Segundo Premio Microbiología 2012-Mariela Reyes

Escuela Tcnica Superior de Ingenieros de Caminos, Canales y Puertos Departamento de Ingeniera Hidrulica y Medio Ambiente
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biolgicos de aguas residuales: Fangos Activados y Digestin Anaerobia
Trabajo de investigacin Autor:
Mariela Beatriz Reyes Sosa

Directores: Jos Ferrer Polo Luis Borrs Falomir Fotografas: Mariela Beatriz Reyes Sosa
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Agradecimientos
Le doy las gracias antes que nada a mi familia, por que a pesar de la distancia me expresan su apoyo y me motivan a continuar. Tambin expreso mis agradecimientos a todas las personas que de alguna manera han estado conmigo en la realizacin de este trabajo: En primer lugar a mis tutores, Jse Ferrer y Luis Borrs por su tiempo y dedicacin. Luis te agradezco la paciencia que me has tenido y espero sigas con ella para lo que continua. A la Doctora Aurora Seco esencial de este trabajo. por su apoyo y orientacin en el punto
A todos y cada uno de los chicos del laboratorio, ya que hicieron mas agradable el tiempo que pas en el laboratorio. Simplemente gracias por esta alli y por estar pendientes. A todos mis amigos tanto de Mxico como los de Valencia, que estan pendientes de mis avances y de mi, gracias por que no pasan el momento para motivarme a seguir, por sus consejos y aportaciones. En especial quiero agradecer a Rosa que siempre ha estado conmigo escuchandome y aconsejandome. A Marcos por que es tan objetivo que siempre me hace observaciones en mi trabajo. A Carles por ejercer cierta presin y ayudarme con el resumen en Valenciano. A Mariam por que es mi compaia en las buenas y en las malas, en las alegras y en las decepciones. A todas las dems personas que por falta de espacio omito nombres.
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RESUMEN La creciente industrializacin y desarrollo de las poblaciones ha producido un importante aumento del uso del agua y una mayor contaminacin de la misma. Por ello, se ha visto la necesidad de depurar las aguas residuales. La depuracin de las aguas residuales domsticas y/o urbanas se ha basado principalmente en la aplicacin de procesos biolgicos. Estos procesos dependen de las poblaciones microbianas presentes en las aguas residuales y en los sistemas de tratamiento. En funcin del tipo de proceso (Fangos activados y Digestin aerobia y/o anaerobia), vara la poblacin microbiana as como su abundancia, que se puede ver favorecida de alguna u otra manera por las caractersticas del proceso de tratamiento (Aerobio, Anaerobio y/o Anxico). En este trabajo se han identificado y cuantificado las poblaciones microbianas ms caractersticas de los procesos biolgicos llevados a cabo en la EDAR (Estacin Depuradora de Aguas Residuales) de la Cuenca del Carraixet (Valencia), que incluye un proceso de Fangos Activados y de Digestin Anaerobia. Con este trabajo se pretende conocer de forma global las poblaciones microbianas y las diferencias que existen en cuanto a presencia y abundancia en los procesos biolgicos que se realizan en una misma EDAR. Para poder llevar a cabo la determinacin de las poblaciones microbianas se adapt la tcnica molecular FISH (Fluorescent in situ hybridization) a las muestras examinadas, ya que, en el caso de muestras procedentes de digestores anaerobios, las muestras no presentaban una seal con suficiente intensidad, por lo que se modificarn los tiempos de fijacin e hibridacin con el fin de optimizar las seales de hibridacin. En los Fangos activados se detectaron bacterias amonio-oxidantes, nitritooxidantes, PAO (bacterias acumuladoras de poli-fosfatos), GAO (bacterias acumuladoras de glucgeno), bacterias desnitrificantes, bacterias metanotrficos, organismos metanognicos y bacterias sulfato-reductores (SRB). Entre estos organismos, los que presentaron una mayor abundancia fueron las bacterias sulfatoreductoras con un 27% (destacando el orden Desulfobacterales seguidas de las Desulfovibrionales) seguidas de las bacterias desnitrificantes con 19% (en su mayoria Azoarcus-Thauera-Castellaniella seguidas de Paracoccus). Los organismos metanognicos supusieron el 11% (Methanomicrobiales y Methanobacteriales), las bacterias nitrificantes el 9%, las GAO el 4%, las PAO un 2% y las Metanotrfas un 1%. El resto de bacterias no identificadas, supuestamente hetertrofas, corresponde a un 27%. En la Digestin anaerobia se detect un 30% de organismos metanognicos (Methanosarcinales, Methanomicrobiales y Metahanobacteriales), un 20% de bacterias sulfato-reductoras (Desulfovibrionales y Desulfobacterales) y un 10% de bacterias desnitrificantes (Thiobacillus denitrificans, Paracoccus y Azoarcus-ThaueraCastellaniella). El resto de bacterias no identificadas (supuestamente acidognicas) corresponde a un 40%. Cabe destacar que no era de esperar encontrar presencia de bacterias desnitrificantes en el digestor anaerobio, ni bacterias sulfato reductoras y archaeas
metanognicas en el reactor aerobio. Por lo que su presencia e interacciones resultan un punto importante dentro de la poblacin microbiana y los diferentes ciclos que se realizan durante el proceso biolgico. El conocimiento de las interacciones que tienen las bacterias en los diferentes procesos de una EDAR nos permiten avanzar en las modelaciones y simulaciones de los procesos para aproximarnos ms a la realidad, y poder mejorar la operacin de las plantas.
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RESUM La creixent industrialitzaci i desenvolupament de les poblacions ha produt un important augment de ls de laigua i una major contaminaci de la mateixa. Per aix, sha vist la necessitat de depurar les aiges residuals. La depuraci de les aiges residuals domstiques i/o urbanes sha basat principalment en laplicaci de processos biolgics. Estos processos depenen de les poblacions microbianes presents en les aiges residuals i en els sistemes de tractament. En funci del tipus de procs (Fangs activats i Digesti aerbia i/o anaerbia), varia la poblaci microbiana aix com la seua abundncia, que es pot veure afavorida dalguna o una altra manera per les caracterstiques del procs de tractament (Aerobi, Anaerobi i/o Anxic). En este treball shan identificat i quantificat les poblacions microbianes ms caracterstiques dels processos biolgics duts a terme en lEDAR (Estaci Depuradora dAiges Residuals) de la Conca del Carraixet (Valncia), que inclou un procs de Fangs Activats i de Digesti Anaerbia. Amb este treball es pretn conixer de forma global les poblacions microbianes i les diferncies que existeixen en quant a presncia i abundncia en els processos biolgics que es realitzen en una mateixa EDAR. Per a poder dur a terme la determinaci de les poblacions microbianes es va adaptar la tcnica molecular FISH (Fluorescent in situ hybridization) a les mostres examinades, ja que, en el cas de mostres procedents de digestors anaerobis, les mostres no presentaven un senyal amb suficient intensitat, per la qual cosa es van modificar els temps de fixaci i hibridaci a fi doptimitzar els senyals dhibridaci. En els Fangs activats es van detectar bacteris amoni-oxidants, nitrit-oxidants, PAO (bacteris acumuladors de poli-fosfatos), GAO (bacteris acumuladors de glucogen), bacteris desnitrificants, bacteris metanotrfics, organismes metanognics i bacteris sulfat-reductors (SRB). Entre estos organismes, els que van presentar una major abundncia van ser els bacteris sulfat-reductors amb un 27% (destacant lorde Desulfobacterals seguides de les Desulfovibrionals) seguides dels bacteris desnitrificants amb 19% (en la seu majoria Azoarcus-Thauera-Castellaniella seguides de Paracoccus). Els organismes metanognics van suposar 11% (Methanomicrobials i Methanobacterials), els bacteris nitrificants el 9%, les GAO el 4%, les PAO un 2% i les Metanotrfes un 1%. La resta de bacteris no identificats, suposadament hetertrofes, correspon a un 27%. En la Digesti anaerbia es va detectar un 30% dorganismes metanognics (Methanosarciales, Methanomicrobiales i Metahanobacteriales), un 20% de bacteris sulfat-reductors (Desulfovibrionales i Desulfobacterales) i un 10% de bacteris desnitrificants (Thiobacillus denitrificans, Paracoccus i Azoarcus-ThaueraCastellaniella). La resta de bacteris no identificats (suposadament acidognics) correspon a un 40%. Cal destacar que no era desperar trobar presncia de bacteris desnitrificants en el digestor anaerobi, ni bacteris sulfat reductors i archaeas metanognics en el reactor aerobi. Pel que la seua presncia i interaccions resulten un punt important dins de la poblaci microbiana i els diferents cicles que es realitzen durant el procs biolgic.
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El coneixement de les interaccions que tenen els bacteris en els diferents processos duna EDAR ens permeten avanar en les modelacions i simulacions dels processos per a aproximar-nos ms a la realitat, i poder millorar loperaci de les plantes.
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SUMMARY Increasing industrialization and development of populations has produced a significant increase in water usage and pollution. Therefore, the need to purify wastewater has become a major priority. The purification of domestic and urban wastewater has been based mainly on the application of biological processes. These processes depend on microbial populations. Depending on the type of process (activated sludge and aerobic or anaerobic digestion), the microbial populations and their abundance vary. This microbial populations can be favored in some way or another by the characteristics of the treatment process (aerobic, anaerobic or anoxic). In this work, most characteristic microbial populations that are present in the biological processes of a WWTP (Wastewater Treatment Plant) have identified and quantified. The WWTP (Cuenca del Carraixet) is placed in Valencia (Spain), and includes an activated sludge process and anaerobic digestion. This work is aimed to determine the overall microbial populations and the abundance differences between the biological processes that take place in a WWTP. As samples from the anaerobic digester examined by FISH (Fluorescent in situ hybridization) resulted in alow signal, it was necessary to adapt this molecular technique to this kind of samples. As a result, the fixation and hybridization times were changed. In the activated sludge process, ammonia-oxidizing bacteria, nitrite-oxidizing, PAO (poly-phosphates accumulating bacteria), GAO (glycogen accumulating bacteria), denitrifying bacteria, methanotrophic bacteria, methanogenic organisms and sulfatereducing bacteria (SRB) were detected. Among these organisms, the highest abundance was achieved by sulfate-reducing bacteria with a 27% (mainly Orders Desulfovibrionales and Desulfobacterales) followed by denitrifying bacteria with a 19% (mostly Azoarcus, Thauera, Castellaniella and Paracoccus). Methanogenic organisms accounted for 11% (Methanomicrobiales and Methanobacteriales), nitrifying bacteria were 9%, 4% of GAO, 2% of PAO 2%, 2% and 1% of methanotrophs. The other unidentified bacteria, presumably heterotrophic, corresponding to 27%. In the anaerobic digestion it was detected 30% of methanogenic organisms (Methanosarciales, Methanomicrobiales and Metahanobacteriales), 20% of sulfatereducing bacteria (Desulfovibrionales and Desulfobacterales) and 10% of denitrifying bacteria (Thiobacillus denitrificans, Paracoccus, Azoarcus, Thauera, and Castellaniella). The other unidentified bacteria (supposedly acidogenic bacteria) was 40%. It should be noted that it was not expected to find denitrifying bacteria in the anaerobic digester or sulfate reducing bacteria and methanogenic archaea in the aerobic reactor. So their presence and interactions are an important point in the microbial population and the different relationships that take place during the biological process. Knowledge of the interactions between bacteria in the different biological processes taking place in the WWTP allow us to advance on modeling and simulation
of the biological processes. This information is usefull to get closer to reality and to improve plant operation.
