Integrantes: Nathalie Gonzales Lyannie Gorena Emanuel Bustamante

Materia: Laboratorio de microbiologa

Tincin de Gram
I. Introduccin El tamao de las bacterias impide verlas a simple vista, sin embargo, las colonias que se forman en medios solidos si son visibles, de esta manera se puede hacer una observacin a simple vista o macroscpica, en las colonias se puede estudiar una serie de caractersticas que nos ayudan a una ligera identificacin, como a nivel morfolgico (forma de las colonias), elevacin, margen o borde y color de las colonias; es decir que por medio de una observacin macroscpica no se puede identificar al tipo de bacterias, es por esto que se debe realizar una observacin microscpica. Ramos y Prez (2004), las clulas microbianas se reproducen habitualmente con tal rapidez que en 18-24 horas dan lugar a la aparicin de masas visibles de clulas sobre medios solidos que se denominan colonias. Cada colonia se considera que est formada por un nico tipo de microorganismo. Las colonias tienen una morfologa caracterstica que se estudia a simple vista con la ayuda de una lupa. Las caractersticas ms importantes de las colonias y cuyo estudio tiene inters en la caracterizacin son los siguientes: Forma: puede ser puntiforme, circular, irregular, filamentosa, rizoide u ovalada. Tamao: se mide en mm. Se dice que es puntiforme si mide menos de 1mm. Elevacin: vistas de perfil las colonias pueden ser plana, elevada (o en relieve), convexa, pulvinada (ms elevada que convexa), mamelonada (con una protuberancia central), o umbilicada (con una depresin central). Forma del borde: puede ser entero, ondulado, lobulado, dentado (o aserrado), filamentoso y rizado. Superficie: puede ser lisa, rugosa, mate, brillante, transparente u opaca. Color: presencia de colores caractersticos y difusin de pigmentos en el medio. Capacidad de emulsin en agua: puede formar una suspensin uniforme, formar una suspensin grumosa o no se emulsiona.

En este laboratorio solo se tom en cuenta la forma, borde, elevacin y color. La observacin microscpica es una de las caractersticas de la microbiologa y aunque es posible observar ciertos microorganismos sin colorear (por ejemplo protozoarios), en el caso de las bacterias es necesario la coloracin de los preparados para aumentar el contraste con el fondo. Existen diversos mtodos de coloracin para una observacin microscpica, como ser: tincin de Ziehl Neelsen, coloracin de esporas, coloracin de flagelos, tincin de Gram, y muchos otros, el que nosotros realizamos fue el ltimo.

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Segn Garcia (2010) las referencias a la morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos, etc.) se basan en la tincin de Gram. Sobre la base de su tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram positivas y Gram negativas (en este caso, los trminos positivo y negativo no tienen que ver con la carga elctrica, sino simplemente designan dos grupos morfolgicos distintos de bacterias). Las Bacterias Gram positivas y Gram negativas tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. La pared de la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo. Garca (2010), el material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. La pared de las clulas Gram positivas es gruesa y consiste en varias capas interconectadas de peptidoglicano as como algo de cido teicoico, generalmente, 80% a 90% de la pared de la clula Gram positiva es peptidoglicano. La pared de la clula Gram negativa, por otro lado contiene una capa mucho ms delgada nicamente de peptidoglicano y est rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolpidos, lipopolisacaridos y lipoprotenas. Solo de un 10% a 20% de la pared de la clula Gram negativa es peptidoglicano. Las clulas Gram positivas, a causa de que sus paredes celulares son ms espesas en peptidoglicano y menos lpidos, no son permeables al disolvente, ya que este deshidrata la pared celular y cierra los poros, disminuyendo as el espacio entre las molculas y provocando que el complejo cristal violeta-yodo quede atrapado dentro de la pared celular. Mientras que para las Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste, habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fuscina bsica. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules. Madigan, Martinko, Parker (..), las diferencias estructurales entre las paredes celulares de las Bacterias Gram positivas y Gram negativas son las responsables del diferente comportamiento de las clulas a la tincin de Gram. En dicha tincin, se forma dentro de las clulas un complejo cristal insoluble violeta-yodo que en el caso de las Gram negativas puede extraerse con alcohol, pero no en las Gram positivas. El alcohol deshidrata las Bacterias Gram positivas, que poseen paredes celulares muy gruesas con varias capas de peptidoglicano. Esto provoca el cierre de los poros de las paredes impidiendo la salida del complejo cristal violeta-yodo. En las Bacterias Gram negativas, el alcohol penetra rpidamente en la capa externa que es rica en lpidos y la fina capa de peptidoglicano no impide el paso del solvente, por lo que el complejo se extrae fcilmente. En la tincin de Gram es importante respetar los pasos y los tiempos: Cristal violeta (1 minuto)

