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UFF CMF MAF CADERNO DE AULAS PRTICAS PARA A DISCIPLINA DE TOXICOLOGIA

MODELO PARA RELATRIOS DE AULA PRTICA


UFF- CMF MAF - DISCIPLINA DE TOXICOLOGIA RELATRIO DE AULA PRATICA Nome do aluno: ................................................................................................................... Turma: ............ Data:. .........

Ttulo da aula: Anlise de paraquat em cascas de maa Objetivo da anlise: A determinao de paraquat em casas de maa visa garantir que o agrotxico no est presente em concentrao acima do permitido pela legislao. Principio analtico: Aps extrao e separao cromatogrfica em placa de CCD, o paraquat pode ser quantificado por densitometria. Relatrio de atividades: As cascas de ma foram trituradas em liquidificador. Uma alquota de 10 g foi extrada com 20 mL de metanol. Aps filtrao, o solvente foi separado e evaporado em banho-maria a 50 C sob corrente de ar. O resduo seco obtido da extrao foi ressuspendido em 100 microlitros de metanol e 10 microlitos foram aplicados placa de CCD, previamente ativada. Aps o desenvolvimento cromatogrfico no sistema solvente clorofrmio: acetona 8:2, a placa foi removida da cuba cromatogrfica e deixada temperatura ambiente por alguns minutos para secar. A placa foi examinada sob luz UV 254nm e algumas manchas de cor escura foram observadas, inclusive no padro de Paraquat. A seguir, foi aplicado o reagente cromognico (soluo de nitrito de sdio) e as manchas referentes ao Paraquat apresentaram a cor azul, tanto na amostra quanto no padro. O valor de Rf obtido para o Paraquat foi de 0,72. As outras manchas que apareceram no UV no apresentaram cor quando submetidas ao reagente cromognico. Uma curva de calibrao foi preparada com aplicao na placa de 10 microlitros de solues de paraquat em diferentes concentraes, com triplicata de cada concentrao. Aps leitura densitomtrica, os valores obtidos foram utilizados para construo da curva de calibrao. A equao obtida por regresso linear foi Y = 0,98x + 0,005 (incluir grfico). Com base na equao, a quantidade de paraquat foi determinada na amostra, sendo de 0,03 mg. Clculos: 0,03 mg em 10 microlitros = 0,3 mg em 100 microlitos. 0,3 mg em 10g de amostra = 30 mg / Kg de amostra = 30 ppm Interpretao do resultado: A concentrao de paraquat encontrada (30 ppm) est acima do permitido pela legislao (1 ppm), sendo o produto considerado imprprio para consumo humano.

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Roteiro de Aula Prtica Mdulos 1 e 2 (extrao e TLC) Extrao e identificao de frmacos de carter cido e neutro em urina
1) Preparao da soluo padro (1mg / mL em metanol) cido saliclico Sulfametoxazol Fenobarbital Diazepam 2) Preparao da amostra fortificada - Acrescentar 50L de cada soluo padro a 5mL de urina (concentrao final = 10g/mL). 3) Ativao das placas de CCD - Cortar 3 placas de CCD ( 10 x 4 cm) e ativar em estufa a 110 C por 1 hora. 3) Procedimento de extrao das urinas (branco e amostra fortificada) - Aliquotar 5 mL da amostra de urina para tubo de centrfuga - Ajustar o pH para 3,5 com gotas de soluo de HCl ou H2SO4 - Adicionar 100 mg de NaCl e agitar no vrtex para dissolver o sal - Acrescentar 5 mL de ter e tampar o tubo. - Misturar por inverso os tubos durante 15 min. - Centrifugar (3000rpm por 10 min) (verificar se as fases esto bem separadas) - Transferir o sobrenadante para um becher de 10 mL - Evaporar o solvente no banho-maria a 45C , sob leve corrente de ar, para obteno do resduo seco. 4) Procedimento de identificao por CCD - Ressuspender o resduo obtido da evaporao do solvente com 100L de metanol - Aplicar o resduo (10 vezes com capilar, no mesmo ponto de aplicao), do branco e da amostra fortificada. - Aplicar 10 microlitros da soluo padro, conforme o esquema abaixo.

