Melina A.

Varnavoglou Biologia II

Trabajo practico N6: Cuantificacin de protenas.

Introduccin:

Las protenas estructuralmente son polmeros formados por secuencias de aminocidos unidos por enlaces peptidicos. Esta unin entre. El enlace peptdico tiene lugar mediante la prdida de una molcula de agua entre el grupo amino de un aminocido y el carboxilo de otro. El resultado es un enlace covalente CO-NH. Es, en realidad, un enlace amida sustituido. Podemos seguir aadiendo aminocidos al pptido, porque siempre hay un extremo NH2 terminal y un COOH terminal

Los aminoacidos son los monmeros fundamentales de las protenas. Se conocen veinte aminocidos proteinogenticos, cada uno de los cuales responden a la frmula de ser cidos 2-aminocarboxlicos y tienen una cadena lateral R distinta, que es la que define sus propiedades particulares; asi, existen varios tipos de aminoacidos segn la naturaleza de su cadena lateral R. Hay algunos aminocidos que

tienen en su cadena lateral anillo aromtico, tal es el caso del triptfano la fenilalanina , entre otros.

y de

La absorcin de luz por parte de una sustancia es una propiedad caracterstica de ella, que puede ser utilizada para su identificacin y cuantificacin. La absorcin de luz depende de la estructura qumica del compuesto absorbente, y en especial de ciertos grupos funcionales, de modo que es posible identificar un compuesto por medio de las caractersticas de su espectro de absorcin. Cuantificacin de protenas de solucin: La tecnica de cuantificacin de protenas consiste en estimar la concentracin de protenas de una muestra dada. En general, no hay un mtodo completamente satisfactorio para medir la concentracin de protenas en una muestra. La eleccin del mtodo depende de la naturaleza de la protena, de la rapidez y la sensibilidad deseada. Pero el fundamento de cualesquiera de los mtodos utilizados se remite a las propiedades intrnsecas que una protena tiene de: a) Absorber activamente la luz de la regin ultravioleta. La relacin entre esta absorcin y la concentracin proteica es lineal (cumple lo establecido por la ley de Lambert-Beer : La absorcin de luz es proporcional al nmero de molculas de las

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sustancias en solucin por donde pasa el haz luminoso). Adems la absorcin de un rango de longitud de onda da cuenta de la regin de la protena que la esta absorbiendo, ya que se presentan dos picos mximos de absorcin de luz: uno a 280 nm correspondiente a la absorcin de fotones por parte de los electrones de un anillo aromtico y, otro a los 200 nm ya que los enlaces pepiticos absorben fotones por debajo de los 210 nm. La ventaja del mtodo por absorcin de luz UV es entonces que la absorvancia vs la concentracin de protenas tiene una relacin lineal, que no hay consumo de protenas, es decir, esa misma muestra puede volver a reutilizarse y que no se necesitan soluciones estndar para medir la absorvancia. Sus desventajas son que hay componentes no proteicos que absorben UV y que la estructuras 1,2, 3 y 4 afectan la absorvancia b) Unir ciertos colorantes. El color indica la capacidad de las sustancias de absorber o reflejar ciertos componentes de la luz que incide sobre ellos. Mediante el agregado de diferentes reactivos qumicos que reaccionan con las protenas se origina un producto coloreado que ser medido en el espectro visible, y cuya intensidad es lineal con respecto a la concentracin proteica en un rango determinado. Para este mtodo, el colorimtrico, si es necesaria una curva estndar. En esta experiencia se utiliz el mtodo colorimtrico de Bradford, que fue diseado por Bradford en 1976 y est basado en el cambio de color del colorante Coomassie brilliant blue G-250 en respuesta a diferentes concentraciones de protenas. Este compuesto interacciona con aminocidos bsicos (especialmente arginina) y aromticos . Este tiene ademas las siguientes caracterisitcas y ventajas: Es Barato, solo se utiliza un reactivo el colorante Comassie Blue G-250. De alta sensibilidad (1-100 g). Es rpido, la reaccin finaliza a los 5 min. y es estable hasta una 1 hr despus. Es sencillo (solo un reactivo se utiliza) La Absorbancia se lee a 595 nm

Objetivo:
Determinacin de la concentracin proteica de una muestra de albumina utilizando el mtodo colorimtrico de Bradford. Comparar los resultados que se obtienen de realizar el mismo procedimiento pero con diluciones seriadas y con diluciones punto a punto.