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Lavar Lugol (1 minuto) Lavar (Gram positivo) Decolorante Lavar Safranina (30 segundos) Lavar Secar y observar en el microscopio

II.

Objetivos Observar macroscpicamente cinco colonias mixtas y dos colonias puras (controles) para clasificarlas de acuerdo a su forma, elevacin, borde y color. Distinguir las bacterias gram positivas y gram negativas de un cultivo mixto utilizando dos controles travs de la observacin microscpica, por el mtodo de tincin de gram para conocer sus caractersticas estructurales.

III. -

Materiales y reactivos 3 cajas Petri (2 Colonias puras y una mixta) 7 portaobjetos Mechero Bunsen Cristal violeta Decolorante (alcohol acetona) Agua Aceite de inmersin - Alcohol - Asa de inoculacin - Solucin fisiolgica - Lugol - Colorante de contraste (safranina) - Microscopio - Gotero

IV.

Procedimientos

Se realiz la prctica en 2 partes, primero se realiz una observacin macroscpica y luego otra microscpica.

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Inicialmente se limpi y desinfecto el rea de trabajo con el uso de alcohol al 70%. Posteriormente se nos proporcionaron 3 cajas Petri, dos de ellas contenan colonias puras (bacterias de control) y la otra contena colonias mixtas. Luego se clasificaron 5 colonias mixtas de acuerdo a su forma, elevacin, borde, color y aspecto, de la misma forma se realiz la operacin con las dos colonias puras. Para hacer us del asa de inoculacin primero se lo flameo en el mechero hasta que se obtuvo un color rojo vivo, luego se mantuvo el asa dentro del rea de esterilidad del mechero el cual es aproximadamente de 20 cm, y se lo dejo enfriar por algunos segundos. Paralelamente se lav el portaobjetos y se coloc una gota de solucin fisiolgica estril. Una vez que el asa enfri se tomaron las bacterias encontradas al borde de cada colonia, las cuales fueron colocadas en el portaobjetos al costado de la solucin fisiolgica para posteriormente juntarlos y esparcir las bacterias con el fin de separarlas para una mejor observacin. Se dej secar la preparacin hasta que el agua se evaporo por completo, entonces se fij la muestra pasndola 3 veces por el mechero con la precaucin de no quemarlas. Este procedimiento se repiti con las diferentes colonias previamente clasificadas. Ya fijadas las muestras se prosigui con la tincin de Gram la cual consisti en cubrir la muestra con cristal violeta durante 1 minuto, luego se lav con agua de grifo. Se cubri el extendido con lugol igualmente durante 1 minuto y se volvi a lavar con agua. Se puso un decolorante (alcohol-acetona) hasta que la muestra ya no desprendi el color violeta, nuevamente se lav con agua. Se cubri con safranina durante 30 segundos, de nuevo se lav con agua y se dej secar a temperatura ambiente. Una vez seca la muestra esta se observ por medio del microscopio con el objetivo de inmersin, identificando si la bacteria corresponde a una Gram (+) o Gram (-), tambin se sacaron fotos para la observacin morfolgica de dichas bacterias. V. Resultados y discusin

Observacin Macroscpica Tabla N1

Cultivo Mixto 1 Forma filamentoso Margen Ondulado Elevacin elevado Color Blanco/crema