A A

BB

CC

- Sistema solvente de desenvolvimento Placa A = acetato de etila:metanol:amnia (8,5:1:0,5) Placas B e C = clorofrmio:acetona (8:2) - Aps o desenvolvimento, secar a placa na capela por 5 minutos, sob corrente de ar. - Localizar as manchas examinando a placa sob luz ultravioleta (254nm e 366 nm) - Reagentes cromognicos Placa A = Soluo de cloreto frrico, seguido de Dragendorff Placa B = Soluo de nitrato mercuroso Placa C = Soluo de p-dimetilaminobenzaldedo (PAB) - Anote todos os resultados e calcule os Rfs.

dia

ze

pa m

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Roteiro de Aula Prtica Mdulos 1 e 2 (extrao e TLC) Extrao e identificao de frmacos de carter bsico e neutro em urina
1) Preparao da soluo padro (soluo metanlica a 1mg/mL) Clorpromazina Amitriptilina 4-N-metilaminoantipirina (MAA) produto de hidrlise cida da dipirona Diazepam 2) Preparao da amostra fortificada Amostra A = acrescentar 50L da soluo padro de clorpromazina e MAA a 5mL de urina (concentrao final = 10g/mL). Amostra B = acrescentar 50L da soluo padro de amitriptilina e diazepam a 5mL de urina (concentrao final = 10g/mL 3) NaOH 5M. 4) Ativao das placas de CCD - Cortar 2 placas de CCD ( 10 x 5 cm) e ativar em estufa a 110 C por 1 hora. - A placa B dever ser previamente nebulizada com soluo de KOH 1% em metanol, seca e ento ativada. 5) Procedimento de extrao das urinas (branco e amostra fortificada) - Aliquotar 5 mL da amostra de urina para tubo de centrfuga - Alcalinizar a amostra com 3 gotas da soluo de NaOH 5M (~pH 11,5) - Acrescentar 5mL do solvente extrator diclorometano:isopropanol (9:1); tampar o tubo. - Misturar por inverso durante 15 minutos. - Centrifugar (3000rpm por 10 min) (verificar se as fases esto bem separadas) - Descartar o aquoso e transferir o solvente para um pequeno becher, filtrando sobre papel de filtro previamente umedecido com diclorometano - Evaporar no banho-maria a 45C na capela, sob leve corrente de ar, para obteno do resduo seco. 6) Procedimento de identificao por CCD (placa alcalina) - Ressuspender o resduo obtido da evaporao do solvente com 100L de metanol - Aplicar o resduo (10 vezes com capilar, no mesmo ponto de aplicao), do branco e da amostra fortificada. - Aplicar 10 microlitros da soluo padro, conforme o esquema abaixo.

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- Sistema solvente de desenvolvimento: Placa A - metanol:amnia (10 : 0,15) Placa B clorofrmio:metanol (90:10) - Aps o desenvolvimento, secar a placa na capela por 5 min, sob corrente de ar - Localizar as manchas examinando a placa sob luz ultravioleta (254nm) - Reagente cromognico Placa A: reagente FPN e, depois, reagente de Dragendorff Placa B: soluo de Iodo Platinado acidificada - Anote os resultados e calcule o Rf.

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Roteiro de Aula Prtica Mdulos 1 e 2 (extrao e TLC) Extrao e identificao de inseticidas


1) Preparao da soluo padro (soluo em acetato de etila a 1mg/mL) aldicarb metilparation 2) Preparao da amostra fortificada Preparar arroz cozido apenas em gua. Fortificar uma poro do arroz com preparaes comerciais dos inseticidas (um ou ambos). 3) Ativao das placas de CCD - Cortar 1 placa de CCD ( 10 x 7 cm) 4) Procedimento de extrao (branco de matriz e matriz fortificada) - Com auxlio de uma esptula, transferir uma alquota da amostra para dois tubos de centrfuga (at mais ou menos a altura que corresponde a 2 mL). - Adicionar a um tubo 5mL de acetonitrila e a outro 5 mL de ter de petrleo ou hexano. - Misturar por inverso durante 15 minutos. - Centrifugar (3000rpm por 10 min) (verificar se as fases esto bem separadas) - Transferir o solvente para um pequeno bcher - Evaporar no banho-maria a 45C na capela, sob leve corrente de ar, para obteno do resduo seco. 5) Procedimento de identificao por CCD - Ressuspender os resduos obtidos da evaporao do solvente com 100L de acetona. - Aplicar os resduos na placa (10 vezes com capilar, no mesmo ponto de aplicao), do branco e da amostra fortificada. - Aplicar 10 microlitros da soluo padro, conforme o esquema abaixo

- Sistema solvente de desenvolvimento: Placas A = Hexano:acetona 8:2 - Aps o desenvolvimento, secar a placa na capela por 5 min, sob corrente de ar - Localizar as manchas examinando a placa sob luz ultravioleta (254nm) - Aplicar o reagente cromognico soluo de cloreto de paldio - Anote os resultados e calcule o Rf.

o Amo stra Aldic arb Metil para tion Bran co 2 Amo stra 2

Bran c

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Roteiro de Aula Prtica Mdulo 3 (aplicao da colorimetria na anlise toxicolgica)


