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24/09/2013

Pr. Izaabel Hassan

e mail : h.izaabel@gmail.com

Cours de Gnomique structurale


La gnomique est l'tude exhaustive des gnomes, des diffrentes squences qui le compose et en particulier, de l'ensemble des gnes, de leur structure, de leur disposition sur les chromosomes, de leur squence, de leur fonction et de leur rle. Rfrences :
Gnes V de Lewin Prcis de gnomique de Gibson & Muse Expression du gnome de Herbomel Gnes & Gnome de Singer et Berg

Chapitre I Structure fine de la chromatine et rgulation de lexpression gnique.

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Chapitre I : Structure fine de la chromatine et


rgulation de lexpression gnique.

I. I.

Gnralits

Dans le noyau :
le DNA nest jamais nu, mais toujours associ des protines et mme des ARN. Lensemble constituant ce que lon appelle la chromatine. chromatine. La vie cellulaire impose qu tout moment linformation adquate soit trouve parmi les 3 milliards de paires de bases, puis lue de manire rgule.

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Cette information doit tre protge protge, , rpare en cas daltration et enfin prennise dans les cellules filles. Tout cela est luvre - au moins en trs large part - des protines de la chromatine qui joue un rle centrale. Ce nest que par la connaissance dtaille de leur structure que lon pourra comprendre la rgulation de lexpression des gnes.

La chromatine se prsente (au stade interphasique) interphasique ) le plus souvent sous la forme d'une matire sans structure particulire.

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A certains moments de la vie de la cellule (aux moments des multiplications (ou stade mtaphasique) ), la chromatine perd son aspect diffus et se condense en structures bien dfinies: les chromosomes.

La fibre de la chromatine observe au microscope lectronique a un diamtre de 100nm.


Dans certains conditions exprimentales cette fibre peut prsenter soit un diamtre de 30nm (300A) ou 10nm (100A).

Ces diffrentes valeurs sont trs suprieures au diamtre de la double hlice de lADN qui est de 20A.

100 nm

30 nm

10 nm

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Chapitre I : Structure fine de la chromatine et


rgulation de lexpression gnique.

I. I.

Gnralits

I. II. Structure de base de la fibre chromatinienne.


1. Structure du Nuclosome

Digestion de la chromatine par la Nuclase de Microcoque.

LADN est coup en des fragments dont la taille est un multiple dune unit de longueur, aprs fractionnement par lectrophorse sur gel dagarose, on obtient une chelle stendant sur une dizaine de bandes successives de lordre de 200 pb.

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La digestion par la nuclase de Microcoque. gnre une chelle nuclosomale.


Quand la chromatine digre par la nuclase de microcoque est fractionne sur un gradient de sucrose, on obtient une srie de pics discrets correspondant des monomres, des dimres, des trimres, des ttramres etc. LADN extraite de ces fractions migrent au mme niveau que les fragments obtenues par digestion par la nuclase de Microcoque.

Si on digre du DNA du foie de rat par la nuclase de microcoque, en 30s de digestion on obtient des fragments de 200 pb. Une digestion plus prolonge aboutie une bande de 146 pb. Conclusion : LADN du nuclosome = ADN coeur fixe de 146pb + lADN de liaison (linker) qui est variable.

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Lorsque la chromatine est traite dans des conditions relativement douces par de l'ADNase de Micrococcus aureus, (nuclase de Microcoque) de petites particules dun diamtre de 100A sont libres.

Ces particules sont constitues par : de lADN long denviron 200 paires de bases, de 8 molcules dhistones (2 H2A, 2 H2B, 2 H3 et 2 H4) de quelques protines non histones.

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La forme du nuclosome correspond un disque plat ou un cylindre dont le diamtre est denviron 11nm et de hauteur de 6nm. LADN denviron 200 pb (=67 nm) ce qui est le double de la circonfrence de la particule gale 34 nm.

Tous ceci suggre que lADN se situ lextrieur du corps protique.

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L'unit fondamentale de la chromatine est donc le nuclosome qui est compos d'ADN et d'histones. Il constitue le premier niveau de compaction de l'ADN dans le noyau.

Elments de dfinition du nuclosome et du chromatosome.

