TEMA 8: PRODUCCION INDUSTRIAL DE METABOLITOS SECUNDARIOS

Dr. Pedro F. Mateos Gonzlez

I. METABOLITOS SECUNDARIOS DE INTERES INDUSTRIAL

Los metabolitos secundarios son molculas sintetizadas por determinados microorganismos, normalmente en una fase tarda de su ciclo de crecimiento, cuyas caractersticas son: (i) No son necesarios para el crecimiento del microorganismo que los produce. En estado natural, sus funciones se hallan ordenadas a la supervivencia de la especie, pero cuando los microorganismos que los producen se desarrollan en cultivo puro los metabolitos secundarios no desempean esa misin. (ii) Generalmente se producen como mezclas de productos muy relacionados qumicamente entre s. Por ejemplo, una nica cepa de una especie del gnero Streptomyces produce 32 antraciclinas diferentes. (iii) Cada uno de estos productos es producido por un grupo muy reducido de organismos. (iv) La produccin puede perderse fcilmente por mutacin espontnea (degeneracin de la raza), por lo que son muy importantes las tcnicas de conservacin de estos microorganismos. De todos los productos tradicionales obtenidos por fermentacin, los ms importantes para la salud humana son los metabolitos secundarios. Donde se incluyen, adems de los antibiticos, ciertas toxinas (micotoxinas), alcaloides (cido lisrgico), factores de crecimiento vegetal (giberelinas) y pigmentos. Los metabolitos secundarios mejor conocidos son los antibiticos, de los que se han descubierto ms de 5000, cifra que aumenta a razn de una media aproximada de 300 por ao, aunque la mayora carecen de utilidad pues son

txicos para los organismos vivos. Aproximadamente el 75% de los antibiticos conocidos son producidos por actinomicetos. Algunas especies son excepcionales productores de antibiticos, por ejemplo Streptomyces gryseus produce al menos 40 antibiticos diferentes.

II. RELACIONES ENTRE TROFOFASE - IDIOFASE

En el metabolismo secundario las fases de crecimiento se denominan trofofase, fase de crecimiento logartmico donde normalmente no se producen los metabolitos secundarios, e idiofase, fase estacionaria donde normalmente se producen los metabolitos secundarios. Aunque es una simplificacin pensar slo en dos fases, esta simplificacin nos permite comprender mejor la fermentaccin industrial de los metabolitos secundarios. Es decir, si nosotros queremos producir un metabolito secundario primero debemos asegurar las condiciones apropiadas durante la trofofase para un buen crecimiento y despus, debemos alterar esas condiciones en el momento adecuado para asegurar una excelente produccin del metabolito secundario. Este retraso en la formacin de metabolitos secundarios es uno de los principales mecanismos mediante el cual los microorganismos productores de antibiticos evitan el suicidio, puesto que al comienzo de la fase logartmica de crecimiento son sensibles a su propio antibitico, para posteriormente, durante la idiofase, volverse resistentes al antibitico que estn produciendo. Los factores que ponen en marcha la produccin de metabolitos secundarios al final de la trofofase no se conocen; nicamente se sabe que este mecanismo se dispara normalmente cuando algn nutriente del medio se ha agotado. En algunas ocasiones el nutriente responsable es una fuente de Carbono, en otras, sin embargo es el Nitrgeno o el Fsforo. La explicacin puede ser que al faltar nutrientes se alteren los metabolitos primarios y se originen inductores de los enzimas encargados de la sntesis de los metabolitos secundarios. Otra explicacin puede ser que al faltar la fuente de Carbono cesa la represin por catabolito, sintetizndose a partir de este momento los enzimas necesarios para la biosntesis de estos metabolitos secundarios. Cualquiera que sea el mecanismo general por el que se dispara el metabolismo secundario al final de la trofofase, es un hecho que en este punto hay unos cambios muy fuertes en la composicin enzimtica de las clulas, apareciendo los enzimas que estn especficamente relacionados con la formacin de metabolitos secundarios. Sin embargo, e independientemente de este aspecto general del metabolismo secundario, se ha puesto de manifiesto la existencia

de sistemas de regulacin que juegan un papel importante en la sntesis de determinados productos industriales.