Avaliao do cido aminolevulnico em urina (ALA-U) Material: 1. Espectrofotmetro para a regio do visvel (553nm) 2. Soluo-estoque de ALA

Em balo volumtrico de 100mL, dissolver 6,4 mg de cloridrato de ALA e completar volume (concentrao final de 50mg/L). Essa soluo estvel por mais de 2 meses quando refrigerada e protegida da luz.
Curca de calibrao em gua: Separar 5 bales volumtricos de 10mL. Em cada balo adicionar, respectivamente, os seguintes volumes de soluo-estoque de ALA: 0,1 0,2 0,5 1 2 mL. Avolumar com gua destilada. Concentraes obtidas: 0,5 1 2,5 5 e 10 mg/L. 3. Tampo acetato, pH 4,6.

Em balo volumtrico de 1L, dissolver 136g de acetato de sdio triidratado em 700mL de gua destilada e adicionar 57 mL de cido actico glacial. Completar volume.
4. Reativo de EHRLICH modificado (preparado no dia da utilizao)

Em balo volumtrico de 25 mL, dissolver 0,5g de p-dimetilaminobenzaldedo em cerca de 15 mL de cido actico glacial. Adicionar 2,5 mL de HClO4 60% e 2,5 mL de gua destilada. Completar volume com cido actico.
5. Acetato de etila e acetoacetato de etila Procedimento para o GRUPO A (preparo da amostra e do branco) 1. Colocar em cada um de dois tubos de ensaio, 1mL de urina e 1mL de tampo acetato. Rotular um tubo como amostra e outro como branco. 2. Adicionar 0,2 mL de acetoacetato de etila no tubo da amostra e agitar por 5 segundos. 3. Manter os tubos em banho de gua fervente durante 10 minutos. 4. Esfriar e adicionar 3ml de acetato de etila aos dois tubos: agitar manualmente (aprox. 50 inverses). 5. Centrifugar, se necessrio, e transferir a camada orgnica superior para outro tubo (tanto o branco quanto a amostra). 6. Adicionar 2 mL de reativo de EHRLICH a cada tubo e misturar. AGUARDAR 10 minutos, at que a reao se complete. 7. Determinar a absorvncia, usando o branco para zerar o equipamento. Procedimento para o GRUPO B (preparo da curva de calibrao). Preparar em duplicata. 1. Colocar no tubo de ensaio, 1mL de cada soluo de ALA preparada de acordo com a tabela acima. 2. Adicionar 1 mL de tampo acetato. 3. Adicionar 0,2 mL de acetoacetato de etila e agitar por 5 segundos. 4. Manter os tubos em banho de gua fervente durante 10 minutos. 5. Esfriar e adicionar 3ml de acetato de etila aos dois tubos: agitar manualmente (aprox. 50 inverses). 6. Centrifugar, se necessrio, e transferir a camada orgnica superior para outro tubo. 7. Adicionar 2mL de reativo de EHRLICH a cada tubo e misturar. AGUARDAR 10 minutos at que a reao se complete.

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8. Enquanto isso, preparar branco de reagentes misturando 3mL de acetato de etila com 2mL de reativo de EHRLICH. Zerar o equipamento com o branco de reagentes. 9. Determinar a absorvncia das duplicatas de cada concentrao, iniciando pela concentrao mais baixa. 10. Construir a curva de calibrao (absorvncia x concentrao de ALA) usando planilha EXCEL. Obter equao da reta atravs de regresso linear. Procedimento para o GRUPO C (dosagem da creatinina) (KIT LABTEST) 1. 2. Fazer a diluio prvia da amostra misturando 0,2mL de urina com 4,8 mL de gua destilada Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como descrito no quadro 1. Quadro 1. Esquema analtico para a dosagem da creatinina. Branco Teste Padro Tampo 2 mL 2 mL 2 mL Amostra 0,25 mL Agua deionizada 0,25 mL Padro 0,25 mL cido pcrico 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL Misturar e incubar em banho-maria a 37C durante 10 minutos Selecionar o comprimento de onda do espectrofotmetro para 510nm e zerar o aparelho com o branco. Determinar a absorvncia do teste (A1) e do padro. Acidificante (colocado na cubeta) 0,1 mL 0,1 mL Homogeneizar e deixar temperatura ambiente por 5 minutos Zerar o equipamento com o branco e determinar a absorvncia do teste (A2) 3. 4. Calcular a concentrao de creatinina urinria atravs da frmula: Creatinina (mg/dL) = 4 x [(A1 A2) / Abs padro ] x 25

Para todos os grupos: Calcular a concentrao de ALA na amostra com auxlio da curva de calibrao.

mg/L ALA g/L creatinina

= mg ALA/g creatinina

Valor de referncia (NR-7): at 4,5mg/g creatinina

Baseado em: Tomokuni, K; Ogata, M. Simple Method for Determination of Urinary -aminoleculinic acid as na Index of Lead Exposure. Clinical Chemistry, v. 18: 1534 36, 1972.

