Gentica bacteriana

Viso geral da construo de uma clula recombinante e alguns exemplos de sua aplicao
Genes pertencentes a uma determinada clula de um organismo podem ser inseridos e expressos em clulas de outro organismo. Clulas geneticamente modificadas podem ser utilizadas para produzir uma grande variedade de produtos teis.

Replicao do DNA

Replicao bidirecional de uma molcula circular de DNA bacteriano

Replicao bidirecional de uma molcula circular de DNA bacteriano

Bactrias: Onde encontramos genes????????? DNA Bacteriano, Plasmdios, DNA Fgico, Transposons Replicons

Variaes Temporrias (Sem alteraes no genoma) (Alteraes Fenotpicas) Morfolgicas

-Serratia marcescens: 37 C sem pigmento 25 C vermelhas, -Bacillus sphaericus: 2% peptona (clulas vegetativas) 0,1% peptona (esporos)

-Gram positivos: Culturas novas cels. azuis Cultura velhas cels. vermelhas,
- Azomonas x sacarose x cpsula

Fisiolgicas
- Produo de beta galactosidase quando tem lactose no meio (regulao gnica)

Variaes Permanentes Com alteraes no genoma) (Alteraes genotpicas)

Mutao e Recombinao Gentica

Plasmdeos

Fagos

Ilhas de patogenicidade

E. coli enterotoxignica-ETEC

E. coli comensal

E. coli uropatognica-UPEC

E. coli enteropatognica-EPEC

E. coli enteroinvasiva-EIEC e Shigella sp. E. coli enterohemorrgica -EHEC

Ahmed ety al. Nature Reviews Microbiology 6, 387-394 (May 2008)

A absoro de elementos genticos mveis (fagos, plasmdeos de virulncia, ilhas de patogenicidade), e perda de pores de DNAcromossmico em linhagens distintas de Escherichia coli, possibilitou surgimento de clones de diferentes patotipos de E. coli associados a sintomas de doenas especficas. LEE - locus of enterocyte effacement; PAIs - pathogenicity island; pEAF - enteropathogenic E. coli adhesion-factor plasmid; pENTenterotoxin-encoding plasmids; Stx - Shiga-toxin-encoding bacteriophage.

Variao permanente resultante de Mutao

tempo

minutos , horas, dias, meses

1. Populao de uma bactria em processo de multiplicao

2. Processo de crescimento e diviso produzem naturalmente clulas mutantes

5. Os mutantes continuam com o crescimento na presena do antimicrobiano e iniciam disperso pelo ambiente

Presso seletiva

4. Clulas so mortas ou impedidas de multiplicao pela antimicrobiano com exceo dos mutantes resistentes ao antimicrobiano especfico.

Clulas so expostas a um composto antimicrobiano

3. Populao continua multiplicao, e originando ocasionalmente, mais clulas mutantes

Variao permanente resultante de Mutao

Mutao cria variao

Mutao desfavorvel selecionada contra Ocorre reproduo e mutao

Com a mutao favorvel provvel que o mutante sobreviva... ....e se reproduza

Variao permanente resultante de Recombinao Gentica

1. Duas populaes bacterianas A e B crescem em um mesmo ambiente. A espcie B resistente a droga X.

2. Troca de DNA (elementos genticos mveis) ocorre entre clulas em baixa frequncia.

Presso seletiva
3. Clulas da espcie A recebem o gen de resistncia a droga X, presente no elemento gentico mvel da espcie B.

4. Na presena da droga X, as clulas da espcie A que receberam gen da resistncia da espcie B so capazes de multiplicar-se enquanto que as clulas originalmente sensveis no multiplicam-se.

Bactrias so expostas a droga X.

MUTAO Alterao brusca no material gentico Alterao hereditria em uma seqncia de bases do DNA Mutante
Natural (10-6 a 10-10 ) Adquirida ou Induzida (Agentes Fsicos e Qumicos)

Variao S (Smooth) R (Rough) em K. pneumoniae por mutao

Klebsiella pneumoniae (Aspecto mucide (molhado) de colnias)

Variao S R

Resistncia drogas antimicrobianas por mutao (Tipo Cromossmica)

Modelo de um passo (one step)

Bactria sensvel a estreptomicina (1 g)

Mutao

Resistente a 500 g

Modelo de vrios passos (multi step)

Bactria sensvel a Penicilina (1 g) Mutao Resistente a 10 g Mutao Resistente a 20 g Mutao Resistente a 50 g

