Estandarización Del Método de Cuantificación de Clotrimazol en Óvulos

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UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Y FARMACIA
ESTANDARIZACIN DEL MTODO UTILIZADO EN EL LABORATORIO NACIONAL DE SALUD PARA LA IDENTIFICACIN Y CUANTIFICACIN DE CLOTRIMAZOL EN VULOS SLIDOS POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA RESOLUCIN.
INFORME DE TESIS
Presentado por
Angela Teresa Samol Sayes
Para optar al ttulo de Qumica Farmacutica
Guatemala, Noviembre de 2007
INDICE
1. Resumen 2. Introduccin.. 3. Antecedentes 3.1 Clotrimazol 3.2 Metodologa Analtica. 3.3 Estndarizacin de mtodos. 3.4 Caractersticas de Desempeo Analtico. 4. Justificacin.. 5. Objetivos 6. Hiptesis 7. Materiales y Mtodos.. 8. Resultados 9. Discusin de Resultados 10. Conclusiones.. 11. Recomendaciones. 12. Referencias. 13. Anexos.
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JUNTA DIRECTIVA
Oscar Cbar Pinto, Ph.D.
Decano
Lic. Pablo Ernesto Oliva Soto
Secretario
Licda. Lillian Raquel Irving Antilln, M.A.
Vocal I
Licda. Liliana Vides de Urzar
Vocal II
Licda. Beatriz Eugenia Batres de Jimnez
Vocal III
Br. Mariesmeralda Arriaga Monterroso
Vocal IV
Br. Jos Juan Vega Prez
Vocal V
AGRADEDIMIENTOS
A Dios, por darme la oportunidad de realizar este sueo. A mis padres, Lic. Jos Angel Samol y Amrica de Samol, por guiarme en el camino de la vida y brindarme el apoyo necesario para culminar mis estudios. A mi esposo, Juan Manuel Castaeda, por animarme siempre a seguir adelante. A la Universidad de San Carlos de Guatemala, en especial a la Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia, por proveerme una preparacin cientfica de alta calidad. Al Lic. Julio Chinchilla, por su dedicacin y orientacin para el desarrollo de esta investigacin. Al Laboratorio Nacional de Salud, por la confianza que me brindaron al darme la oportunidad de realizar este trabajo de investigacin. Especialmente al Lic. Ismael Mancilla A la Unidad de Fisicoqumico de Medicamentos, por la oportunidad que me dieron para adquirir la experiencia necesaria para el desarrollo de esta investigacin. Especialmente a la Licda. Millie Cruz. A la Licda. Ilda Garca, gracias por el apoyo en la realizacin de este estudio. A la Licda. Doris Sols, por su colaboracin en la elaboracin de la parte experimental del estudio. A la Licda Julia Amparo Garca, por su apoyo, amistad y consejos brindados durante este tiempo.
DEDICATORIA
A Dios, por darme el regalo de la vida y la inteligencia para poder desarrollar mi carrera. A mis padres, Lic. Jos Angel Samol y Amrica de Samol, por el amor, amistad y apoyo que me han brindado durante toda mi vida. Muchas gracias por estar conmigo siempre. A mi esposo, Juan Manuel Castaeda, por brindarme su amor y apoyo en todo momento. A mis abuelitos, Agustin Samol, Teresa de Samol, Eligio Sayes y Clemencia de Sayes, por sus sabios consejos y el ejemplo que siempre me han brindado. A toda mi familia, gracias por su apoyo y amistad incondicional. A mis amigos, muchas gracias porque siempre me animaron en todo momento. Al rea de Fisicoqumico de Medicamentos, gracias por la amistad que hemos cultivado durante este tiempo. A la Iglesia Bautista La Verdad, por su apoyo y oraciones.
1. RESUMEN
En el presente estudio se realiz la estandarizacin del mtodo de Identificacin y Cuantificacin de Clotrimazol por Cromatografa Lquida de Alta Resolucin, en vulos Slidos utilizado en el Laboratorio Nacional de Salud (LNS), como una alternativa al anlisis de este principio activo, ya que al utilizar otros mtodos, se tiene que trabajar con condiciones extremas, las cuales pueden aumentar los costos o disminuir la vida til de la columna utilizada, o pueden alterar su fase estacionaria. Por estas razones se evaluaron las caractersticas de desempeo del mismo, incluyendo la Exactitud, Precisin (Repetibilidad y Precisin Intermedia), Especificidad, Linealidad del Sistema e Intervalo o rango. Por estar en un proceso de acreditacin bajo las Normas ISO/IEC 17025, el Laboratorio cumple con todos los requisitos de las Buenas Prcticas de Laboratorio. Se utilizaron las instalaciones del mismo y el equipo disponible en el rea de Fisicoqumico de Medicamentos que se utiliza para anlisis de muestras. Para llevar a cabo esta evaluacin se utilizaron estndares USP y muestras que se han recibido en el LNS, para su anlisis. Los resultados obtenidos en la estandarizacin del mtodo son satisfactorios, indican que el mtodo se desempea de manera efectiva y reproducible, cumple con los requisitos necesarios para su utilizacin y que los resultados obtenidos al utilizar este mtodo son confiables.
2. INTRODUCCIN
En el rea de Fisicoqumico de Medicamentos del Laboratorio Nacional de Salud (LNS) se realizan los anlisis de valoracin de principio activo que contienen las muestras recibidas, segn lo declarado por la boleta cualicuantitativa presentada en el expediente de Solicitud de Registro Sanitario de Referencia. Con estos datos, se determina, conforme a normas y reglamentos que aseguran la calidad, eficacia e inocuidad de los medicamentos, si estos productos pueden ser utilizados por la poblacin. Esta rea brinda soporte analtico a los programas de Registro Sanitario de Referencia, Contrato Abierto, Muestreo de Establecimientos Farmacuticos, Particulares y Medicamentos del Ministerio de Agricultura, Ganadera y Alimentacin (MAGA).
Por esta razn, el Laboratorio Nacional de Salud recibe una gran cantidad y variedad de muestras, y se deben utilizar metodologas que sean confiables, seguras y estandarizadas que permitan generar resultados verdicos para asegurar la calidad y competitividad Nacional e Internacional de los servicios prestados y al mismo tiempo brindar un mejor servicio a la comunidad. Para ello, se pretende acreditar el Laboratorio Nacional de Salud bajo las Normas COGUANOR ISO/IEC 17025 en el ao 2007, cumpliendo con los requisitos de las mismas.
El mtodo de determinacin de Clotrimazol utilizado en el LNS es una alternativa al anlisis descrito en las farmacopeas, ya que estos procesos utilizan condiciones que pueden alterar qumicamente la fase estacionaria de la columna de Cromatografa de Alta Resolucin (HPLC) y as disminuir su tiempo de vida til y requieren la utilizacin de diferentes reactivos, los cuales aumentan el costo del anlisis. El mismo puede ser utilizado cuando no se cuenta con algn reactivo de la metodologa enviada por el fabricante o por la especificada en la USP; siempre contando con la autorizacin del cliente para su utilizacin. Este ensayo es utilizado para todas las formas farmacuticas de este principio activo, pero en el presente estudio se estandariz el mtodo de
identificacin
y cuantificacin de Clotrimazol presente en vulos slidos,
debido a que es la forma farmacutica analizada con mayor frecuencia, segn revisin de expedientes realizada en el Laboratorio Nacional de Salud, y as asegurar que los resultados obtenidos en estos ensayos cumplen con las caractersticas necesarias para su utilizacin. Las caractersticas del desempeo del mtodo que se verificaron fueron: la Exactitud, Precisin (Repetibilidad y Precisin Intermedia), Especificidad, Linealidad del sistema e Intervalo o Rango. Los resultados fueron analizados con metodologa estadstica adecuada y con base en los criterios de aceptacin que se especifican en el estudio, el mtodo analizado cumple con los requisitos necesarios para el fin previsto y los resultados obtenidos por medio de este anlisis son confiables, y al mismo tiempo, agilizan el proceso de acreditacin del Laboratorio bajo las Normas ISO/IEC 17025.
3. ANTECEDENTES
De acuerdo a la revisin bibliogrfica efectuada, y a los datos obtenidos en el Laboratorio Nacional de Salud, hasta el momento no se han efectuado estudios de estandarizacin de mtodos para la identificacin y cuantificacin de Clotrimazol en vulos slidos en esta Institucin. De la misma manera, se realiz una revisin bibliogrfica en tesis llevadas a cabo tanto en la Universidad de San Carlos de Guatemala como en la Universidad del Valle de Guatemala, y se pudo encontrar algunas tesis relacionadas con Guas sobre validacin de metodologas analticas y validacin de metodologas analticas para diversos principios activos por Cromatografa Lquida de Alta Resolucin, pero ninguna es especfica para la estandarizacin del ensayo de Clotrimazol. Por otra parte, se encontr un estudio realizado en Managua, Nicaragua sobre Cuantificacin de derivados imidazlicos (Ketoconazol y Clotrimazol) con complejos de cobalto (II) en cremas, por espectrofotometra UV/VIS, en el cual se realiz la validacin de dicho mtodo. La Cromatografa Lquida de Alta Resolucin (HPLC) es un mtodo analtico ampliamente utilizado, ya que presenta ventajas sobre los mtodos tradicionales de anlisis. Entre estas estn: Los ensayos se pueden realizar en un tiempo muy corto, se pueden separar sustancias de mezclas complejas, mtodo de anlisis fcil y exacto y brinda errores relativos con un porcentaje muy bajo (1). Por todas las ventajas expuestas con anterioridad, el mtodo analtico por medio del HPLC es un ensayo utilizado ampliamente en el Laboratorio Nacional de Salud (LNS) para la identificacin y cuantificacin de principios activos presentes en las muestras recibidas.
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3.1 CLOTRIMAZOL
3.1.1 FARMACOLOGA El tratamiento de las infecciones micticas superficiales ocasionadas por dermatfitos puede efectuarse con antimicticos tpicos y con frmacos administrados por va oral (2, 3). Entre los antimicticos tpicos ms comunes estn los azoles. Los antimicticos azlicos incluyen dos clases generales que son los imidazoles y triazoles. Ambos comparten el mismo espectro y mecanismo de accin contra los hongos (2, 3). Los triazoles sistmicos se metabolizan con mayor lentitud y tienen menor efecto en la sntesis de esteroles en el ser humano, que los imidazoles. Por esta razn los agentes que se estudian en este momento pertenecen al grupo de los triazoles (2,3). Los agentes que actualmente se encuentran disponibles son: Imidazoles: Clotrimazol, Miconazol, Ketoconazol, Econazol, Butoconazol, Oxiconazol, Sulconazol Triazoles: Terconazol, Itraconazol y Fluconazol (2,3).
3.1.2. MECANISMO DE ACCIN El principal efecto de los Azoles a las concentraciones que se alcanzan durante el uso sistmico, es la inhibicin de la esterol 14-desmetilasa en los hongos, que es un sistema de enzimas que depende de citocromo p 450 microsomal (2,3). De ese modo estos frmacos entorpecen la biosntesis de ergosterol en la membrana citoplsmica y permiten la acumulacin de los 14- -metilesteroles (2,3).
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Estos
metilesteroles
pueden
alterar
la
disposicin
ntima
(empacamiento) de las cadenas acilo fosfolpidos y, con ello, alterar las funciones de algunos sistemas enzimticos de la membrana, como ATPasa y enzimas del sistema del transporte electrnico, y de este modo inhibir la proliferacin de los hongos (2). Algunos azoles como el clotrimazol, incrementan directamente la permeabilidad de la membrana citoplasmtica del hongo, pero las concentraciones necesarias para este fin quiz se obtengan solo con uso local (2). Los productos azlicos no tienen actividad antibacteriana o antiparasitaria til, con excepcin posible de los efectos antiprotozoicos contra Leishmania major (2). El Clotrimazol tiene la estructura qumica siguiente:
El Clotrimazol es un agente antimictico imidazlico que se utiliza para el tratamiento de infecciones causadas por varias especies patgenas de dermatfitos, levaduras y Malassezia furfur (2). Este frmaco esta indicado en las dermatofitosis, las candidiasis oral y vaginal y en las tias. Debido a que el frmaco no alcanza
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concentraciones en el tejido subcutneo, no esta indicado en ese tipo de micosis (2). El Clotrimazol se encuentra en una gran variedad de preparaciones incluyendo presentaciones para aplicacin tpica a la piel como crema, locin y solucin al 1%, y como crema vaginal al 1 2%, o tabletas vaginales (vulos slidos) de 100, 200 500 mg y trociscos de 10 mg. Tambin se encuentran combinaciones fijas de antimicticos y corticosteroides, que proporcionan una mejora sintomtica ms rpida que un antimictico solo, pero estas estn disponibles para aplicacin tpica (2,4,5). Los preparados para uso cutneo son eficaces en sujetos con tias del cuerpo, de los pies y la ingle, la versicolor y candidiasis cutnea. Esta presentacin no es idnea para aplicar en la boca, vagina u ojos (2,3). Los preparados ms convenientes para tratar la candidiasis vaginal son cremas, vulos y tabletas vaginales (vulos slidos). Se usan una vez al da, de preferencia a la hora de acostarse para facilitar la retencin (2). Los hongos han demostrado poca resistencia al Clotrimazol. La droga es activa contra una gran variedad de hongos, levaduras y dermatofitos incluyendo: Aspergillus fumigatus. Candida albicans. Cephalosporium. Cryptococcus. Epidermophyton floccosum. Microsporum canis. Malassezia furfur. Sporothrix.