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Mecanismo da reao:

C CH2

OCH2CH3

C CH

OCH2CH3 OH

HOOCCH2CH2 CH2CH2COOH

O CH2

CH3

H3C

OH

H2N

NH2

ACETOACETATO DE ETILA

ACIDO -AMINOLEVULNICO

H2O
O CH3CH2O C CH2CH2COOH

H3C

N H

CIDO 2-METIL-3-CARBETOXI-4-PROPIONICOPINOL

H N(CH3)2 O

p-DIMETILAMINOBENZALDEDO O C

OCH2CH3 CH2CH2COOH

H3C

N H

C H

N(CH3)2

Complexo vermelho

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Roteiro de Aula Prtica Mdulo 3 (aplicao da colorimetria na anlise toxicolgica)


Avaliao do cido hiprico urinrio no diagnstico do uso abusivo de tolueno Princpio do mtodo: O cido hiprico reage com o cloreto de benzenosulfonila, na presena de piridina, formando um composto rseo-avermelhado, de max = 410nm, cuja intensidade de colorao proporcional concentrao de cido hiprico presente na amostra.
O

O N H O OH

O Cl -

O O N

cido hiprico

Material: 1. cido hiprico 2. Cloreto de benzenosulfonila (cuidado; corrosivo trabalhar com culos de proteo e luvas, na capela e adicionar lentamente ao tubo escorrendo pelas paredes do tubo). 3. Piridina (cuidado: odor pungente, cancergeno - trabalhar na capela, com luvas e culos de proteo). Curva de calibrao em gua (0,25 a 2,5 mg/mL): Soluo estoque a 2,5mg/mL: pesar 62,5 mg de cido hiprico em um becker e adicionar 20 mL de gua deionizada (para auxiliar na dissoluo, coloque o becker no ultra-som com gua aquecida a 50C). Deixe esfriar, e transfira quantitativamente para balo volumtrico de 25 mL, avolumando com gua deionizada. Preparar diluies da soluo estoque em gua nas seguintes concentraes: 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2 e 2,5 mg/mL. Quadro 1. Esquema analtico para dosagem do cido hiprico: Amostra / reagente Tubo da amostra Tubo da curva de calibrao Urina 0,2 Soluo de calibrao 0,2 Piridina 0,5 0,5 CBS 0,2 0,2 gua destilada 2 2 Aguardar de 5 10 minutos

Tubo do branco de reagentes 0,5 0,2 2,2

Tabela 1. Valores de absorvncia obtidos para a curva de calibrao. mg/mL Absorvncia Concentrao de cido hiprico na amostra (mg/mL): 2,5 2 Concentrao de creatinina (mg/dL): 1,5 1 Resultado final: 0,5 0,25 Interpretao: valor de referncia: at 1,5 g/g creatinina I.B.M.P (NR-7): at 2,5 g/ g creatinina
Baseado em Yoshida, M. et al. Simple colorimetric semiquantitation method of hippuric acid in urine for demonstration of toluene abuse. Legal Medicine, v. 7: 198 200, 2005.

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Roteiro de Aula Prtica Mdulos 3 (espectrofotometria no visvel)


Dosagem de Metemoglobina

A oxidao do ferro contido na hemoglobina para a forma frrica inviabiliza a ligao da hemoglobina com o oxignio. Vrias substncias qumicas so capazes de promover essa converso, entre elas: medicamentos (antipirina, dapsona, metoclopramida, anestsicos locais), conservantes de alimentos (nitratos, nitritos e cloratos), e agentes como anilina, nitrobenzeno, hidrazinas, polifenis. Algumas patologias esto associadas com aumento de metemoglobina (hemoglobinose M e indivduos deficientes de glicose-6-P desidrogenase ou de NADH diaforase). Princpio do mtodo: o percentual de globinas na forma de metemoglobina (MetHb) avaliado atravs da diferena de absorvncia obtida com a converso da MetHb existente (A1) cianometemoglobina (A3). O total de globinas avaliado depois de sua converso metemoglobina (A2) e posteriormente cianometemoglobina A4). Obs.: a absoro mxima da metemoglobina ocorre a 632 nm.
0,8 mL de sangue heparinizado em tubo de centrfuga 2,2 mL de gua destilada 1 mL de soluo tampo fosfato 1 gota de TRITON X-100

Centrifugar a 10.000 rpm por 15 minutos ( nossa centrfuga velocidade mxima por 30 minutos)
2,4 mL sobrenadante 0,2 mL + 2,2 mL reativo ferricianeto-fosfato