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LADN a besoin d'tre protg par des protines lorsqu'il n'est pas utilis comme modle pour l'expression des gnes ou la rplication. Cette protection se fait par enroulement autour de protines basiques capables de se lier avec lADN. Des octamres d'histones sont au centre de particules qu'on trouve tous les 200 nuclotides et autour desquels lADN s'enroule. La structure voque un collier de perles . Chaque nuclosome est constitu d'un fragment dADN de 146 paires de nuclotides et de huit molcules d'histones.

Chapitre I : Structure fine de la chromatine et rgulation de


lexpression gnique.

I. I. Gnralits I. II. Structure de base de la fibre chromatinienne.


1. Structure du Nuclosome

2. Protines histones.

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Caractristiques des histones de mammifres


Type Nombre dacides amins 213 129 125 135 102 Poids molculaire (KD) 23.0 14.0 13.8 15.3 11.3 Nombre dacides amins basiques 65 26 28 32 26 Rapport Lys/Arg Nombre dacides amins acides 12 20 16 18 10

H1 (lapin) H2A (vache) H2B (vache) H3 (vache) H4 (vache)

21 1.2 2.5 0.7 0.8

Caractristiques typiques des histones de mammifres


Les histones sont les protines les plus abondants du noyau. Elles sont de petites taille (11 28 kDa). Elles possdent un caractre trs basique (pHi > 10). Une lctrophorse pH acide montre quil existe cinq types appels respectivement H1, H2A, H2B, H3 et H4. Ces cinq histones sont retrouves chez tous les eucaryotes. Les squences primaires des cinq histones de diffrentes espces ont t entirement dtermines, ce qui a permis de montrer leur trs grande conservation au cours de lvolution. Les histones les plus conserves sont H3 et H4.

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Les modifications post-traductionnelles des nuclosomes


Chaque histone peut subir toute une srie de modifications posttraductionnelles: mthylation, actylation ou phosphorylation. Toutes ces modifications concernent les domaines flexibles N et Cterminaux. La charge totale de la protine peut se trouver rduite par ces modifications.

Les modifications post-traductionnelles des nuclosomes


Squences primaires des extrmits N-terminales des histones nuclosomales.

Les nombres indiquent la position des acides amins. Les modifications post-traductionnelles sont indiqus (ac en rouge = sites d'actylation ; p en bleu = sites de phosphorylation ; m en vert = sites de mthylation)

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Les modifications post-traductionnelles des nuclosomes

Chapitre I : Structure fine de la chromatine et rgulation de


lexpression gnique.

I. I. Gnralits I. II. Structure de base de la fibre chromatinienne.


1. Structure du Nuclosome 2. Protines histones.

3. Organisation des histones dans le nuclosome.

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Organisation des Histones dans le Nuclosome Les histones prsentent une grande habilit dagrgation : On obtient facilement des ttramres ( H32-H42). Les histones riches en lysine forment plutt des dimres (H2A-H2B) avec une tendance former des ttramres (H2A2-H2B2). Des octamres dhistones (former in vitro) peuvent tre dissocis pour gnrer des hexamres ayant perdu un dimre de H2A-H2B, aprs les autres H2A-H2B sont librs indpendamment en gnrant H32-H42.

Organisation des Histones dans le Nuclosome


Tous ceci suggre lexistence dune forme dorganisation o le nuclosome prsente une graine centrale constitue dun ttramre (H32-H42) associ deux indpendants (H2A-H2B).

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Une cinquime histone, l'histone H1, vient sceller et relier les nuclosomes.
H1 est deux fois plus grande que les autres histones (24 kD au lieu de 10-12 kD). H1 interagit avec 10 pb l'entre et la sortie du nuclosome, de sorte que l'ADN fait dsormais deux tours complets autour de l'octamre, scells leur base par H1. Ensuite, les molcules d'H1 associes chaque nuclosome peuvent interagir entre elles, sans doute par leur bras C-terminal flexible, reliant ainsi les nuclosomes.

Chapitre I : Structure fine de la chromatine et rgulation de


lexpression gnique.

I. I. Gnralits I. II. Structure de base de la fibre chromatinienne.


1. Structure du Nuclosome 2. Protines histones. 3. Organisation des histones dans le nuclosome.

4. Organisation des nuclosomes sur la fibre chromatinienne.


a . Facteur de compaction du gnome et niveaux de condensation

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Facteur de compaction du gnome et niveaux de condensation

Au-del du nuclosome, les niveaux suprieurs de condensation de la chromatine rsultent de la proportion des nuclosomes s'empiler rgulirement les uns sur les autres, dans plusieurs directions, et au rle jou par l'histone Hl dans ces empilements.