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INDICE
RESUMEN ....................................................................................................................................... I RESUM ................................................................................................................................................. III 1 1.1 1.2 1.3 1.3.1 1.3.2 1.3.3 1.3.4 1.3.5 1.3.6 1.3.7 1.3.8 1.4 INTRODUCCIN ................................................................................................................... 1
CARACTERSTICAS TPICAS DE LAS AGUAS RESIDUALES ............................................................... 1 PROCESOS BIOLGICOS EN AGUAS RESIDUALES ........................................................................... 2 MICROORGANISMOS ..................................................................................................................... 3 Bacterias amonio-oxidantes (AOB) y bacterias nitrito-oxidantes (NOB) ................................ 5 Bacterias acumuladoras de poli-fosfatos (PAO) ....................................................................... 7 Bacterias acumuladoras de glucgeno (GAO) .......................................................................... 8 Bacterias desnitrificantes ........................................................................................................ 10 Bacterias acidognicas/acetognicas ...................................................................................... 12 Bacterias metanotrfas........................................................................................................... 18 Bacterias sulfato-reductoras (SRB)......................................................................................... 19 Organismos metanognicos .................................................................................................... 24 TCNICA MOLECULAR PARA LA DETERMINACIN DE LAS POBLACIONES MICROBIANAS. HIBRIDACIN MOLECULAR FLUORESCENTE IN SITU (FISH) ......................................................................... 29 1.4.1 Fijacin de la biomasa para la hibridacin ............................................................................. 30 1.5 SONDAS ...................................................................................................................................... 32 2 3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 OBJETIVOS .......................................................................................................................... 33 MATERIALES Y MTODOS ............................................................................................. 35 PROCEDENCIA DE LA MUESTRA .................................................................................................. 35 TOMA DE MUESTRA .................................................................................................................... 35 HIBRIDACIN FLUORESCENTE IN SITU, FISH .............................................................................. 36 PROCEDIMIENTO ........................................................................................................................ 36 SONDAS ...................................................................................................................................... 39 CUANTIFICACIN DE LOS MICROORGANISMOS ........................................................................... 44
4 ADAPTACIN DE LA TCNICA FISH PARA MUESTRAS DE UN DIGESTOR ANAEROBIO ........................................................................................................................................... 45 4.1 4.2 4.3 4.4 RECOMENDACIN A PROBLEMAS ASOCIADOS CON LA DETECCIN DE LA FLUORESCENCIA ........ 45 DETERMINACIN DE LOS TIEMPOS DE FIJACIN Y DE HIBRIDACIN PTIMOS ............................. 46 CUANTIFICACIN DE LA SEAL DE HIBRIDACIN ....................................................................... 47 ANLISIS CUANTITATIVO ........................................................................................................... 48
5 DETECCIN Y CUANTIFICACIN DE LOS DISTINTOS GRUPOS BACTERIANOS PRESENTES EN LOS PROCESOS DE FANGOS ACTIVADOS Y DIGESTIN ANAEROBIA............................................................................................................................................ 51 DETECCIN Y CUANTIFICACIN DE LAS BACTERIAS NITRIFICANTES ........................................... 51 DETECCIN Y CUANTIFICACIN DE LAS BACTERIAS ACUMULADORAS DE POLI-FOSFATOS (PAOS) Y ACUMULADORAS DE GLCOGENO (GAOS) .............................................................................................. 53 5.3 DETECCIN Y CUANTIFICACIN DE LAS BACTERIAS DESNITRIFICANTES .................................... 55 5.4 DETECCIN Y CUANTIFICACIN DE LAS BACTERIAS METANOTROFAS ........................................ 57 5.5 DETECCIN Y CUANTIFICACIN DE LAS BACTERIAS SULFATO-REDUCTORAS (SRB) .................. 58 5.6 DETECCIN Y CUANTIFICACIN DE LAS BACTERIAS METANOGNICAS ...................................... 62 5.7 COMPARACIN DEL TOTAL DE LAS POBLACIONES BACTERIANAS ENCONTRADAS EN EL FANGO ACTIVADO Y EN LA DIGESTIN ANAEROBIA ................................................................................................ 64 6 7 8 CONCLUSIONES ................................................................................................................. 69 RECOMENDACIONES ....................................................................................................... 71 REFERENCIAS .................................................................................................................... 73 5.1 5.2
ANEXO .......................................................................................................................................... 85
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INDICE FIGURAS
Figura 1. Reacciones llevadas a cabo en los fangos activados...4 Figura 2. Reacciones que se llevan a cabo en la Digestin anaerobia. Garca 1991. ........................ 5 Figura 3. Clasificacin de las Sondas metanognicas en relacin con las bacterias metanognicas que detectan . .............................................................................................................................................. 27 Figura 4. Esquema de la Hibridacin Fluorescente in situ FISH. www.iqb.es................................ 30 Figura 5. Diferencia estructural celular entre las gram positivas y las gram negativas . ................. 31 Figura 6. Representacin esquemtica de los peptidosglicanos . ................................................... 32 Figura 7. Esquema de la EDAR del Carraixet. ................................................................................ 35 Figura 8. Hibridacin Fluorescente FISH sin modificacin de tiempos.......................................... 46 Figura 9. Esquema de trabajo para la adaptacin de la tcnica FISH a muestras del Digestor anaerobio.47 Figura 10. Hoja de calcul que genera el programa de cuantificacin. ........................................... 48 Figura 11. Hibridacin Fluorescente FISH con modificacin de tiempos de fijacin y de hibridacin.. ................................................................................................................................................ 49 Figura 12. Bacterias amonio-oxidantes en el Reactor aerobio.. ...................................................... 52 Figura 13. Bacterias nitrito-oxidantes en el Reactor aerobio.. ........................................................ 52 Figura 14. Bacterias PAO en el Reactor aerobio.. ........................................................................... 54 Figura 15. Bacterias GAO en el Digestor anaerobio.. ..................................................................... 54 Figura 16. Bacterias desnitrificantes.. ............................................................................................. 56 Figura 17. Bacterias Metanotrofas en el Reactor aerobio ............................................................... 58 Figura 18. Bacterias Sulfato-reductoras en el Digestor anaerobio. ................................................. 59 Figura 19. Bacterias Sulfato-reductoras en el Reactor aerobio.. ..................................................... 60 Figura 20. Bacterias Metanognicas en el Digestos anaerobio.. ..................................................... 63 Figura 21. Bacterias Metanognicas en el Reactor aerobio............................................................. 64 Figura 22. Comparacin de los grupos de bacterias en cada proceso analizado.. ........................... 65
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INDICE DE TABLAS
Tabla 1. Bacterias acidognicas hidrolticas de la digestin Anaerobia ......................................... 14 Tabla 2. Bacterias acidognicas fermentativas de la digestin anaerobia ...................................... 15 Tabla 3. Bacterias acetognicas sintrficas obligatorias de la digestin anaerobia ........................ 16 Tabla 4. Bacterias homoacetognicas de la digestin anaerobia ..................................................... 17 Tabla 5. Grupos nutricionales de las bacterias metanognicas........................................................ 28 Tabla 6. Cantidades de Formamida y agua para la preparacin de la solucin de hibridacin ..... 38 Tabla 7. Cantidades de NaCl para la solucin de lavado ............................................................... 39 Tabla 8. Sondas Generales .............................................................................................................. 40 Tabla 9. Sondas especficas para grupo Nitrificantes ...................................................................... 40 Tabla 10. Sondas especficas para el grupo PAO y GAO ............................................................... 41 Tabla 11. Sondas especficas para el grupo de las bacterias desnitrificantes .................................. 42 Tabla 12. Sondas especficas para el grupo de las bacterias metanotroficas ................................... 42 Tabla 13. Sondas especficas para las SRB ..................................................................................... 43 Tabla 14. Sondas especficas para las arqueas metanognicas ........................................................ 44 Tabla 15. Promedio de las reas (pixeles) ocupadas por las bacterias y error en la cuantificacin de la seal detectada en la muestra del digestor anaerobio para las bacterias SRB ................................... 49
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Introduccin
El agua como recurso natural se ha vuelto cada vez ms escasa con la creciente poblacin mundial. El dficit del agua es debido, sobre todo, al aumento de las necesidades surgidas del desarrollo econmico y de la explotacin demogrfica. El hombre ha utilizado el agua para fines cada vez ms numerosos, por lo que ha crecido la dependencia que tenemos hacia ella. El agua al precipitar durante su ciclo, arrastra impurezas del aire, al circular en la superficie se le aade otros contaminantes, ms la contaminacin generada por el hombre, esta ultima sea por la actividad agrcola, ganadera o industrial, hace sobrepasar el poder de autodepuracin de la naturaleza. A causa de esto se hace necesario tomar medidas para mitigar el problema de la contaminacin del agua. Para ello se lleva a cabo tratamientos fsicos, qumicos, mecnicos y biolgicos para depurar las aguas contaminadas generadas por las actividades humanas. A las aguas contaminadas por las actividades del hombre se le denomina agua residual. Las aguas residuales son el lquido recogido mediante la red de alcantarillado para su envo a una planta de depuracin (Mujeriego, 1990). Se considera aguas residuales a las aguas provenientes de las zonas habitadas y que son generadas principalmente por el desarrollo humano y por las actividades comerciales o domsticas de limpieza y alimentacin (Barajas, 2002). Las aguas residuales urbanas (ARU), son generadas cuando dentro de la misma red de alcantarillado que transporta el agua proveniente de las zonas habitadas, se vierte aguas residuales de origen industrial. Estas ltimas provienen de las instalaciones de manufacturado y elaboracin de alimentos. As mismo las ARU pueden contener aguas de escorrenta que acceden a la red de alcantarillado a travs de los pozos de registro y aguas subterrneas que se infiltran en la red a travs de uniones deterioradas o de grietas en las conducciones (Barajas, 2002). 1.1 Caractersticas tpicas de las aguas residuales
La composicin de un agua residual muestra un amplio margen de variacin entre las diferentes poblaciones. Esto se debe no solo a las influencias de origen industrial, comercial y fluvial que pudiera presentar si no tambin a los usos pblicos del agua en funcin de la naturaleza de la poblacin residente. En trminos generales, la mayor parte de los componentes presentes en un agua residual son materia orgnica, nutrientes, metales, materia inorgnica y microorganismos. Una considerable parte de estos componentes se encuentran en forma particulada.
1.2
Procesos biolgicos en aguas residuales
Las sustancias orgnicas que se encuentran en las aguas residuales, sufren cambios debido a la accin de los organismos vivientes que se encuentran en ellas. Todos los procesos biolgicos llevados a cabo en la depuracin de las aguas contaminadas con materias orgnicas biodegradables, se basan, en el proceso natural de autodepuracin de las aguas y por tanto en los requerimientos nutricionales de los microorganismos (Cataln, 1997). Los microorganismos en ausencia o presencia de oxgeno libre, descomponen la materia orgnica obteniendo la energa necesaria para sus necesidades metablicas y para elaborar otros materiales que incorporan a sus propias clulas (Cataln, 1997). El resultado final de la degradacin total de la materia orgnica, en presencia de oxgeno libre, es la formacin de compuestos oxidados como fosfatos, nitratos, sulfatos, anhdrido carbnico, etc. Cuando la degradacin se realiza en ausencia o escasez de oxgeno libre, o sea en un medio anaerobio, se obtienen compuestos intermedios como amoniaco, metano, sulfuros, etc. (Cataln, 1997). El objetivo fundamental del tratamiento biolgico de las aguas residuales con materias orgnicas biodegradables es estabilizar la materia orgnica. La estabilizacin de la materia orgnica presente en el agua se realiza mediante la intervencin de microorganismos, por lo que el xito de ste tratamiento radicar en favorecer la proliferacin de los mismos (Cataln, 1997). Los tratamientos biolgicos se prestan a diversas clasificaciones. Cabe distinguir entre dos tipos claramente diferenciados (Ferrer, 2007): 1. Procesos Biolgicos de cultivo en suspensin 2. Procesos Biolgicos de soporte slido En todos estos procesos es preciso retener en el sistema la biomasa creada con el objeto de que se produzca el proceso. En los de cultivo en suspensin se suele recurrir a una decantacin y recirculacin de la biomasa, mientras que en la de soporte slido la retencin de la biomasa queda asegurada por las caractersticas del propio proceso (Ferrer, 2007). Los sistemas ms caractersticos de los procesos de cultivo en suspensin son los fangos activados, las lagunas aireadas, el lagunaje y el tratamiento de fangos. Entre los procesos de soporte slido se encuentran los filtros percoladores, los biodiscos y los lechos de turba (Ferrer, 2007). Los fangos activados son los ms usados en las depuradoras de aguas residuales, as como tambin el tratamiento de fangos a travs de la digestin. En los sistemas de fangos activados, con las aguas residuales son introducidas muchas especies de organismos. Muchas de ellas encuentran en ellas un medio inadecuado y, como consecuencia de ello mueren; otras en cambio al ser favorables
persisten y se multiplican. La composicin especfica de los fangos activados estar determinada por la velocidad relativa de crecimiento de las especies, la disponibilidad de alimento en competicin con otras especies del mismo nivel trfico y el efecto de la prelacin de los organismos de niveles trficos ms altos. Otros factores importantes son, la disponibilidad de oxgeno, el pH, la temperatura y la presencia de agentes inhibidores o txicos. De todas las especies de un mismo nivel trfico que compiten por el mismo alimento la ms fuerte y mejor adaptada de ellas se convertir en dominante. Esta situacin debera conducir a la eliminacin de las otras especies que compiten. Esto no ocurre debido a las condiciones cambiantes que se dan conforme los fangos pasan a travs del sistema, que favorecen sucesivamente a diferentes especies, y a la introduccin constante de una poblacin microbiana mixta que mantienen la competicin por el alimento (Ferrer, 2007). Los microorganismos que se pueden encontrar en los sistemas de tratamiento de aguas residuales son, bacterias, protozoo, algas, hongos, rotferos y nemtodos. Siendo las bacterias las que constituyen el 95% de la biomasa en el proceso de fangos activados (Ferrer, 2007). Este trabajo se ha centrado en estudiar la poblacin bacteriana presente en los procesos biolgicos de una EDAR (Estacin Depuradora de Aguas Residual), describiendo algunos grupos funcionales de bacterias que se encuentran comnmente en las diversas aguas residuales en las plantas de tratamiento. Para la realizacin del trabajo nos basamos en la filogenia bacteriana y en la tcnica molecular FISH (Fluorescence in situ Hybridization ). 1.3 Microorganismos
Las bacterias son microorganismos unicelulares, que se multiplican por escisin celular, y son las principales responsables de la mineralizacin de la materia orgnica. Desde el punto de vista metablico, se clasifican en auttrofas y hetertrofas. La principal ventaja competitiva de las bacterias, reside en su extraordinaria facultad metablica, es decir, su capacidad de adaptacin a condiciones ambientales y sustratos orgnicos muy variados. Ciertos alimentos o sustratos orgnicos estimulan selectivamente la accin metablica de algunas bacterias. De la misma forma, las sustancias resultantes del metabolismo de un grupo de bacterias, estimulan a otros grupos de bacterias a multiplicarse (Cataln, 1997).
Principales grupos de bacterias presentes en los procesos biolgicos (fango activado y digestin anaerobia) de una Estacin depuradora de aguas residuales: Bacterias amonio-oxidantes (AOB) Bacterias nitrito-oxidantes(NOB) Bacterias acumuladoras de poli-fosfatos (PAO) Bacterias acumuladoras de glucgeno (GAO) Bacterias desnitrificantes Bacterias acidognicas/acetognicas
Organismos metanognicos Bacterias metanotrficas Bacterias sulfato-reductoras (SRB) Los 5 ltimos grupos corresponden a bacterias caractersticas de la digestin anaerobia. En la figura 1 se muestran las reacciones llevadas a cabo por las bacterias dentro de los fangos activados.
Figura 1. Reacciones llevadas a cabo en los fangos activados. En las reacciones que llevan a cabo las bacterias desnitrificantes son por enzimas estas son: 1. nitrito reductasa, 2. nitrito reductasa, 3. oxidonitrico reductasa y la 4. oxidonitroso reductasa .
En la figura 2 se muestran las reacciones que se dan dentro de un digestor anaerobio.

Polmero Biolgico
HIDROLISIS Y ACIDOGENESIS
Bacterias hidrolticas
Monmeros
Bacterias fermentativas BHA
NO3 -
SO4 2CO2+H2O Bacterias nitrato-reductoras NO2+ N2O+N2 NH4+ Piruvato, Succionato Lactato, Etanol Bacterias Sulfato-reductoras BSR Bacterias fermentativas SO4 2Acetato BMA SO42BSR
CH4 + CO2
Formato H 2+CO2
Acetato
Propionato Butirato Valerato Caproato
BSR Bacterias sincrnicas
CO2 + H2O
ACETOGNESIS
Bacterias homoacetognicas BHA
SO 4 2SO4 2CO2+H2O BSR Bacterias metanognicas acetoclasticas BMA CH4 + CO2 BMA CH4 + CO2 Bacterias metanognicas hidrogenotrficas. Acetato H 2+CO2 Acetato
CH4 + CO2
METANOGNESIS
Figura 2. Reacciones que se llevan a cabo en la Digestin anaerobia. Garca 1991.