Cultivo Mixto 2 circular ondulado convexa Blanco/crema

Cultivo mixto 3 puntiforme ondulado plana Blanco/crema

Cultivo mixto 4 Circular entero elevado Blanco/crema

Cultivo Mixto 5 rizoide entero elevado Blanco/crema

Control circular entero elevado Blanco/crema

Control + circular entero convexo Blanco/crema

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Tabla N2 Figura 1: Cultivo mixto-Colonia I Figura 2: Cultivo mixto-Coloni II

Figura 3: Cultivo mixto-Colonia III

Figura 4: Cultivo mixto-Colonia IV

Figura 5: Cultivo mixto-Colonia V

Figura 6: Muestra control (Gram negativas)

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Figura 7: Muestra control (Gram positivo)

+
Elaboracin propia 2013

Discusin

Segn Ramos y Prez (2004), las clulas microbianas se reproducen habitualmente con tal rapidez que en 18-24 horas dan lugar a la aparicin de masas visibles de clulas sobre medios solidos que se denominan colonias. Cada colonia se considera que est formada por un nico tipo de microorganismo. Las colonias tienen una morfologa caracterstica que se estudia a simple vista con la ayuda de una lupa. Las caractersticas ms importantes de las colonias y cuyo estudio tiene inters en la caracterizacin son los siguientes: Forma: puede ser puntiforme, circular, irregular, filamentosa, rizoide u ovalada. Tamao: se mide en mm. Se dice que es puntiforme si mide menos de 1mm. Elevacin: vistas de perfil las colonias pueden ser plana, elevada (o en relieve), convexa, pulvinada (ms elevada que convexa), mamelonada (con una protuberancia central), o umbilicada (con una depresin central). Forma del borde: puede ser entero, ondulado, lobulado, dentado (o aserrado), filamentoso y rizado. Superficie: puede ser lisa, rugosa, mate, brillante, transparente u opaca. Color: presencia de colores caractersticos y difusin de pigmentos en el medio. Capacidad de emulsin en agua: puede formar una suspensin uniforme, formar una suspensin grumosa o no se emulsiona.

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Aqu se muestran imgenes tomadas por una cmara de celular. En este laboratorio solo se tom en cuenta la forma, borde, elevacin y color, ya que son los parmetros ms importantes para una observacin macroscpica. Como se dijo anteriormente con una observacin macroscpica no se puede identificar al tipo de bacterias presentes, es por esto que ms adelante se hace una observacin microscpica. En la parte superior se muestran imgenes de los cultivos, en la que tuvimos uno mixto y dos puros, los cuales eran las muestras control. Mediante esta observacin pudimos determinar cuatro factores (forma, elevacin, borde y color). La figura 1, pertenece al cultivo mixto y por lo que pudimos observar con la ayuda de la lupa es que esta colonia es filamentosa, elevada y ondulada; la figura 2, igual pertenece al cultivo mixto y pudimos observar que es circular, convexa y ondulada; la figura 3, pertenece de la misma forma al cultivo mixto y vimos que es puntiforme, plana y ondulada; la figura 4 perteneciente al cultivo mixto es circular, elevada y entera; la figura 5 al igual que las anteriores pertenece al cultivo mixto y es rizoide, elevada y entera; la figura 6 es una de las muestras control (Gram negativo) la cual es circular, elevada y entera y por ltimo la figura 7 es la muestra control (Gram positivo) es circular, convexa y entera. Observacin microscpica. Tabla N3 Control (+) Control (-)

