HEMOSTASIA Y GRUPOS SANGUNEOS. Temas de estudio. - Composicin de la sangre. - Concepto de hemostasia - Fases de la hemostasia. - Vas de la coagulacin. - Qu es un anticoagulante.

Ejemplos de anticoagulantes. - Qu es la Hemofilia. - Concepto de antgenos y anticuerpos. - Sistemas AB0 (cero) y Rh para la determinacin de los grupos sanguneos en el humano. - Cules son los aglutingenos y las aglutininas en los sistemas AB0 y Rh, - Otros sistemas para la determinacin de los grupos sanguneos. - Eritroblastosis fetal. INTRODUCCIN. La hemostasia es el conjunto de mecanismos de defensa que evitan la extravasacin sangunea e inician la reparacin de la microcirculacin. La hemostasia consta de tres fases: 1) Fase vascular. 2) Fase plaquetaria. 3) Fase plasmtica. La fase vascular consiste a su vez de dos etapas: una vasoconstriccin inicial y una vasodilatacin tarda. La vasoconstriccin inicial tiene por objetivo limitar la prdida de sangre, reduciendo el dimetro del vaso lesionado, y es inducida por agentes tales como la noradrenalina liberada por las terminaciones nerviosas y el tromboxano A2 y la serotonina, liberados por las plaquetas. Las clulas endoteliales liberan endotelina 1 que es uno de los vasoconstrictores fisiolgicos ms poderosos as como prostaciclina y bradicinina, que posteriormente inducen vasodilatacin; lo que favorece la llegada de los elementos celulares que participan en la siguiente fase de la hemostasia. La fase plaquetaria de la hemostasia es resultado de la accin de las plaquetas, fragmentos celulares producidos por gemacin de los megacariocitos de la mdula sea. Esta fase consta de las siguientes etapas: 1.- Adherencia. Consiste en la formacin de una monocapa plaquetaria a lo largo del sitio de la lesin vascular, como puente de unin entre las clulas endoteliales de los extremos de la lesin. 2.- Secrecin. Corresponde a la degranulacin plaquetaria, se inicia con la activacin de una cascada de sealizacin que activa a la fosfolipasa C y que trae como consecuencia la liberacin del contenido granular, rico en mediadores qumicos vasoactivos y agentes proagregantes (como el ADP, las catecolaminas, el calcio y el fibringeno). 3.- Agregacin. Consiste en la formacin de un tapn plaquetario multicelular formado por varias capas, resultantes de la interaccin estrecha entre las plaquetas las cuales experimentan un cambio notable en su citoesqueleto y en su forma general. 4.- Fusin. Est dada por la fusin de las membranas de las plaquetas para formar un tapn unicelular que proporcione la mxima resistencia a la zona lesionada y mantenga unido el endotelio de la misma. La fase plasmtica est representada por un grupo de protenas plasmticas y otros factores que participan en la coagulacin sangunea, fenmeno que consiste en el cambio de estado coloidal de la sangre, de predominantemente sol a predominantemente gel. Las protenas que intervienen en la coagulacin son, en su mayora, sintetizadas en el hgado. 1