A1

Ler as absorvncias a 632 nm (A1 e A2) Adicionar 80 L reativo cianeto Aguardar 1 minuto

A2

A3

Ler as absorvncias a 632 nm (A3 e A4)

A4

% Metemoglobina =

100 x

A1 A3 (A2 A4) x 12

Valor de referncia (NR-7): < 2%

Solues
A. Soluo de ferricianeto de potssio a 5% B. Soluo tampo fosfato 0,5 M pH 7,2 (juntar 10 mL de soluo 0,5 M de NaH2PO4 com 7 mL soluo de NaOH 0,5 M). Reativo de ferricianeto-fosfato: em tubo de ensaio graduado misturar 0,2 mL de soluo A com 2,5 mL de soluo B e completar volume q.s.p. 10 mL com gua destilada (preparo dirio). C. Soluo de cianeto de sdio a 10% (preparo recente) D. Soluo de cido actico a 12% Reativo cianeto: em tubo de ensaio misturar 1 mL da soluo C com 0,9 mL da soluo D.

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Figura 1. Diferentes espectros de absoro com comprimento de ondas especficos (nm) de oxiemoglobina, deoxiemoglobina, metemoglobina e cianometemoglobina. Fonte: Naoum, P.C. et al. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, v. 26(1): 19 - 22, 2004.

Referncia da metodologia : Hegesh, E. et al. Clin. Chim. Acta, v. 30: 679 82, 1970.

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Roteiro de Aula Prtica Mdulo 3 (espectrofotometria no visvel)


Determinao da Dapsona no plasma / soro A dapsona um frmaco quimioterpico empregado principalmente no tratamento da hansenase e na preveno da infeco respiratria por P. carinii em pacientes aidticos e crianas com leucemia linfoblstica aguda. Principais produtos de bioativao: monoacetildapsona (ADDS) e mono-N-hidroxidapsona (NHDDS). Ela tambm atua sobre o P. falciparum sendo indicada na profilaxia da malria Os efeitos adversos so mais comuns em concentraes plasmticas superiores a 0,01 mg / mL e incluem anemia hemoltica e formao de metemoglobina. Reaes de hipersensibilidade cutnea podem estar presentes em at 17% dos pacientes. Esto sob risco maior os indivduos deficientes de NADH-citocromo b5-redutase (heterozigotos) que podem chegar a mais de 10% de MetHb em 3 10 semanas de tratamento. A avaliao dos nveis plasmticos de dapsona til para o diagnstico da intoxicao medicamentosa e para ajuste da dose. Nveis teraputicos: 0,5 5 g/mL. Princpio do mtodo: A dapsona, em meio cido, forma um complexo colorido com o PAB. Procedimento: 1. Soluo padro de DDS 1mg/mL Pesar 0,01g de DDS e dissolver em etanol absoluto utilizando balo volumtrico de 10mL. Acondicionar a soluo em vidro mbar e conservar em geladeira. 2. Curva de calibrao em plasma ou soro. Transferir quatro alquotas (0,01, 0,02, 0,04 e 0,06mL) da soluo padro de DDS para quatro tubos de centrfuga. Evaporar o solvente e acrescentar 2 mL de plasma. Levar ao vortex por 1 minuto. Fazer cada concentrao em triplicata. Em paralelo, separar 2 mL de plasma para o branco. 3. Reativo de Ehrlich

Pesar 3 g de 4-dimetilaminobenzaldedo (PAB) e diluir em etanol absoluto. Completar ao volume para 100mL. Acondicionar em vidro mbar e conservar sob refrigerao.
4. Seguir o procedimento analtico esquematizado abaixo. 2mL de plasma ou soro
2 gotas de soluo KOH 6% (para obter pH 10 11) 10 mL de CHCl3 agitar por 15 minutos e centrifugar

Fase aquosa desprezar

Fase orgnica
Filtrar 5 mL de HCl 3N / agitar por 15 minutos e centrifugar

Fase orgnica desprezar

Fase aquosa (4 mL)


2 mL etanol absoluto 2 mL de reativo Ehrlich Agitar por 20 s

Ler absorvncia a 470 nm

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5. Montar uma planilha Excel com os resultados (absorvncia x concentrao). Obter a equao da curva de calibrao atravs de regresso linear.