Muestra 1

Muestra 2

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Muestra 3

Muestra 4

Muestra 5

Elaboracin propia 2013

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Discusin Segn Salazar (2007), Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tien de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. Las bacterias Gram-negativas presentan una fina pared celular de peptidoglicano, mientras que las bacterias Gram-positivas presentan la pared de peptidoglicano es mucho ms gruesa. Al ser la pared fina, no retiene el colorante durante la tincin de Gram. Aqu se muestran imgenes de lo observado en los porta objetos, que fueron tomadas por una cmara digital. Primeramente el control (+) y (-), fueron los primeros en observarse en el microscopio, debido a que su funcin era ser un punto de referencia para poder distinguir las bacterias gram + y gram en las otras 5 muestras provenientes de un medio de cultivo mixto. Al observar el control (+) se observ una coloracin azul/violeta, lo cual nos comprueba que contienen una gruesa capa de peptidoglucano capaz de retener el colorante cristal violeta como tambin que la constitucin de su pared celular es diferente en comparacin con las bacterias gram (-) debido a que estas bacterias poseen una pared de peptidoglucado muy delgada, incapaz de retener el complejo formado por la combinacin de cristal violeta y lugol. De esta forma podemos estar seguros que el control (+), son bacterias gram positivas y el control (-) gram negativas. Una vez que se verifico que los controles positivo y negativo correspondan a las bacterias gram positivas y negativas, se pudo analizar con mayor certeza las 5 muestras. En la muestra N1 podemos ver que hay un alto grado de retencin de color azul/violeta, es decir que posee un pared celular gruesa, sus caractersticas coinciden con las del control (+) se puede concluir de que se trata de bacterias gram positivas, como tambin tienen forma de coco agrupndose en forma de diplococos, estafilococos y sarcinas principalmente, este creci en grupos similares a racimos de uvas. En la muestra N2 se observa un coloracin rosada tenue, es decir que hubo una escasa retencin de color, caracterstica de las bacterias gram (-) por su delgada capa de peptidoglucano, similar al control (-) como tambin se observ que las bacterias poseen forma de bacilos. La muestra N3 se puede observar que ocurri una tincin mixta por que que se puede distinguir bacterias gram positivas de color azul/violeta en forma de bacilos y las bacterias gram negativas de color rosado tenue en forma de bacilos, una de las razones por las que estas bacterias se encuentran en una misma muestra puede ser es resultado de provenir de un medio de cultivo mixto por lo cual hay una mezcla de bacterias gram (+) y (-). En la muestra N 4 se puede observar una coloracin azul/violeta caracterstica de las bacterias gram (+) y en forma de bacilos por ultimo esta la muestra N5 la cual tiene una coloracin rosado tenue que concuerda con el control de bacterias gram (-) y las bacterias tienen forma de cocos agrupados en forma de racimos o estafilococos.

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En el comienzo de la clase el docente nos proporcion la informacin de que los cultivos fueron hechos con las bacterias Escherichia coli y Staphylococcus aureus y que debamos identificarlos mediante la observacin microscpica como tambin consultar bibliogrficamente para poder comparar resultados. Segn Tortora (2007), la bacteria Escherichia coli es posiblemente unos de los microorganismos ms estudiados por el ser humado, es necesaria para el funcionamiento de nuestro aparato digestivo y se caracteriza por ser una bacteria gram (-) ya que no se tie de azul oscuro o violeta por la tincin de Gram. Tabla N3 Comparativa Tortora (2007) Control (-)

E. coli Tortora(2007)

E.coli Muestra N1

S.aureus

S.aureus

Como podemos ver las bacterias E.coli son gram (-) y la bacteria S.aureus es gram (+)

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VI.

Conclusin

Se logr observar los diferentes cultivos mixtos y puros (muestras control), de manera muy sencilla, ya que solo se utiliz una lupa para diferenciar y clasificar a las diferentes colonias, de acuerdo a sus caractersticas morfolgicas, elevacin, borde y color. Como resultado de la tincin de Gram, las bacterias gram positivas, correspondientes al estafilococo aureus quedaron teidas de violeta, mientras que las gram negativas, correspondientes a E. Coli aparecieron de color rojo. Este comportamiento diferente frente a la tincin de Gram obedeci a la diferente composicin de la pared celular de los dos grupos bacterianos. VII. Cuestionario