En los apartados siguientes se describe cada grupo de las bacterias escritas anteriormente.
1.3.1 Bacterias amonio-oxidantes (AOB) y bacterias nitrito-oxidantes (NOB) Un grupo muy limitado de microorganismos auttrofos (bacterias nitrificantes) lleva a cabo el proceso de la nitrificacin. La nitrificacin se produce en dos pasos, cada uno de ellos realizado por un tipo especfico de bacterias. El primer paso se consiste en oxidar el amonio a nitrito, cuya reaccin es (Ferre, 2007): NH4+ + 3/2 O2 NO2- + 2H+ + H2O El grupo de bacterias que lleva a cabo esta oxidacin son las bacterias del gnero Nitrosomonas, Nitrosospira y Nitrosococcus (Teira, 1996).
La clasificacin taxonmica de estas bacterias basada en la segunda edicin del manual Bergeys (Garrity et al., 2001) es la siguiente: Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase II: -proteobacteria Orden V: Nitrosomonadales Familia I: Nitrosomonadaceae. Gnero I: Nitrosomonas Grero II: Nitrosospira Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase III: -proteobacteria Orden I: Chromatiales Familia I: Chromatiaceae Gnero X: Nitrosococcus
El segundo paso consiste en la oxidacin de nitrito a nitrato. La reaccin que se lleva a acabo es la siguiente (Ferre, 2007): NO2- + O2 NO3El grupo de bacterias que participan en este proceso son las bacterias del gnero Nitrobacter y Nitrospina (Teira, 1996). La clasificacin taxonmica es la siguiente (Garrity et al., 2001): Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase I: -proteobacteria Orden VI: Rhizobiales Familia VII: Bradyrhizobiaceae Gnero I: Nitrobacter Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase IV: -proteobacteria Orden III: Desulfobacterales Familia III: Nitrospinaceae Gnero I: Nitrospina Las bacterias nitrificantes se caracterizan por una baja tasa de crecimiento. Esto es debido a la poca energa obtenida con las oxidaciones para la nitrificacin en las plantas de tratamiento biolgico de aguas residuales (Teira, 1996).
Tanto las nitrosomonas como las nitrobacter son bacterias auttrofas quimiosintticas. Esto significa que obtienen la energa necesaria para sintetizar tejido celular mediante reacciones de oxidacin-reduccin, y que la fuente de carbono que utilizan para este fin es CO2 (inorgnico) que tiene que ser reducido antes de pasar a formar parte de la biomasa celular. La desaparicin de estos organismos por muerte o lisis da lugar a la aparicin en la disolucin de sustrato lentamente biodegradable, que es hidrolizado y consumido por los organismos hetertrofos (Ferrer, 2007). 1.3.2 Bacterias acumuladoras de poli-fosfatos (PAO) Se ha comprobado que la eliminacin biolgica de fsforo es llevada a cabo por un grupo de bacterias denominadas PAO (Polyphosphate Accumulating Organisms). Estas bacterias liberan y toman fsforo en condiciones anaerobias y aerobias alternadas. En condiciones anaerobias la materia orgnica fcilmente biodegradable es descompuesta por las bacterias acidognicas a cidos grasos voltiles de cadena corta. Estos cidos grasos son absorbidos por las bacterias PAO y almacenados como polihidroxi-butirato (PHB) y otros polihidroxialcanoatos (PHA). La energa necesaria para el almacenamiento de los cidos grasos, es obtenida de la descomposicin de los polifosfatos en condiciones anaerobias. Durante este proceso es cuando se produce la descarga de fosfatos al medio. Bajo condiciones aerobias, las bacterias PAO pueden utilizar el sustrato almacenado (PHB) dando lugar a un crecimiento de las mismas. As mismo, utilizan parte de este sustrato almacenado para acumular fsforo intracelular en forma de polifosfatos, asegurando las reservas de energa necesaria para la etapa anaerobia. En un estudio en 1994 se utiliz la tcnica FISH (Fluorescence in situ Hybridization) para estudiar la comunidad microbiana en una planta de tratamiento de aguas residuales en las que se produca el fenmeno de la eliminacin biolgica de fsforo (Wagner et al., 1994). La poblacin bacteriana result en su mayora Actinobacteria y -proteobacteria, seguida de -proteobacteria, y en un mnimo de la poblacin la especie Acinetobacter. Al ao siguiente se realizaron estudios comparando la estructura de la comunidad bacteriana de fangos con y sin eliminacin de fosfatos (Bond et al., 1995). Se operaron dos reactores de laboratorio con diferentes capacidades para la eliminacin de fosfatos. En ambos reactores, el grupo dominante de bacterias perteneca a la clase proteobacteria y dentro de esta clase, el genero Rhodocyclus se encontraba en mayor proporcin en el reactor que experimentaba mejor la eliminacin de fsforo. En 1999 un estudio indic la posicin filogentica definitiva del subgrupo proteobacteria, como muy cercano al gnero Rhodocyclus. A este se le llam Candidatus Accumulibacter Phosphatis (Hesselmanm et al., 1999). Otro estudio realizado un ao mas tarde comprob que Accumulibacter era capaz de realizar el transito de los polifosfatos en el medio (Croccetti et al., 2000). Estos estudios
demostraron que Accumulibacter corresponda con el fenotipo de las PAO y que predominan en los reactores tanto de laboratorio como los industriales. Se han desarrollado diversas sondas para detectar los principales miembros de Accumulibacter en las muestras de aguas residuales. Algunas de estas sondas son: PAO462, PAO651, PAO846 (Croccetti et al., 2000). El uso conjunto de las sondas forman la sonda PAOMIX que cubrira todas las secuencias conocidas de las bacterias Accumulibacter en las muestras de fangos activados. Las taxonomas de las algunas bacterias PAO segn la segunda edicin del manual Bergeys (Garrity, et al., 2001) son: Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase II: -proteobacteria Orden VI: Sin clasificacin en -proteobacteria Familia I: Candidatus Accumulibacter Gnero: Candidatus Accumulibacter Phosphatis Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase II: -proteobacteria Orden VI: Rhodocyclales Familia I: Rhodocyclaceae Gnero I: Rhodocyclus Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase III: -proteobacteria Orden IX: Pseudomonadales Familia II: Moraxellaceae Gnero II: Acinetobacter
La reaccin de la degradacin de polifosfato en condiciones anaerobias es (Ferrer, 2007): 2C2H4O2 + (HPO3) + H2O (C2H4O2)2 + PO4-3 + 3H+ La reaccin de la toma de fosfatos en condiciones aerobias es (Ferrer, 2007): (C2H4O2)2 + 0.2 PO4-3 + 1.2 O2 + 0.16 NH4+ 0.16C5H7NO2 + 1.2 CO2+ 0.2 (HPO3) + 0.44 OH- + 1.44 H2O
1.3.3 Bacterias acumuladoras de glucgeno (GAO) Las bacterias GAO (Glycogen Accumulating Organisms) son bacterias que compiten con las PAO. Poseen un metabolismo muy similar al de las PAO, ya que al
igual que ellas, utilizan los cidos grasos voltiles para la produccin de PHA en las zonas anaerobias, y sintetizan glucgeno en las zonas aerobias. El trmino GAO fue propuesto en 1995, definido como el fenotipo de organismos que acumulan glcogeno aerbicamente, y lo consumen anaerbicamente como fuente de energa. Esto lo realizan con el fin de tomar fuentes de carbono y almacenarlas en forma de PHA (Mino et al., 1995). Existe gran diversidad filogentica entra las GAO, entre ellas Amaricoccus spp. y Defluviicoccus vanus, de la clase de -proteobacteria; Quadracoccus spp, de la clase proteobacteria; algunas bacterias de la clase -proteobacteria y algunas Actinobacteria como Tetrasphaera spp., Micropruina glycogenia y Kinosphaera limosa (Maszenan et al., 1997; Shintani et al., 2000; Kong et al., 2001; Hanada et al., 2002; Liu et al., 2002). En 1999 se disearon dos sondas FISH (Gam1019 y Gam1278) para hibridar sobre las bacterias GAO pertenecientes a la clase -proteobacteria (Nielsen et al., 1999). Estas sondas fueron utilizadas para un fango deteriorado de un proceso de eliminacin de fsforo y encontraron que el 35% de la poblacin microbiana coincidan con las bacterias GAO. Aos mas tarde se realizo un estudio donde se utiliz un fango enormemente deteriorado de un proceso de eliminacin de fsforo (Crocetti et al., 2002). Como resultado se diseo dos nuevas sondas (GAOQ431 y GAOQ989) que hibridaban sobre bacterias pertenecientes a la clase -proteobacteria. Estas sondas hibridaban bacterias pertenecientes al mismo grupo que se hibridaban con las sondas diseadas en 1999. Sin embargo se identific claramente el fenotipo GAO en este grupo de bacterias y las llamaron Candidatus Competibacter phosphatis (Crocetti et al., 2002). En el 2002 se realiz in minucioso estudio en el que se identificaron un nuevo grupo de GAO compuesto por siete subgrupos dentro de la clase de -proteobacteria (Kong et al., 2002). Se disearon 10 sondas FISH para hibridas especficamente sobre este nuevo grupo de bacterias a diferentes niveles jerrquicos: GB, la sonda para el nivel ms general, fue dividida en GB_G1 (idntica a GAOQ989), GB_G2 y GB_1-GB_7. Las bacterias que hibridaban estas sodas mostraban morfologas de cocos y bacilos. Otros dos subgrupos de la clase -proteobacteria y prximos a Defluviicoccus vanus, han sido relacionados con el fenotipo GAO. El primero de los subgrupos comprende las bacterias que hibridan con las sondas TFO_DF218 y TFO_DF618 (Wong et al., 2004). Este grupo de bacterias mostr una importante presencia en los reactores de laboratorio, pero no en plantas de tratamiento reales. A este grupo se le conoce como Defluviicoccus vanus Cluster 1. El segundo subgrupo corresponda con bacterias encontradas en reactores alimentados con propionato (Meyer et al., 2006). Las sondas diseadas para hibridar sobre este subgrupo fueron DF988 y DF1020. A este grupo se le ha llamado Defluviicoccus vanus Cluster 2. Las taxonomas de las bacterias GAO segn la segunda edicin del manual Bergeys (Garrity, et al., 2001) son: Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase I: -proteobacteria 9
Orden III: Rhodobacterales Familia I: Rhodobacteraceae Gnero III: Amaricoccus Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase I: -proteobacteria Gnero: Defluviicoccus vanus Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase II: -proteobacteria Gnero: Quadracoccus spp. Dominio: Bacteria Phylum BXIV: Actinobacteria phy. nov. Clase I: Actinobacteria Subclase V: Actinobacteridae Orden I: Actinomycetales Suborden: Micrococcineae Familia X: Intrasporangiaceae Gnero VIII: Tetrasphaera Dominio: Bacteria Phylum BXIV: Actinobacteria phy. nov. Clase I: Actinobacteria Subclase V: Actinobacteridae Orden I: Actinomycetales Suborden IX: Propionibacterineae Familia II: Nocardioidaceae Gnero VI: Micropruina
Las reacciones que llevan a cabo son (Oehmen et al, 2005): Condiciones anaerobias C2H4O2 + 1.12CH10/6O5/6 PHA(1.358PHB + 0.456PHV + 0.0367PH2MV) + 0.27CO2 Condiciones aerobias 4/3CH1.5O0.5 + 4/6 ATP + 5/6 H2O CH10/6O5/6 1.3.4 Bacterias desnitrificantes Existe un gran nmero de bacterias capaces de llevar a cabo el proceso de desnitrificacin, ya que muchas bacterias aerobias pueden utilizar los nitratos para su respiracin en condiciones anaerobias (anxicas) (Barajas, 2002). Las bacterias que
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llevan a cabo la desnitrificacin pueden ser, tanto bacterias hetertrofas (utilizan el Carbono de la materias orgnica para la sntesis celular y como fuente de energa) como anaerobias facultativas (utilizan el oxgeno y el nitrato como aceptor de electrones) (Barajas, 2002). Aunque existen bacterias autotrofas que tambin son capaces de llevar a cabo la desnitrificacin (Ferrer, 2007). Las bacterias desnitrificantes son filogenticamente diversas y estn distribuidas ampliamente en ecosistemas acuticos y terrestres. El proceso de desnitrificacin ocurre en muchas especies de Eubacteria y en unas pocas Arqueobacterias. Las Proteobacterias y las Enterobacterias son anaerobias facultativas, debido a que cambian el aceptor de electrones como el oxgeno por xidos de nitrgeno (NO2, NO3) bajo condiciones anxicas (Benavides et al., 2006). Los tpicos gneros desnitrificantes organotrficos de los sistemas de fangos activados son: Achromobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Bacillus, Flavobacterium, Hypomicrobium, Moraxella y Pseudomonas (Wanner, 1994). La estructura de la comunidad de bacterias desnitrificantes se ve afectada por las diversas fuentes de carbono. Esto se demuestra por el enriquecimiento de las diversas bacterias desnitrificantes con metanol y acetato (Ginige et al., 2004, 2005; Hallin et al., 2006; Osaka et al., 2006; Morgan et al., 2008). Se sospechaba que en las plantas de lodos activados para la eliminacin de carbono, nitrificacin y desnitrificacion dominaban entre las desnitrificantes la proteobacteria del gnero Aquaspirillus, seguidas de las Thauera y Azoarcus (Thomsen et al., 2007). Sin embargo se ha observado que las Zoogloea junto con Azoarcus y Thauera abundan y se cree que son las dominantes en la desnitrificacion de las plantas de tratamiento industrial (Juretschko et al., 2002). Las -proteobacteria del orden Methylophilales del gnero Dechloromonas y Thauera fueron las bacterias desnitrificantes dominantes en fangos activados con metanol (Ginige et al., 2004) y acetato (Ginige et al 2005) respectivamente. Recientemente se han hallado otras proteobacteria capaces de desnitrificar en el tratamiento de lodos activados, estas son: Comamonadaceae y algunas Alphaproteobacterias Rhodobacteraceae (Osaka et al., 2006). Muchos investigadores han estudiado desnitrificar en presencia de azufre y tiosulfato como donadores de electrones, esto con cultivos puros de Thiobacillus desnitrificans y Paracoccus (Lee, et al., 2008). Thiobacillus desnitrificans es capaz de crecer como anaerobios facultativos quimiolitotrofos, de oxidar compuestos inorgnicos de azufre, nitrato y otros compuestos nitrogenados (Lee, et al., 2008). Las taxonomas de los microorganimos desnitrificantes segn la segunda edicin del manual Bergeys (Garrity, et al., 2001) son:
Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase I: -proteobacteria Orden III: Rhodobacterales Familia I: Rhodobacteraceae 11
Gnero XI: Paracoccus Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase II: -proteobacteria Orden II: Hydrogenophilales Familia I: Hydrogenophilaceae Gnero II: Thiobacillus Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase II: -proteobacteria Orden VI: Rhodocyclales Familia I: Rhodocyclaceae Gnero II: Azoarcus Gnero IX: Thaurea
Las reacciones que se llevan a cabo en la desnitrificacin son por va enzimtica de las bacterias desnitrificantes (Sunil et al., 2010). Estas son: NO3- NO2- [NO] N2O N2 1. 2. 3. 4. Enzima nitrato reductasa Enzima nitrito reductasa Enzima oxido nitrico reductasa Enzima oxido nitroso reductasa
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La reaccin de reduccin del nitrato a nitrgeno gas, utilizando metanol como fuente de carbono puede representarse de la siguiente manera (Ferrer, 2007): Primera fase: 6NO3- + 2CH3OH 6NO2- + 2CO2 + 4H2O Segunda fase: 6NO2-+ 3CH3OH 3N2 + 3CO2 + 3H2O + 6OH-
1.3.5 Bacterias acidognicas/acetognicas Las bacterias acidognicas o fermentativas producen cidos grasos voltiles, lactato, etanol, formato, hidrgeno y bixido de carbono (Ramrez, 1992). En el caso de la celulosa se pueden representar en tres niveles (Guyot, 1988):
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Primer nivel: bacterias primarias. Son las que hidrolizan la celulosa a celobiosa, glucosa, etanol, lactato, acetato, hidrgeno y bixido de carbono. Segundo nivel: bacterias secundarias. Son las que hidrolizan celobiosa + glucosa a etanol, lactato, hidrgeno y bixido de carbono, Tercer nivel: bacterias auxiliares. Son las que transforman el etanol o el lactato a acetato, hidrgeno y bixido de carbono. Adems de las bacterias celulolticas existen bacterias proteolticas y lipolticas (Ramirez, 1992). Dentro de las especies celulolticas anaerobias ms numerosas se encuentran el gnero Clostridium (tabla 1). La poblacin bacteriana fermentativa vara mucho con el sustrato, en la tabla 2 se muestran diversas bacterias y sus productos. Las bacterias acetognicas son a menudo llamadas bacterias homoacetognicas. Estos son organismos estrictamente anaerobios (Brauman et al., 1992), que utilizan la va del acetil-CoA para reducir las emisiones de CO2, y tienen como acetato su producto principal de la respiracin (Wood y Ljunadahl 1991; Drake 1994). La mayora de las bacterias acetognicas se han aislado de hbitats anaerobios estrictos, tales como, en sedimentos marinos o de estuarios, estanques de agua dulce o los lodos de depuradoras anxicas (Drake 1994; Schink 1994). Filogenticamente las bacterias acetognicas no forma una unidad distinta, pero estn incluidas dentro del gran grupo filogentico de las Clostridios Gram-positivas (Tanner y Woese 1994). Las bacterias acetognicas son muy particulares, ya que solamente pueden crecer en presencia de otras bacterias anaerobias estrictas consumidoras de hidrgeno, como las metanognicas hidrogenotrofas o algunas sulfato-reductoras en presencia de sulfato. El descubrimiento de estas bacterias puso en evidencia el proceso de transferencia de interespecies de hidrogeno. En la tabla 3 se muestra algunas bacterias acetognicas y las reacciones que llevan a cabo.
