus pH Temperatura
Presencia de Rotavirus 1
pH -0,321326124 1
Temperatura -0,905644004 0,4586235 1

Coeficiente de correlacin presencia de Rotavirus-pH-temperatura de las pilas
evaluadas con ICT

Tabla 6. Coeficiente de correlacin para pilas con 50% de residuos de plaza.

Presencia de Rotavirus pH Temperatura
Presencia de Rotavirus 1
pH -0,969563896 1
Temperatura -0,965422928 0,907917271 1

Tabla 7. Coeficiente de correlacin para pilas con 60% de residuos de plaza.

Presencia de Rotavirus pH Temperatura
Presencia de Rotavirus 1
pH -0,633937916 1
Temperatura -0,663599839 0,4586235 1


ANOVA Anlisis fsico qumico

Tabla 8. ANOVA Porcentaje de humedad

Origen de las
variaciones Suma de cuadrados
Grados
de
libertad F Probabilidad
Valor
crtico
para F
Entre grupos 97,2066667 2 0,17083439 0,84692136
5,143
25285
Dentro de los
grupos 1707,03333 6

Total 1804,24 8


Tabla 9. ANOVA Porcentaje de nitrgeno orgnico

Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados
de
libertad F Probabilidad
Valor crtico
para F
Entre grupos 2,28302222 2 4,83281588 0,05618366 5,14325285
Dentro de los
grupos 1,4172 6

Total 3,70022222 8








Tabla 10. ANOVA Porcentaje de fsforo


Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados
de
libertad F Probabilidad
Valor crtico
para F
Entre grupos 0,47615556 2 1,77375828 0,24818898 5,14325285
Dentro de los
grupos 0,80533333 6

Total 1,28148889 8

Tabla 11. ANOVA Porcentaje de potasio

Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados
de
libertad F Probabilidad
Valor crtico
para F
Entre grupos 0,91606667 2 1,18808543 0,36755063 5,14325285
Dentro de los
grupos 2,31313333 6

Total 3,2292 8

Tabla 12. ANOVA Porcentaje de calcio

Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
Libertad F Probabilidad
Valor crtico
para F
Entre grupos 9,0098 2 2,34280415 0,17703372 5,14325285
Dentro de los
grupos 11,5372 6

Total 20,547 8

Tabla 13. ANOVA Porcentaje de magnesio

Origen de las
variaciones
Suma de
cuadrados
Grados de
Libertad F Probabilidad
Valor crtico
para F
Entre grupos 1,21108889 2 2,64173534 0,15035769 5,14325285

Dentro de los
grupos 1,37533333 6

Total 2,58642222 8





























ANEXO 9

Tabla 1. Absorbancias de la prueba de ELISA para el primer proceso de compostaje


50% RP* 50% RP 50%RP 60% RP 60% RP 60% RP
SEMANA 1 1,259 1,346 1,273 1,527 1,483 0,534
SEMANA 2 0,087 0,046 0,496 0,001 0,001 0,001
SEMANA 3 0,001 0,005 0,001 0,009 0,001 0,001
SEMANA 4 0,001 0,001 0,041 0,075 0,093 0,092
SEMANA 5 0,086 0,061 0,006 0,074 0,187 0,08
SEMANA 6
SEMANA 7
SEMANA 8 0,067 0,208 0,064 0,027 0,149 0,207


*RP: residuos de plaza. Las absorbancias resaltadas en amarillo son consideradas
positivas para Rotavirus.