Tipos de Resistncia Cromossmica

RECOMBINAO GENTICA: Doadora Receptora Molculas distintas de DNA so combinadas numa mesma molcula, graas a um processo fsico de quebra e ligao destas molculas

DNA externo = DNA Exogenoto Destinos possveis (? )

TRANSFORMAO (Griffith-1928) (Reverso Pneumoccica (RS) (Rough Smooth)

Incorporao de DNA solvel (Lise ou Liberao Espontnea)

(Plasmdeos so passveis de transferncia tambm)

Condies para ocorrer a transformao DNA homlogo, Dupla fita e PM elevado (105 a 107),

Meio sem DNAase Bactria Receptora em Estado de Competncia Fisiolgica

(DNA solvel, Qualquer momento, Determinado estgio do ciclo celular, Condies Especiais)

Transformao

CONJUGAO (Tatum e Lederberg - 1947 - E.coli)

Transferncia atravs de comunicao entre as duas bactrias ( Unidirecional)

Conjugao bacteriana

Pili (Gram negativa)

Ponte de conjugao (Gram positiva)

Conjugao de Gram negativa

Conjugao de Gram positiva

Doadora Receptora

Adaptado de Murray, B.E. (1998)

Enterococcus faecalis pheromone-responsive conjugative system. Pheromone A released from the potential recipient cell (right) interacts with plasmid A in the potential donor cell (left) to induce synthesis of aggregation substance. Attachment of aggregation substance to binding substance causes the cells to clump into visible aggregates. Once the pheromone-responsive plasmid A has transferred from donor to recipient cell, synthesis of pheromone A is shut off.

Processo mediado por Plasmdeos (Ex. Plasmdeo R=Resistncia drogas, F=Fertilidadede, Virulncia, Col, Metablico, Crptico, etc) Obs. DNA cromossmico tambm pode ser transferido durante a conjugao.

Plasmdeo R

Plasmdeo conjugativo

TRANSDUO ( Zinder e Lederberg - 1952)

Transferncia (DNA bacteriano e Plasmdios) ocorre por meio de um vrus (Bacterifago)

Um fago infecta a clula bacteriana doadora O DNA e protenas do fago so produzidos, e o DNA bacteriano quebrado em fragmentos. Ocasionalmente, durante a montagem do fago, fragmentos do DNA bacteriano so empacotados no capsdeo do fago. Ento a clula doadora lisada e as partculas de fago so liberados.

Um fago carreando o DNA bacteriano infecta a nova clula hospedeira, a clula receptora. A recombinao pode ocorrer, produzindo uma clula recombinante com um gentipo diferente da clula doadora e da clula receptora.

Ciclo Ltico (vrus virulento)

Ciclo Lisognico (vrus temperado)

Transposon Genes Saltadores, Elementos Mveis ou Jumping genes

Codificam Resistncia a Drogas, Sntese de Toxinas e Enzimas Degradantes.

Encontrados tanto em DNA cromossmico como em Plasmdios

Tem sequncia (de Insero) que codifica enzima Transposase (Transposio ) Interfere com sequncia linear do gene Mutao, Inativao ou Quebra;

Regulao da Expresso Gnica

Evitar sntese desnecessria de metablitos, desperdcio energtico, acmulo intracelular de metablitos txicos. Interao entre DNA e Protenas Reguladoras Regulam sntese de RNAm e Atividade de enzimas especficas
(Ex. Operon Lac em E.coli ( Operon Indutvel); Operon Trp de E. coli (Operon repressvel)

Operon Lac de E. coli (Operon indutvel)

Operon Lac de E. coli (Operon indutvel)

Operon Lac de E. coli (Operon indutvel)

Operon Trp de E. coli (Operon repressvel)

Operon Trp de E. coli (Operon repressvel)

Operon Trp de E. coli (Operon repressvel)

Resistncia bacteriana as drogas antimicrobianas

Variao permanente resultante de Mutao

tempo

minutos , horas, dias, meses

1. Populao de uma bactria em processo de multiplicao

2. Processo de crescimento e diviso produzem naturalmente clulas mutantes

5. Os mutantes continuam com o crescimento na presena do antimicrobiano e iniciam disperso pelo ambiente

Presso seletiva

4. Clulas so mortas ou impedidas de multiplicao pela antimicrobiano com exceo dos mutantes resistentes ao antimicrobiano especfico.