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Tabla 1. Bacterias acidognicas hidrolticas de la digestin Anaerobia (Garca, 1983)
Especie Acetivibrio cellulolyticus Bacteroides succinogenes Butyrivibrio fibrisolvens Cillobacterium cellulosolvens Ruminococcus Albus Ruminococcus flavifaciens Bacteroides ruminicola Butyrivibrio fibrisolvens Bacillus spp. Bacteroides spp. Clostridium butyricum Clostridium spp. Lactobacillus spp. Micrococcus spp. Pseudomonas spp. Clostridium butyricum Anaerovibrio lipolytica Bacillus spp. Clostridium acidi urici Clostridium cylindrosporum Micrococcus aerogenes Micrococcus lactilycus Bacillus spp. Clostridium spp. Bifidobacterium spp. Peptococcus anaerobus Staphylococcus spp.
Sustrato Celulosa
Hemicelulosas
Almidn
Pectinas Lpidos
Compuestos nitrogenados
Protenas
Termoflicas Clostridium thermocellum Clostridium thermohydrosulfuricum Celulosa Almidn y Pectinas
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Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biolgicos de aguas residuales: Fangos Activados y Digestin Anaerobia Tabla 2. Bacterias acidognicas fermentativas de la digestin anaerobia (Garca, 1983)
Especie
Acetobacterium woodii Clostridium aceticum Clostridium formiaceticum Butyribacterium methylotrophicum Eubacterium sp. Acidaminococcus sp. Clostridium sp. Propionibacterium sp. Anaerovibrio sp. Veillonella sp. Lactobacillus sp. Bifidobacterium sp. Ruminococcus sp. Leptotrichia sp. Streptococcus sp. Succinivibrio sp. Butyrivibrio sp. Fusobacterium sp. Megasphaera
Metabolitos
Acetato
Acetato, Butirato
Acetato, Butirato, Etanol Acetato, Propionato
Acetato, Etanol, Lactato Acetato, Lactato Acetato, Lactato, Formato Lactato
Succinato Butirato
Butirato, Isobutirato, Valerato, Isovalerato, Caproato
Termoflicas Clostridium thermo-aceticum Acetogenium kivui Thermo-anaerobium brockii Thermo-bacteroides acetoethilicus Thermo-anaerobacter ethanolicus Clostridium thermo-saccharolyticum Acetato
Lactato, Acetato, Etanol Etanol, Acetato, Butirato, Isobutirato Etanol, Acetato, Lactato, Isobutirato, Isovalerato Etanol, Acetato, Lactato, Butirato, Formato
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Tabla 3. Bacterias acetognicas sintrficas obligatorias de la digestin anaerobia (Garca, 1991)
Bacterias Organismos S (Pelobacter sp.) Syntrophobacter wolinii Syntrophomonas bryantii sapovorans wolfei sub. sp. saponavida wolfei sub. sp. Wolfei Syntrophospora bryantii Syntrophus buswellii
Reaccin Etanol+H2Oacetato+H2O Propionato+3 H2Oacetato+3 H2O+CO2 Butirato+2 H2O2 acetato+2 H2O
Benzoato+7 H2O3 acetato+3 H2O+CO2
Existen otras bacterias fermentativas (tabla 4) cuyas caractersticas son (Eichler y Schink, 1984): a). tres moles de acetato deben de ser formados a partir de la glucosa y fructosa. b). no hay hidrgeno molecular producido. c). el bixico de carbono es necesario para el crecimiento. d). el bixico de carbono es incorporado al acetato dependiendo del sustrato utilizado.
Estas bacterias se dividen en dos grupos, en la tabla 4 se divide los dos grupos de acuerdo a la reaccin para la formacin del acetato.
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Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biolgicos de aguas residuales: Fangos Activados y Digestin Anaerobia Tabla 4. Bacterias homoacetognicas de la digestin anaerobia (Garca, 1991)
Grupo 1: H+ (reduccin de un compuesto carbonado) + CO2 acetato Gnero Especie

Butyribacterium Clostridium rettgeri acidiurici cylindrospermum formicoaceticum magnum thermoaceticum glycinophilus
Peptococcus
Grupo 2: H2 + CO2 acetato Gnero

Acetoanaerobium Acetobacterium
Especie
noterae carbinolicum malicum termitida wieringae Woody rigidum arabaticum paucivorans ruminis aceticum ljungdahlii mayombii thermoautotrophicum limosum acidovorans malonica ovata paucivorans sphaeroides termitida
Acetofilamentum Acetohalobium Acetothermus Acetitomaculum Clostridium
Eubacterium Sporomusa
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1.3.6 Bacterias metanotrfas Las bacterias oxidantes de metano (metanotrfos) son un nico grupo de bacterias metilotrficas que utilizan el metano y compuestos pequeos de carbono como su fuente de energa (Murrell, 1994; Hanson and Hanson, 1996). Tras el anlisis de 16s rADN se defini las relaciones filogenticas y ocho gneros de organismos metanotrofos: Methylococcus, Methylomonas, Methylomicrobium, Methylobacter, Methylocaldum, Methylosphaera, Methylocystic y Methylosinus. Estos gneros se dividen en dos distintos grupos filogenticos. Tipo I (Methylomonas, Methylomicrobium, Methylobacter, Methylocaldum, Methylosphaera), este grupo capaz de asimilar el formaldehdo producido a partir de la oxidacin del metano a travs del metanol, y Tipo II (Methylocystis y Methylosinus), utilizan el grupo de la serina para la asimilacin del formaldehdo (Hanson and Hanson, 1996; Bourne et al., 2000). Los miembros del gnero Methylococcus poseen una combinacin de caractersticas tanto del Tipo I como del Tipo II metanotrofos. El Tipo I (incluyendo Methylococcus) se encuentra en la subdivisin de proteobacteria de la clase proteobacteria, mientras que el grupo II se encuentra en a subdivisin -proteobacteria (Tsien et al., 1990; Brusseau et al. 1994; Bourne et al., 2000). Existen pocos estudios utilizando FISH para la deteccin especfica de las metanotroficas. Recientemente se ha aplicado la tcnica FISH para determinar la abundancia de diferentes grupos filogenticos de metanotrofos en una turba de Sphagnum al oeste de Siberia (Dedysh et al., 2001). El conjunto de sondas metanotroficas incluyo sondas especificas para el Tipo I MOB (Methane Oxidising Bacteria) (sonda M-84 y M-705) o para el grupo de Tipo II MOB Methylosinus/Methylocystis (sondas Ma-464 MA-221 y M-450), as como las sondas (Mcell_1026 y Mcell-181) para el methanotroph acidfilas palustris Methylocella (Dedysh et al., 2000; Dedysh et al., 2003). Hasta hace poco, las secuencias de genes de 16s rRNA de Tipo II MOB eran muy poco representadas en la base de datos del dominio pblico. Esto hizo imposible formular sondas permitiendo la diferenciacin entre Methylocystis spp. y especies de Methylosinus (Dedysh et al., 2003). Incluso una publicacin reciente ha trabajado con sondas de oligonucletidos 16s rRNA dirigidas a un solo grupo (Gulledge et al., 2001). La base de datos de las secuencias de 16s RADN del Tipo II MOB fue descrita en un estudio en el 2002 (Heyer et al., 2002). La reaccin que se lleva a cabo por las bacterias metanotrofas es (Modin et al., 2007): CH4 + 1.02 O2 + 0.786 NO3- + 0.786 H+ 0.393 N2 + 2.39 H2O + CO2 Las taxonomas de los distintos gneros de las bacterias metanotroficas segn el manual Bergeys (Garrity, et al., 2001) son:
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Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase I: -proteobacteria Orden VI: Rhizobiales Familia V: Methylocystaceae Gnero I: Methylocystis Grero III: Methylosinus Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria phy. nov. Clase III: -proteobacteria Orden VII: Methylococcales Familia I: Methylococcaceae Gnero I: Methylococcus Gnero II: Methylobacter Gnero III: Methylocaldum Gnero IV: Methylomicrobium Gnero V: Methylomonas Gnero VI: Methylosphaera 1.3.7 Bacterias sulfato-reductoras (SRB) Llevan a cabo el ciclo del sulfuro, son importante reguladores de una variedad de procesos esenciales como: descomposicin de materia orgnica, biodegradacin de contaminantes cloro-aromticos, metilacin del mercurio (Fauque, 1995; Barton, 1995) y remediacin ambiental en diversos ambientes. La reduccin desasimilatoria del sulfato es un proceso clave en los ciclos biogeoqumicos del azufre, del carbono y del hierro, oxidndose la materia orgnica de forma anaerobia (Pallud & Van Cappellen, 2006). Los sustratos a partir de los cules las bacterias sulfato reductoras obtienen energa directamente van desde el hidrgeno hasta compuestos aromticos, aunque la mayora utiliza sustratos tales como acetato, lactato, piruvato y etanol, que son compuestos comunes en los ecosistemas (Pallud & Van Cappellen, 2006). Las bacterias sulfato-reductoras que se conocen estn divididas entre oxidadores completos y en oxidadores incompletos. Las bacterias que se conocen como oxidadores incompletos, tales como los Desulfovibrionales y la familia Desulfobulbeceae y aquellas conocidas como oxidadores completos, principalemente representados por la familia Desulfobacteraceae pueden vivir en ambientes extremos halfilos, esto indica que existen SRB haloflicas tolerantes a las sales, las cuales posiblemente poseen nuevas vas metablicas, siendo capaces de degradar anaerbicamente compuestos complejos tales como la celulosa (Foti et al., 2007). Las SRB tambin son importantes miembros de la comunidad microbiana involucrada en la reduccin de metales que ocurre en una variedad de ambientes incluyendo plantas productoras de aceites y gas, aguas de desecho de origen domstico, industrial y de minas (Singleton, 1993).