La reaccin fundamental en la coagulacin de la sangre es la conversin del fibringeno en fibrina. El fibringeno es una protena globular soluble del plasma, mientras que la fibrina es un polmero fibrilar insoluble. La conversin del fibringeno es catalizada por la trombina, que resulta de la activacin de su precursor inactivo circulante, la protrombina, por la accin de un complejo de protenas (factor X, factor V), por calcio y por el factor plaquetario III (una mezcla de fosfolpidos y protenas de superficie plaquetaria), llamado Complejo Activador de la Protrombina (CAP). El CAP puede ser activado por dos diferentes secuencias de reacciones que reciben el nombre de va intrnseca y va extrnseca. La activacin de la va intrnseca ocurre cuando la sangre hace contacto con las fibras de colgena de la membrana basal subendotelial de los vasos sanguneos o con superficies hmedas con carga elctrica, lo cual induce la activacin del factor XII. La liberacin de tromboplastina tisular o factor III (mezcla de protenas y de fosfolpidos) desde las clulas endoteliales, activa al factor VII, con lo que se da inicio a la va extrnseca. El inicio de estas dos vas, a su vez, produce activacin secuencial de un sistema de proteasas (factores XI, X, IX, VIII, V) hasta la formacin del CAP; muchos de estos pasos requieren la presencia de calcio inico, por lo que los quelantes de los iones divalentes pueden tener efecto anticoagulante. Una vez reparada la pared de los vasos lesionados, el factor XII activado promueve la activacin de una molcula plasmtica denominada calicrena; sta a su vez, cataliza la conversin de plasmingeno en plasmina, la cual digiere la fibrina y, por lo tanto, promueve la disolucin del cogulo. Grupos sanguneos. La membrana de los eritrocitos contiene diversos antgenos llamados aglutingenos. Los ms importantes son el A y el B. Los individuos se dividen en cuatro grupos sanguneos dependiendo de la presencia o ausencia de estos antgenos en la superficie de la membrana de sus eritrocitos, estos grupos son: A, B, AB y 0 (cero). Adems de los antgenos del sistema AB0 (es un sistema de alelos en un mismo locus del material gentico el que codifica para estas protenas), existen los del sistema Rh, llamados as porque fue estudiado por primera vez en los monos del gnero Rhesus. Es en realidad un sistema compuesto por muchos antgenos, dentro de los cuales el D es el ms antignico. Los anticuerpos para los aglutingenos se llaman aglutininas; stas pueden existir naturalmente (esto es, hereditariamente) o ser producidos por exposicin a los eritrocitos de otro individuo. Los anticuerpos circulan en el plasma a diferencia de los antgenos que estn en la membrana de los eritrocitos. Objetivos. Valorar, en el laboratorio, las diversas etapas del proceso de hemostasia mediante tcnicas in vitro e in vivo. Desencadenar e inhibir in vitro el proceso de la coagulacin sangunea, modificando variables fisiolgicas como la temperatura y la concentracin de calcio en el medio. Observar en el microscopio al polmero de fibrina. Manejar adecuadamente las muestras de sangre humana. Observar la reaccin de aglutinacin en muestras de sangre al mezclarlas con antisueros del sistema AB0 y del sistema Rh. Determinar los diferentes tipos sanguneos de muestras obtenidas de los alumnos. Determinar la frecuencia de los grupos sanguneos en la poblacin estudiada y compararla con otras poblaciones ya reportadas. MATERIAL Y MTODO 1 Papel filtro de forma circular. 1 cronmetro. 2

Torundas de algodn. Alcohol. 5 tubos de ensaye de 1 x 10 cm 1 gradilla. 1 recipiente para hielo. 1 termmetro. 1 liga para torniquete. 2 vaso de precipitados de 250 mL Hielo. Solucin de citrato de sodio al 4%. Solucin de cloruro de calcio al 4%. 6 portaobjetos. 1 cubreobjetos. 1 tringulo de vidrio o 3 varillas cortas. 1 caja de Petri. 1 microscopio ptico Agua destilada. Solucin de azul de metileno al 1%. Lancetas estriles (una por cada integrante del equipo). Palillos. Suero anti-A. Suero anti-AB. Suero anti-B. Suero anti-D. Antes de iniciar cualquier maniobra experimental, el alumno debe contar con todo el material necesario y tener muy claro el procedimiento a seguir en cada etapa de la prctica. Es importante iniciar preparando una cmara hmeda que se usar para la formacin de fibrina (punto 3 de la parte B) ya que la cmara debe estar lista desde el momento de obtener la sangre. Revise el punto mencionado para preparar la cmara. A. FASE VASCULAR Y PLAQUETARIA. Limpie cuidadosamente con alcohol la parte interna del dedo medio de cualquier mano y perfore la piel con una lanceta. Conviene que sea un alumno el que ejecute las maniobras para la obtencin de la muestra y que otro sea el donador, ya que uno mismo no se logra perforar adecuadamente la piel. Presione ligeramente el dedo hasta que aparezca una gota de tamao mediano y despus depostela haciendo contacto con la superficie en algn punto de la periferia del papel filtro; en este momento ponga a funcionar el cronmetro. Cada diez segundos deber repetir esta maniobra, pero sin hacer presin sobre el dedo, depositando las gotas obtenidas hacia la derecha de la primera mancha recolectada y dejando una distancia entre las gotas de 0.5 cm siguiendo el permetro del papel filtro y si es necesario, proseguir en espiral hacia el centro del crculo. El experimento termina cuando ya no aparece ninguna mancha de sangre sobre el papel filtro y en ese momento se debe detener el cronmetro. B. FASE PLASMTICA. 1. Efecto de la temperatura. Se empieza a cronometrar el tiempo a partir del momento en el que a tres tubos de ensaye, perfectamente limpios y secos, se le coloca a cada uno, un mililitro de sangre recin extrada. Uno de los tubos se coloca en bao mara a una temperatura constante de 37C. El segundo tubo se coloca en hielo. El tercer tubo se deja en contacto externo con agua caliente a una temperatura de 60 C. Cada 30 segundos se debe verificar si ha habido coagulacin en alguno de los tubos, anotar el tiempo que