Avaliao da recuperao (exatido): Tomar duas alquotas de soluo padro (0,010 e 0,040) e colocar cada uma em um tubo de centrfuga. Fazer triplicata desse procedimento. Adicionar 4 mL de HCl 3N em cada tubo. Homogeneizar. Adicionar 2mL de etanol absoluto e 2 mL de reativo de Ehrlich. Agitar por 20 segundos e ler a absorvncia. Obter a mdia dos valores de absorvncia (M2). Construir a curva de calibrao (Absorvncia x microgramas dapsona). Obter a mdia dos valores de absorvncia obtidos para anlise de plasma fortificado a 10g/mL. Anotar o valor de absorvncia correspondente (A1). Avaliar a massa de dapsona correspondente a essa absorvncia utilizando a curva Abs x massa dapsona [M1]. M1 = massa de dapsona realmente extrada M2 = massa de dapsona teoricamente extrada [(10 g x 2) x 4/5] Clculo de rendimento %: [M1 / M2] x 100 Avaliao da preciso intra-srie: Calcular o Coeficiente de Variao (CV) dos resultados para cada concentrao da curva de calibrao atravs da formula: CV% = (desvio-padro / mdia) x 100

Como voc estudaria a especificidade/ seletividade ?

A tcnica tem sensibilidade adequada para monitorar concentraes txicas de DDS ?

Como voc avaliaria a linearidade desse mtodo?

Baseado em: Revista Brasileira de Cincias Farmacuticas, (SP), v. 25, n. 2, p. 177-178, 1989.

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Roteiro de Aula Prtica Mdulo 4 (aplicao da enzimologia na anlise toxicolgica)


Dosagem de nitrito e nitrato em alimento Nitratos e nitritos so usualmente empregados como conservantes para alimentos. Quando ingerido pelo homem, o nitrato sofre ao da flora microbiana sendo reduzido a nitrito. Por reagir com aminas e amidas presentes no meio, os nitritos geram nitrosaminas e nitrosamidas, sabidamente carcinognicas, mutagnicas e teratognicas. O nitrito tambm interage com a oxiemoglobina, oxidando o ferro e gerando aumento nas taxas de metemoglobina segundo a reao: 2 O2Fe2+ + 3NO2- + 2H+ = 2Fe3+ + 3NO3- + H2O. Princpio do mtodo: O nitrito quantificado por reao com o Reagente de Griess, formando um composto rseo-violeta, com max = 540 nm. O nitrato quantificado como nitrito aps ser reduzido pelo vandio trivalente. A diferena entre as duas dosagens expressa a concentrao real de nitrato presente na amostra.

Mecanismo da reao de Griess Preparo de solues e reagentes: 1. Soluo estoque de Nitrato e de Nitrito a 1mg/mL Pesar 0,050g de nitrato ou nitrito de sdio e dissolver em gua destilada utilizando balo volumtrico de 50mL. Armazenar por no mximo duas semanas. 2. Solues de trabalho (A. B e C) de nitrato e nitrito: em bales volumtricos de 100 mL diluir os seguintes volumes das solues estoque: Soluo A: 5 mL ; Soluo B: 1 mL ; Soluo C: 0,1 mL 3. Reagente de Griess (dosagem do nitrito) Pesar 200 mg de sulfanilamida e 10 mg de N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride (NEED) e dissolver em 150 mL de HCl 1M. Armazenar em vidro mbar e conservar sob refrigerao por no mximo um ms. 4. Reagente de Griess com redutor (dosagem do nitrato): Pesar 400 mg de VCl3 (pesar em capela de exausto) e diluir com 50 mL de HCl 1M. Pesar 200 mg de sulfanilamida e 10 mg de (NEED) e dissolver em 100 mL de HCl 1M. Misturar as duas solues. Armazenar em vidro mbar e conservar sob refrigerao por no mximo um ms. 5. Curva de calibrao do nitrito. Preparar triplicata de cada concentrao. Em tubos de ensaio adicionar os seguintes volumes de soluo de nitrito, gua destilada e reagente de Griess. Massa de nitrito Soluo de trabalho gua destilada Reagente de Griess (g) (mL) (mL) Branco de reagentes 1 1 0,25 250 L da soluo C 0,90 1 0,5 50 L da soluo B 0,95 1 1 100 L da Soluo B 0,90 1 2,5 50 L da Soluo A 0,95 1 5 100 L da Soluo A 0,90 1

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6. Montar uma planilha Excel com os resultados (absorvncias x massas). Obter as equao da curva de calibrao atravs de regresso linear. 7. Preparo da amostra: Pesar cerca de 10 g de lingia triturada - 70 ml de gua destilada - Banho-maria de 80 C por 35 min - Esperar esfriar - Transferir para um balo volumtrico de 250 mL - Lavar o bquer com 30 mL de gua destilada quente e juntar ao balo - 2 mL da soluo de ferrocianeto de potssio a 15% - 2 mL da soluo de sulfato de zinco a 30% - Completar volume com gua destilada - Esperar 5 minutos - Filtrar em papel pregueado Whatmann n 4 Filtrado 250 L Adicionar 750 L de gua destilada Nitrato - 1mL do reagente de Griess com VCl3 - Aquecer a 48,5C por 70 min Ler absorvncia a 540 nm (nitritos totais = nitrato + nitrito) Nitrito - 1mL do reagente de Griess sem VCl3 - Aguardar 70 min Ler absorvncia a 540 nm (nitrito real na amostra) 250 L