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El sulfato es utilizado como un aceptor terminal de electrones, pero la mayora de las SRB tambin son capaces de crecer sobre una amplia variedad de otros aceptores de electrones, tales como tiosulfato, sulfito, azufre elemental y nitrato (Bak et al., 1991). Entre los dadores de electrones simples tenemos al etanol, lactato e hidrgeno hasta compuestos ms complejos como los hidrocarburos (Jorgensen, 1982; Rabus et al., 1996; Krekeler et al., 1998; Krumholz et al., 1999; Steger et al., 2002; Kaksonen et al., 2004). Se conoca la imposibilidad de las SRB de utilizar carbohidratos, sin embargo, se han encontrado cepas de Desulfovibrio capaces de utilizar poliglucosa y nitrocelulosa como fuente de carbono (Petrova et al., 2002). Adems son capaces de oxidar acetato a CO2 y reducir el sulfato a sulfuro (Krumholz et al., 1999) mediante el ciclo modificado de cidos tri-carboxlicos y va acetil-CoA, siendo este ultimo el ms empleado por las SRB (Krumholz et al., 1999). Tambin se sabe que muchas cepas SRB pueden fijar N2 y usar el nitrgeno de los aminocidos como fuente de nitrgeno, algunas Desulfovibrio son capaces de utilizar nitrato como aceptor final de electrones, otras reducen el nitrato a amonio (Lie et al., 1999). Adicionalmente las SRB pueden tolerar una variedad de metales pesados y sulfuro disuelto, algunos de estos organismos son capaces de reducir Fe +3 a magnetita (Fe3O4) o siderita (FeCO2) y U+4 a uranito (UO2), aunque no generen energa a partir de estos procesos (Lovley et al., 1992; Chang et, al., 2001). Los dadores de electrones utilizados por las SRB son principalmente compuestos de bajo peso molecular y a la mayora de estos son conocidos como productos fermentativos de la degradacin bacteriana de carbohidratos, protenas y otros compuestos de detritos. Unas pocas SRB son capaces de degradar complejos moleculares como compuestos aromticos (Widdel, 1988), siendo los dadores de electrones ms importantes el H2, acetato, lactato, butirato y propionato (Sorensen et al., 1981; Postgate, 1984; Hao et al., 1996; Fukui et al, 1999). Algunas de las reacciones ms importantes que llevan a cabo las bacterias sulfatoreductoras (Ruel et al. 2002) son: C2H4O2 + SO42- S2- + 2H2O + 2CO2 Ac. Actico C3H6O2 + 3/4 SO42- 3/4 S2- + C2H2O2 + H2O + CO2 Ac. Propinico C4H8O2 + 3/2 SO42- 3/2 S2- + C2H2O2 + 2 H2O + 2 CO2 Ac. Butrico
Clasificacin filogentica y taxonoma Segn los anlisis de secuencias de RNAr permiti realizar la clasificacin de varias especies de SRB (Castro et al., 2000).
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SRB gram-negativas mesofilicas.- Desulfobulbus, Desulfomicrobium, Desulfomonas, Desulfovibrio, Desulfobacter, Desulfobacterium, Desulfococcus, Desulfomonile, Desulfonema, Desulfosarcina. SRB gram-positivas formadoras de esporas.- Desulfotomaculum SRB termofilicas.- Thermodesulfobacterium SRB arqueas termofilicas.- Archaeoglobus Todos estos grupos se caracterizan por que utilizan el sulfato como aceptor de electrones durante la respiracin anaerobia con la consecuente produccin de sulfuro de hidrgeno H2S. Daly et al., 2000, clasific a las SRB ms conocidas y representativas, restringindose a gneros mesoflicos dentro de la subdivisin delta-proteobacteria y gram (-/+), agrupndolos en seis grupos filogenticos distintos: Grupo 1. Desulfotomaculum (DFM). Grupo 2. Desulfobulbus (DBB). Grupo 3. Desulfobacterium (DBM). Grupo 4. Desulfobacter (DSB). Grupo 5. Desulfococcus, Desulfonema, Desulfosarcina (DCC). Grupo 6. Desulfovibrio, Desulfomicrobium (DSV). Grupo 1. Desulfotomaculum (DFM): son bacilos rectos o curvados, mviles por la presencia de flagelos pertricos o polares, con pared celular, mesfilas, son las nicas SRB gram-positivas de bajo contenido GC, no contienen desulfoviridina, adems forman esporas volvindose de este modo resistentes a condiciones adversas (desecacin y oxidacin del medio ambiente) y le permite subsistir en una gran variedad de medios (Londry et al, 1997; Castro et al., 2000). Son capaces de utilizar hidrgeno como fuente de energa, que les otorga un carcter quimiolittrofo (Imachi et al., 2000). Este genero tiene adems la capacidad de realizar la dismutacin de tiosulfato (Jackson y Mclnermey, 2000). Grupo 2. Desulfobulbus (DBB): ese grupo esta estrechamente relacionado con los gneros Desulfocapsa, Desulforhopalus y Desulfofutis dentro de la familia Desulfobacteriaceae. Este grupo presenta tres especies Desulfobulbus elongatus, Desulfobulbus Marinus y Desulfobulbus propionicus, se caracteriza por ser clulas ovoides, no forman esporas, no contiene desulfoviridina, presentan un flagelo polar nico, algunas especies presentan motilidad y otras no, tiene una posicin dentro de la subclase delta de las proteobacterias. A diferencia del grupo 1 de las Desulfotomaculum, las Desulfobulbus es mesofilica de gram-negativo al igual que los dems grupos de SRB (Balows et al., 1992), por lo que se desarrollan entre 20 a 40 C. Utilizan propionato como donador de electrones oxidndolo de manera incompleta hasta acetato, adems son capaces de subsistir con lactato, etanol, H2, acetato, formato y bicarbonato (Benoit et al., 2001; Ito et al., 2002), utilizando alguno de estos compuestos incluso en ausencia de sulfato (Balows et al., 1992). Tambin se ha visto que este grupo puede utilizar nitrato (Ito et al., 2002) como aceptor final de electrones por lo que es capaz de competir con las bacterias nitrificantes. Adems, utilizan oxgeno adquiriendo un carcter aerotolerante y probablemente facultativo (Ito et al., 2002), adems el efecto del oxigeno durante la formacin de microcapas, produce etapas de latencia que preceden una composicin predominante de Desulfobulbus y Desulfovibrio, lo explica su presencia en diversos ambientes debido a su adaptabilidad a la qumica de su entorno 21
(Santegoeds et al., 1999). Este grupo puede realizar la dismutacin de azufre, sulfuro, sulfito y tiosulfato (Finster et al., 1998), con azufre elemental como compuesto intermediario. Por otra parte se ha reportado que Desulfobulbus propionicus realiza la mutilacin del mercurio en cultivos puros (Widdel y Bak 1991; Benoit et al., 2001). Grupo 3. Desulfobacterium (DBM): este es un grupo nutricionalmente verstil, con formas semejantes a bastoncillos de forma oval o casi esfrica, presenta capacidades especiales en cuanto a degradacin de compuestos orgnicos, como la descomposicin de hidrocarburos. Las especies de este gnero son fundamentalmente marinas y requieren elevadas concentraciones de cloruro de sodio. Al igual que Desulfobacter, Desulfobacterium es potencialmente importante para la metilacin del mercurio y no tolera condiciones aerobias (Widdel y Bak, 1991; King et al., 2000). Grupo 4. Desulfobacter (DSB): una de las caractersticas ms sobresalientes de este grupo es su capacidad de oxidar de manera completa y efectiva al acetato debido a que poseen toda la maquinaria funcional para realizar el ciclo del cido ctrico (Balows et al., 1994). Adems se ha visto la versatilidad de este grupo de utilizar gran variedad de substratos. Son bacterias ovoides o semiesfricas parecidas a las Desulfovibrio, normalmente motiles y se desplazan mediante un flagelo polar nico, mesfilicas, no producen esporas y no tienen desulfoviridina. Adems se ha identificado al gnero Desulfobacter com uno de los principales metiladores de mercurio en medios que contienen lactato y acetato (Widdel y Bak 1991; King et al., 2000). Grupo 5. Desulfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina (DCC): los tres gneros de este grupo son estructuralmente diferentes, Desulfococcus y Desulfosarcina se agrupa en clulas coloides virtualmente inmviles y Desulfonema es el nico genero de SRB multicelular filamentosa motil por deslizamiento. Sin embargo, el anlisis mediante 16S de RNA relaciona a este grupo de manera estrecha con la familia Desulfobacteriaceae en el orden Desulfobacterales que comparte con los gneros Desulfobacterium, Desulfobacter, y de manera mas distante con Desulfobulbus. Morfolgicamente presentan formas de bastoncillos ovalados. La caracterstica metablica de este grupo implica oxidacin completa de substratos (Castro et al., 2000) tales como formiato, acetato, acetona, propionato, butirato, isobutirato, valerato, metilbutirato, caproato, malato, piruvato, succinato, fumarato, malato benzoato, etanol, propanol, butanos, hidrgeno y CO2 (Fukui et al., 1999). Algunas cepas han sido aisladas de medios contaminados por hidrocarburos. Desulfococcus ha sido aislado de sedimentos de aguas dulces y tambin se desarrolla en medios salinos; mientras que la desulfosarcina es primordialmente en medio marino. Este grupo ha sido detectado en la quimioclina, entre ambientes aerobio y anaerobio, por lo que podra tener la capacidad de tolerar el oxgeno (Widdel y Bak, 1991). Desulfococcus es uno de los gneros ms importantes en cuanto a la metilacin del mercurio, tercero despus de Desulfomicrobium y Desulfobacter (Widdel y Bak, 1991; King et al 2000). Grupo 6. Desulfovibrio-Desulfomicrobium: la familia Desulfovibrionaceae incluye a los gneros Desulfovibrio y Desulfomicrobium, aunque otros dos gneros podran ser incorporados dentro de la misma (Desulfohalobium y Desulfonatronum). Morfolgicamente son en general vidrioides, espiralados u ovoides, no forman esporas contienen desulfoviridina, son motiles (Castro et al., 2000). Siendo la caracterstica ms
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sobresaliente su capacidad de adaptarse a diversos hbitats gracias a sus intrincadas estrategias metablicas que les permite subsistir. Metabolitamente se diferencia de la familia Desulfobacteriaceae por realizar la oxidacin incompleta de los substratos con la formacin final de acetato durante la fermentacin (Voordouw et al., 1995). Una de sus caractersticas ms importantes es su capacidad para tolerar oxgeno y en algunos casos, incluso consumirlo (Zinkevich y Beech 2000; Loubinoux et al., 2002; Fournier et al., 2006), son capaces de subsistir bajo estrs oxidante en presencia de incluso 20 uM de O2 (la mayora no sobrevive por encima de 0.24 a 0.48 uM) en el torrente sanguneo humano (Schoenborn et al. 2001). El gnero se encuentra desde ambientes salinos, donde han sido ms estudiados hasta los sedimentos de agua dulce y son selectivamente aislados en medios que contienen H2 y CO2, piruvato, malato, lactato y fumarato (Widdel y Bak 1991; Voordouw 1995; Luca et al 2001; Steger et al., 2002; Foti et al., 2007). El gnero Desulfomicrobium en cuanto a sus caractersticas fisiolgicas y nutricionales es muy similar a Desulfovibrio, tiene forma de bastoncillo y carece de desulfoviridina. Segn el manual Bergeys la taxonoma de algunas sulfato reductoras queda de la siguiente manera (Garrity et al., 2001): Dominio: Bacteria Phylum BXII: Proteobacteria Clase VI: -proteobacteria Orden II: Desulfovibrionales Familia I: Desulfovibrionaceae Gnero I: Desulfovibrior Familia II: Desulfomicrobiaceae Gnero I: Desulfomicrobium Familia III: Desulfohalobiaceae Gnero II: Desulfomonas Orden III: Desulfobacterales Familia I: Desulfobacteraceae Gnero I: Desulfobacter Gnero II: Desulfobacterium Gnero III: Desulfobacula Gnero V: Desulfococcus Gnero VI: Desulfofaba Gnero VII: Desulfofrigus Gnero VIII: Desulfonema Gnero IX: Desulfosarcina Familia II: Desulfobulbaceae Gnero I: Delsulfobulbus Gnero II: Desulfocapsa Gnero III: Desulfofustis Gnero IV: Desulforhopalus Orden IV: Desulfuromonadales Familia I: Desulforomonadaceae Gnero I: Desulfomonas 23
1.3.8 Organismos metanognicos La caracterstica comn de los organismos metanognicos y de otros organismos litotrfos, es el uso de hidrgeno como fuente de energa, y el dixido de carbono como aceptor de electrones. Este modo de generacin de energa se ajusta a los definidos como quimiolittrofos. Los organismos metanognicos juegan un papel muy importante en el circuito degradativo del ciclo del carbono. Estos utilizan como sustrato para generar metano, el producto de degradacin de las bacterias formadoras de cidos. (Cataln, 1997). El proceso que comprende la formacin del metano a partir de actico y a partir de hidrgeno se le llama metanognesis. La metanognesis es la nica va por las cuales los organismos metanognicos pueden obtener energa para su crecimiento y estos son los nicos productores de metano como un producto catablico final. Estas bacterias solo pueden utilizar el acetato, H2, CO2, y/u otras fuentes de carbono como sustratos de energa (Salazar 2008). La clasificacin taxonmica de las metangenos se ha realizado mediante varios mtodos, entre los que se incluye el estudio de su morfologa, motilidad, imgenes por microscopia electrnica, morfologa de la colonia, caractersticas nutricionales, tasa y condiciones de crecimiento, productos metablicos finales, tincin Gram, susceptibilidad a lisis, anlisis de lpidos, distribucin de poliaminas, hibridacin de cidos nucleicos, secuenciacin del 16s rRNA entre otros estudios (Boone y Whitman, 1988). En 1977 (Woese, et al., 1997) clasific a los metanognicos como del domino Archaea. Originalmente, slo se clasificaron los metangenos en este nuevo dominio, y las arqueas eran consideradas extremfilos que slo vivan en hbitats como aguas termales y lagos salados. Se han definido 5 rdenes, 10 familias, 26 gneros y 74 especies validas (Boone et al., 1993; Salazar 2008). Orden Methanobacteriales
Incluyen a dos familias, la familia Methanobacteriaceae y la familia Metanothermaceae. La familia Methanobacteriaceae tiene cuatro gneros morfolgicamente distintos. Estos incluyen especies recuperadas de una variedad de hbitats (agua dulces, rumen bovino, madera, intestino de termitas, etc.), las cuales son capaces de utilizar sustratos como H2/CO2, 2-propanol, formato y metanol para producir CH4. La familia Metanothermaceae consiste de un nico gnero termfilo extremo hidrgenotrofo. Orden Methanococcales
Incluye a dos familias, Methanociccaceae y Methanocaldococcaceae, cada familia con dos gneros, los cuatro gneros son hidrgenotrofos principalmente de ambientes marinos y costeros. La mayora de las especies son capaces de utilizar H2 y formato como donadores de electrones.