Clulas so expostas a um composto antimicrobiano

3. Populao continua multiplicao, e originando ocasionalmente, mais clulas mutantes

Variao permanente resultante de Recombinao Gentica

1. Duas populaes bacterianas A e B crescem em um mesmo ambiente. A espcie B resistente a droga X.

2. Troca de DNA (elementos genticos mveis) ocorre entre clulas em baixa frequncia.

Presso seletiva
3. Clulas da espcie A recebem o gen de resistncia a droga X, presente no elemento gentico mvel da espcie B.

4. Na presena da droga X, as clulas da espcie A que receberam gen da resistncia da espcie B so capazes de multiplicar-se enquanto que as clulas originalmente sensveis no multiplicam-se.

Bactrias so expostas a droga X.

Stios de ao de drogas antibacterianas

Azitromicina Claritromicina Estreptograminas (Quinopristina/ Dalfopristina)

Tigeciclina

Sntese de lipdeos
Platensimicina

Streptomyces platensis

DEFINIES
Resistente: aquela capaz de crescer in vitro em presena da concentrao mdia que a droga atinge no sangue do hospedeiro durante o tratamento, quando administrada por via oral Sensvel: Quando no cresce nestas condies

TIPOS DE RESISTNCIA
Natural: Todos os indivduos da espcie so resistentes
Ex. Ausncia do stio de ao (Drogas que atuam na parede; Macroldeos e ausncia de receptores nos ribossomos de Gram negativas)

Adquirida: Linhagens resistentes e sensveis na mesma espcie

Mecanismos genticos - Mutaes e Recombinao Gentica

Resistncia vantajosa s na presena da droga (no provoca inibio ou morte de possveis competidores da bactria resistente)

Natural ou intrnseca: Bactria est fora do espectro de ao da droga

EXEMPLOS: Penicilina G Bactrias Gram negativas Penicilinas Micoplasma Vancomicina Bactrias Gram negativas Aminoglicosdeos Bactrias anaerbias

Resistncia

Adquirida: Por mecanismos genticos diversos, surgem numa populao bacteriana amostras que no sofrem mais a ao da droga, que eficaz contra o resto da populao

Resistncia Cromossmica

(Mutao)

Resistncia Simples (uma nica droga)

possvel a transferncia desta resistncia

Tipos de Resistncia Cromossmica

Resistncia Extra-Cromossmica Plasmdeos Plasmdeo R (possuir o segmento FTR Plamdeo F)

Perda do fator de resistncia (Cura) (Repiques frequentes, uso de substncias qumicas)

Expresso Bioqumica da Resistncia

Mecanismos de ao
Drogas que inibem a sntese do DNA: Fluoroquinolonas.

Mecanismos de resistncia
Reduo na permeabilidade para a droga.

Drogas que inibem a RNA Polimerase: Rifampicina

Bomba de Efluxo

Parede bacteriana

Drogas que inibem a formao da parede bacteriana: Drogas que agem sobre Penicilinas, os ribossomos e sntese Cefalosporinas, protica: Manobactmicos, Aminoglicosdeos, Carbapenem, Tetraciclinas, Vancomicina, Macroldeos, Clindamicina, Cloranfenicol, Linezolida.

Modificao no stio de ao da droga. (PBP, DNA girase, ribossomos)

Drogas que agem sobre a membrana plasmatica alterando sua estrutura :Polimixinas, Daptomicina.

Alterao ou destruio da droga por enzimas (ex. -lactamase, fosfotransferases, adenilase, acetilase, acetiltransferase)

-lactamases do Grupo 1 (AmpC)

Testes de sensibilidade aos antimicrobianos

Kirby&Bauer

E Teste

Determinao de sensibilidade bacteriana aos antimicrobianos

Diagnstico microbiolgico
O diagnstico laboratorial das doenas infecciosas comea com a indicao clnica adequada do exame microbiolgico, o que requer conhecimento da epidemiologia e da fisiopatologia do processo infeccioso.

requer o conhecimento e a colaborao de vrios profissionais

A suspeita clnica do processo infeccioso determinar o tipo de amostra clnica que deve ser enviada ao laboratrio para confirmar, estabelecer ou complementar o diagnstico clnico A coleta e o transporte da amostra so etapas crticas na execuo do exame microbiolgico.