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Materiales: Instrumental de laboratorio:

o o o o o Tubos de hemlisis Tubos eppendorf. Micropipetas automticas p200 y p 2000 Espectrofotmetro Cubetas de cuarzo

Sustancias proporcionadas: o Solucin madre de Albmina bovina (BSA) o Solucin cida del reactivo de color (Coomassie Blue G) o Agua destilada.

Metodologa:
Fundamento del mtodo: El pico de absorcin mxima del colorante en una solucin cida , se desplaza desde los 465 nm a los 595 luego del agregado de la protena, debido a la estabilizacin de la forma aninica del colorante por interacciones tanto inicas como hidrofbicas. El colorante reacciona principalmente con los residuos de arginina, y en menor proporcin con histidina, lisina, tirosina, triptofano y fenilalanina.
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Procedimiento:
Se realizaron previamente las diluciones correspondientes para la curva de calibrado y de la muestras incgnita BSA. Dos grupos de trabajo realizaron una dilucion seriada de la muestra y su duplicado y, los dos restantes hicieron, en cambio una dilucion punto a punto y el duplicado de esta otra. Se realizo esto con el fin de obtener dos curvas de calibrado: una seriada y una punto a punto. En la experiencia de este grupo la curva a realizar asignada fue la seriada, por lo que solo se describir el procedimiento de dilucion seriada en este trabajo: La misma consisti en, a partir de una concentracin original dada dentro de un tubo eppendorf (que era de 20 mg/ml de BSA cuyo volumen, al estar en solucin fue de 100 mcl), realizar una primera dilucion (con 150 mcl de agua) e ir tomando alicuotas (en general y en esta experiencia particular, siempre de la misma medida: 100 mcl) de la
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Para la preparacion del reactivo colorante ver el anexo 1 al final de este trabajo.

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dilucion que le anteceda. De esta forma se obtuvieron 4 concentraciones contenidas en 4 tubos eppendorf, descriptas en la siguiente tabla: Concentracion 8 mg/ml 4 mg/ml 2 mg/ml 1 mg/ml BSA (100 mcl) 20 mg/ml 8 mg/ml 4 mg/ml 2 mg/ml Agua 150 mcl 100 mcl 100 mcl 100 mcl

Se realiz este procedimiento con una micropipeta automtica P200. Finalmente, se rotularon cada uno de los tubos numerndolos de mayor a menor concentracin. Luego, se procedi a rotular cuatro tubos de hemlisis de la misma forma que los tubos eppendorf. En ellos es donde tendr lugar el ensayo colorimtrico. Se coloc 1 ml de reactivo de Brandorf (Coomasie) en cada uno de ellos. Una vez preparado esto, con una micropipeta automtica se extrajeron 0,5 mcl de cada uno de los tubos eppendorf que contenan la muestra y se los coloc en cada uno de los tubos de hemlisis que contena el reactivo. Por ltimo se agito cada tubo, tapando la boca con un pequeo papel que parecia estar siliconado, con el fin de homogenizar la mezcla muestra-reactivo. Se los dejo incubar durante 5 minutos y se encendi el espectrofotometro, ya este deber ser prendido 15 minutos antes de realizarlo. Colocando los tubos que contenian diferentes concentraciones en orden poda observarse un degrad en color azul (color caracterisitico del reactivo Coomasie), as, se defini una curva colorimtrica que tal como lo explicitado en la introduccin, expresaba la relacion directa entre el desarrollo de color y la concentracin de protenas: a mayor intensidad del color azul, mayor concentracin de protenas. Efectivamente esto era asi, ya que el tubo con el rotulo 1 (la muestra mas concentrada), era el mayormente coloreado. Una vez que se hubieron cumplido los 15 minutos desde el encendido del espectrofotmetro, se procedi a utilizarlo. Para ello, primero se lo calibro en una longitud de onda de 595 nm ya que esa es la longitud de onda en la que se lee la absorvancia para el mtodo de Brandford. Luego, se coloc una cubeta de cuarzo que solo contenia el reactivo y se pulso la tecla AUTOCERO para que este valor se restara a todas las dems muestras a analizar para que se mida no la concentracion del reactivo color mas el de la protena sino el de la protena solamente. Se fue colocando el contenido de cada uno de los tubos en cubetas de cuarzo llenndolas hasta su volumen mnimo y se procedi a colocarlas en el espectrofotmetro para la medicin de la absorvancia de la sustancia que cada una de ellas contena. Registrando los valores se confeccion la siguiente tabla: Dilucion BSA (concentracin) 1 (8 mg/ml) 2 (4 mg/ml) Volumen a pipetear (mcl) 100 ml 100 ml Absorvancia (DO)
0,175 0,287