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Orden Methanomicrobiales
Comprende a tres familias y nueve gneros de matanognicas hidrgenotrofas. La familia Methanomicrobiaceae incluye a especies aisladas de varios ambientes. La familia Methanocorpusculaceae incluye a tres gneros que utilizan H2/CO2 y formato como sustrato. La famila Methanospirillaceae es una familia nueva con un nico gnero, sus miembros se han reportado en varios hbitats y son capaces de utilizar diferentes donadores de electrones para la metanognesis del CO2. Orden Methanosarcinales
Boone (Boone et al., 1993) propuso reagrupar a todos las metanognicas acetotroficas y/o metilotroficas dentro de dos familias en este orden. La familia Methanosarcinaceae que incluye a seis gneros de matangenicas muy verstiles aisladas de varios hbitats y que son capaces de utilizar H2/CO2, acetato o compuestos metil como sustratos. La familia Methanosaetaceae incluye a un nico gnero de metangena acetotrofica obligada. Orden Methanopyrales
Es un nuevo arden de matanogenicas hipertermofilicas, las cuales no estn relacionadas con todas las otras metanognicas conocidas. El orden incluye una nica Methanopyraceae y una especie Methanopyrus kandleri. Se ha determinado la secuencia del DNA del genoma total Methanococcus jannaschii (Bult et al., 1996) y Methanobacterium thermoautotrophicum (Smith et al., 1997). Recientemente, la secuencia del DNA para archaeoglobul fulgidus tambin ha sido publicado (Klenk et al 1997). Esta arquea sulfato-reductora filogenticamente esta estrechamente relacionada con el gnero Methanosarcinales, con quien comparte muchas caractersticas bioqumicas en comn. Basndonos en el manual Bergeys (Garrity, et al., 2001), tenemos la siguiente taxonoma de los organismos metangenos: Dominio: Archaea Phylum AII: Euryarchaeota phy. nov. Clase I: Methanobacteria class. nov. Orden I: Methanobacteriales Familia I: Methanobacteriaceae Gnero I: Methanobacterium Gnero II: Methanobrevibacter Gnero III: Methanosphaera Gnero IV: Methanothermobacter Familia II: Methanothermaceae Gnero I: Methanothermus Clase II: Methanococci class. nov.
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Orden I: Methanococcales Familia I: Methanococcaceae Gnero I: Methanococcus Gnero II: Methanothermococcus Familia II: Methanocaldococcaceae Gnero I: Methanocaldococcus Gnero II: Methanotorris Orden II: Methanomicrobiales Familia I: Methanomicrobiaceae Gnero I: Methanomicrobium Gnero II: Methanoculleus Gnero III: Methanofollis Gnero IV: Methanogenium Gnero V: Methanolacinia Gnero VI: Methanoplanus Familia II: Methanocorpusculaceae Gnero I: Methanocorpusculum Familia II: Methanospirillaceae Gnero I: Methanospirillum Orden III: Methanosarciales Familia I: Methanosarcinaceae Gnero I: Methanosarcina Gnero II: Methanococcoides Gnero III: Methanohalobium Gnero IV: Methanohalophilus Gnero V: Methanolobus Gnero VI: Methanomicrococcus Gnero VII: Methanosalsum Familia I: Methanosaetaceae Gnero I: Methanosaeta Clase VII: Methanopyri class. nov. Orden I: Methanopyrales Familia I: Methanopyraceae Gnero I: Methanopyrus
Las archaes metanognicas fueron el primer grupo microbiano en tener su taxonoma basada en la filogenia deducida por la secuencia de 16s rRNA (Balch et al. 1979; Raskin et al. 1994). La distribucin limitada filogentica de las metanognicas sugiri que una base de datos de secuencia de rRNA podra ser la base para el diseo de sondas que abarquen la mayora de los miembros del grupo. Para esto se desarroll y caracteriz una coleccin de sondas metanognicas (figura 3). Entre las bacterias metanognicas podemos distinguir 3 principales grupos nutricionales (tabla 5):
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1. Archaeas metanognicas hidrogenotrofas: Estas archaeas utilizan como sustrato el hidrgeno ms bixido de carbono y algunas el formato. 2. Archaeas metanognicas acetoclsticas: Estas archaeas utilizan el acetato como sustrato y segn las especies hidrgeno ms bixido de carbono y metilaminas. 3. Archaeas metanognicas metilotrofas: estas utilizan como sustrato metanol, metilaminas y metildisulfuros. En las especies descritas hay 67% de hidrogenotrofas, 13% de acetoclsticas, 27% de metilotrofas obligadas y el 3% son hidrgeno.metilotrofas y usan el hidrgeno para reducir el metanol a metano. Algunas especies son alcoholotrofas y producen metano en presencia de ciertos alcoholes como donadores de hidrgeno. El monxido de carbono puede tambin ser convertido en metano, pero no constituye un sustrato importante en la metanognesis.
Figura 3. Clasificacin de las Sondas metanognicas en relacin con las bacterias metanognicas que detectan (Crocceti et al., 2006).
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Tabla 5. Grupos nutricionales de las bacterias metanognicas (Garca, 1991)
1. Hidrogenotrficas H2 + CO2 + formato segn especies CH4 Methanobacterium Methanothermus Methanococcus Methanolacinia Methanogenium Methanospirillum Methanoplasma Methanobrevibacter Methanopyrus Methanomicrobium Methanoculleus Methanocorpusculum Methanoplanus 2. Acetoclsticas Acetato + segn especies H2 + CO2 + Formato, Metanol y Metilaminas CH4 Methanosarcina Methanosaeta Methanothix 3. Metilotroficas Metanol + Metilaminas CH4 Methanolobus Methanohalophilus Methanohalobium Methanococcoides Methanohalococcus Methanobacterium Methanogenium Methanospirillum Methanocorpusculum 4. Hidrogeno-metilotroficas H2 + Metanol CH4 Methanosphaera 5. Alcoholotrficas CO2+ alcohol (2-propanol, 2-butanol, etanol) Methanobacterium Methanogenium Methanospirillum Methanocorpusculum
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1.4
Tcnica molecular para la determinacin de las poblaciones microbianas. Hibridacin molecular fluorescente in situ (FISH)
En la actualidad se hace uso de tcnicas de biologa molecular que permiten estudiar la diversidad taxonmica y la estructura de comunidades microbianas, ya que brindan la posibilidad de identificar poblaciones microbianas especificas en su hbitat natural (sin necesidad de cultivarlas) generando resultados confiables y rpidos (Crdenas et al, 2006). La hibridacin molecular es una de las tcnicas que permite la deteccin del rRNA 16s empleando sondas marcadas con fluorocromos. Las clulas de muchos microorganismos son muy ricas en RNA. En las bacterias constituye el 20-25 % del peso seco. El RNA predominante es el ribosmico (rRNA) que se presenta en varias especies moleculares (23s, 16s y 5s) que constituye el 80% del RNA total (Pars Ramn/ Jurez Antonio). La presencia del 16S rRNA en grandes cantidades en procariotas (Amman, R. I. et al., 1995), permiti desarrollar sondas especficas para la secuencia 16S rRNA permitiendo el procesamiento de un gran nmero de muestras requeridas para el estudio ecolgico, al mismo tiempo que posibilit la deteccin directa de microorganismos concretos en las muestras (Salazar 2008). La hibridacin permiti mejorar las estimaciones de la abundancia microbiana, mostrando una estratificacin de los diferentes grupos filogenticos de las comunidades microbianas (Devereux et al., 1996; Ramsing et al., 1996). La hibridacin molecular fluorescente in situ (FISH) consiste en la deteccin de una secuencia de nucletidos dentro del genoma. Esta tcnica utiliza fragmentos de DNA (sondas) marcadas con fluorocromos, basandose en la hibridacin especfica de dos secuencias de cidos nucleicos complementarios entre la sonda marcada y la bacteria diana, formando un hibrido DNA: RNA fcilmente detectable mediante un microscopio de fluorescencia (Crdenas et al 2006). La hibridacin del 16S rRNA genera valiosa informacin acerca de la caracterizacin y abundancia de comunidades microbianas y en algunos casos acerca de la actividad bacteriana. La fluorescencia se produce mediante el uso de los fluorocromos que son sustancias que tienen la propiedad de absorber energa de una longitud de onda especfica y volverla a emitir con una determinada longitud de onda mayor (menor energa). La cantidad de energa emitida y su longitud de onda depende del propio fluorocromo. Los fluorocromos de ltima generacin emiten seal fluorescente ms intensa y son ms foto estables (Roncero, 2009). En la figura 4, se muestra en que consiste generalmente la tcnica de hibridacin FISH.
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Figura 4. Esquema de la Hibridacin Fluorescente in situ FISH. www.iqb.es
1.4.1
Fijacin de la biomasa para la hibridacin
La fijacin debe realizarse inmediatamente despus de coger la muestra procedente de la planta de tratamiento de aguas residuales, para evitar las lesiones que produciran cambios osmticos y alteraciones estructurales y bioqumicos, fenmeno conocido como autolisis. La fijacin de las clulas depende mucho de la estructura de su membrana celular, la cantidad y la clase de protenas de una membrana celular especifica depende del ambiente en el que acte la clula (Mc kee, et al., 2003). Las Clulas gram positivas tienen paredes celulares de capa gruesa de peptidoglucano, por el contrario de las clulas gram negativas que poseen una capa fina de peptidoglucano (Mc kee,et al., 2003)(Figura 5). Para explicar la estructura de la membrana celular en las bacterias y la diferencia entre gram positivas y gram negativas, se describirn cuatro molculas importantes: la murena, el lipopolisacrido, los cidos teicoicos y los cidos lipoteicoicos.
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Figura 5. Diferencia estructural celular entre las gram positivas y las gram negativas (Saenz 1998-2008).
La murena es un peptidoglicano que se encuentra en todas las bacterias, con excepcin de las arqueobacterias y los mollicutes (micoplasmas). Constituye la mayor parte de la pared celular y es responsable de la forma de la clula y de su integridad estructural, proporcionando rigidez a la misma. La murena esta compuesta de restos de N-acetilglucosamina (NAG) y de cido N-acetil murmico (NAM) (Figura 6), unidos alternativamente por enlaces -1,4-glucosdicos. Hay un tetrapptido unido al NAM que puede unirse a su vez con el tetrapptido de una cadena adyacente (Pars, et el., 1997). La estructura del liposacrido (LPS) vara de una bacteria a otra, e incluso entre diferentes cepas, pero se presenta en todas las bacterias gram negativas. El lpido A es un disacrido de glucosamina fosforilado y esterificado con distintos cidos (docecanoico, tetradecanoico, hexadecanoico y 3-hidroxitetradecanoico). El ncleo es un oligosacrido que comnmente incluye L- glicero-d-manoheptosa y cido cetodesoxi-octanoico. El lpido A y el ncleo corresponden al LPS de las distintas enterobactericeas (Pars, et al., 1997). Las gram positivas no tienen LPS, pero pueden presentar cidos teicoicos asociados a la murena. Se trata de polmeros del glicerol o del ribitol unidos por
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enlaces fosfodister y con uno o ms aminocidos como sustituyentes (Pars, et al., 1997). Tambien en las gram positivas se encuentran molculas ms complejas llamadas cidos lipoteicoicos (LTA) y los lipoglucanos, los cuales tienen carcter macroanfiflico y estn anclados en la membrana protoplamatica por interaccin hidrofbica con el resto acil-grasos (Pars, et al., 1997). Por las diferencias en las estructuras celulares de las bacterias, a la hora de fijar las bacterias gram negativas se puede hacer con paraformaldehdo, con un perodo de tiempo menor que el necesario para fijar las bacterias gram positivas. Las bacterias gram positivas no solo necesitan de mayor tiempo para fijar, si no al ser hidrofbicas es necesario fijarlas con etanol como se describe en el capitulo de materiales y mtodos.
Figura 6. Representacin esquemtica de los peptidosglicanos (Saenz 1998-2008).
1.5
Sondas
Las sondas o cadenas de oligonucletidos son segmentos cortos de DNA de cadena simple que contienen de 18 a 24 nucletidos. Estas sondas solo hibridan con sus secuencias complementarias en condiciones estrictas de hibridacin (Hernndez, 2005). Mediante el anlisis de las secuencias parciales del 16s rRNA, es posible encontrar patrones de secuencias especficos para grupos y especies de bacterias concretas. Para la identificacin de los microorganismos a ese nivel, se han desarrollado pequeas sondas especficas. La hibridacin con sondas especficas permite la identificacin rpida y directa de un gran nmero de microorganismos usando un extremo de acido nucleico como diana. El uso combinado de sondas universales y especficas permite estimar la fraccin de determinados microorganismos dentro de un conjunto (Hernndez, 2005).
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Objetivos
El desarrollo de este trabajo tiene como objetivo principal identificar y cuantificar las poblaciones microbianas presentes en los procesos biolgicos (Fangos activados y Digestin anaerobia) de la EDAR del CARRAIXET. Los objetivos especficos que se pretenden alcanzar son:
1. Adaptacin de la tcnica molecular FISH a las muestras procedentes de la Digestin anaerobia. 2. Identificacin de las poblaciones microbianas en ambos procesos: fangos activados y digestin anaerobia. 3. Cuantificacin de los grupos de microorganismos en cada proceso estudiado. 4. Comparacin de la poblacin microbiana general entre ambos procesos.
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3
3.1 Procedencia de la muestra
Materiales y Mtodos
Las muestras provienen de las instalaciones de la planta de tratamiento de aguas residuales urbanas de la Cuenca del Carraixet, ubicada en la Comunidad Valenciana con una capacidad de 100 000 habitantes-equivalentes. El caudal de funcionamiento de la planta de tratamiento es de 38.551 m3/dia, el rendimiento del tratamiento es del 98% de eliminacin de los slidos suspendidos, del 97% del DBO5 y el 94% de DQO. El tratamiento biolgico que se realiza es de fangos activados, en la lnea de fangos esta constituida por un espesador de gravedad y otro por flotacin, que alimentan la entrada del fango al tanque de digestin anaerobia (figura 7).
Figura 7. Esquema de la EDAR del Carraixet.
3.2
Toma de muestra
La toma de muestra se realiz en el reactor aerobio y en el digestor anaerobio. La muestra de ambos procesos es del mismo da. Despus de tomar la muestra, esta fue transportada para su posterior tratamiento (fijacin de las clulas y aplicacin de la tcnica de hibridacin fluorescente in situ FISH), a las instalaciones del laboratorio de qumica de la Universidad de Valencia.