Le premier niveau d'empilement, en colonne, conduit ce qu'on appelle la fibre de 11 nm de diamtre (largeur d'un nuclosome).

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Organisation des nuclosomes sur la fibre chromatinienne


Fibre de 10nm

Au-del, la microscopie lectronique rvle des structures fibreuses, dont la fibre de 30 nm :

fibre torsade large de six nuclosomes, Ceci constituerait le premier niveau de condensation audel de l'empilement simple.

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Organisation des nuclosomes sur la fibre chromatinienne Fibre de 30nm

Un modle de diverses structures enroules de la chromatine.


La range hlicodale plus condense du brin de 10 nm formant la structure en solnode d'un diamtre de 30 nm

La forme partiellement enroule, la brin de 10 nm de diamtre,

A noter la faon dont les histones Hl, associes aux nuclosomes, interagissent pour favoriser l'enroulement des fibres de 10 nm, formant les fibres plus condenses de 30 nm.

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Dans la fibre de 30 nm, le facteur de compaction de l'ADN est de 40 fois. On estime que le facteur de compaction global de la chromatine dans le noyau est de l'ordre de 1000 fois Il s'accrot encore de 10 fois lorsque s'individualisent les chromosomes la mitose.

Au-del des nuclosomes, l'organisation compacte de la chromatine dpend fortement de son interaction intime avec le rseau de protines non histones qui constitue ce qu'on appelle la matrice nuclaire.

Niveaux d'organisation de la chromatine dans le noyau

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Chapitre I : Structure fine de la chromatine et rgulation de


lexpression gnique.

I. I. Gnralits I. II. Structure de base de la fibre chromatinienne.


1. Structure du Nuclosome 2. Protines histones. 3. Organisation des histones dans le nuclosome.

4. Organisation des nuclosomes sur la fibre chromatinienne.


a . Facteur de compaction du gnome et niveaux de condensation b . Organisation des Nuclosomes en Phase.

Organisation des Nuclosomes en Phase. Supposant que la squence dADN soit organise dans les nuclosomes selon une seule configuration particulire de telle sorte que chaque site sur lADN soit toujours localis sur une position dtermine du nuclosome.

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Les produits dune double digestion par la nuclase de microcoque et par lenzyme de restriction sont spars par lectrophorse sur gel.

Une sonde qui reprsente la squence immdiatement adjacente au site de restriction est utilise pour identifier le fragment correspondant dans la double digestion.

Organisation des Nuclosomes en Phase.


lidentification dune seule bande nette et troite dmontre que la position du site de restriction est prcisment dtermine par rapport lextrmit de lADN nuclosomal Donc le nuclosome possde bien une squence particulire dADN.

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Chapitre I : Structure fine de la chromatine et rgulation de


lexpression gnique.

I. I. Gnralits I. II. Structure de base de la fibre chromatinienne.


1. Structure du Nuclosome 2. Protines histones. 3. Organisation des histones dans le nuclosome.

4. Organisation des nuclosomes sur la fibre chromatinienne.


a . Facteur de compaction du gnome et niveaux de condensation b . Organisation des Nuclosomes en Phase. c . Organisation des Nuclosomes au hasard.

Organisation des Nuclosomes au hasard.

Quarrive-il si le nuclosome nest pas localis en une position unique? Donc Sur chaque fibre, le nuclosome est positionn diffremment

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double digestion par la nuclase et par lenzyme de restriction et sparation par lectrophorse sur gel.

Les fragments de liaison (entre les nuclosomes) sont maintenant constitus de diffrentes squences dADN dans chaque copie du gnome. Ainsi, chaque fois, la position du site de restriction est diffrente en fait, toutes les localisations sont possibles par rapport aux extrmits de lADN nuclosomal monomrique.

Organisation des Nuclosomes au hasard.

La double digestion engendrera donc une large trane allant des plus petits fragments dtectables (20 bases) jusqu la longueur du monomre dADN. Les nuclosomes sont donc organiss au hasard

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