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Trichophyton rubrum. T. mentagrophytes. El Clotrimazol no se administra para absorcin sistmica. Los trociscos por va oral se utilizan para las candidiasis orofarngeas y prcticamente no se absorbe. Las concentraciones que persisten en la saliva se deben a su unin a la mucosa oral (2). La absorcin del clotrimazol es menor de 0.5% despus de aplicarlo en la piel intacta; en la vagina es de 3 a 10%. Las concentraciones fungicidas en la vagina persisten por 3 das despus de su aplicacin (4). Las pequeas cantidades que se absorben por va sistmica son metabolizadas en el hgado y excretadas en la bilis (2). En adultos, inicialmente una dosis oral diaria de 200 mg genera cifras plasmticas de 0.2 a 0.35 ug/ml, seguidas por una declinacin progresiva (4, 5). En una pequea fraccin de los pacientes que reciben clotrimazol en la piel, puede experimentar una sensacin punzante, eritema, edema, vesculas, descamacin, prurito y urticaria (4, 5). Si se aplica el producto en la vagina, en promedio 1.6% de las mujeres que lo reciben manifestarn ardor leve y, en infrecuentes ocasiones, clicos en la mitad inferior del vientre, incremento moderado de la frecuencia de miccin o una erupcin cutnea (2). Por va oral, el clotrimazol origina irritacin gastrointestinal. En personas que consumen los trociscos, la incidencia del efecto adverso es de 5%, aproximadamente (2, 4, 5).
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En piel, se hacen las aplicaciones dos veces al da. En vagina, los regmenes habituales incluyen colocacin de una tableta de 100 mg una vez al da a la hora de acostarse, durante siete das; una tableta de 200 mg/da durante tres das, una tableta de 500 mg aplicada una sola vez o 5 g de crema una vez al da, durante 3 das (crema al 2%) o siete das (crema al 1%) (2,4,5). En mujeres no embarazadas, cabe utilizar una vez al da dos tabletas de 100 mg, por tres das. Los trociscos deben disolverse lentamente en la boca cinco veces al da, durante 14 das (2, 4, 5). Segn algunos hallazgos, el clotrimazol cura las dermatofitosis en 60 a 100% de los casos. Las tasas de curacin de candidiasis cutnea son de 80 a 100%. En la candidiasis vulvovaginal, dicha tasa casi siempre es mayor de 80% cuando se utiliza el rgimen de siete das. Se logran efectos semejantes con un rgimen de 200 mg una vez al da, durante tres das y tambin un rgimen de una sola dosis (500 mg). Las recidivas son frecuentes despus de todos los regmenes. La tasa de curacin con trociscos disueltos en la boca en la candidiasis oral y farngea puede llegar a 100% en el husped inmunocompetente (2). Este tipo de medicamentos es comercializado por diferentes casas farmacuticas, las cuales para poder obtener un registro sanitario, llevan sus medicamentos para anlisis al Laboratorio Nacional de Salud, que es el laboratorio de referencia para realizar este trmite.
3.2
METODOLOGA ANALTICA Para el anlisis de Clotrimazol se cuenta con diferentes metodologas descritas en las diferentes Farmacopeas utilizadas como referencia para ensayos analticos, entre estas La Farmacopea de Estados Unidos y la Farmacopea Britnica (6, 7). Por otra parte, en el Laboratorio Nacional de
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Salud se recibe informacin adicional sobre otras metodologas de anlisis que se han investigado. Entre estas se encuentra la metodologa utilizada actualmente en esta institucin. Esta se basa en la identificacin y cuantificacin de Clotrimazol por solubilidad y extraccin del principio activo utilizando un equipo de Cromatografa Lquida de Alta Resolucin con detector ultravioleta visible. Utilizando como fase mvil una mezcla de Buffer de fosfato de Amonio: Metanol y como solvente metanol (8).
3.3 ESTANDARIZACIN DE MTODOS Para el cumplimiento de las buenas prcticas de laboratorio, la estandarizacin es un requisito establecido por entidades regulatorias y por comisiones de Farmacopeas para el registro de nuevos medicamentos y para el anlisis de medicamentos (6, 9, 10, 11). Para la evaluacin de un medicamento es necesaria la utilizacin de un mtodo analtico que permita cuantificar el producto mayoritario como ingrediente activo de una formulacin. Para asegurar la confiabilidad, los mtodos analticos se someten a un proceso de estandarizacin, el cual comprueba si el mtodo es lo suficientemente confiable y si los resultados previstos se obtienen dentro de las condiciones prefijadas (6). La estandarizacin de los mtodos es la confirmacin, a travs del examen y el aporte de evidencia objetiva, de que se cumplen los requisitos particulares para un uso especfico previsto. Es una verificacin documentada que proporciona un alto grado de confianza de que el sistema integral o proceso funciona de la manera prevista en el ambiente de operacin normal o producir en forma consistente un resultado que cumpla con sus especificaciones predefinidas (10, 12).
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Es el proceso que establece, mediante estudios de laboratorio, que las caractersticas de desempeo del mtodo cumplen los requisitos para las aplicaciones analticas previstas. Las caractersticas de desempeo analtico habituales que deben ser evaluadas en la estandarizacin de mtodos son los siguientes: Exactitud Precisin Especificidad Lmite de Deteccin. Lmite de Cuantificacin Linealidad Intervalo o Rango (6) Los procedimientos para la determinacin de productos farmacuticos varan en gran manera, por lo que diferentes mtodos de prueba requieren diferentes esquemas de estandarizacin, los cuales se pueden agrupar en cuatro categoras: Categora I: Mtodos analticos para la cuantificacin de los componentes principales de frmacos a granel o ingredientes activos (incluyendo conservantes) en productos farmacuticos terminados. Categora II: Mtodos analticos para la determinacin de impurezas en frmacos a granel o productos de degradacin en productos farmacuticos terminados. Estos mtodos incluyen anlisis cuantitativos y pruebas de lmite. Categora III: Mtodos analticos para la determinacin de las caractersticas de desempeo (por ejemplo, disolucin, liberacin del frmaco). Categora IV: Pruebas de identificacin. (6)
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Para cada categora de anlisis se requiere diferente informacin analtica y los datos que se requieren para cada una de las categoras de anlisis se indican en la siguiente tabla (6, 11):
Tabla No. 1. Datos requeridos para la estandarizacin de un mtodo analtico. Categora I + + + * + + Categora II Cuantitativo + + + + + + + Prueba de lmite * + + * Categora III * + + * * * * * Categora IV * -
Caracterstica Exactitud Precisin Repetibilidad Precisin intermedia Especificidad Lmite de deteccin Lmite de cuantificacin Linealidad Rango
* Puede requerirse segn la naturaleza de la prueba.
En base a esta clasificacin, el tipo de estandarizacin a realizarse en el presente trabajo se incluye en la categora I, que requiere el anlisis de los siguientes parmetros para metodologas por HPLC (6): Exactitud Precisin: Repetibilidad y Precisin intermedia. Especificidad Linealidad del sistema Intervalo o Rango No se debe evaluar el lmite de deteccin y lmite de cuantificacin en el presente estudio, debido a la concentracin de principio activo que se utiliza en el anlisis. sta es bastante alta, por lo que no requiere la determinacin de estos parmetros.
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La documentacin de los estudios de estandarizacin constituye un requisito bsico para determinar si un mtodo es adecuado para sus aplicaciones previstas (6).
3.4 CARACTERSTICAS DE DESEMPEO ANALTICO 3.4.1 EXACTITUD Definicin: La exactitud de un mtodo analtico es la proximidad La exactitud de un entre los resultados de la prueba obtenidos mediante ese mtodo (valor experimental), y el valor verdadero. mtodo analtico debe establecerse en todo su intervalo (6, 12). Determinacin: En la valoracin de un frmaco, la exactitud puede ser determinada mediante la aplicacin del mtodo analtico con respecto a un analito de pureza conocida (por ejemplo, un Estndar de Referencia) o por comparacin de los resultados del mtodo con los resultados de un segundo mtodo bien caracterizado cuya exactitud se haya comprobado o definido (6). La exactitud se calcula como el porcentaje de recuperacin de la cantidad valorada con respecto a la cantidad conocida de analito aadida a la muestra, o como la diferencia entre la media de la valoracin y el valor verdadero aceptado, considerando los intervalos de confianza (6). Los documentos ICH (International Conference Harmonization) recomiendan que la exactitud sea evaluada utilizando un mnimo de nueve determinaciones sobre un mnimo de tres niveles de concentracin, cubriendo el intervalo especificado (es decir, tres concentraciones y tres determinaciones repetidas de cada concentracin) (6).
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Cuando no es posible contar con un placebo, se determina por duplicado el contenido promedio del analito en la muestra con el mtodo a evaluar; una vez conocido el contenido promedio se procede a enriquecer las muestras con estndar para preparar las soluciones, en este caso se mantiene constante la cantidad de muestra tomada y se agregan cantidades variables del estndar. Tambin se puede trabajar utilizando un mnimo de tres concentraciones de soluciones estndar que cubran el rango de trabajo y se evala el porcentaje de recuperacin obtenido utilizando el mtodo a evaluar (13). Se preparan muestras a tres niveles de concentracin diferentes, preparando las muestras independientes por triplicado a cada nivel de concentracin. Para llevar a cabo el clculo del porcentaje de recuperacin, se requiere contar con los datos de la cantidad de principio activo agregado a cada muestra (13).
3.4.2. PRECISIN: Definicin: La precisin de un mtodo analtico expresa la cercana de coincidencia entre una serie de mediciones obtenidas de mltiples muestreos cuando se aplica el mtodo repetidamente a una muestra homognea. Puede considerarse a 3 niveles: Reproducibilidad, Repetibilidad y precisin intermedia (13). La precisin de un mtodo analtico habitualmente se expresa como la desviacin estndar o la desviacin estndar relativa (coeficiente de variacin) de una serie de mediciones. La precisin puede ser una medida del grado de reproducibilidad o repetibilidad del mtodo analtico en condiciones normales de operacin.
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3.4.2.1 REPRODUCIBILIDAD Expresa la precisin de los resultados de ensayos realizados sobre la misma muestra homognea, pero ejecutados bajo diferentes condiciones, analistas, laboratorios, reactivos, das, proveedores, equipo, etc., como por ejemplo en un estudio en colaboracin (6, 12). Se expresa con los mismos parmetros matemticos que la repetibilidad. El coeficiente de variacin en el estudio de la reproducibilidad debe ser igual o mayor que el obtenido en el estudio de repetibilidad para la misma cantidad o concentracin debido a la mayor fuente de error que existe en la reproducibilidad. Esta se realiza como resultado de estudios interlaboratoriales diseados para estandarizar la metodologa (14). En el presente estudio no se evaluar la
reproducibilidad.
3.4.2.2 PRECISIN INTERMEDIA La precisin intermedia expresa la variacin obtenida dentro de un laboratorio, por ejemplo en diferentes das, con diferentes analistas o con equipo diferente de una muestra homognea dentro del mismo laboratorio (6, 14).
3.4.2.3 REPETIBILIDAD Precisin obtenida en la utilizacin de un procedimiento analtico en un laboratorio bajo las mismas condiciones de operacin en un intervalo corto de tiempo (mismo da), por
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un mismo analista, en la misma muestra homognea y en el mismo equipo (6, 14). Este parmetro permite evaluar la incertidumbre en la estimacin de la media, es decir, el error aleatorio que se corresponde con la dispersin de los datos alrededor de la media. En la mayora de los casos, la repetibilidad es el criterio de mayor inters en los procedimientos analticos (6). Determinacin: La precisin de un mtodo analtico se determina mediante el anlisis de un nmero suficiente de alcuotas de una muestra homognea que permita calcular estadsticamente estimaciones vlidas de la desviacin estndar o de la desviacin estndar relativa (coeficiente de variacin). Los anlisis en este contexto son anlisis independientes de muestras que se han llevado a cabo mediante el procedimiento analtico completo, desde la preparacin de la muestra hasta el resultado final de las pruebas (6). Los documentos ICH recomiendan que se evale la repetibilidad utilizando un mnimo de nueve determinaciones que cubran el intervalo especificado para el procedimiento (es decir, tres concentraciones y tres determinaciones repetidas de cada concentracin), o un mnimo de seis determinaciones al 100% de la concentracin de prueba (6).
3.4.3. ESPECIFICIDAD/SELECTIVIDAD Definicin: Los documentos de la ICH definen la especificidad como la capacidad de evaluar de manera inequvoca el analito en
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aquellos componentes cuya presencia resulta previsible, como impurezas, productos de degradacin y componentes de la matriz. La falta de especificidad de un procedimiento analtico individual puede ser compensada al utilizar otros procedimientos analticos complementarios. Para los ensayos de prueba o valoracin, la definicin anterior tiene las siguientes implicaciones (6): Ensayos de identificacin: Garantiza la identidad del analito. Valoraciones: Proporcionan un resultado que permita una determinacin exacta del contenido o potencia del analito en una muestra. Selectividad: Es la capacidad que tiene un mtodo analtico de distinguir o separar la respuesta de la sustancia de inters del resto de los componentes de una muestra. Es aplicable a mtodos en los que dos o ms componentes son separados y cuantificados en una matriz compleja (12). Debido a que las muestras a analizar en el presente trabajo solamente contienen un principio activo, se determinar la especificidad del mtodo. Es importante tomar en cuenta, que en aquellos casos en que la matriz de la muestra es variable, tanto en trminos de su composicin, como en la fuente de las materias primas que las componen (diferentes proveedores, diferentes orgenes), se recomienda que la especificidad se establezca para las diferentes composiciones o fuentes en forma independiente. Determinacin: Esta capacidad debera confirmarse mediante la obtencin de resultados positivos a partir de muestras que