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3.3
Hibridacin Fluorescente in situ, FISH
Para hacer uso de la hibridacin fluorescente in situ FISH con sondas marcadas con fluorocromos se debe preparar la muestra. Esto implica la fijacin y permeabilizacin de la pared celular para inactivar las clulas microbianas y la actividad enzimtica. La permeabilizacin de la clulas tiene como objetivo ayudar a la penetracin de la sonda (Nielsen et al., 2009). Una vez fijada las clulas se aplica la tcnica de hibridacin FISH, lo que permite realizar un anlisis cualitativo de la poblacin microbiana presente en la muestra tratada. La hibridacin se realiza mediante diferentes sondas (fragmentos de DNA), el uso de cada sonda depende de cada grupo de bacterias y permite identificar las bacterias presentes en la muestra. 3.4 Procedimiento La fijacin celular se realiza de la siguiente manera: Para las bacterias Gram negativas se realiza la fijacin con Paraformaldehdo (PFA al 4%). Aadir 3 volmenes de PFA (750 l) a 1 volumen de muestra (250 l) y mantener a 4 C durante 1-3 horas Someter las clulas a centrifugacin (5000 x g durante 3 minutos) y eliminar el paraformaldehdo Lavar las clulas PBS 1X (fosfato bfer salino), centrifugar (5000 x g durante 3 minutos) y eliminar el sobrenadante Repetir el paso anterior si es necesario Resuspender las clulas en PBS 1X (aadir 500 l) para tener una concentracin de 108-109 clulas/ml en la muestra fijada y aadir 1 volumen (500 l) de etanol absoluto fro (4C) Guardar a -20C
Para las bacterias Gram positivas se realiza la fijacin con etanol absoluto fro. Aadir 1 volumen de etanol absoluto (500 l) a 1 volumen de muestra ( 250 l muestra + 250 l de PBS, para mantener la misma concentracin de clulas que las gram negativas) y mantener a 4 C durante 4-16 horas Centrifugar ( 5000 xg durante 3 minutos) y eliminar el fijador Lavar las clulas con PBS 1X (500 l) dos veces Resuspender en PBS 1X (aadir 500 l), para tener una concentracin de 108-109 clulas/ml en la muestra fijada y aadir 1 volumen (500 l) de etanol absoluto fro (4C) Guardar a -20C
Tratamiento de los portaobjetos cubiertos con Tefln
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El tratamiento de los portaobjetos tiene como objetivo el poder mantener sobre el mismo la mayor cantidad de clulas posibles y por ms tiempo, evitando la perdida de las clulas por los lavados posteriores a la visualizacin en el microscopio. El tratamiento se lleva a cabo de la siguiente manera: Lavar con agua y detergente neutro Enjuagar con agua destilada Secar en estufa a 46 C (es importante secar completamente) Cubrir con gelatina por inmersin en la solucin de gelatina 0.1% con sulfato potsico cromato 0.01% (preparada en el momento, T= 60 C) Secar al aire (proteger del polvo ambiental)
Hibridacin in situ FISH 1. Aplicacin de la muestra en los portaobjetos cubiertos de tefln Poner un volumen de 5 l de muestra fijada en cada pocillo del portaobjetos Secar al aire Deshidratar en etanol al 50% durante 3 minutos por inmersin Deshidratar en etanol al 80% durante 3 minutos por inmersin Deshidratar en etanol al 98% durante 3 minutos por inmersin Despus del deshidratado se deja secar y los portaobjetos pueden ser conservados indefinidamente a -20C
2. Hibridacin in situ Las reacciones de hibridacin se hacen a concentraciones altas de sal y en presencia de agentes desnaturalizantes (formamida). La sal y el porcentaje de formamida hacen que la hibridacin sea estable. Para ello se prepara la solucin de hibridacin: a). Preparar solucin de hibridacin (tubo eppendorf 2 ml) Aadir 360 l de NaCl 5M Aadir 40 l TrisHCl 1M Aadir formamida segn tabla 6 Aadir agua MilliQ segn tabla 6 Aadir 2 l de SDS al 10% Mezclar cuidadosamente
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Tabla 6. Cantidades de Formamida y agua para la preparacin de la solucin de hibridacin
Cantidad de formamida (l) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200
% formamida para la sonda 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Cantidad de agua MilliQ (l) 1598 1498 1398 1298 1198 1098 998 898 798 698 598 498 398
Una vez preparada la solucin de hibridacin se procede del siguiente modo: Poner 8 l de la solucin de hibridacin en cada pocillo del portaobjeto que lleve muestra Poner 1 l de la sonda a utilizar y repartir homogneamente por todo el pocillo Introducir el portaobjetos con la solucin de hibridacin y las sondas a la camara de hibridacin (tubo tipo falcon de 50 ml previamente preparado con papel de celulosa dentro). Una vez dentro el portaobjetos a hibridar el tubo se debe mantener siempre en posicin horizontal Incubar a 46C durante 1-2 horas
Con el fin de eliminar los restos de sondas no hibridadas y la formamida de los portaobjetos se prepara una solucin de lavado. b). Preparacin de solucin de lavado En un tubo tipo falcon de 50 ml aadir segn tabla 7, las cantidades indicadas de NaCl 5M dependiendo del porcentaje de formamida utilizada en la solucin de hibridacin. Aadir 1 ml de TrisHCl Aadir EDTA si segn tabla 7 se requiere Aproximar a 50 ml con aguan MilliQ Aadir 50 l de SDS 10% Mezclar cuidadosamente
38
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biolgicos de aguas residuales: Fangos Activados y Digestin Anaerobia Tabla 7. Cantidades de NaCl para la solucin de lavado
% formamida de la sonda 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
NaCl (M)
NaCl 5M (l) 9000 6300 4500 3180 2150 1490 1020 700 460 300 180 99 41
EDTA 0.5 M (l) --------500 500 500 500 500 500 500 500 500
0.900 0.636 0.450 0.318 0.225 0.159 0.112 0.080 0.056 0.040 0.028 0.020 0.014
Terminado el tiempo de incubacin del portaobjetos donde estn las clulas a hibridar se procede a: Sacar de la incubadora el portaobjetos. Con la ayuda de un cuentagotas y la solucin de lavado previamente preparada eliminar la formamida que aun este en los pocillos, para eliminar las sondas no hibridadas introducir el portaobjetos dentro del tubo con la solucin de lavado y mantenerlo en un bao de agua a 48 C durante 10- 15 min, protegido de la luz. Una vez concluido el tiempo de lavado, se saca el portaobjetos de la solucin de lavado y se sumerge en un vaso con agua MilliQ fria durante 1 segundo Secar el portaobjetos a temperatura ambiente protegindolo de la luz Si no se observa inmediatamente en el microscopio, guardar a -20C
3.5
Sondas
Las sondas utilizadas en este trabajo, se han adquirido ya marcadas, a travs de Thermo Scientific. En la tabla 5, se muestran las sondas generales usadas en este trabajo as como su referencia de uso.
39
Tabla 8. Sondas Generales
Sonda
EUB 338 EUB 338II EUB 338III ARCH915
Secuencia
GCTGCCTCCCGTAGGAGT GCAGCCACCCGTAGGTGT GCTGCCACCCGTAGGTGT GTGCTCCCCCGCCAATTCCT
Organismo
Muchas bacterias Planctomycetales Verrucomicrobiales Archaeas
Referencia
Amman, et al., 1990 Daims, et al., 1999 Daims, et al., 1999 Stahl y Amman 1991
Para el uso de las sondas EUB 338, EUB 338II y la EUB 338III, se realiz una mezcla de ellas, la sonda EUB MIX, la mezcla tiene como fin cubrir el mayor nmero de bacterias posibles en la muestra. Las hibridaciones para la poblacin general del flculos se utiliz EUM MIX + ARCH915. En la tabla 9, 10, 11, 12, 13 y 14 se describen las sondas especficas de cada grupo de bacterias estudiadas en el presente trabajo.
Tabla 9. Sondas especficas para grupo Nitrificantes

SONDA SECUENCIA BACTERIA %FA REFERENCIA
NSO 1225 LNA
TACGGATTTCAC TCCT
Betaproteobacterial ammonia.oxidizing bacteria Muchos miembros de Nitrospirae
45
Alonso, et al., 2009
Ntspa712
CGCCTTCGCCACCGGCCTTCC
50
Daims et al., 2001
Ntspa712 compet
CGCCTTCGCCACCGGCCTTCC
Nitrobacter spp. NIT3

CCTGTGCTCCATGCTCCG
40
Wagner et al., 1996
NIT3 compet
CCTGTGCTCCATGCTCCG
Las sondas de la tabla 9 se usan con un alto porcentaje de formamida, lo cual son muy restrictivas en el momento de la hibridacin. Mientras mas restrictivas son las hibridaciones es ms confiable el resultado hibridado.
40
Tabla 10. Sondas especficas para el grupo PAO y GAO

PAO462
CCGTCATCTACWCAGGGTATTAAC
Candidatus Accumulibacter phosphstis Candidatus Accumulibacter cluster Candidatus Accumulibacter phosphstis Candidatus "Competibacter phosphatis" Candidatus "Competibacter phosphatis" grupo gammaproteoba cterial Defluviicoccus cluster 1 Defluviicoccus cluster 1 Defluvicoccus vanus cluster 2 Defluvicoccus vanus- cluster 2
35 35
Crocetti et al., 2000 Crocetti et al., 2000 Crocetti et al., 2000 Crocetti et al., 2000 Crocetti et al., 2002 Kong 2002 et al.,
PAO651
CCCTCT GCCAAACTCCAG
35
PAO846
GTTAGCTACGGCACTAAA AGG
GAOQ431
TCCCCGCCT AAAGGGCTT
35 35
GAOQ989
TTCCCCGGATGTCAAGGC
35
GB
CGATCCTCTAGCCCACT
TFO_DF218
GAAGCCTTTGCCCCTCAG
2535 2535
Wong et al., 2004 Wong et al., 2004 Meyer et al., 2004 Meyer et al., 2004
TFO_DF618
GCCTCACTTGTCTAACCG
DF 988
GATACGACGCCCATGTCAAGGG
35 35
DF 1020
CCGGCCGAACCGACTCCC
35 H966 (DF 988 compet)

CTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGC
35 H1038 (DF 988 compet 2)

AGCAGCCATGCAGCACCTGTGTGG CGT
Las sondas de la tabla 10, tienen un porcentaje de trabajo muy similar, con lo que para facilitar su uso, se mezclan en grupos: La sonda PAOMIX, es una mezcla de las sondas: 1. PAO462 2. PAO651 3. PAO846
41
La sonda GAOMIX es una mezcla de las sondas: 1. GAOQ431 2. GAOQ989 3. GB Las sondas DEFMIX 1 es una mezcla de las sondas: 1. TFO_DF218 2. TFO_DF618 La sonda DEFMIX 2 es una mezcla de las sondas: 1. DF988 2. DF1020
Tabla 11. Sondas especficas para el grupo de las bacterias desnitrificantes

AT1458
GAATCTCACCGTGGTAAGCGC
Azoarcus-ThaueraCastellaniella Paracoccus Thiobacillus denitrificans
50
Rabus et al., 1999 Neef et al., 1996 Fernndez et al., 2008
PAR651
ACCTCTCTCGAACTCCAG
40
TBD1419
ACTTCTGCCAGATTCCAC
50
En la tabla 11 podemos observar que las tres sondas para la deteccin de las desnitrificantes de interes tienen un alto porcentaje de trabajo, esto nos da mayor confianza de hibridacin.
Tabla 12. Sondas especficas para el grupo de las bacterias metanotroficas

Ma464
TTATCCAGGTACCGTCATTA
Tipo II methanotrophs. Methylocystaceae Tipo I methanotrophs. Methylococcaceae
20
Eller et al., 2001
Mg84
CCACTCGTCAGCGCCCGA
20
Eller et al., 2001
42
Tabla 13. Sondas especficas para las SRB

SONDA SECUENCIA BACTERIA Desulfovibrio spp., Desulfomonas, Desulfuromonas, Desulfomicrobium Some Desulfobacteraceae (Desulfobacter, Desulfosarcina, Desulfocccus) %FA REFERENCIA
DSV687
TACGGATTTCACTCC T
15
Devereux et al. 1992
Dsb804
CAACGTTTACTGCGTGGA
10
Devereux et al. 1992
DNMA657
TTCCGCTTCCCTCTCCCATA
some Desulfonema
30
Fukui et al. 1999 Devereux et al. 1992 Hristova et al. 2000 Amann et al. 1990
DBB660
GAATTCCACTTTCCCCTCTG
some Desulfobulbus Many Desulfotomaculum cluster I and other Firmicutes (G+) Most Desulfovibrionales and other Bacteria Desulfobacteracea (Desulfobacterales, Desulfuromonales, Syntrophobacterales, Myxococcales, and other Bacteria)
60
Dtm230
TAATGGGACGCGGACCCA
10
SRB385
CGGCGTCGCTGCGTCAGG
35
SRB385Db
CGGCGTTGCTGCGTCAGG
30
Rabus et al. 1996
En la deteccin del grupo de las SRB, la bibliografia describen como sondas generales para este grupo en particular, las sondas SRB385 y SRB385Db, estas sondas se han usado junto con otras sondas para la deteccin de familias o especies de las SRB.
Para las hibridaciones de las Arqueas Metanognicas se usarn sondas por ordenes de estas arqueas. En general estas sondas tienen porcentajes altos de formamida para la hibridacin.