8. Calcular a massa de nitrito presente nas alquotas atravs da equao da curva de calibrao. 9. Calcular a concentrao de nitrato levando em considerao que: a) Nitritos totais nitrito real = nitrito que veio do nitrato b) 5 mg de nitrato geram 4 mg de nitrito aps a reduo c) a massa de nitrito estava contida em 250 mL; uma alquota mil vezes menor foi tomada para o ensaio (250 L); ento a massa obtida deve ser multiplicada por 1000; d) a seguir, a massa encontrada estava na quantidade pesada de lingia, ento faa uma regra de trs para saber quanto teria em 1000g (Kg) da amostra. e) a concentrao de nitrito deve ser expressa em mg/Kg (ppm). 10. Comparar os valores mximos permitidos pelo Ministrio da Sade e da Agricultura descritos no D.O.U, Braslia, 28 de junho de 1976, p. 8904: 500 ppm para nitrato e 200 ppm para nitrito. O Ministrio da Sade, atravs da Portaria n 1004, de 11 de Dezembro de 1998, reduziu esses limites para 150 ppm de nitrito e 300 ppm de nitrato

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Referncias bibliogrficas:
1. 2. 3. 4. 5. Doane T. A. e Horwth W. R. Analytical Letters, v. 36, n. 12, p. 27132722, 2003. Miranda K. M., Espey M. G. e Wink D. A. Nitric Oxide: Biology and Chemistry , v. 5, n. 1, p. 6271, 2001. Governo do Brasil. Ministrio da Agricultura. Instruo Normativa n 20, de 21/07/1999. Rodkey, F. L. Clinical Chemistry, v. 22, n. 12, p. 1986 1990, 1976. AOAC Official Method 993.03 Nitrate in Baby Foods. J.AOAC Int., v. 77, p. 425, 1994.

UFF CMF MAF CADERNO DE AULAS PRTICAS PARA A DISCIPLINA DE TOXICOLOGIA Avaliao da atividade da colinesterase em soro / plasma

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Princpio do mtodo: a atividade da enzima colinesterase presente no plasma / soro avaliada frente ao substrato adicionado (acetiltiocolina) amostra. A hidrlise da acetiltiocolina produz cido actico e colina. A colina reage com o DTNB formando o TNB que absorve na regio do visvel (400 420 nm).

Preparo dos reagentes


1. Tampo fosfato 52 mM - pH 7,2 Preparar soluo 0,104 M de fosfato de sdio monobsico (NaH2PO4) e 0,104 M de fosfato de sdio dibsico (Na2HPO4). Misturar 84 mL da primeira com 216 mL da segunda. Acrescentar 300 mL de gua destilada. 2. Soluo de DTNB (cido 5,5-ditiobis-2-nitrobenzico) a 0,26 mM em tampo fosfato pH 7,2 Pesar 51,5 mg do cido e dissolver no tampo fosfato em balo volumtrico de 500 mL. Completar volume. Esta soluo estvel por 6 semanas em frasco mbar na geladeira. 3. Soluo de iodeto de acetiltiocolina 28 mM Pesar 451,2 mg do sal e dissolver em gua destilada em balo volumtrico de 10 mL.

Obteno do soro
Colher cerca de 2mL de sangue em tubo sem anticoagulante. Centrifugar suavemente a 3000 rpm por 10 minutos. Com auxlio de uma pipeta automtica, transferir cerca de 0,2 ml do sobrenadante, de cor amarelo claro (soro), para um outro tubo graduado. Diluio da amostra Diluir o soro 1:10 com gua deionizada imediatamente antes da anlise. Homogeneizar. Quadro 1. Esquema analtico para dosagem da colinesterase (todos os reagentes devero estar estabilizados a 25C). Reagentes Tubo da Tubo do branco de amostra reagentes (L) (L) Amostra diluda 20 gua deionizada 20 DTNB 3000 3000 Acetiltiocolina 100 100 Misturar manualmente. Depois de 2 minutos, anotar o primeiro valor de absorvncia obtido a 405 nm. Realizar mais trs leituras em intervalos de 30 segundos. Nota.: o primeiro valor de absorvncia no pode exceder 0,5. Se a variao de absorvncia (30s) for maior que 0,2 ser necessrio diluir a amostra com gua deionizada.