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contengan el analito (o mediante comparacin con un material de referencia conocido), junto con resultados negativos de muestras que no contengan dicho analito, y mediante la confirmacin de que no se obtiene una respuesta positiva de materiales con estructura similar estrechamente relacionada a la del analito (6). En una valoracin, la demostracin de especificidad requiere evidencia de que el procedimiento no resulta afectado por la presencia de impurezas o excipientes. En la prctica, esto puede hacerse agregando al frmaco o producto farmacutico una cantidad conocida de excipientes o de impurezas en concentraciones adecuadas, y demostrando que el resultado del anlisis no resulta afectado por la presencia de estos materiales extraos (6). Si no se dispone de estndares de impureza o de los productos de degradacin, puede demostrarse la especificidad comparando los resultados de las pruebas de muestras que contengan impurezas o productos de degradacin con los de un segundo procedimiento bien caracterizado (por ejemplo, un procedimiento farmacopeico u otro procedimiento validado). Estas comparaciones deberan incluir muestras sometidas a condiciones forzadas relevantes (por ejemplo, luz, calor, humedad, hidrlisis cida y alcalina, oxidacin). En una valoracin, deben compararse los resultados (6). Los documentos de ICH afirman que cuando se utilizan los procedimientos cromatogrficos, debern presentarse cromatogramas representativos para demostrar el grado de selectividad y los picos debern identificarse adecuadamente. (6).
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3.4.4. LINEALIDAD O INTERVALO Definicin de Linealidad: La linealidad de un mtodo analtico es su capacidad para obtener resultados de prueba que sean proporcionales ya sea directamente, o por medio de una transformacin matemtica bien definida, a la concentracin de analito en muestras en un intervalo dado (6). Definicin de Intervalo: El intervalo de un mtodo analtico es la amplitud entre las concentraciones inferior y superior de analito (incluyendo esos niveles) en la cual se puede determinar al analito con un nivel adecuado de precisin, exactitud y linealidad utilizando el mtodo segn se describe por escrito. El intervalo se expresa normalmente en las mismas unidades que los resultados de la prueba (por ejemplo, porcentaje, partes por milln) obtenidos mediante el mtodo analtico (6). Determinacin de Linealidad e Intervalo: La linealidad debe establecerse en el intervalo completo del procedimiento analtico. Debera establecerse inicialmente mediante examen visual de un grfico de seales como funcin de concentracin de analito del contenido. S parece existir una relacin lineal, los resultados de la prueba deberan establecerse mediante mtodos estadsticos adecuados (por ejemplo, mediante el clculo de una lnea de regresin por el mtodo de los cuadrados mnimos). En algunos casos, para obtener la linealidad entre la respuesta de un analito y su concentracin, puede que haya que someter los datos de la prueba a una transformacin matemtica. Los datos obtenidos a partir de la lnea de regresin pueden ser tiles para proporcionar estimaciones matemticas del grado de linealidad.
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Se debern presentar: el coeficiente de correlacin (r), la interseccin con el eje de ordenadas (b), la pendiente de la lnea de regresin (m) y la suma de los cuadrados residuales (r2) (6). El intervalo del mtodo se evala verificando que el mtodo analtico proporciona precisin, exactitud y linealidad aceptables cuando se aplica a muestras que contienen el analito en los extremos del intervalo, al igual que dentro del intervalo (6). La ICH recomienda que, para establecer la linealidad se utilicen normalmente un mnimo de cinco concentraciones. que se indican a continuacin (6): Valoracin de un Frmaco (o producto terminado): De 80% a 120% de la concentracin de prueba. El intervalo de determinacin puede variar, pero debe incluir los porcentajes mencionados anteriormente. Por ejemplo, 50% a 150% de la concentracin de prueba. La evaluacin de la linealidad y el clculo del rango de aplicacin son de utilidad para establecer una estrategia de calibracin, es decir, para determinar: Con qu frecuencia se necesita preparar una nueva curva de calibracin durante la aplicacin rutinaria del mtodo analtico. Cuntos niveles de calibracin se requiere. El nmero de repeticiones necesarias en cada nivel de concentracin. Al efectuar un nmero grande de determinaciones a lo largo del rango de aplicacin se consigue una medida de la precisin a estas Tambin recomienda que se consideren los intervalos especificados mnimos
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diferentes concentraciones, as como tambin informacin adicional acerca de la linealidad de la curva.
3.4.6. APTITUD DEL SISTEMA Si las mediciones son susceptibles a variaciones en condiciones analticas, stas deben controlarse adecuadamente o incluirse en el mtodo una declaracin preventiva. Una consecuencia de la evaluacin de la tolerancia del mtodo sera el establecimiento de una serie de parmetros de aptitud del sistema que garantizan que se mantenga la funcionalidad del mtodo analtico siempre que se utilice (6). El laboratorio debe estandarizar los mtodos no normalizados, los mtodos que disea o desarrolla, los mtodos normalizados empleados fuera del alcance previsto, as como las ampliaciones y modificaciones de los mtodos normalizados, para confirmar que los mtodos son aptos para el uso previsto. La estandarizacin debe ser tan amplia como sea necesario para satisfacer las necesidades de la aplicacin o del campo de aplicacin dado. El laboratorio debe registrar los resultados obtenidos, el procedimiento utilizado para la estandarizacin y una declaracin acerca de si el mtodo es apto para el uso previsto (10). Las tcnicas usadas para la determinacin del desempeo de un mtodo deberan ser una, o una combinacin, de las siguientes: La calibracin utilizando patrones de referencia o materiales de referencia; La comparacin con resultados obtenidos por otros mtodos; Las comparaciones interlaboratorios; La evaluacin sistemtica de los factores que influyen en el resultado;
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La evaluacin de la incertidumbre de los resultados basada en el conocimiento cientfico de los principios tericos del mtodo y en la experiencia prctica (10).
Cuando se introduzca algn cambio en los mtodos no normalizados estandarizados, la influencia de tales cambios debera ser documentada y, cuando sea apropiado, se debe realizar una nueva estandarizacin (10). El rango y la exactitud de los valores que se pueden obtener empleando mtodos estandarizados (por ejemplo, la incertidumbre de los resultados, la selectividad del mtodo, la linealidad, el lmite de repetibilidad o de reproducibilidad, la robustez ante influencias externas o la sensibilidad cruzada frente a las interferencias provenientes de la matriz de la muestra o del objeto a ensayar) tal como fueron determinados para el uso previsto, deben ser pertinentes a las necesidades de los clientes (10). La estandarizacin incluye la especificacin de los requisitos, la determinacin de las caractersticas (los parmetros de desempeo) de los mtodos y una verificacin de que los requisitos pueden ser cumplidos al utilizar el mtodo (10). A medida que se desarrolla el mtodo, se deberan realizar revisiones peridicas para verificar que las necesidades del cliente siguen siendo cumplidas. (10). La estandarizacin es siempre un equilibrio entre los costos, los riesgos y las posibilidades tcnicas. Existen muchos casos en los que el rango y la incertidumbre de los valores (por ejemplo, la exactitud, el lmite de deteccin, la selectividad, la linealidad, la repetibilidad, la reproducibilidad, la robustez y la sensibilidad cruzada) slo pueden ser dados en forma simplificada debido a la falta de informacin (10). Cualquier cambio en los requisitos que requiera modificaciones en el plan de desarrollo debera ser aprobado y autorizado
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Algunas de las ventajas de un estudio de estandarizacin son las siguientes: Tiene menor costo prevenir que corregir. Se cumplen con los requerimientos legales, ISO 17025 Evaluacin y optimizacin de las caractersticas de desempeo del mtodo y del sistema. Obtencin de datos que sirvan como base para la comparacin a largo plazo de la calidad analtica de los resultados Identificacin de la experiencia y necesidades de capacitacin del personal. Identificacin de reactivos qumicos e instrumentos requeridos. Eficiente operacin del mtodo cuando es adoptado. Evita perjudicar el prestigio, imagen y prdida de credibilidad del laboratorio por una mala aplicacin del mtodo. Diseo de una estrategia de control de calidad.
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4. JUSTIFICACIN Para asegurar la calidad de los productos farmacuticos, es necesario estandarizar los procedimientos de anlisis, ya que de ellos depende la aprobacin o rechazo de un producto. Especialmente en el caso del Laboratorio Nacional de Salud que recibe las muestras de medicamentos para su comercializacin en el pas y de los resultados que se obtienen en estos anlisis depende la autorizacin del Registro Sanitario respectivo. Debido a esto, el Laboratorio Nacional de Salud debe contar con mtodos de anlisis que sean confiables, por lo que se debe utilizar el mtodo enviado por la casa fabricante, el especificado por la USP o un mtodo de anlisis estandarizado en el Laboratorio Nacional de Salud, el cual debe cumplir con las caractersticas de desempeo necesarias para su aplicacin. Entre estos procesos se encuentra el mtodo de determinacin y cuantificacin de Clotrimazol en sus diferentes formas farmacuticas utilizado en el rea de Fisicoqumico de Medicamentos del Laboratorio Nacional de Salud. Dicho mtodo es una alternativa a los ensayos propuestos en la Farmacopea Britnica y en la Farmacopea de Estados Unidos, ya que al utilizar este procedimiento, se deben utilizar condiciones extremas, que puede alterar qumicamente la fase estacionaria de la columna de Cromatografa de Alta Resolucin (HPLC) y as disminuir su tiempo de vida til; o requieren de otro tipo de preparaciones, las cuales aumentan el costo del anlisis. Este ensayo es utilizado para todas las formas farmacuticas de este principio activo, pero en el presente estudio se estandariz el mtodo de identificacin y cuantificacin de Clotrimazol en vulos slidos, debido a que es la forma farmacutica ms analizada de este principio activo en el Laboratorio Nacional de Salud, segn revisin de registros en esta Institucin, para as asegurar que los resultados obtenidos en estos procedimientos son confiables y seguros.
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5. OBJETIVOS
5.1 Objetivo General: Demostrar a travs de la estandarizacin, que el Mtodo Analtico de Identificacin y Cuantificacin de Clotrimazol por Cromatografa Lquida de Alta Resolucin, en vulos Slidos, utilizado en el Laboratorio Nacional de Salud se desempea de manera efectiva y reproducible, cumpliendo con los requerimientos y especificaciones establecidas en el estudio.
5.2 Objetivos Especficos: 5.2.1. Determinar la Exactitud, Precisin, Especificidad, Linealidad e Intervalo del mtodo de identificacin y cuantificacin de Clotrimazol en vulos Slidos, por Cromatografa Lquida de Alta Resolucin, utilizado en el Laboratorio Nacional de Salud. 5.2.2. Determinar si los resultados obtenidos por este mtodo son confiables para su utilizacin en el Laboratorio Nacional de Salud. 5.2.3. Determinar la variacin de la respuesta del mtodo dentro del mismo laboratorio, evaluando las muestras en diferentes das, equipos y analistas durante el ensayo.
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6. HIPTESIS
El mtodo de Identificacin y Cuantificacin de Clotrimazol en vulos slidos por cromatografa lquida de alta resolucin, utilizado en el Laboratorio Nacional de Salud, brinda resultados confiables para su uso en el anlisis de Muestras de medicamentos que contienen este principio activo.
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7. MATERIALES Y MTODOS
7.1. Universo o poblacin y Muestra: Muestras de Clotrimazol en vulos slidos. Muestras que se reciben en el Laboratorio Nacional de Salud para su anlisis.
7.2. Medios: 7.2.1 Recursos Humanos: Autora: Angela Teresa Samol Sayes Asesor: Licda. Julia Amparo Garca Bolaos Co-Asesor: Licda Millie Cruz Revisor: Lic. Julio Chinchilla Personal profesional y tcnico del Laboratorio Nacional de Salud
7.2.2
Recursos Materiales: 7.2.2.1 Aparatos: Cromatgrafo Lquido de Alta Resolucin Merck Hitachi Lachrom Clsico Bao Ultrasnico (desgasificador) Sistema para filtrar tanto muestra como solventes. Estufa con agitador Potencimetro Columna de 3.9 mm x 15 cm rellena con material L1 (octadecilsilano). Balanza analtica Computadora Magnetos Filtro de 0.5 micrmetros
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7.2.2.2 Reactivos Estndar de Clotrimazol USP Metanol grado HPLC Fosfato de amonio dibsico cido fosfrico Agua desmineralizada purificada para uso HPLC