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3 (2 mg/ml) 4 (1mg/ml)

100 ml 100 ml

0,381 0,502

Con los datos de los demas grupos se confeccionaron estas tablas:

PUNTO A PUNTO GRUPO 1 GRUPO 2 Concentracion (mg/ml) Absorbancia Absorbancia PROM 0 0 0 0 1 0,128 0,163 0,146 2,6 0,283 0,254 0,269 5 0,412 0,471 0,442 7,6 0,448 0,52 0,484 CURVA SERIADA GRUPO 3 GRUPO 4 Concentracion (mg/ml) Absorbancia Absorbancia PROM 0 0 0 1 0,175 0,436 2 0,287 0,474 4 0,381 0,533 8 0,502 0,55

Aclaracion: de la dilucion punto a punto y su duplicado se realizo un promedio ya que los valores obtenidos eran bastante similares, en cambio de la dilucion del grupo 3 para con su duplicado con el grupo 4 no era conveniente hacerlo ya que sus valores distaban bastante entre si y realizar un promedio significara aumentar el error, ya que es probable que una de las dos este bien. En este caso el grupo que obtuvo valores mas cercanos al a concentracion incognita fue el grupo de este trabajo, el grupo 3. Los datos que se utilizaron para interpolar en la ecuacion de la recta de la curva estandar fueron solo estos, los del grupo del grupo 3. Esta, la curva estandar, se realiza con diferentes soluciones de una protena patrn cuya concentracion es conocida. Luego se procede a interpolar los puntos obtenidos en ella, dando como resultado un grafico como el siguiente: (Este es tan solo un ejemplo, no son los resultados obtenidos)

Absorbancia vs ug de proteinas
0,9 0,8 0,7
Abs (595nm)

0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 5 10 15 ug de albumina 20 25 30 y = 0,034x R2 = 0,9789

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Esta recta describe la siguiente funcion Donde y = Abs 595 m = pendiente m = a.b , siendo a= cte de absortividad y b= longitud de la trayectoria a traves de la solucion. x= la concentracin de protenas b = ordenada al origen La concentracion de la muestra patron es entonces igual a X=yb/a

Resultados:

0.6 0.5 0.4 ABS 0.3 0.2 0.1 0 0 2 4 6 8

y = 0.0743x R = 0.8646

concentracion (mg/ml)

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Conclusiones:

Los resultados obtenidos, los puntos de la curva, de los que se obtuvo la concentracion que tenia la solucion de BSA coincidian con gran aproximacion a los datos develados luego de realizar la experiencia, estos eran: 1,5; 3; 6 y 12. Observaciones:

Si un punto se obtiene fuera de la linealidad de la curva, es conveniente diluir la muestra en ese punto hasta obtener un valor que si este dentro de ella. En este caso no fue necesario ya que todos los puntos dieron conforme a la linealidad de la curva o recta estandar, como se muestra en los resultados

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Anexo 1 Preparacion del reactivo de color: Se disuelve 100 mg de Serva Blue G en una mezcla de 100 ml de 85% de cido fosfrico y 50 ml de etanol 95%, despus de la completa disolucin del colorante se lleva el volumen a 1 litro con agua.