III. EFECTO DE LOS PRECURSORES

Las manipulaciones, tanto del medio de cultivo como de las condiciones ambientales que se llevan a cabo durante el screening secundario de una forma sistemtica, incluyen la adicin de centenares de aditivos en los medios de cultivo que puedan actuar como posibles precursores del producto que estamos investigando. Ocasionalmente se encuentra un precursor que incrementa de forma notable la produccin de este metabolito secundario. El precursor puede incluso dirigir la sntesis de un determinado producto de entre varios que se producan anteriormente; es lo que se conoce como biosntesis dirigida. Como ejemplos de precursores estn el cido fenilactico en el caso de la produccin de bencil penicilina; determinados aminocidos especficos en la produccin de actinomicinas y tirociclinas; cidos benzoicos sustituidos en la formacin de novobiocinas. En muchas fermentaciones, sin embargo, los precursores no muestran ninguna actividad. Esto es debido a que su sntesis por el microorganismo no es el factor limitante de la produccin del metabolito secundario. En estos casos, la adicin de aditivos ha revelado efectos dramticos, tanto estimuladores como inhibidores en la produccin del metabolito secundario por parte de una molcula no precursora. Este efecto se debe normalmente a la interaccin de estos compuestos con los mecanismos reguladores del microorganismo productor. Precisamente, estudiando estos efectos se puso de manifiesto que los mecanismos reguladores de los microorganismos ejercen un efecto notable en la produccin de los metabolitos secundarios.

IV. INDUCCION ENZIMATICA

A lo largo de los estudios sobre el papel que el triptfano juega como estimulador de la biosntesis de alcaloides por Claviceps (Cornezuelo del centeno) se puso de manifiesto que la induccin enzimtica juega un papel

importante en la produccin de metabolitos secundarios. Si bien el triptfano es un precursor en la biosntesis de estos alcaloides, no es un factor limitante; ya que su efecto estimulador se debe en gran parte a la induccin de la sntesis de los enzimas que dan lugar a la sntesis de los alcaloides. Existen tres razones que han llevado a esta conclusin: (i) Los anlogos del triptfano, que no se incorporan a la molcula del alcaloide, es decir, que no son precursores, estimulan la produccin de los alcaloides. (ii) El triptfano se debe aadir durante la trofofase ya que si se aade durante la idiofase tiene poco efecto. (iii) El triptfano aadido es absorbido por la clula durante la fase de crecimiento y alcanza su mayor concentracin intracelular justo antes de la sntesis de los alcaloides. Otro efecto de induccin similar es el de la metionina en la biosntesis de cefalosporina por Cephalosporium acremonium. A pesar de que la metionina provee azufre al antibitico, la estimulacin de la formacin de cefalosporina C se debe a un efecto de induccin. Se lleg a esta conclusin ya que la metionina debe aadirse durante la trofofase; adems, la metionina puede ser reemplazada por su anlogo norleucina que no tiene azufre en su molcula, por lo que su efecto no puede ser debido al hecho de aportar azufre. La induccin tambin juega un papel muy importante en determinar la relacin entre los componentes de la mezcla que se produce en una fermentacin. Por ejemplo, en la fermentacin para la produccin de estreptomicina se produce estreptomicina y mansido estreptomicina. La conversin de mansido estreptomicina en estreptomicina se cataliza mediante el enzima -D-manosidasa que es inducido por manano.

V. REGULACION POR RETROALIMENTACION

La regulacin por retroalimentacin tambin parece jugar un papel fundamental en el metabolismo secundario. Por ejemplo, el cloranfenicol al igual que la cicloheximida, penicilina y otros antibiticos limitan su propia produccin actuando por retroalimentacin generalmente sobre el primer enzima de la ramificacin que conduce a la sntesis de este metabolito.

Otro caso de regulacin por retroalimentacin sucede cuando la ruta metablica ramificada, mediante la cual se sintetiza el metabolito secundario, conduce a su vez a la sntesis de un metabolito primario, como es el caso de la lisina y la penicilina en Penicillium chrysogenum. En un primer momento se encontr que la L-lisina disminua la produccin de penicilina, pero no se saba porqu; hasta que se descubri que el -aminoadipato es un intermediario en la biosntesis de los dos, lisina y penicilina. La disminucin en la formacin de penicilina por lisina est causada por la inhibicin por retroalimentacin de la homocitrato sintasa, que es el primer enzima en la biosntesis de lisina. Otro camino mediante el cual acta la regulacin por retroalimentacin en la formacin de metabolitos secundarios implica la inhibicin y la represin de las fosfatasas por fosfato. Muchas fermentaciones se inhiben por ortofosfato (H3PO4) a concentraciones (>10 mM) que no son inhibidoras para el crecimiento. En algunos casos se explica ya que los intermediarios de la ruta metablica del producto que nos interesa estn fosforilados, aunque el producto final no lo est. Las fosfatasas actuaran en estos intermediarios. Un ejemplo lo tenemos en la biosntesis de estreptomicina donde actan varias fosfatasas en la formacin de estreptidina y en el ltimo paso, desfosforilacin de la estreptomicina fosfato, donde el enzima que cataliza esta reaccin tambin est inhibida por el fosfato inorgnico.