1. Explique detalladamente(a nivel de la pared celular) qu es lo que ocurre durante la tincin de Gram, para que las bacterias presenten diferente coloracin. Al poner el cristal violeta y luego el Lugol-Yodo sobre el portaobjeto con la muestra fijada, se forma dentro de cada clula un complejo cristal insoluble Violeta Yodo. Posteriormente al poner el alcohol acetona, en las Gram (+) se deshidrata su pared celular compuesta por varias capas de Peptidoglicano, formando una barrera y manteniendo el complejo cristal Violeta-Yodo en su interior, en cambio en las Gram () el alcohol acetona elimina su segunda bicapa lipdica compuesta por Lipopolisacaridos, permitiendo el escape del complejo cristal Violeta-Yodo. Luego se cubre el extendido con safranina y solo las Gram (-) se tien de color anaranjado a rojizo y no las Gram (+) debido a que estas ltimas tienen sus poros cerrados por el alcohol acetona y no permite el ingreso de este segundo colorante. Y de esta manera las Gram (+) quedan teidas de color violeta a azulado y las Gram () de un anaranjado a rojizo. (Cf. MADIGAN; MARTINKO; PARKER 2003:79 y PRESCOTT; HARLEY; KLEIN 2002:29) 2. Qu tipo de coloracin existe? Explique cules son y en qu se diferencian. Tincin simple: Se utiliza solo un colorante, pueden tener colorantes bsicos y cidos. o Tincin vital: Son aquellas que se efectan sobre clulas que estn vivas, mediante la introduccin de un colorante en la circulacin, estos colorantes pueden ser:

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Colorantes Bsicos: Azul de metileno, Fucsina bsica, Cristal violeta, Safranina. Verde malaquita. Colorantes cidos: Eosina. Rosa de bengala y Fucsina cida.

o Tincin no vital: Se realizan sobre clulas muertas. Lugol Tincin diferencial: Tincin de un colorantes para diferenciar tipos de bacterias, morfologa. o Tincin de Gram. o Tincin de cido-a1cochol resistencia (Ziehl-Neelsen). Tincin de estructuras especficas: Para teir estructuras bacterianas. o Tincin de esporas o Tincin negativa ( observacin de capsulas ) o Tincin de flagelos (Cf. PRESCOTT; HARLEY; KLEIN 2002:28-31 y COLLINS; LYNE 1989: Cap.6) 3. Nombre cientfico de 3 bacterias Gram(+) y 3 de Gram (-),que no sean los controles utilizados. Bacterias Gram (+) Listeria monocytogenes Corynebacterium diphtheriae Streptococcus pnwumoniae

Bacterias Gram (-) Neisseiria meningitidis Haemophilus influenzae Bordetella bronchiseptica (Cf. JOKLIK (et al.) 1997: 596,611,637,651,662,670) VIII. Bibliografia

Aquiahuatl M. Ramos M. Manual de Practicas del Laboratorio de Microbiologa General. Primera edicin. Editorial universidad autnoma metropolitana, unidad Iztapalapa 2004 Mexico. Pag 15.

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Collins, Christopher H.; LYNE, Patricia M. (1989). Mtodos microbiolgicos. Zaragoza. Acribia, S.A.} Garca F. Reporte de prctica: laboratorio de microbiologa, Practica 2 Tincion de Gram. 2010. Gerard J. Tortora,Berdell R. Funke,Christine L. Case. 2007. Introduccin a la Microbiologa. Editorial Mdica Panamericana. Buenos Aires. Argentina.Pag.69-71. Joklik, Wolfgang K. (et al.) (1997). Zinsser Microbiologa. Buenos Aires. Panamericana S.A. Madigan, Michael T.; MARTINKO, John M.; PARKER, Jack (2003). Biologa de los microorganismos. Madrid. Pearson Educacin.

Michael T. Jhon M. Jacko. Biologia de microorganismos. Decima Edicion. Editorial Pearson. Madrid, Espania. Pag 74, 81. Prescott, Lansing M.; HARLEY, John P.; KLEIN Donald A. (2002). Microbiologa. Madrid. McGraw-Hill Companies.

Salazar Wilson.2007. Guas de prctica de Laboratorio de Microbiologa. Departamento de publicaciones de la Facultad de Ciencias Mdicas, Quito Ecuador. Pag, 14.