Como la Proteina represora controla al Operon lac

En 1961, Franois Jacob y Jacques Monod utilizaron las mutaciones de los genes lac en E. coli para desarrollar un modelo general de control de la transcripcin en bacterias. Control de la Transcripcin Los mismos procesos que permiten el control del metabolismo celular tambin proporcionan los medios para regular cmo se expresan los genes. A nivel metablico, compuestos celulares se unen a las protenas enzimticas especficas, cambiar su forma y por lo tanto su funcin. A nivel de la sntesis de ARNm, existe una serie similar de controles alostricos (enzimas), que regula los genes que son transcritos y en qu medida. La influencia de los controles de transcripcin puede ser muy marcada, y de hecho se ha observado desde el cambio de siglo, pero hasta hace poco la naturaleza de estas influencias no se entenda. En 1900, F. Dienert inform de que las enzimas del metabolismo de la galactosa en la levadura estaban presentes slo cuando la levadura utiliza galactosa como fuente de carbono, era como si la presencia de galactosa haba "provocado" de la levadura las enzimas especficas necesarias para metabolizar el azcar. Muchos informes similares de que los microbios podian "adaptarse" a su medio de crecimiento siguieron. Enzimas microbianas se agrupan en dos clases: las enzimas de adaptacin, normalmente no presentes en las clulas y que se producen slo cuando el sustrato de la enzima estaba presente en el medio de crecimiento, y las enzimas constitutivas, producidos normalmente por las clulas sin tener en cuenta la presencia o ausencia de sustrato. La teoria de Yudkin Fue casi 40 aos antes, que una teora se adelant, podra explicar satisfactoriamente la adaptacin enzimatica en bacterias. La teora de la accin de masas propuesta por John Yudkin en 1938, aunque posteriormente se demostr que era incorrecta, parece sorprendentemente moderna en retrospectiva. Sugiri que existen enzimas dentro de las clulas en equilibrio dinmico con sus precursores, un equilibrio que favorece la formacin de la enzima para las enzimas constitutivas, pero favorece los precursores inactivos en el caso de las enzimas de adaptacin. La Unin del sustrato para enzimas de adaptacin podra estabilizarse en la forma de enzima. Observado desde fuera, parece como si el sustrato haba ordenado mgicamente su enzima activa. Hiptesis de accin de masas de Yudkin fue refutada por dos lneas de evidencia, desarrollados a partir del estudio de la adaptacin de las bacterias a la lactosa como fuente de carbono, un sistema que se ha convertido en el foco de una intensa investigacin. La bacteria E. coli pueden crecer en los medios de cultivo con el disacrido lactosa como nica fuente de carbono. La lactosa se divide en glucosa y galactosa por la enzima beta-galactosidasa, la galactosa, es subsecuentemente convertida es ms glucosa, y la glucosa utilizada en el metabolismo primario. Las clulas bacterianas en crecimiento activo en lactosa contienen cada una varios miles de molculas de betagalactosidasa (hasta 5 por ciento de la protena celular total). Sin embargo, cuando las mismas clulas se cultivan en un medio con una fuente de carbono diferente (como la glucosa), poca betagalactosidasa est presente - menos de diez molculas por clula. Betagalactosidasa era por tanto un caso clsico de una enzima "adaptativa. La primera lnea de evidencia que contradice la hiptesis de Yudkin fue desarrollado por Jacques Monod en la dcada de 1950. Seal que los compuestos adems de lactosa podran inducir la produccin de beta-galactosidasa. Algunos de ellos, tales como isopropiltiogalactsido (IPTG), no