7.2.2.3 Cristalera Balones aforados de 1000 mL Balones aforados de 100 mL Pipetas volumtricas de 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4 mL, y 5 mL, 6 mL. Varilla de vidrio Embudos Probeta de 50 mL Probeta de 100 mL Beaker de 250 mL Viales Micropipeta Mortero y pistilo
Limpieza de cristalera: Lavar con detergente para cristalera sin fosfatos y enjuagar al menos 10 veces con agua del tubo y una vez con agua destilada.
7.3
Mtodos: Mtodo de Determinacin de Clotrimazol 7.3.1 Fase Mvil: Buffer de fosfatos de amonio: metanol (30:70), pH = 7.0 con cido fosfrico.
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Buffer de fosfatos:
Pesar 6.60 gramos de fosfato de amonio
dibsico y disolverlo en 1000 mL de agua. 7.3.2 Preparacin del estndar: Pesar exactamente cerca de 20.0 mg de estndar de Clotrimazol USP a un baln de 25 mL. Aadir 25 mL de metanol y disolver con ayuda de un bao ultrasnico. Llevar a volumen con el mismo solvente.
7.3.3 Preparacin de la muestra: Pesar 10 vulos slidos y determinar el peso promedio de cada vulo. Determinar el peso promedio. Luego triturar los vulos y pesar el polvo equivalente a 20 mg de clotrimazol de la muestra en un baln de 25 mL. Agregar aproximadamente 10 mL de metanol y disolver con calor y agitacin constante. Enfriar y llevar a volumen con el mismo solvente. Leer las muestras y el estndar en un Cromatgrafo Lquido de Alta Resolucin.
7.3.4 Sistema Cromatogrfico Columna: C18 corta. Longitud de onda: 254 nm Flujo: 2.0 mL/min Loop: 100 L Inyeccin: 50 L Fase Mvil: Buffer de fosfatos de amonio: metanol (30:70).
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7.3.5 Criterios de Aceptacin: Los vulos slidos de Clotrimazol contienen no menos de 90.0 por ciento y no ms de 110.0 por ciento de la cantidad de Clotrimazol declarada en la etiqueta.
7.4. PARMETROS EVALUADOS: Exactitud Precisin o Repetibilidad o Precisin intermedia. Especificidad Linealidad del sistema Intervalo o Rango
7.5 PROCEDIMIENTO, DISEO Y ANLISIS
7.5.1. ADECUACIN DEL SISTEMA: Primero se realiz la adecuacin del sistema (system suitability), que est diseado para determinar la efectividad de la operacin del sistema analtico y del equipo con el mtodo, antes de ser utilizado (12). Dejar estabilizando el equipo con todas las funciones y parmetros indicados del mtodo, luego que ya se tiene una lnea base bien estable, se procede con las inyecciones del estndar de referencia del mtodo (12). Se inicia con las 6 inyecciones del estndar al 100%, ya inyectados los estndares, se analizan los resultados con los siguientes clculos (12):
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Media aritmtica: Es el valor calculado de la suma de los datos dividida entre el nmero de datos analizados (15).
X =
Xi
n
Desviacin estndar: Describe matemticamente el esparcimiento de la medicin, en un conjunto determinado de datos (15).
S=
r
n
Coeficiente de variacin: Es el cociente entre la desviacin estndar y la media de la distribucin. desviacin estndar relativa (15). Es lo mismo que
C.V . =
S
_
*100
Con estos valores se determina si tanto el equipo como la metodologa estn respondiendo bajo los rangos que se especifican a continuacin.
Criterio de Aceptacin: El Coeficiente de Variacin tiene que ser menor del 3 % (12).
7.5.2. ESPECIFICIDAD: Debido a que en el Laboratorio Nacional de Salud se analizan muestras de diferentes casas farmacuticas que utilizan diversos excipientes, se evalu la especificidad para alguna de estas muestras, para determinar si los excipientes no interfieren en la determinacin del principio activo.
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Se prepara una solucin estndar del analito a la concentracin esperada en el procedimiento de ensayo y una solucin de las diferentes muestras a analizar a la misma concentracin del estndar. Midiendo cada una de las soluciones por duplicado. Se lleva a cabo una comparacin de las mediciones de las soluciones. Tambin se debe realizar una solucin blanco, la cual se prepara con el solvente utilizado para las muestras, se debe agitar la solucin, dejar enfriar a temperatura ambiente y filtrar de la misma forma en que se filtran las muestras. Se debe realizar la lectura del blanco para demostrar que no se presenta ningn pico que interfiera la lectura del principio activo. Para la preparacin de la muestra se debe pesar y pulverizar homogneamente no menos de 10 vulos slidos de Clotrimazol. Transferir a 1 baln volumtrico de 25 mL una porcin del polvo pesada con exactitud, que equivalga aproximadamente a 20 mg de clotrimazol, agregar 10 mL de metanol y disolver la muestra con agitacin constante. Dejar enfriar la muestra a temperatura ambiente y aforar con el solvente utilizado para la preparacin de la muestra. Filtrar las muestras y realizar lecturas de la solucin por duplicado. Repetir el procedimiento para las diferentes muestras de Clotrimazol que se evaluarn. Criterios de Aceptacin: Para la identificacin del analito se debe obtener un Tiempo de Retencin (TR) en HPLC entre +/- 5% del Tiempo de Retencin del estndar en la misma secuencia.
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La muestra no debe presentar ningn tipo de seal que interfiera con la seal que se encuentra para el estndar (13). El cromatograma debe incluir un listado de sustancias con sus correspondientes tiempos de retencin.
7.5.3. LINEALIDAD DEL SISTEMA: Se determin construyendo una curva de calibracin (concentracin vrs. rea) utilizando 5 puntos (concentraciones de 50%, 75%, 100%, 125% y 150%) con diluciones preparadas a partir de una solucin madre y haciendo un anlisis por triplicado para cada dilucin para evaluar estadsticamente la regresin lineal del sistema (12, 14). Pesar una cantidad exacta cercana a 50.0 mg de clotrimazol estndar USP. Transferir a un baln aforado de 25 mL, agregar aproximadamente unos 10 mL de metanol y colocar en ultrasonido durante unos 5 minutos, esperar a que el baln llegue a temperatura ambiente luego aforar con el mismo solvente, tapar y agitar. Esta ser la solucin madre. De esta solucin madre se toman alcuotas correspondientes para preparar una gama de 5 soluciones. Medir alcuotas de los siguientes valores: (2.0, 3.0, 4.0, 5.0 y 6.0mL) y colocarlas en sus respectivos balones aforados de 10 mL y llevar a volumen con el solvente. Determinar el rea de las 5 soluciones, previa adecuacin del sistema, inyectando las muestras correspondientes a cada concentracin por triplicado. Con estos datos se grafica la respuesta de la medicin, contra la concentracin del analito, colocando la concentracin en el eje horizontal (x) y la respuesta del instrumento en el eje vertical (y).
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Esto soporta el grado de confiabilidad de acuerdo a los intervalos de confianza de la recta. especificaciones (16). Determinar por medio de regresin lineal, la ecuacin de la recta Y = mX + b y para su evaluacin se calcula el coeficiente de determinacin que es el porcentaje de desviacin de los resultados explicado en la recta, y el intercepto b que no debe ser mayor del 3% del valor mximo de concentracin. Calcular el coeficiente de regresin utilizando una sola curva con las tres lecturas realizadas para cada concentracin. Realizar un diagrama de residuales, que es la grfica que representa la diferencia entre los resultados observados y los predecidos por la regresin lineal. (Valor real de la concentracin menos el clculo por la ecuacin de regresin para cada valor de X). Adems evaluar la ecuacin por medio de anlisis de varianza para la regresin. Criterios de Aceptacin (14):
Tabla No. 2: Criterios de Aceptacin para la Linealidad del Sistema r = Coeficiente de correlacin (Es la raz cuadrada del coeficiente de determinacin). Es una medida del grado de asociacin entre las mediciones y la concentracin del analito. r2 = Coeficiente de determinacin (Mide la exactitud con la que se ajusta la curva de regresin a los valores experimentales de y). b = Intercepto de la lnea m = Pendiente Valores lineales mayores de 0.98 son
Realizar la grfica correspondiente con
los resultados obtenidos y comparar los resultados con las
Mayor o igual a 0.998
Menor o igual a 0.03 +/- 3% Igual a la sensibilidad del sistema
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Luego de realizado sto, se evala la precisin la cual se divide en repetibilidad y reproducibilidad, que se describe a continuacin (12).
7.5.4. PRECISIN DEL SISTEMA: Se calcula con los resultados de la adecuacin del sistema, preparando una solucin con estndar de clotrimazol al 100% de la concentracin de trabajo, e inyectndola 6 veces, previa verificacin de lnea base estable. Evaluar los resultados segn la desviacin estndar y el coeficiente de variacin obtenidos.
Criterios de Aceptacin: Coeficiente de Variacin: 3.0%
7.5.5 PRECISIN DEL MTODO
7.5.5.1. REPETIBILIDAD: Se determina realizando el anlisis de 6 replicados al 100% de la concentracin de trabajo, por un mismo analista, en la misma muestra homognea y en el mismo equipo, el mismo da. Los anlisis son independientes y se llevan a cabo mediante el procedimiento analtico completo. Se evala un mnimo de seis determinaciones al 100% de la concentracin de prueba (14). Preparar 6 muestras al 100% de la concentracin de trabajo (pesadas por separado), del mismo lote, segn el procedimiento descrito para la preparacin de la muestra, cada una de ellas se prepara de forma individual. Luego se lee cada una de las muestras.
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Este parmetro se evalu luego de la adecuacin del sistema (14). obtenidos (14). Criterio de Aceptacin (14): Coeficiente de Variacin menor o igual al 2.5 % Calcular el coeficiente de variacin, con la siguiente frmula: Coeficiente de Variacin = (desviacin estndar / media) * 100 Intervalos: 2 Desviaciones estndar (2S) Nivel de Confianza del 95% Evaluar los resultados segn la y el coeficiente de variacin desviacin estndar
7.5.5.2 PRECISIN INTERMEDIA: Se determin realizando un mnimo de seis determinaciones al 100% de la concentracin de trabajo, con muestras del mismo lote, segn el procedimiento descrito para la preparacin de la muestra, cada una de ellas se prepara de forma individual. Luego se lee cada una de las muestras. Se evala en dos diferentes das, dos analistas diferentes y dos equipos diferentes, utilizando la misma columna (17)
Criterios de Aceptacin Coeficiente de Variacin: < 3.0% (6). Realizar un anlisis de Varianza de dos vas para establecer si hay diferencias significativas entre analistas y equipos (18).
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7.5.6. EXACTITUD: La exactitud fue evaluada utilizando quince determinaciones, sobre cinco niveles de concentracin, cubriendo el intervalo especificado y tres repeticiones de cada una, siendo de 50%, 75%, 100%, 125% y 150% de la concentracin normal de trabajo del mtodo, utilizando para la preparacin de las muestras un estndar certificado (14). Pesar una cantidad exacta cercana a 50.0 mg de clotrimazol estndar USP. Transferir a un baln aforado de 25 mL, agregar aproximadamente 10 mL de metanol y colocar en ultrasonido por 5 minutos, esperar a que el baln llegue a temperatura ambiente, luego aforar con el mismo solvente, tapar y agitar. Esta ser la solucin madre. De esta solucin madre se toman alcuotas de 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 y 6.0mL y colocarlas en sus respectivos balones aforados de 10 mL y llevar a volumen con el solvente. Estas son las soluciones estndar de prueba. A los balones con las alcuotas, incorporar aproximadamente 2 mL de solvente, someter a ultrasonido durante 5 minutos, dejar enfriar, diluir a volumen y mezclar. Pasar una porcin de esta solucin a travs de un filtro con un tamao de poro de 0.5 micrmetros o menor descartando los primeros 2 mL del filtrado. Usar el filtrado para determinar el rea de las 5 soluciones de prueba, previa adecuacin del sistema (14). El orden de las inyecciones es el siguiente: estndar al 100% de la concentracin de trabajo (es el estndar que se utiliz en la adecuacin del sistema), solucin estndar de prueba al 50%, 75%, 100%, 125% y 150%, estndar al 100%, solucin estndar de prueba al 50%, 75%, 100%, 125% y 150%; estndar al 100%,
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solucin estndar de prueba al 50%, 75%, 100%, 125% y 150%. De manera que se lean los quince estandares de prueba preparadas (14). Calcular el % de Recuperacin con la frmula: % Recuperacin= (mg determinados/ mg pesados) * 100% Calcular la desviacin estndar, la media y el coeficiente de variacin.
Criterios de Aceptacin Al graficar la cantidad recuperada contra la cantidad adicionada, la pendiente debe ser mayor o igual a 0.95 y el intercepto debe ser igual a la concentracin inicial (14). % de Recobro: 95 a 105 % Coeficiente de Variacin menor o igual a 3.0 % % recuperado vs. % adicionado Pendiente (m) = mayor o igual a 0.95 Intercepto (b) = 0.03 Coeficiente de determinacin (r2) = 0.98 Adems de estos parmetros, se construy y evalu un intervalo de confianza para el porcentaje de recuperacin con la distribucin t de Student, a un nivel de significancia de = 0.05 (18)
7.5.7 Intervalo: El intervalo del mtodo se evala verificando que el mtodo analtico proporciona precisin, exactitud y linealidad aceptables cuando se aplica a muestras que contienen el analito en los extremos del intervalo, al igual que dentro del intervalo (6).
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8. RESULTADOS
8.1 Precisin del Sistema
8.1.2 Precisin del Sistema 1