pas antes de observar la coagulacin. Se espera que la sangre coagule en el tubo que se encuentra a 37 C en el bao mara pero no en los otros dos tubos. Despus de un tiempo prolongado; por ejemplo, tres veces el tiempo que tardo en observarse la coagulacin en el tubo a 37 C, colocar los tubos en donde no se ha observado la coagulacin en el bao mara y empezar a contar el tiempo de coagulacin en esta situacin. 2. Accin del calcio. En un tubo de ensaye coloque una gota de la solucin de citrato de sodio (quelante de calcio), se agrega un mililitro de la sangre extrada, se agita suavemente y se deja reposar 15 minutos en el bao mara a 37 C. Despus de ese tiempo se observa que no hay coagulacin y se procede a colocar 3 gotas de la solucin de cloruro de calcio, se agita ligeramente el tubo y se regresa al bao mara. Haga observaciones cada 30 segundos hasta observar la coagulacin. 3. Formacin de fibrina. Prepare una cmara hmeda, colocando un tringulo de vidrio (o unas varillas) en el fondo de una caja de Petri, y agregando agua de la llave sin cubrir completamente el tringulo; dicha caja se tapa para permitir que el ambiente se sature de vapor de agua durante 15 minutos. Despus, deposite una gota de sangre fresca en un portaobjetos y coloque sobre ella un cubreobjetos. Coloque el portaobjetos sobrre el tringulo dentro de la caja de Petri. Despus de 30 minutos saque el portaobjetos de la caja y escurra unas gotas de agua destilada sobre el borde del cubreobjetos para aflojarlo y poderlo retirar. Lave cuidadosamente la pelcula con gotas de agua destilada y drene el exceso de agua con un papel absorbente. Haga una tincin de la preparacin colocando unas gotas de una solucin acuosa de Azul de metileno al 1% sobre el portaobjetos. Deje el colorante durante tres minutos y despus lave y deje secar. Observe en el microscopio con el objetivo de 10 aumentos y dibuje las fibras de fibrina. C. GRUPO SANGUNEO. En un portaobjetos limpio, marcado en uno de sus extremos, coloque dos gotas de sangre obtenidas por la puncin de un dedo utilizando una lanceta estril. Las gotas deben colocarse por separado, una en cada extremo del portaobjetos. En otro portaobjetos coloque otras dos gotas de sangre de la misma manera en que se hizo con el primer portaobjetos. A cada gota de sangre se le debe agregar una gota de suero, procure que las gotas de sangre y de suero sean aproximadamente iguales. Una gota de sangre debe mezclarse con el suero anti-A, otra con el suero anti-B otra con el suero anti-AB y la ltima con el anti-D. Para mezclar la sangre con el suero correspondiente utilice un palillo el cual debe ser diferente para cada muestra. Despus de un minuto observe si en las muestras hay o no hay aglutinacin; con base en lo anterior, determine el tipo sanguneo del individuo. La determinacin del tipo sanguneo se debe hacer para todos los miembros del equipo teniendo cuidado de utilizar siempre una lanceta estril para cada persona y palillos nuevos. RESULTADOS A.- FASE VASCULAR Y FASE PLAQUETARIA. Reportar el tiempo en que se complet esta etapa de la hemostasia. Mencionar cuntas manchas se lograron hacer sobre el papel filtro y cmo cambia su tamao. B.- FASE PLASMTICA. 1.- Efecto de la temperatura.

Reporte en forma de tabla el tiempo de coagulacin en cada uno de los tubos a diferentes temperaturas. Haga una grfica. Reporte qu ocurri con los tubos a temperaturas extremas cuando se colocaron a 37C. 2.- Efecto del calcio. Observaciones al agregar citrato de sodio. Mencione qu ocurre al agregar cloruro de calcio y en cunto tiempo. 3.- Formacin de fibrina. Realice un esquema de la preparacin observada en el microscopio conteniendo las fibras de fibrina y describa brevemente lo observado. C.- GRUPO SANGUNEO. Haga un esquema representando lo que se observ al mezclar las gotas de sangre con las gotas de los diferentes sueros. Reporte el tipo sanguneo de los integrantes del equipo. Reporte la frecuencia de cada uno de los tipos sanguneos en el grupo. Prese nte los datos en una grfica.