eran sustratos metabolizables incluso de la enzima. La existencia de tales inductores gratuitos argument en contra de la hiptesis de Yudkin, y sugiri que el inductor no puede interactuar directamente con la enzima despus de todo. La segunda lnea de evidencia, repetida muchas veces en diferentes formas, era la demostracin de que la adaptacin de las bacterias a la lactosa, la induccin de la enzima de beta-galactosidasa por el inductor lactosa, implica la sntesis de nuevas protenas de enzimas en lugar de montaje de precursores como Yudkin haba supuesto. Esto se demostr por el crecimiento de E. coli durante muchas generaciones en un medio de 35S (Azufre 35) sin un inductor presente, a continuacin, transferir las clulas a un medio no radiactivo y la adicin de un inductor. El b-galactosidasa inducida no contiene ningn 35S (Azufre 35). Este resultado demuestra que el b galactosidasa inducida est recin sintetizados (de novo) y no podra haber sido derivado de subunidades preexistentes, que habran contenido cistena y metionina marcadas con 35S (Azufre 35). Cual es la base de la induccin enzimtica? Surgi rpidamente una serie de pistas. La primera ya ha sido discutido: induccin implica la sntesis de protenas de novo. La segunda idea surgi de los estudios genticos de Joshua Lederberg en la induccin de lactosa. Como todo buen genetista, se dispuso a obtener una coleccin de mutantes lac, con la esperanza de que al compararlos con los de tipo salvaje, pudiera empezar a describir las propiedades del sistema. Este enfoque de "mirar para ver lo que puede salir mal" puede ser muy poderoso (es sorprendente lo mucho que se puede aprender sobre el cableado de una casa, sacando los fusibles uno por uno y buscando el efecto). En el caso de los mutantes lac- (lac negativos) de Lederberg, se hizo evidente despus de varios aos de investigacin que haba ms de una clase de mutante. Algunos eran lac- (lac negativos) porque carecan de actividad bgalactosidasa (llamados mutantes lacZ), mientras que otros tenan actividad b-galactosidasa en los extractos de clulas, pero no en las clulas intactas (estos fueron llamados mutantes lacY). Actividad en los extractos se ensay mediante el uso de un anlogo de sustrato incoloro llamado onitrofenil-b-galactsido (ONPG), que es hidrolizado por la b-galactosidasa para producir onitrofenol intensamente amarillo. Actividad en las clulas intactas fue ms convenientemente evaluada por las clulas que crecen en medio que contiene colorantes redox eosina y azul de metileno, un medio en el que las celulas lac- producen colonias incoloras mientras que las clulas normales lac + (que liberan iones de hidrgeno cuando hidrolizar la lactosa y as ms bajo es el pH de la medio circundante) son rojos. Se ha demostrado que los mutantes tenan un lacZ una enzima b-galactosidasa defectuosa. Los mutantes de LacY tenian una normal b-galactosidasa, pero tenan una permeasa inactivo, enzima necesaria para el transporte de lactosa en las clulas bacterianas. La segunda idea era que ambas enzimas fueron inducidos por la lactosa: hubo cambios (en concetraciones) paralelos en las actividades de ambas enzimas. Ms tarde, una tercera enzima, transacetilasa galactosidasa (lacA), tambin se encontr que estaba inducida por la lactosa. Esta tambin cambi (en su concentracin) en concierto con los otros. La tercera pista vino en la dcada de 1950 ms tarde, cuando tres tipos de mutantes de Lederberg (lacZ-, Lacy-, y lacA-) fueron sometidos a anlisis gentico. Es posible derivar un mapa gentico de cromosomas bacterianos mediante el anlisis de las frecuencias de recombinacin, con la posicin relativa de cada mutacin encuentra. Tres mutantes de Lederberg fueron todos mapeados juntos. Lo que estas tres pistas revelaron fue que la induccin enzimtica de las sinstesis de novo de varias enzimas que eran contiguas una a la otra en el cromosoma bacteriano. Esto sugiere claramente que la interaccin del inductor estaba en el nivel cromosmico.