ST Clotrimazol USP 20.4mg/25mL= 0.816 mg/mL Estndar 1 Estndar 2 Estndar 3 Equipo: Cromatgrafo Lquido de Alta Resolucin Merck Hitachi Lachrom Clsico, No 3
Criterio de Aceptacin: CV < 3.0%
rea del pico 1850742 1860901 1867545 1875878 1886107 1891890 1872177,16700 15520,35757 0,82900
Estndar 4 Estndar 5 Estndar 6 Promedio Desviacin estndar
Analista A
Coeficiente de Variacin

ST Clotrimazol USP 20.0mg/25mL= 0.800 mg/mL Equipo: Cromatgrafo Lquido de Alta Resolucin Merck Hitachi Lachrom Clsico, No 2 Estndar 1 Estndar 2 Estndar 3 Estndar 4 Estndar 5 Estndar 6
* Criterio de Aceptacin: CV < 3.0% Promedio
rea del pico 1791033 1856050 1881298 1881305 1884675 1900500 1865810,16700 39309,32414 2,10682
Desviacin estndar Analista B Coeficiente de Variacin
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ST Clotrimazol USP 20.0mg/25mL= 0.800 mg/mL Estndar 1 Estndar 2 Equipo: Cromatgrafo Lquido de Alta Resolucin Merck Hitachi Lachrom Clsico, No 2 Estndar 3 Estndar 4 Estndar 5 Estndar 6
rea del Pico
1802355 1813634 1817774 1810620 1816069 1819235 1813281,16700 6164,30231 0,33995
Desviacin estndar Analista A Coeficiente de Variacin
8.2
Linealidad
Adecuacin del Sistema Estndar 1 Estndar 2 Estndar 3 rea del pico 1850742 1860901 1867545 1875878 1886107 1891890 1872177,16700 15520,35757 0,82900
ST Clotrimazol USP 20.4mg/25mL= 0.816 mg/mL
Equipo: Cromatgrafo Lquido de Alta Resolucin Merck Hitachi Lachrom Clsico, No 3

Analista A
Se trabaj con una solucin madre de 50 mg de Estndar de Clotrimazol USP en 25 mL de metanol. De esta solucin madre se tomaron alcuotas de 2, 3, 4, 5, y 6 mL diluidos en 10 mL de metanol, que corresponden al 50%, 75%, 100%, 125% y 150% de concentracin.
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Se obtuvieron los siguientes resultados Concentracin (%) 50% 50% 50% 75% 75% 75% 100% 100% 100% 125% 125% 125% 150% 150% 150% rea 903987 901173 942829 1369812 1391462 1446909 1855517 1884202 1918645 2321460 2363529 2400174 2800351 2840559 2879245
La linealidad se calcul con la concentracin de la solucin y el rea del pico obtenido.
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Criterios de Aceptacin:
r mayor o igual a 0,999 r2 mayor o igual a 0,998 b < 0,03 r = Coeficiente de correlacin r2 = Coeficiente de determinacin b = intercepto de la lnea
Donde:
Resultados obtenidos: r = r2 = b=(41518/2879245) = 0.9991 0.9982 0,01442
Se realiz una evaluacin estadstica de la recta para determinar la probabilidad sobre la ecuacin obtenida para la linealidad, obtenindose un valor de p = 3.3168E-19. Ver Anexo 5: Evaluacin Estadstica de la recta obtenida para la Linealidad
8.3 Exactitud
ST Clotrimazol USP 20.4mg/25mL= 0.816 mg/mL Adecuacin del Sistema Estndar 1 Estndar 2 Estndar 3 Equipo: Cromatgrafo Lquido de Alta Resolucin Merck Hitachi Lachrom Clsico, No 3
rea del pico 1850742 1860901 1867545 1875878 1886107 1891890 1872177,16700 15520,35757 0,82900
Analista A
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Los resultados fueron los siguientes:

Concentracin Terica (mg) Concentracin Determinada (mg)
% recuperacin 97,91459 97,60979 102,12173 98,91335 100,47669 104,48049 100,48938 102,04288 103,90821 100,57879 102,40146 103,98913 101,10589 102,55758 103,95433 101,50295 2,19197 2,15952
0,4024 0,4024 0,4024 0,6036 0,6036 0,6036 0,8048 0,8048 0,8048 1,0060 1,0060 1,0060 1,2072 1,2072 1,2072 Promedio Desviacin estndar Coeficiente de variacin Frmulas: Concentracin Terica:
0,39401 0,39278 0,41094 0,59704 0,60648 0,63064 0,80874 0,82124 0,83625 1,01182 1,03016 1,04613 1,22055 1,23807 1,25494
___mg pesados___ * ____Alcuota____ volumen de aforo volumen de aforo ___rea Mx___ * Concentracin del estndar rea del Estndar __mg Pesados__ Volumen de aforo
Concentracin Determinada: Concentracin del Estndar: % Recuperacin:
Concentracin determinada *100 Concentracin Terica
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EXACTITUD
1.5 1 0.5 0 0 0.5 1 1.5
CONCENTRACIN TERICA (mg)
y = 1.0414x - 0.0181 R = 0.9982 EXACTITUD Lineal (EXACTITUD)