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Tabela 1. Incrementos de absorvncia obtidos na avaliao da atividade da colinesterase plasmtica Abs A0 A 30 A 60 A 90 Abs Abs (mdia)

Clculos:
Abs x t . . d

V1 V2

Abs x [3,12 / 0,02 mL] 0,5 min x 1,33 L x mmol


1

= mmoles produto / min . L


1

x mm

x 10 mm

Onde: Abs / t = incremento mdio de absorvncia por minuto = absortividade molar do corante a 405 nm = 13300 L. mol 1 . cm 1 d = caminho tico (mm) Lembre-se: A = bc (onde b = 1 cm e c = moles / L) V1 = volume final da preparao em mL V2 = volume da amostra em mL

Definir a atividade da enzima em U / L ou moles produto / min . L

Colinesterase plasmtica ou pseudocolinesterase - Valores normais por essa tcnica: Mulheres: 1700 a 3700 U / L Homens: 1900 3800 U / L Variao normal de atividade da colinesterase plasmtica em um mesmo indivduo: at 30% por conta de flutuaes fisiolgicas ou no ritmo circadiano. Uma reduo em mais de 30% da atividade basal do indivduo pode ser devida a contato com inibidores da colinesterase. ndice Biolgico Mximo Permitido (NR7 Brasil): at 50% de reduo do valor basal do indivduo para colinesterase plasmtica.

Baseado em: Analyses of Hazardous Substances in Biological Materials. Angerer, J; Schaller, K.H. eds. VCH Weinheim. V.3. p.45 62, 1991.

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(CH3)3NCH2CH2SC CH3
ACETILTIOCOLINA

Enzima

(CH3)3NCH2CH2S TIOCOLINA

+ CH3COO

- + 2H+

ACIDO ACTICO

O2N COOH

NO2 COOH

DTNB

(CH3)3NCH2CH2S

HS
O2N COOH

NO2

COOH TNB ( = 13.600 para = 412nm)

Figura 1. Principais reaes qumicas no mtodo de Ellman. Fonte: Ellman, G.L. Archives of Biochemistry and Biophysics, v. 82, p. 70 - 77, 1959.

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Reagentes (Clarkes Analysis of Drugs and Poisons, 2004)

Reagente de Van Urk Dissolver 1 g de p-dimetilaminobenzaldeido em 100 mL de etanol e adicione 10 mL de cido clordrico. Nebulizar a placa com o reagente e aquecer em estufa a 100 C por 5 minutos. Manchas amarelas so produzidas por reao com sulfonamidas e meprobamato, Manchas azuis so produzidas com alcalides do ergot. Manchas rosa e violeta so produzidas por reao com outros compostos, como por exemplo, fenazona.

Soluo de cloreto frrico Dissolver 5 g de cloreto frrico em 100 mL de gua deionizada Manchas azuis ou violetas so obtidas na reao com fenis. Essa soluo pode ser nebulizada sobre uma placa previamente revelada com o reagente de Van Urk.
O OH OH + FeCl3

OH O
-

Fe3+

3 HCl

Soluo de Nitrato Mercuroso Dissolver 1g de nitrato mercuroso em uma mistura de 50 mL de gua destilada e 5mL de acido ntrico. Avolumar para 100 mL. Guarde em frasco de vidro mbar, protegido da luz. Manchas cinza escuro, que clareiam rapidamente so obtidas na reao com barbitricos (amidas).

Soluo de Iodo Platinado acidificado Dissolva 0,25g de cloreto platnico e 5 g de iodeto de potssio em 100 mL de gua deionizada. Adicione 5 mL de HCl.

Reagente FPN Misture 5 ml de soluo de cloreto frrico (a 5%), com 45 mL de soluo de cido perclrico a 20% w/w. A seguir, adicione 50 mL de soluo de cido ntrico a 50% v/v. Manchas rosas, vermelhas ou arroxeadas so produzidas com fenotiaznicos. Manchas azuladas so produzidas por reao com as dibenzazepinas.

Reagente de Dragendorff Soluo A: misture 2g de subnitrato de bismuto, com 25 mL de cido actico e 100 mL de gua. Soluo B: misture 40g de iodeto de potssio em 100 mL de gua Misture 10mL da soluo A com 10 mL da soluo B, e acrescente 20 mL de cido actico e 100mL de gua destilada. A mistura estvel por 2 dias. Cloreto de paldio Dissolver com ajuda de calor, 0,1g de cloreto de paldio em 5 Ml de HCl 2M. Diluir a soluo para 100 mL com gua destilada. Misturar volumes iguais desta soluo com hidrxido de sdio 2M. O reagente assim misturado estvel por vrias semanas. Cores do amarelo, laranja ao marrom so obtidas para compostos com enxofre na cadeia (exceto se o enxofre estiver ligando dois anis ou se for apenas uma cadeia S-alquil, sem halognios na extremidade).