El inductor mutante La clave del enigma, como suele ser el caso, era un mutante revelador. Entre los muchos mutantes de Lederberg, fue uno con un fenotipo muy inusual: Este mutante siempre preentaba altos niveles de b-galactosidasa, permeasa y acetilasa, incluo en ausencia de lactosa. La mutacin habia transformado a la clula, de ser Adaptativa, a ser Constitutiva. Debido a que carecia de la caracteristica de induccin, este mutante constitutivo fue etiquetado cono lac I -. El mapeo gentico indica que lacI no era parte del grupo lacZ lacY y lacA, aunque se encuentra muy cerca. Lac I por lo tanto parece ser una mutacin reguladora de algn tipo. Cmo podra funcionar? La hipotesis ms obvia era que lacI + -> lacI - conduce a la produccin de un inductor interno, por lo que la sinteis de lacZ, lacY y lacZ es siempre constitutiva. Esta hipotesis se someti a una prueba clara: predijo que lacI sera dominante sobre lacI +. en una clula que contiene los genes de lacI y lacI+ , lacI - podra aun producir el inductor interno y la clula aun podra ser constitutiva. La hipotesis de Jacob & Monod Las bacterias son haploides que contienen un solo cromosoma. Franois Jacob y Monod tuvieron xito en la obtencin de clulas en las que los genes de agrupacin de la lactosa haban sido transferidos de una bacteria a otra (las dos clulas se unen, uno dona su ADN a la otra, replica una copia a travs de un proceso de replicacin del ADN "crcular continuo, y la transferencia de la copia a travs de un puente citoplsmico estrecha a la clula receptora). Este procedimiento fue particularmente importante aqu, ya que por lo tanto fue posible construir lneas de clulas bacterianas que eran de hecho parcialmente diploide, mediante la transferencia de ADN del donante que lleva el gen lactosa a diferentes receptores bacterianos. Cuando Jacob y Monod probadon diploides parciales que eran lacI - Z + / lacI + Z -, no se encontr beta-galactosidasa a menos que se aadiera lactosa al medio de crecimiento. La sntesis se lo inducible, no constitutivo, y no lacIwas claramente dominante. Sntesis era inducible, por lo tanto, no constitutivo, y lacI era claramente no dominante. Debido a qu lacI no era dominante, y sin inductor interno nunca podra ser aislado, pareca probable que la accin del gen lacI estaba a nivel de la propia sintesis de mRNA. Cmo podra funcionar? Como se saba que lacI+ era dominante sobre lacI-, se asumi que lacI+ produca activament un producto de proteina que acta para regular los genes lacZ, lacY y lacA. Haba 2 alternativa, realmente opuestas, que tenan que ser consideradas: 1. En una hipotesis, el producto del gen lacI + podra ser un elemento esencial en la transcripcin de los genes de la lactosa (talvez un factor de la RNA Polimerasa?), con el inductor lactosa siendo necesario para activar el proceso. La mutacin lacI podria ser constitutiva si es que el producto del gen lacI es liberado del control positivo del inductor. 2. Bajo la hipotesi alternativa, el producto del gen lacI + en realidad podra prevenir la transcripcin de lo genes de la lactosa (tal vez por la unin en el ADN, en el sitio de reconocimiento de la RNA polimerasa), con el inductor uniendose e inactivando al represor lacI +, de modo que la transcripcin de la genes de lactosa podran proceder. La mutacin lacI sera constitutiva, porque el represor lacI sera defectuoso y no podra unirse al ADN para ejercer el control negativo.