2
CRITERIOS DE ACEPTACIN
CV < 3% b < 0,03 m > 0,95 r2 > 0.98 % Recuperacin: 95% -105% CV es el coeficiente de Variacin. b es el intercepto m es la pendiente
Donde:
Resultados:
CV = b= m= r 2= % Recuperacin
Se obtuvo un Intervalo de = 100.304 102.696%.
2.1595 0.0181 1.0414 0.9982 101.50% para la media
Confianza del 95%
poblacional del porcentaje de recuperacin con la distribucin t de Student
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8.4 Precisin del Mtodo 1

Adecuacin del Sistema ST Clotrimazol USP 20.4mg/25mL= 0.816 mg/mL Adecuacin del Sistema Estndar 1 Estndar 2 Estndar 3 Equipo: Cromatgrafo Lquido de Alta Resolucin Merck Hitachi Lachrom Clsico, No 3
rea del pico 1850742 1860901 1867545 1875878 1886107 1891890 1872177,16700 15520,35757 0,82900
Analista A
ANALISTA A
Muestra 1
mg. Pesados de Principio activo
mg Absorbancia 2010667 1954378 1925847 1967964 1965513 1955456 Promedio 205.80269 200.29141 198.35987 202.18954 202.06441 200.90446
% 102.90134 100.14570 99.17994 101.09477 101.03220 100.45223 100.80103 1.24339 1.23351
Determinados recuperacin
Muestra A Muestra A1 Muestra A2 Muestra A3 Muestra A4 Muestra A5 Absorbancia del estndar
21.29131 21.26471 21.15832 21.21152 21.19822 21.21152
1872177 Desviacin Estndar Coeficiente de Variacin
La Precisin del mtodo se determina evaluando la respuesta del equipo utilizando las mismas condiciones de anlisis. La precisin intermedia se determina al realizar el mismo anlisis en diferente da, con diferente equipo y diferente analista.
51
Muestra 2
% 99.54491 100.00085 99.47504 98.79462 99.82326 101.02996 99.77811 0.73922 0.74087
Muestra B Muestra B1 Muestra B2 Muestra B3 Muestra B4 Muestra B5 Absorbancia del estndar
19.99893 19.99893 19.99893 19.97229 19.99893 20.01226
1813281.17 Desviacin Estndar Coeficiente de Variacin
Muestra 3
% 102.84071 102.73626 104.96216 102.28069 104.57890 101.59991 103.16644 1.32283 1.28223
Muestra C Muestra C1 Muestra C2 Muestra C3 Muestra C4 Muestra C5 Absorbancia del estndar
21.28601 21.31129 21.38713 21.28601 21.26073 21.26073
1872177 Desviacin Estndar Coeficiente de Variacin
Criterio de aceptacin: C.V.: Menor o igual al 2.5% para cada muestra
52
Frmulas mg pesados de Principio activo = (mg pesados * concentracin Terica) peso promedio de las tabletas mg determinados =
____mg pesados___* Concentracin estndar. * Volumen aforo * Peso promedio tableta. absorbancia estndar Peso Muestra alcuota
% Recuperacin = Concentracin determinada * 100 concentracin Pesada Criterios de Aceptacin: CV : 2.0 % Intervalos de Confianza: 2 Desviaciones estndar (2S) Nivel de Confianza del 95%
8.4 Precisin Intermedia
ANALISTA B
Adecuacin del Sistema ST Clotrimazol USP 20.0mg/25mL= 0.800 mg/mL Equipo: Cromatgrafo Lquido de Alta Resolucin Merck Hitachi Lachrom Clsico, No 2 Estndar 1 Estndar 2 Estndar 3 Estndar 4 Estndar 5 Estndar 6
rea del pico 1791033 1856050 1881298 1881305 1884675 1900500 1865810,16700 39309,32414 2,10682
Desviacin estndar Analista B Coeficiente de Variacin
53
Muestra 1
mg Absorbancia 1874502 1897749 1872083 1869190 1866004 1913180 201,05201 203,41006 200,52573 200,21585 200,27380 205,33709
% 100,52601 101,70503 100,26286 100,10792 100,13690 102,66854 100,90121 1,05179 1,04240
Muestra A Muestra A1 Muestra A2 Muestra A3 Muestra A4 Muestra A5 Absorbancia del estndar
19,98803 20,00133 20,01463 20,01463 19,97473 19,97473
1865810,17 Promedio Desviacin estndar Coeficiente de Variacin
Muestra 2
mg Absorbancia 1914524 1904643 1890850 1879092 1883772 1937848 102,41165 101,81540 101,21258 100,51632 100,83371 103,65930
% 102,41165 101,81540 101,21258 100,51632 100,83371 103,65930 101,74149 1,16081 1,14094
Muestra B Muestra B1 Muestra B2 Muestra B3 Muestra B4 Muestra B5 Absorbancia del estndar
20,03890 20,05223 20,02558 20,03890 20,02558 20,03890
1865810,17 Promedio Desviacin estndar Coeficiente de Variacin
54
Muestra 3
% 100.27257 99.864689 101.70901 100.40400 100.45904 100.02031 100.45494 0.65511 0.65215
Muestra C Muestra C1 Muestra C2 Muestra C3 Muestra C4 Muestra C5 Absorbancia del estndar
20.04727 20.07255 20.02199 20.07255 19.99671 20.09783 1865810.17
Desviacin estndar
Coeficiente de Variacin Criterio de aceptacin: C.V.: Menor o igual al 2.5% para cada muestra Intervalos de Confianza: 2 Desviaciones estndar (2S) Nivel de Confianza del 95%
Frmulas mg pesados de Principio activo = (mg pesados * concentracin Terica) peso promedio de las tabletas mg determinados =
____mg pesados___* Concentracin estndar. * Volumen aforo * Peso promedio tableta. absorbancia estndar Peso Muestra alcuota
% Recuperacin = Concentracin determinada * 100 concentracin Pesada Criterios de Aceptacin: Coeficiente de Variacin: < 3.0% (6) entre analistas Realizar un anlisis de Varianza de dos vas para establecer si hay diferencias significativas entre analistas y equipos (13).
55
Comparacin entre Analistas Muestra A Analista A