Antibiograma
(Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI),

Auxiliar o clnico com a escolha do antimicrobiano a prescrever para o paciente pois verifica se a bactria pesquisada sensvel ou resistente aos antimicrobianos testados.
Princpio da Diluio Princpio da Difuso

1.Mtodos baseados na diluio da droga

Diluio em caldo Concentrao Inibitria Mnima (CIM) e Concentrao Bactericida Mnima (CBM) Diluio em meio de cultura slido CIM

Macrodiluio em tubos (1 a 2 ml de meio)

Primeira a ser utilizada na avaliao da sensibilidade aos agentes antimicrobianos e envolve a preparao de diluies seriadas e logartmicas de antimicrobianos (por exemplo, 1, 2, 4 e 8 g/mL) em um meio de cultura lquido, o qual permitir o crescimento bacteriano.

Determinao da CIM pelo mtodo da diluio em caldo. A CIM no exemplo abaixo de 16g/ml.

Microdiluio em Placas de Elisa (100 a 200 l)

Apresentao de uma placa utilizada no teste de microdiluio, aps sua inoculao e incubao.

16

32

64

128

256

512

1024 g/mL

Controles positivos

2.Mtodos baseados na difuso da droga

Princpio do mtodo de Kirby - Bauer Parmetros a serem padronizados: meio de cultura, discos, inoculao do germe no meio, incubao das placas, leitura e interpretao

a.Controle de qualidade

Mtodo de Kirby-Bauer
Meio de Cultura (Mueller-Hinton Meio Padro)
Permite crescimento satisfatrio da maioria dos germes no fastidiosos; No interfere com a atividade da droga (Ex.: peptonas sulfas; Mg++ - gentamicina; Ca++, Fe++, Mg++ - tetraciclinas) So utilizadas placas de Petri (vidro ou plstico) com camada do meio de 6 mm de espessura

Inculo (Padronizado)
Preparo: Transferir para um tubo com BHI (Brain Heart Infusion) 5 colnias da bactria em estudo; incubar a 37oC; obter densidade equivalente ao padro de Mc Farland 0,5 (1,5 x 108 UFC/mL)

Obs. O padro 0,5 de Mc Farland o correspondente a turvao mostrada em soluo contendo 0,5 mL de BaCl2 a 1% em 99,5 mL de soluo de cido sulfrico a 1%)

0,5

1,0

2,0

3,0

Tubos da escala de McFarland posicionados em frente do carto de Wickerham.

Comparao da escala 0,5 de McFarland com suspenso bacteriana (E. coli ATCC 25922)

Semeadura: Swab estril; retirar excesso de caldo e semear na superfcie do meio uniformemente; secar em temperatura ambiente por 3 a 5 minutos. Importante: nmero de colnias utilizadas (vrias); material contaminado com flora normal (no usar colnias provenientes de meios de enriquecimento); variaes na densidade do inculo possibilitam variaes tambm no tamanho do halo de inibio

Discos
Aplicao: pressionar levemente contra a superfcie do meio e pelo menos 2 cm da borda da placa e a pelo menos 3 cm um do outro (evitar halos de inibio em fuso); usar apenas um disco de cada grupo de drogas (concentrao nica)

Caractersticas: papel de filtro adequado; concentrao de droga suficiente; prazo de validade; controle de eficincia

Incubao das Placas Em temperatura (37oC) e atmosfera adequada para o crescimento da bactria (aerobiose, anaerobiose, 10% de CO2) Atmosfera influi na atividade das drogas: tetraciclina, meticilina e novobiocina CO2; estreptomicina e canamicina anaerobiose

Leitura das Placas

Aps 18-24 horas de incubao; usar compasso ou rgua para determinar o dimetro do halo de inibio; colnias dentro do halo sugerem mutantes resistentes ou contaminantes.

Halo de leitura em mm

Interpretao

resistente, moderadamente resistente ou sensvel, de acordo com o halo de inibio; correlao inversa entre concentrao inibitria mnima e dimetro do halo de inibio.

Curva de regresso linear da correlao entre a CIM e o halo de inibio.

Kirby e Bauer Mtodo dos discos

Resistente Intermedirio Sensvel

CIM (g/mL)

Halo de inibio (mm)

Etest ( teste da elipse = Episilometer test)

rea de Crescimento bacteriano Fita graduada de material impermevel

Elipse de inibio

Concentrao Inibitria Mnima (CIM)

Apresentao do Etest para avaliao da CIM aps incubao