El experimento de Jacob y Monod. En un intento de entender el modo de accin de la mutacin lacI - de Lederberg, Jacob y Monod primero tuvieron que determinar si el gen hizo o no un producto, que a su vez actua sobre el operon lac (en vez de algn efecto estructural del gen en s mismo), y si el gen lacI actua de una manera positiva (estimuladora) o negativa (inhibidora) Ellos se dirigieron a la primera pregunta de la determinacin de la conducta dominante de la mutacin lacI. Ellos razonaron que un heterocgoto lacI + / I - debera ser constitutiva si el gen lacI eran de accin en cis (limitado en su accin para el mismo cromosoma), como los genes lacI del cromosoma tendria el fenotipo lacI (constitutivo), siendo afectado por los genes lacI + de los otros cromosomas. Alternativamente, un lacI + / I-heterocigoto debe ser inducible si el gen lacI produce un producto difusible, como los genes lacI - del cromosoma estaran expuestos a dicho producto y as tendran el fenotipo lac + (inducible). En el primer caso, lacI - parece dominante sobre lacI + en los heterocigotos, mientras que en el segundo caso, lacI - parece recesivo a lacI +. La bacteria E. coli utilizadas en el estudio es normalmente haploides, pero Jacob y Monod tuvieron xito en conseguir diploides parciales para lac mediante el aprovechamiento de dos hechos: 1. Cepas Hfr de E. coli podan transferir una copia de su cromosoma en la cepa F - receptora de E. coli en un proceso hacia abajo como conjugacin. Esto proporcion, al menos temporalmente, un organismo diploide que contiene tanto los beneficiarios como los donantes de ADN. Estos productos de conjugacin fueron llamados meri-diploides, y proporcionan a Jacob y Monod un medio de examinar combinaciones de genes diploides dentro de E. Coli. 2. No todo el cromosoma donante fue transferido durante la conjugacin. Esto significa que Jacob y Monod necesitan un medio para identificar y aislar las clulas que de hecho haban transferido los genes lac. Podran, por supuesto, haber aislado y probado las clulas individuales, pero esto habra sido un proceso tedioso. En su lugar, se encuentra otro gen, prolina, situado muy cerca de lac en el cromosoma bacteriano. Cuando las clulas receptoras fueron PRO-, era una simple cuestin de seleccionar a los beneficiarios PRO +. En la obtencin del gen PRO +, estas clulas es casi seguro que tenan los genes lac transferidos as. Y qu pasa con las clulas del donante PRO +? Si uno usa PRO + para seleccionar las clulas receptoras que han obtenido los genes lac, cmo se distinguen de las clulas del donante PRO + original? Jacob y Monod utilizaron otro marcador Sensibilidad al virus T6. Eligieron una cepa receptora a la que le faltara una apropiada proteina de superficie celular para el reconocimiento de T6 y as fue resistente a la infeccin y lisis por el virus T6. Despus de PRO +, T6S (HFR) se mezcl con PRO-, T6R (F-), y la conjugacin procedi durante un tiempo. A continuacin se aadi virus T6, matando a todos de las clulas del donante. Las clulas restantes se extienden a continuacin, y se dejaron crecer en una superficie de medio sinttico sin prolina. Slo las clulas que haban recibido la porcin PRO + del cromosoma donante podran crecer para formar colonias visibles. Por lo tanto, este procedimiento produce colonias que eran predominantemente diploides para la regin LAC. El comportamiento de dominancia del lacI - se puso a prueba en el apareamiento constitutiva entre

lacI - Z + (HFR) con un destinatario lacI +, que tambin era beta-galactosidasa negativo: lacI + Z(F-). El diploide resultante era lacI - Z + / I + Z- , tuvo el fenotipo lacI +. Fue inducible en lugar de constitutiva. LacI-era por lo tanto recesiva a lacI +, lo que indica que el gen lacI + produce un producto difusible, que ms tarde demostr ser una protena. Si este producto ha actuado de manera positiva o negativa podra entonces ser probado directamente por la repeticin del anlisis en la configuracin gentica opuesto. Jacob y Monod acoplaron una cepa lacI + Z + (HFR), con una cepa lac Z - (F-) , y monitorearon el gen lacZ durante el proceso de conjugacin. Las clulas se retiraron peridicamente, se rompieron, y se prob la capacidad de hidrolizar ONPG. Al principio, las clulas donantes no estaban haciendo beta-galactosidasa porque eran lacI + y crecen en un medio sin lactosa, mientras que las clulas receptoras no estaban haciendo beta-galactosidasa porque eran lacZ-. Cuando el gen lacZ + se transfiri a la clula receptora, esa celula fue entonces lacZ + I e inmediatamente inicio la sintesis de betagalactosidasa constitutiva. Poco despus, el gen lacI + se transfiri, la sntesis constitutiva se detuvo, y la sntesis de betagalactosidasa se convirti en inducible. La entrada de lacI + permite la produccin de una sustancia que detiene la sntesis constitutiva a pesar de la presencia de lacI - . No slo este resultado confirma que lacI + era dominante sobre lacI - , que tambin demostr inequvocamente que el producto del gen lacI ejerce el control negativo, que acta para inhibir la sntesis de los genes lac en ausencia de inductor.