% Recuperacin
Analista B
% Recuperacin
Muestra A1 Muestra A2 Muestra A3 Muestra A4 Muestra A5 Muestra A6 Promedio Desviacin Estndar Coeficiente de Variacin.
102.90134 100.14570 99.17994 101.09477 101.03220 100.45223 100.80103 1.24340 1.23351
100.52601 101.70503 100.26286 100.10792 100.13690 102.66854 Entre Analistas 100.90121 Promedio Desviacin 1.05179 Estndar Coeficiente 1.04240 de Variacin. 0.070240 0.070838 100.85112
Muestra B Analista A
% recuperacin
Analista B
% recuperacin
Muestra B1 Muestra B2 Muestra B3 Muestra B4 Muestra B5 Muestra B6 Promedio Desviacin Estndar Coeficiente de Variacin.
99.54491 100.00085 99.47504 98.79462 99.82326 101.02996 99.77811 0.73922 0.74087
102.41165 101.81540 101.21258 100.51632 100.83371 Entre Analistas 101.74149 Promedio 100.75980 Desviacin 1.16081 Estndar Coeficiente 1.14094 de Variacin. 1.37785 1.38832 103.65930
56
Muestra C
Analista A
% recuperacin
Analista B
% recuperacin
Muestra C1 Muestra C2 Muestra C3 Muestra C4 Muestra C5 Muestra C6 Promedio Desviacin Estndar Coeficiente de Variacin.
102.84071 102.73626 104.96216 102.28069 104.57890 101.59991 103.16644 1.32283 1.28223
100.27257 99.86469 101.70901 100.40400 100.45904 100.02031 Entre Analistas 100.45494 Promedio 100.81011 Desviacin 0.65511 Estndar Coeficiente 0.65215 de Variacin. 1.90191 1.91732
Anlisis de Varianza
Analista 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 Muestras 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 Respuesta 102.90134 100.14570 99.17994 101.09477 101.03220 100.45223 100.526007 101.705031 100.262863 100.107923 100.1369 102.668544 99.5449151 100.000853 99.4750381 98.7946246 99.8232652 101.029958 Analista 2 2 2 2 2 2 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 Muestras 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Respuesta 102.41165 101.815399 101.212576 100.516322 100.833708 103.659296 102.840712 102.736256 104.96216 102.280688 104.578899 101.599915 100.272567 99.8646887 101.709013 100.403998 100.459041 100.020309
57
ANLISIS DE VARIANZA Se realiz un anlisis de varianza para la evaluacin entre analistas y muestras y se encontr que no existe diferencia significativa entre analistas (p=0.9173), ni entre muestras (p=0.1522) para un nivel de significancia=0.05
Analistas
104
Respuesta
Concentracin
102
100
98 1 2
Nmero de Analista
Muestras
104
Respuesta
Concentracin
102
100
98 1 2 3
Nmero de Muestra
58
9. DISCUSIN DE RESULTADOS
Previo a realizar la estandarizacin del mtodo, se evalu la columna a utilizar, determinando la cantidad de platos tericos de la columna utilizada en el estudio, para ello se utilizaron estndares de uracilo y tolueno; el resultado fue satisfactorio, ya que la columna obtuvo ms de 1000 platos tericos para el primer estndar y en el segundo estndar se obtuvieron ms de 2000 platos tericos, lo que indica que la columna utilizada tiene las condiciones ptimas para su uso, el factor de simetra fue de 1.79 y 1.04, respectivamente, lo cual est dentro del rango aceptado que es menor de 2.0 (Ver anexo 1: Determinacin de platos tericos) (1). Por otra parte, el equipo utilizado en la estandarizacin tuvo una calibracin y verificacin constante por parte de personal calificado, lo cual asegura que los equipos estaban funcionando de manera adecuada, y la ltima verificacin de la balanza se realiz 4 meses previo a realizar el anlisis y se recomiendan calibraciones cada 6 meses para asegurar el buen funcionamiento de la balanza (Ver anexo 2: Calibracin de la balanza). Por otra parte, a los equipos de cromatografa Lquida de Alta Resolucin se les realiz la verificacin de su funcionamiento 3 meses antes de la realizacin del estudio, esto asegura que el equipo se encontraba en ptimas condiciones para realizar la estandarizacin Cromatgrafos lquidos). En la evaluacin de los parmetros se utiliz Estndar de Clotrimazol USP para determinar la especificidad, precisin del sistema, linealidad y exactitud. Para la determinacin de la precisin del mtodo y la precisin intermedia se utilizaron vulos slidos de tres laboratorios fabricantes diferentes, analizados por dos analistas diferentes. Previo a analizar los parmetros antes descritos se realiz una adecuacin del sistema, utilizando para ello 6 lecturas de un estndar de Clotrimazol USP al 100% de la concentracin de trabajo (0.800 mg/mL). La adecuacin del sistema fue satisfactoria, ya que el coeficiente de variacin (CV) (Ver Anexo 3: Verificacin de
59
fue menor que el mximo permitido (3%) en cada uno de los casos. Se evalu la precisin del sistema en tres ocasiones debido a que el anlisis de la muestra B del Analista A se realiz en diferente da, para evitar la sobresaturacin de la columna utilizada y en las tres ocasiones, el coeficiente de variacin obtenido fue menor del 3%, por lo cual se demuestra que el sistema utilizado tiene la precisin requerida para su utilizacin. Para evaluar la especificidad se evalu una solucin blanco, la cual no contena el Principio Activo a evaluar (Clotrimazol) y fue preparado de la misma manera que la solucin estndar al 100% de la concentracin de trabajo y la muestra a la misma concentracin, la solucin blanco no present ningn pico en el tiempo de retencin del principio activo analizado y adems se realiz una comparacin entre el tiempo de retencin que presenta el estndar de Clotrimazol y las muestras de Clotrimazol analizadas por duplicado. En la identificacin del analito se obtuvo un Tiempo de Retencin (TR) entre +/- 1% del Tiempo de Retencin del estndar en la misma secuencia y los picos obtenidos en la grfica tienen una buena resolucin (Ver Anexo 4: Cromatogramas obtenidos), con lo cual se demuestra la especificidad del mtodo. La muestra no debe presentar ningn tipo de seal que interfiera con la seal que se encuentra para el estndar. tiempos de retencin. Para evaluar la Linealidad, se trabaj con una solucin madre de Estndar de Clotrimazol USP, de la cual se prepararon soluciones al 50%, 75%, 100%, 125% y 150% de la concentracin de trabajo, evaluando cada solucin por triplicado; y con las mismas se realiz una curva de calibracin, la cual di un coeficiente de correlacin (r) de 0.9991, lo que indica que hay relacin entre las mediciones y las concentraciones del analito. El coeficiente de determinacin (r2) obtenido (0.9982) demuestra que la curva de regresin se ajusta a los valores experimentales de las mediciones obtenidas. El intercepto de la lnea (b) cumpli con el criterio de aceptacin, ya que el resultado fue de Para realizar esta evaluacin el cromatograma incluye un listado de sustancias con sus correspondientes
60
0.01442, y el esperado deba ser < 0.03; lo que indica que no se obtiene una absorbancia significativa cuando la concentracin del analito es 0 y la relacin lineal fue significativa (p = 3.3168E-19). Esto demuestra que el rea obtenida en unidades de absorbancia en cada nivel de concentracin es proporcional a dicha concentracin, y los resultados son predecibles cuando se trabaje en el intervalo de concentracin evaluado.
El parmetro de Exactitud se evalu a travs del porcentaje de recuperacin obtenido para 5 niveles de concentracin de trabajo (50%, 75%, 100%, 125% y 150%) a travs de soluciones preparadas a partir de una Este solucin madre de estndar y realizando tres lecturas de cada solucin.
parmetro se evalu de esta manera debido a que el Laboratorio Nacional de Salud recibe una gran diversidad de matrices para analizar y no se puede unificar o estandarizar la matriz utilizada para este tipo de forma farmacutica. Los porcentajes de recuperacin obtenidos estn dentro del rango de 97.6% a 104.5%, que est dentro del rango de aceptacin, que es del 95% - 105%, por lo que hay concordancia entre el valor experimental y el valor verdadero. El Coeficiente de Variacin obtenido en la evaluacin de este parmetro es de 2.15, que es menor al lmite aceptado, que es de 3%, por lo que los resultados obtenidos cumplen con este requisito. El intercepto de la lnea (b) es menor del 3%. El valor obtenido fue de 0.0181. La pendiente (m) debe ser mayor de 0.95 y en el presente estudio se obtuvo una pendiente de 1.0414. Tambin se evalu el coeficiente de determinacin (r2) que se obtuvo un resultado de 0.9982, que es mayor del valor lmite (0.98), lo que indica que hay relacin entre las mediciones y la concentracin del analito. De acuerdo al intervalo de confianza construido a travs de la distribucin t de Student a un nivel de significancia de = 0.05, el parmetro evaluado est contenido dentro del intervalo, y cumple con el criterio de aceptacin. Esto demuestra que el mtodo es exacto.
61
En la determinacin de la precisin del mtodo, se evaluaron tres muestras de vulos slidos, de diferentes casas farmacuticas y diferentes lotes, utilizando seis soluciones al 100% de la concentracin de trabajo, pesadas individualmente. Al analizar estas soluciones por un mismo analista, el mismo da, se obtuvo un coeficiente de variacin para las tres muestras entre 0.74 y 1.28, estos valores estn dentro del criterio de aceptacin, el cual debe ser menor o igual al 2.5%. Tambin se evalu la Precisin Intermedia, analizando las mismas muestras, preparando 6 soluciones de forma individual de cada muestra realizadas por un analista distinto, diferente da y en un equipo diferente. Al evaluar las muestras, se obtuvo un coeficiente de variacin entre 0.65 y 1.14, que est dentro del rango permitido que es menor o igual a 2.5%, que es el rango aceptado para la precisin del mtodo. Para la Precisin Intermedia se debe obtener un coeficiente de Variacin menor de 3.0 entre los anlisis realizados por diferentes analistas, diferentes das y diferente equipo. En el presente estudio se logr determinar que el Coeficiente de Variacin para este parmetro est dentro del rango de 0.079-1.28, que es menor al lmite aceptado. Por lo que se puede indicar que el mtodo de anlisis de Clotrimazol tiene una precisin Intermedia adecuada al trabajar en diferentes das, diferentes analistas y diferentes equipos. Tambin se realiz un anlisis de varianza de dos vas para establecer si hay diferencias significativas entre analistas y equipos. El resultado obtenido al realizar la comparacin entre los resultados obtenidos por diferentes analistas se obtuvo un valor de p = 0.9173 y al comparar los resultados obtenidos en las muestras al analizarlas en equipos diferentes se obtuvo un valor de p = 0.1522, por lo que se demuestra que no hay diferencia significativa entre los anlisis efectuados por analistas diferentes, ni por equipos diferentes. Con los resultados anteriormente presentados se prueba que el mtodo de Anlisis de Clotrimazol en vulos slidos por Cromatografa Lquida de Alta Resolucin evaluado en el presente estudio cumple con los parmetros de
62
Precisin del Sistema, Linealidad, Exactitud y Precisin del mtodo, Precisin Intermedia y Especificidad, necesarios para instituirlo como un mtodo de anlisis estandarizado para su utilizacin en el Laboratorio Nacional de Salud, utilizando las condiciones establecidas en el presente estudio.
63
10. CONCLUSIONES
10.1 El mtodo de Anlisis de Clotrimazol en vulos slidos por Cromatografa Lquida de Alta Resolucin evaluado cumple con los parmetros de Precisin del Sistema, Linealidad, Exactitud y Precisin del mtodo, Precisin Intermedia y Especificidad. 10.2 El mtodo utilizado cuenta con una precisin del sistema aceptable, ya que los resultados no varan de una manera significativa cuando se evalan repetidas veces muestras homogneas. 10.3 El mtodo es especfico para el anlisis de Clotrimazol, ya que no se presenta ningn pico en el tiempo de retencin de Clotrimazol; es lineal, ya que el rea obtenida en unidades de absorbancia en cada nivel de concentracin es proporcional a dicha concentracin y es exacto, ya que hay concordancia entre el valor experimental y el valor verdadero. 10.4 El mtodo de anlisis de Clotrimazol tiene una precisin adecuada al evaluar una muestra homognea repetidas veces bajo las mismas condiciones y una precisin Intermedia adecuada al trabajar en diferentes das, diferentes analistas y diferentes equipos. 10.5 El mtodo de Anlisis de Clotrimazol en vulos slidos por Cromatografa Lquida de Alta Resolucin cumple con los parmetros necesarios para instituirlo como un mtodo de anlisis estandarizado para su utilizacin en el Laboratorio Nacional de Salud, utilizando las condiciones establecidas en el presente estudio, confiabilidad del mismo. debido a la
64
11. RECOMENDACIONES
11.1 Para evaluar el parmetro de especificidad, se podran realizar evaluaciones con matrices de diferentes laboratorios fabricantes para poder tener un dato ms amplio de la especificidad. 11.2 En la evaluacin de la exactitud, se puede evaluar tambin con enriquecimiento de la muestra con adicin de estndar, pero esto se debe hacer con muestras que cuenten con un certificado del fabricante y que pueda facilitar la obtencin de la matriz para realizar este tcnica. 11.3 Para poder evaluar ms ampliamente el mtodo se debera realizar una comparacin de los resultados obtenidos con el presente estudio comparado con los obtenidos con el anlisis realizado con un mtodo normalizado.
65
12. REFERENCIAS 12.1. Bloom, Joseph Dr. 2006. Curso de Cromatografa Lquida de Alta Resolucin. 12.2. Goodman y Gilman. Las Bases Farmacolgicas de la Teraputica. 10 Edicin. Vol I. McGraw-Hill. 2003. Mxico. 12.3. Katzung, Bertram G. Farmacologa Bsica y Clnica. 8 Edicin.
Editorial El Manual Moderno, S.A. de C.V. 2002. Mxico, D.F. 12.4. Martindale. The Complete Drug Reference. 34th Edition. Pharmaceutical Press. 2005. United States of America. Pag. 569. 12.5. Drug Information for the Health Care Professional USP DI. Volume 1. 26th Edition. Editorial Thomson Micromedex. 2006. Estados Unidos de Amrica. Pag. 928 12.6. Farmacopea de los Estados Unidos. El Formulario Nacional. Edicin XXIX Versin en Espaol. Convencin de Farmacopeica de Estados Unidos. 2006. Estados Unidos. 12.7. British Pharmacopoeia CD-ROM. Pharmaceutical Substances. 2003 12.8. Procedimiento Analtico de Clotrimazol. Manual de Procedimientos del rea de Fisicoqumico de Medicamentos. Salud. 2004. Guatemala. 12.9. Castillo Aguilar, Beatriz. Gonzlez Hernndez, Rolando. Protocolo de Validacin de Mtodos Analticos para la Cuantificacin de Frmacos. Revista Cubana Farmacia 1997. Cuba. 9 p. Laboratorio Nacional de Volume I & II. Medicinal and
66
12.10. NORMA
GUATEMALTECA
RECOMENDADA
COGUANOR
NGR/
ISO/IEC 17 025 1. Revisin Requisitos Generales para la Competencia de los Laboratorios de Ensayo y de Calibracin. 2001. Guatemala 12.11. Pappa, H. N. 2005. Buenas Prcticas de Control de Calidad. Costa Rica. 12.12. Procedimiento para la validacin de mtodos analticos por HPLC. Manual de procedimiento para la Validacin de mtodos analticos por HPLC. Laboratorio Nacional de Salud. Ambiente y Salud. 2005. Guatemala. 12.13. Baudritt, Olga., et. al. Costa Rica. 12.14. Protocolo de Verificacin del Mtodo de Anlisis de Cuantificacin de Acetaminofn Tabletas de 500 mg por Cromatografa Lquida de Alta Presin. Laboratorio Nacional de Salud. rea de Fisicoqumico de Medicamentos. 2006. Guatemala 12.15. Salguero, Rmulo E. Guatemala. 12.16. Millar, James N, Millar, Jane C. 2002. Espaa. 150 p. 12.17. Procedimiento de Validacin de Mtodos de Analticos no Normalizados. Laboratorio Nacional de Salud. rea de Fisicoqumico de Medicamentos. Revisin No. 1. Ao 2006. Guatemala. Estadstica y Quimiometra para Estadstica y Estadstica Comparativa. 2006. Gua de Validacin de Mtodos Analticos 2005. rea de Contaminantes de
Fisicoqumicos Ligeramente Modificados o Mejor Definidos.
Qumica Analtica. 4ta edicin (1 edicin en Espaol). Prentice Hall.
67
12.18. Nave Herrera, Oscar Federico.
Herramientas de Estadstica y
Computacin Aplicadas al Control de Calidad en los Anlisis. Modulo 5. Diplomado de Sistemas de Gestin de la Calidad para Laboratorio con base en las Normas COGUANOR ISO 17025:2005 e ISO 15189:2003. 2006. Guatemala 12.19. Harris, Daniel C. Anlisis Qumico Cuantitativo. 3 Edicin. Grupo
Editorial Iberoamrica, S.A. de C.V. 1992. Mxico. 12.20. Anleu Lainfiesta, Rossana. Validacin del Mtodo de Cromatografa
Lquida de Alta Resolucin para la Cuantificacin de Ibuprofeno en Suspensin. Guatemala 2000. 52 p. Tesis Licenciada en Qumica Farmacutica. Universidad de San Carlos de Guatemala. Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia. Escuela de Qumica Farmacutica. 12.21. Baudrit Carrillo, Olga. 2005. Validacin de Procedimientos de Anlisis de Medicamentos. Universidad de Costa Rica. 10 p. 12.22. Baudrit Carrillo, Olga. 2005 Protocolo de Validacin de Procedimientos de Anlisis de Medicamentos. Costa Rica. 14 p. 12.23. Bloom, Joseph Dr. 2005 Aspectos Generales e Importancia de la Escuela de Farmacia. VII Asamblea
Validacin de Metodologa Analtica en la Prctica Farmacutica. Universidad de Puerto Rico. Farmacia. Guatemala. 9 p. 12.24. Alvarado, Zoila., et al 2000. Propuesta de un Reglamento para los General de la conferencia Hispanoamericana de Facultades de
Estudios de Validacin de Mtodos Analticos Requeridos para el Registro Sanitario de Medicamentos ante el Ministerio de Salud de la Repblica de Costa Rica. Analticos. Costa Rica 2000. Comisin Nacional de Calidad de Medicamentos. Subcomisin de Validacin y Acreditacin de Mtodos
68
12.25. Franco Flores, Anabelly Carolina. 2002. Mtodos Analticos Nuevos o Farmacuticos.
Gua para Validacin de para productos
Modificados
Guatemala; 45 p. Tesis Licenciada en Qumica
Farmacutica. Universidad de San Carlos de Guatemala. Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia. Escuela de Qumica Farmacutica. 12.26. Food and Drug Administration. U.S. Department of Health and Human Services. Public Health Service. Guideline form submitting samples and analytical data for methods validation. 1987. United States of America.
69
ANEXOS
70
Anexo No. 1 Determinacin de platos tericos
71
72
73
Anexo No. 2 Calibracin de la Balanza Analtica
74
75
76
Anexo No. 3 Verificacin de Cromatgrafos Lquidos
77
78
Anexo No. 4 Cromatogramas
79
80
81
82
Anexo No. 5 Anlisis Estadstico
83
Evaluacin Estadstica de la recta obtenida para la Linealidad
Resumen Estadsticas de la regresin Coeficiente de correlacin mltiple 0.99909175 Coeficiente de determinacin R^2 0.99818432 R^2 ajustado 0.99804465 Error tpico 31144.8911 Observaciones 15 ANLISIS DE VARIANZA Grados de libertad Regresin Residuos Total 1 13 14 Suma de cuadrados 6.9325E+12 1.261E+10 6.9451E+12
Promedio de los Valor crtico cuadrados F F 6.9325E+12 7146.84984 3.3168E970004242
Coeficientes Intercepcin Concentracin (%) -41518 19228.416
Error tpico 24124.7289 227.450126
Estadstico t
Probabilidad
Inferior 95%
-1.72097271 0.10895149 84.5390433 3.3168E-19
-93636.30 18737.03
Anlisis de los residuales Pronstico Area 919902.8 919902.8 919902.8 1400613.2 1400613.2 1400613.2 1881323.6 1881323.6 1881323.6 2362034 2362034 2362034 2842744.4 2842744.4 2842744.4
Resultados d
Observacin 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Residuos -15915.8 -18729.8 22926.2 -30801.2 -9151.2 46295.8 -25806.6 2878.4 37321.4 -40574 1495 38140 -42393.4 -2185.4 36500.6
Residuos estndares -0.53031511 -0.6240777 0.76390192 -1.02629724 -0.30491836 1.54257795 -0.85987697 0.09590841 1.24355057 -1.35192734 0.04981346 1.27082636 -1.41254982 -0.07281762 1.21620148
Percentil 3.333333
16.66666 23.33333
36.66666 43.33333
56.66666 63.33333
76.66666 83.33333
96.66666
84
Hiptesis nula: la pendiente que de la ecuacin de la recta que explica la relacin entre ambas variables es en la po
Hiptesis alterna: la pendiente que de la ecuacin de la recta que explica la relacin entre ambas variables es en la Conclusin: dado que el valor de probabilidad es menor al nivel de significancia, la relacin entre ambas variables e diferente a cero =0 0 IC = 95% 3.3168E-19 p < 0.05 Anlisis realizado con el mdulos de anlisis de datos de Excel
85
Anexo 6: Prueba de Student realizada para la exactitud.