VI. REGULACION CATABOLICA

La represin catablica fue observada en la industria de antibiticos mucho antes de que se conociera y se entendiera el significado general de este fenmeno. Durante el desarrollo de la produccin de penicilina se observ que la glucosa, que era una magnfica fuente de carbono para el crecimiento del microorganismo, era un sustrato muy malo para la produccin de penicilina; sin embargo, se observ que la lactosa, que soporta un crecimiento muy pobre, es un buen sustrato para la produccin de penicilina. Por lo tanto, el medio clsico de Jarvis y Johnson lleva una mezcla de glucosa y lactosa. Los mecanismos moleculares de la regulacin catablica se esclarecieron en la dcada de los 70. Hoy sabemos que la regulacin catablica est mediada por el nivel intracelular de un nucletido especial, el monofosfato cclico de adenosina (AMPc), cuyo nivel intracelular es inverso a la concentracin de glucosa en el medio de cultivo. Mientras existe glucosa en el medio de cultivo

el nivel intracelular de AMPc es sumamente reducido, debido a que la glucosa inhibe la actividad adenilciclasa, enzima que interviene en la sntesis de AMPc. Cuando la glucosa del medio se agota, la concentracin intracelular de AMPc aumenta rpidamente. El AMPc sintetizado forma un complejo con una protena existente en la clula, denominada "protena receptora de AMPc". Este complejo de protena receptora y AMPc acta sobre el gen promotor al objeto de inducir la sntesis de los enzimas necesarios para la utilizacin de otras fuentes de carbono distintas a la glucosa. La glucosa inhibe gran cantidad de metabolitos secundarios. La represin catablica tambin juega un papel importante en la determinacin de la concentracin relativa de cada uno de los antibiticos de una misma familia qumica que se producen en una fermentacin. Este es el caso de la produccin de estreptomicina por Streptomyces gryseus. Como ya hemos dicho, el manano es el inductor de la manosidasa que convierte la mansido estreptomicina en estreptomicina; sin embargo, este enzima no se sintetiza si hay glucosa (>0,5%) en el medio debido a la represin catablica. Slo cuando la glucosa ha desaparecido se produce el enzima que es inducido por manano. En este caso la represin catablica juega un papel fundamental en el porcentaje de mansido estreptomicina producido en esta fermentacin.

VII. REGULACION POR EL ESTADO O CARGA ENERGETICA

La produccin de clortetraciclina se reduce en gran cantidad cuando existe fosfato inorgnico en el medio. En las fermentaciones para la produccin de clortetraciclina, la idiofase comienza cuando se agota el fosfato en el medio. Puesto que en la biosntesis de clortetraciclina donde intervienen 72 intermediarios, ninguno de ellos fosforilado, este efecto del fosfato no se debe a la regulacin por retroalimentacin de fosfatasas. Sin embargo, es posible que esta regulacin est mediada por la carga energtica ya que el contenido en ATP de dos cepas de Streptomyces aureofaciens, una poco productora (200 g/mL) y la otra muy productora (2000 g/mL) de clortetraciclina, difieren en que la cepa menos productora tiene de 2 a 4 veces ms ATP que la ms productora. En ambas cepas la concentracin de ATP aumenta en la trofofase y disminuye en la idiofase, durante la produccin de clortetraciclina.

VIII. INCREMENTO DE LA PRODUCCION DE METABOLITOS SECUNDARIOS

La mayora de los controles descritos en este captulo se eliminan mediante manipulacin ambiental o mediante la obtencin de mutantes mal regulados.

1.- Manipulacin ambiental

Catabolito: eliminacin de la glucosa del medio. Induccin: adicin de manano al medio. Carga energtica: disminucin de fosfato en el medio. Precursores: adicin de precursores al medio.

2.- Seleccin de mutantes mal regulados

A. Revertientes La estrategia consiste primeramente en seleccionar las mejores cepas productoras del antibitico. Estas cepas se someten a mutacin con un agente mutgeno (UV, luz ultravioleta o NTG, nitrosoguanidina). De los mutantes obtenidos se seleccionan aquellos que no sean productores del antibitico (se seleccionan aquellas cepas que poseen una protena inactiva). Estos mutantes se vuelven a someter a mutacin y se seleccionan aquellas cepas que sean de nuevo productoras del antibitico (se obtienen mutantes dobles desregulados en un gen en el que acta esa protena inactiva). B. Resistencia a anlogos La estrategia es la misma que la descrita con los metabolitos primarios. C. Mutasntesis Se realiza mediante la mutacin en el gen que codifica para un precursor del antibitico natural, con lo que se consigue la sntesis de una molcula de antibitico incompleta. Cuando se aade al medio el precursor que no puede sintetizar el microorganismo, ste reanuda la produccin del antibitico

natural. De esta manera se pueden obtener nuevos antibiticos simplemente aadiendo precursores con estructuras ligeramente diferentes.