Universidad de Panam Facultad de Ciencias Naturales, Exactas y Tecnologa Escuela de Biologa Laboratorio de Bioqumica

Informe # 4 Mtodos para la determinacin de protena total.

Presentado a Profa. Concepcin Molina

Preparado por Dennis Gonzlez 8-864-1053 Ana I. Santana 8-878-2208

Fecha: 20/9/2013

Introduccin

Marco Terico Las protenas son macromolculas que estn compuestas de aminocidos. Estn constituidas bsicamente por carbono (C), hidrgeno (H), oxgeno (O) y nitrgeno (N); aunque pueden contener tambin azufre (S) y fsforo (P) y en menor proporcin, hierro (Fe), cobre (Cu), magnesio (Mg), yodo (I). Son imprescindibles para el organismo. Estas se utilizan con fines: Estructural (colgeno y queratina, Reguladora (insulina y hormona del crecimiento), Transportadora (hemoglobina), Inmunolgica (anticuerpos), Enzimtica (sacarasa y pepsina), Contrctil (actina y miosina), Homeosttica: colaboran en el mantenimiento del pH, Transduccin de seales (rodopsina) y Protectora o defensiva (trombina y fibringeno). El mtodo de Biuret, para la determinacin de protenas, es una de los ms simples en este tipo; es reproducible, pero requiere una alta concentracin de protenas para la formacin de color. La sensibilidad del mtodo es de 0,25- 200 mg de protenas por mL de solucin, se debe tener precaucin con la presencia de un exceso de lpidos en los blancos es mejor desecharlos. El reactivo de Biuret est formado por una disolucin de sulfato de cobre en medio alcalino, este reconoce el enlace peptdico de las protenas mediante la formacin de un complejo de coordinacin entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrgeno que forma parte de los enlaces peptdicos, lo que produce una coloracin rojo-violeta. En el presente laboratorio se utiliz el mtodo de Biuret para la determinacin de la concentracin de protenas en el hgado de pollo y de pescado. Mediante la medicin de su absorbancia se obtendr una curva de valoracin con la cual se nos har ms fcil hallar la concentracin de la muestra problema.

METODO DE BIURET.
Preparacin de la solucin de la clara de huevo. 1. 2. 3. 4. 5. 6. Pesar y luego cascar, con precaucin, un huevo de gallina. Separar la clara y descartar la yema. Pesar la clara. Tomar 3.0g de la clara con la ayuda de una esptula y diluir con H20. Agitar con una varilla de vidrio hasta obtener una mezcla homognea. Repartir entre dos tubos de centrifuga que, una vez equilibrados, se centrifugan a mxima velocidad durante unos 10 minutos. 7. Tras retirarlo, cuidadosamente obtener el sobrenadante. 8. Utilizar el sobrenadante como las muestras (M1, M2, M3 y M4) Vidrio reloj 57,96g Huevo 67,23g Vaso qumico 107,42g Vaso ms clara 151,05g Clara 43,63g Clara de huevo tomada 3,11g

PROCEDIMIENTO
TUBO M1 M2 M3 M4 CURVA DE CALIBRACION MUESTRA (ml) REACTIVO DE BIURET (ml) 0,30 3,00 0,40 3,00 0,50 3,00 0,70 3,00 H2O (ml) 1,70 1,60 1,50 1,30

Mezclar cada tubo. Incubar a 37C durante 10 minutos. Dejar enfriar y leer la absorbancia en a 540nm. Elaborar un grfico de absorbancia en funcin de la concentracin de BSA. Paralelamente desarrolle este procedimiento con la muestra de clara de huevo y determine la concentracin de protena en el mismo, utilizando la curva de calibracin. Expresar el % de protena en la clara de huevo.

Clculos.
Grafica #1

Curva de Calibracion
0.7 0.6 0.5 Absorbancia en nm 0.4 Curva de Calibracion 0.3 0.2 0.1 0 0 -0.1 2 4 6 8 10 12 Cantidad de BSA (mg) Linear (Curva de Calibracion) y = 0.0667x - 0.0305 R = 1

Grafica #2

Metodo de Biuret
0.45 0.4 Absorbancia A- 540nm 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 Cantidad de Proteina (ml) Metodo de Biuret Linear (Metodo de Biuret) y = 0.5734x + 0.0127 R = 0.9767

RELSULTADOS.

Prueba de absorbencia en el espectrofotmetro.