Prueba t para dos muestras suponiendo varianzas iguales 97.914594 90.0284833 1096.74373 17 548.371865 0 32 1.24146105 0.1117294 1.6938887 0.22345881 2.03693333 100 100 0 17
Media Varianza Observaciones Varianza agrupada Diferencia hipottica de las medias Grados de libertad Estadstico t P(T<=t) una cola Valor crtico de t (una cola) P(T<=t) dos colas Valor crtico de t (dos colas)
H o : y % recuperacin = 100%
Ho: y %recueracin = 100 Ha: y %recuperacin 100 One-Sample T: C1 Test of mu = 100 vs not = 100
Variable N Mean StDev SE Mean 95% CI T P C1 18 90.47 32.18 7.59 (74.46, 106.47) -1.26 0.226
Conclusin: % de recuperacin poblacional es igual al parmetro (100) No hay diferencia estadsticamente significativa entre la media poblacional del porcentaje de recuperacin y el valo (100%) Anlisis realizado conb Minitab 15
86
Anexo 7: Analisis de Varianza

. anova respuest analista muestras Number of obs = Root MSE Source | Partial SS Prob > F -----------+---------------------------------------------------Model | 7.47507527 | analista | .020453446 muestras | 7.45462182 0.1522 | Residual | 59.7037358 1.86574174 -----------+---------------------------------------------------Total | 67.1788111 1.9193946 No existe diferencia significativa entre analistas (p=0.9173), ni entre muestras (p=0.1522) Nivel de significancia=0.05 35 32 1 .020453446 2 3.72731091 0.01 2.00 0.9173 3 2.49169176 1.34 0.2801 36 R-squared = 0.1113
= 1.36592 df MS
Adj R-squared = 0.0280 F
87
___________________________ Br. Angela Teresa Samol Sayes Autor
___________________________ Licda. Millie Cruz Co-Asesora
______________________________ Licda. Julia Amparo Garca Bolaos
88
Asesora
___________________________ Lic. Julio Chinchilla Revisor
___________________________ Lic. Estuardo Serrano Director de Escuela
___________________________ Dr. Oscar Cobar Decano

Estandarización Del Método de Cuantificación de Clotrimazol en Óvulos

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1

UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS Y FARMACIA

Angela Teresa Samol Sayes

Para optar al ttulo de Qumica Farmacutica

Guatemala, Noviembre de 2007

Oscar Cbar Pinto, Ph.D.

Lic. Pablo Ernesto Oliva Soto

Licda. Lillian Raquel Irving Antilln, M.A.

Licda. Liliana Vides de Urzar

Licda. Beatriz Eugenia Batres de Jimnez

Br. Mariesmeralda Arriaga Monterroso

Br. Jos Juan Vega Prez

y cuantificacin de Clotrimazol presente en vulos slidos,

* Puede requerirse segn la naturaleza de la prueba.

diferentes concentraciones, as como tambin informacin adicional acerca de la linealidad de la curva.

Pesar 6.60 gramos de fosfato de amonio

7.5 PROCEDIMIENTO, DISEO Y ANLISIS

Realizar la grfica correspondiente con

los resultados obtenidos y comparar los resultados con las

Mayor o igual a 0.998

Menor o igual a 0.03 +/- 3% Igual a la sensibilidad del sistema

Criterios de Aceptacin: Coeficiente de Variacin: 3.0%

7.5.5 PRECISIN DEL MTODO

8.1 Precisin del Sistema

8.1.2 Precisin del Sistema 1

Estndar 4 Estndar 5 Estndar 6 Promedio Desviacin estndar

8.1.2 Precisin del Sistema 2

Desviacin estndar Analista B Coeficiente de Variacin

8.1.3 Precisin del Sistema 3

rea del Pico

1802355 1813634 1817774 1810620 1816069 1819235 1813281,16700 6164,30231 0,33995

Desviacin estndar Analista A Coeficiente de Variacin

ST Clotrimazol USP 20.4mg/25mL= 0.816 mg/mL

Equipo: Cromatgrafo Lquido de Alta Resolucin Merck Hitachi Lachrom Clsico, No 3

Estndar 4 Estndar 5 Estndar 6 Promedio Desviacin estndar

La linealidad se calcul con la concentracin de la solucin y el rea del pico obtenido.

Resultados obtenidos: r = r2 = b=(41518/2879245) = 0.9991 0.9982 0,01442

Estndar 4 Estndar 5 Estndar 6 Promedio Desviacin estndar

Los resultados fueron los siguientes:

Concentracin Determinada: Concentracin del Estndar: % Recuperacin:

Concentracin determinada *100 Concentracin Terica

y = 1.0414x - 0.0181 R = 0.9982 EXACTITUD Lineal (EXACTITUD)

2.1595 0.0181 1.0414 0.9982 101.50% para la media

Confianza del 95%

poblacional del porcentaje de recuperacin con la distribucin t de Student

8.4 Precisin del Mtodo 1

Estndar 4 Estndar 5 Estndar 6 Promedio Desviacin estndar

% 102.90134 100.14570 99.17994 101.09477 101.03220 100.45223 100.80103 1.24339 1.23351

Muestra A Muestra A1 Muestra A2 Muestra A3 Muestra A4 Muestra A5 Absorbancia del estndar

21.29131 21.26471 21.15832 21.21152 21.19822 21.21152

1872177 Desviacin Estndar Coeficiente de Variacin

% 99.54491 100.00085 99.47504 98.79462 99.82326 101.02996 99.77811 0.73922 0.74087

Muestra B Muestra B1 Muestra B2 Muestra B3 Muestra B4 Muestra B5 Absorbancia del estndar

19.99893 19.99893 19.99893 19.97229 19.99893 20.01226

1813281.17 Desviacin Estndar Coeficiente de Variacin

% 102.84071 102.73626 104.96216 102.28069 104.57890 101.59991 103.16644 1.32283 1.28223

Muestra C Muestra C1 Muestra C2 Muestra C3 Muestra C4 Muestra C5 Absorbancia del estndar

21.28601 21.31129 21.38713 21.28601 21.26073 21.26073

1872177 Desviacin Estndar Coeficiente de Variacin

Criterio de aceptacin: C.V.: Menor o igual al 2.5% para cada muestra

8.4 Precisin Intermedia

Desviacin estndar Analista B Coeficiente de Variacin

mg. Pesados de Principio activo