43
Tabla 14. Sondas especficas para las arqueas metanognicas

SONDA SECUENCIA BACTERIA %FA REFERENCIA Devereux et al., 1992. Devereux et al., 1992 Devereux et al., 1992 Devereux et al., 1992
MSMX860
GGCTCGCTTCACGGCTTCCCT
Methanosarcinales
45
MG1200b
CRGATAATTCGGGGCATGCTG
Methanomicrobiales
20
MB311
ACCTTGTCTCAGGTTCCATCTCC
Methanobacteriales
30
MC504
GGCTGCTGGCACCGGACTTGCCCA
Methanocaldococcaceae
55
MC504 Compet MC1109
GGCTGCTGGCACCGGACTTGCCCA Fukui 1999 et al.,
GCAACATAGGGCACGGGTCT
Methanococcales
45
3.6
Cuantificacin de los Microorganismos
Para la cuantificacin de las clulas despus de la aplicacin de la tcnica FISH, se lleva a cabo la observacin en el microscopio y toma de imgenes. La observacin se realiza en un microscopio de fluorescencia modelo Leica DM2500, con cmara digital integrada (Leica 420 C), cuyos filtros usados son N2.1 y I3 La toma de imgenes se realiza a 20 campos distintos y representativos de la muestra hibridada. Se realiza un anlisis de las imgenes, para esto se hace uso de un programa (MATLAB 7.1), el programa descompone la imagn capturada en escala de grises, donde los valores irn de 0 (Negro) a 255 (blanco). El cambio de las imgenes de color a escala de grises facilita el conteo de pixeles (figura 8). Las imgenes capturadas son introducidas en el software de cuantificacin desarrollado para este fin en la tesis doctoral de Borrs, 2008. El software realiza un informe donde se da los porcentajes de las reas ocupadas por las bacterias hibridadas acompaado del error de la medida. Este ltimo se calcula como : desviacin estndar n: nmero de campos
, donde: n
44
Adaptacin de la tcnica FISH para muestras de un digestor anaerobio
Las muestras provenientes de la digestin anaerobia presentan diversos obstculos asociados con el mtodo FISH, los principales son: la permeabilidad de la clula, insuficiencia en el contenido de los ribosomas, inaccesibilidad al ribosoma por la sonda y muestras que emiten auto fluorescencia (suciedad en la muestra). En las muestras procedentes de la digestin anaerobia, la aplicacin del protocolo estndar FISH para la visualizacin de las bacterias, da seales de hibridacin muy dbiles (figura 8). Esto se debe a varios de los obstculos que ya se han mencionado. 4.1 Recomendacin a problemas asociados con la deteccin de la fluorescencia
La inaccesibilidad de las sondas al ribosoma puede causar seales con ausencia o baja fluorescencia. Esto puede remediarse mediante la aplicacin de sondas helpers (sondas de ayuda). Las sondas helpers se disean para hibridar sin marcar sobre secuencias de rRNA junto a la sonda FISH en su lugar de destino. Las sondas de ayuda abren las estructuras secundarias y terciarias de la base de los nucletidos para que con ello se aumente la accesibilidad de la sonda FISH (Nielsen et al., 2009). Otra solucin para hibridar sobre los sitios de difcil acceso ha sido alargar el tiempo de hibridacin (hasta 72 horas), lo cual mejora la difusin de la sonda en la clula y disminuye las barreras cinticas de la accesibilidad del lugar de destino. De esta forma se consigue una mejor eficiencia de hibridacin y, en general, las seales de fluorescencia aumentan de intensidad (Nielsen et al., 2009). La seal de hibridizacin tambin puede incrementarse debido a la unin no especfica de las sondas a los contaminantes unidos sobre la membrana celular, como pudieran ser sustancias hmicas y trozos de DNA unidos a la membrana celular. Esto inmoviliza al rRNA y puede producir un incremento de la hibridizacin (falsos positivos) debido a la unin no especfica de la sonda. Tambin es posible, sin embargo, que las sutancias hmicas o los trozos de DNA interfieran con la hibridizacin de la sonda al rRNA. De esta manera la seal de hibridizacin disminuye (Salazar 2008). Para no perder la intensidad de fluorescencia se debe evitar la exposicin demasiado larga a fuentes de luz fuertes, almacenar siempre los portaobjetos FISH en la oscuridad, retirar con cuidado todas las trazas de etanol de muestras almacenadas, ya que el etanol puede hacer desaparecer la seal de fluorescencia. Por ltimo, se debe evitar los tiempos de fijacin demasiado largos (sobre todo para la fijacin mediante PFA), ya que los tiempos excesivos pueden reducir la permeabilidad de la clula por la sonda (Nielsen et al., 2009). Basndonos en las recomendaciones antes descritas y los problemas presentes en las muestras, se modificaron los tiempos requeridos para la fijacin e hibridacin en el protocolo FISH para poder aumentar las seales de hibridacin (figura 9).
45
En este capitulo se pretende optimizar los tiempos de fijacin y de hibridacin en las muestras procedentes del Digestor Anaerobio de la planta de tratamiento de aguas residuales Carraixet, para establecer los tiempos requeridos en las hibridaciones posteriores. Para llevar a cabo el establecimiento de los tiempos se ha realizado una cuantificacin de la seal detectada en cada tiempo evaluado.
Figura 8. Hibridacin Fluorescente FISH sin modificacin de tiempos. A) Hibridacin con sonda especfica SRB385 en el canal rojo. B) hibridacin con sonda general de bacterias EUBMIX en el canal verde. Imgenes capturadas a 630x.
La figura 8 esta compuesta de dos imgenes. En la primera imagen (A), podemos observar la poca intensidad fluorescente al aplicar la sonda para bacterias sulfatoreductoras (SRB385), lo que dificulta enormemente la cuantificacin de los microorganismos. En la imagen B, podemos ver que el problema de baja fluorescencia en la hibridacin es tambin notoria para la sonda general de bacterias (EUBMIX); tambin se observan seales rojas que corresponden a la sonda especfica y que se deben a falsos positivos presentes en la muestra. 4.2 Determinacin de los tiempos de fijacin y de hibridacin ptimos
Mediante la tcnica de hibridacin fluorescente in situ (FISH) y utilizando sondas marcadas con fluorocromos (FAM y TAMRA) que emiten fluorescencia bajo condiciones apropiadas de excitacin, se hace posible la visualizacin de los microorganismos con secuencias de oligonucleotidos determinados, dependiendo de las sondas utilizadas (anlisis cualitativo). Para ello se ha utilizado un microscopio de fluorescencia (Leica DM 2500) con cmara integrada (Leica DFC 420 C), y las sondas SRB385 (bacterias sulfato reductoras, SRB) y EUBMIX (dominio eubacteria). Para determinar los tiempos requeridos en la tnica FISH (el de fijacin y el de hibridacin), se ha realizado en este trabajo evaluaciones y anlisis de una misma muestra (Digestor anaerobio Carraixet) a diferentes tiempos. En la fijacin se evaluaron los tiempos de 30, 45, 60, 90, 120 y 180 min. De las muestras resultantes de las fijaciones se evaluaron los tiempos de hibridacin 60, 90 y 120 min a cada una. En la figura 9, se muestra el esquema de los anlisis realizados para las muestras del digestor anaerobio.
46
Figura 9. Esquema de trabajo para la adaptacin de la tcnica FISH a muestras del Digestor anaerobio.
4.3
Cuantificacin de la seal de hibridacin
Para el propsito de la cuantificacin de la seal emitida por la florescencia de los microorganismos se realiz la evaluacin de la intensidad captada mediante el software MATLAB 7.1 y el algoritmo de cuantificacin, realizando fotos a 20 campos distintos y en los dos canales, verde y rojo (cada canal con el filtro correspondiente para cada fluorocromo). Un canal es para las sondas de inters marcadas con el fluorocromo TAMRA (rodamina) con una longitud de onda de absorcin de 555 nm y de emisin 580 nm (de color rojo), y el otro canal para la sonda general marcada con el fluorocromo FAM (fluorescena) con una longitud de onda de 494 nm y de emisin de 518 nm (de color verde). Las imgenes se tomaron de campos representativos de la hibridacin (con presencia bacterias). Las imgenes se introducen en un software de cuantificacin (Borrs 2008) y el programa realiza un promedio de la intensidad detectada en el canal de la sonda de inters con respecto al canal de la sonda general.
47
4.4
Anlisis Cuantitativo
El programa genera una hoja de clculo, donde se pueden ver el informe detallado de los resultados de la cuantificacin (reas ocupadas por las bacterias presentes en la muestra hibridada) para cada campo y para el total de las imgenes, as como tambin un grfico de los porcentajes hibridados (figura 10). El resultado final es un nmero que representa el porcentaje en rea de una especie bacteriana en la muestra, acompaado del error de cuantificacin (Borrs, 2008).
Figura 10. Hoja de calcul que genera el programa de cuantificacin.
En la tabla 9, se muestran los resultados obtenidos de la cuantificacin realizada con la ayuda del software de cuantificacin (Borrs 2008). Para los tiempos de fijacin y de hibridacin evaluados, en la tabla se muestra la media aritmtica y la incertidumbre de las reas detectadas para las SRB (bacterias sulfato reductoras detectadas con la sonda SRB385, orden desulfovibrionales), con respecto al total de bacterias detectadas con la sonda EUBMIX (general para las bacterias que comprende EUB338; EUB338II y EUB338III, dominio eubacteria). Con los resultados obtenidos y reportados en la tabla 15, podemos observar que entre los tiempos de fijacin hay un incremento de los promedios de las reas (pixeles) conforme aumentamos el tiempo de fijacin. Este incremento llega hasta los 90 min, luego hay un decremento hasta los 180 min. Esta tendencia de la seal detectada se presenta para los tres tiempos de hibridacin evaluados. En cuanto a los tiempos de hibridacin evaluados, hay un incremento de la seal detectada (expresada como promedio de las reas) entre el tiempo de 60 min y el de 90 min, sin embargo entre los tiempos de 90 min y el de 120 min la seal detectada decrece.
48
Abundancia de los diversos grupos funcionales bacterianos en los procesos biolgicos de aguas residuales: Fangos Activados y Digestin Anaerobia Tabla 15. Promedio de las reas (pixeles) ocupadas por las bacterias y error en la cuantificacin de la seal detectada en la muestra del digestor anaerobio para las bacterias SRB
Tiempo hibridacin
60 min
90 min
120 min
Tiempo fijacin
30 min 45 min 60 min 90 min 120 min 180 min
8 +/- 2 8 +/- 3 11 +/- 3 9 +/- 3 8 +/- 2 10 +/-2
6 +/- 1 9 +/- 2 12 +/- 2 14 +/- 2 12 +/- 2 9 +/- 2
8 +/- 2 7 +/- 2 6 +/- 1 9 +/- 3 8 +/- 2 10 +/- 4
En el tiempo de hibridacin de 90 min se registran las incertidumbres ms estables y las mayores seales detectadas (figura 11). Entre los tiempos de fijacin, el de 90 min reporta mayor seal detectada. Por tanto se ha decidido trabajar con tiempos de hibridacin de 90 min y de fijacin de 90 min ya que estos tiempos se obtiene la seal ms alta.
Figura 11. Hibridacin Fluorescente FISH con modificacin de tiempos de fijacin y de hibridacin. A) Hibridacin con sonda especfica SRB385.Vista en el canal rojo. B) Hibridacin con sonda general de bacterias EUBMIX. Vista en el canal verde. 630x.
La figura 11 esta compuesta de dos imgenes: la imagen A correspondiente a la sonda especfica y de inters (SRB385), y la imagen B correspondiente a la hibridacin con la sonda general. Si comparamos las dos imgenes de la figura 11 con las de la figura 8 se observa un notable incremento de la intensidad de fluorescencia.
49
50
Deteccin y cuantificacin de los distintos grupos bacterianos presentes en los procesos de Fangos activados y Digestin anaerobia
En este capitulo se describen para cada grupo bacteriano, los resultados obtenidos en las hibridaciones asi como en el anlisis de cuantificacin realizado. La deteccin de cada uno de los distintos grupos de bacterias se realiz tanto en las muestras del Fango activado como en las de la Digestin anaerobia. Los resultados de las cuantificaciones se expresan como porcentajes de abundancia del grupo funcional de interes. 5.1 Deteccin y cuantificacin de las bacterias nitrificantes
Para las hibridaciones correspondientes a la deteccin de las bacterias nitrificantes, tanto amonio-oxidantes como nitrito-oxidantes, se usaron las sondas especficas que se mencionan en la tabla 9 descrita en el apartado de materiales y mtodos. La sonda NSO1225 LNA, detecta bacterias amonio-oxidantes, mientras las sondas Ntspa712 y NIT3 detectan las bacterias nitrito-oxidantes. Las tres tienen un porcentaje alto de formamida por lo que son muy restrictivas en la hibridacin, lo que las hace muy fiables. En las muestras procedentes del Digestor anaerobio las tres sondas usadas dan resultados negativos. Las bacterias que llevan a cabo la nitrificacin tienen una tasa de crecimiento lento, y estas solo crecen cuando las condiciones son las adecuadas para ellas (temperatura, pH, edad del fango, oxgeno disuelto, etc.). La nitrificacin se da en la mayora de los tratamientos aerobios cuando las condiciones ambientales y las de funcionamiento son las adecuadas (Ferrer, 2007). Para las muestras del reactor biolgico de fangos activados, fueron positivos los resultados de las hibridaciones con la sonda NSO1225LNA y Ntspa712. En la deteccin de estas bacterias se observ que las amonio-oxidantes se agrupan en flculos definidos y gruesos (figura 12), mientras que las nitrito-oxidantes se agrupan en flculos pequeos (figura 13).
51
Figura 12. Bacterias amonio-oxidantes en el Reactor aerobio. Las seales en verde corresponden a diversas bacterias mientras que las seales en rojo corresponden a las AOB. Imagen a 630x.
Figura 13. Bacterias nitrito-oxidantes en el Reactor aerobio. Las seales en verde corresponden a las diversas bacterias presentes en la muestra, mientras que las seales en rojo corresponden a las NOB. Imagen a 630x.
52
Comparando las figuras 12 y 13 podemos ver que hay ms abundancia de las Amonio-oxidantes que de las nitrito-oxidantes. Sin embargo ambas forman el grupo de las bacterias nitrificantes, que es el grupo de inters. Las bacterias nitrificantes en el reactor aerobio estan presentes en un 9% (+/- 1%). Este grupo de bacterias se disponen en el flculos de manera aglomeradas entre ellas, dentro del mismo floculo. 5.2 Deteccin y cuantificacin de las bacterias acumuladoras de poli-fosfatos (PAOs) y acumuladoras de glcogeno (GAOs)
Las sondas especficas usadas para este anlisis se muestran en la tabla 10, como ya se ha mencionado antes y para facilitar las hibriaciones se han usado mezclas de las sondas, tanto para las PAO como para las GAO. Las hibridaciones se realizaron tanto en las muestras del Digestor anaerobio como para la muestra procedente del Reactor aerobio. En el digestor anaerobio no se detect presencia de las bacterias PAO y GAO, lo que parece lgico, ya que estas bacterias no son capaces de crecer en condiciones anaerobias. As, estas bacterias presentan una clara desventajas con respecto a otros grupos bacterianos capaces de utilizar los cidos grasos voltiles presentes en la digestin anaerobia. En el reactor aireado de fangos activados se ha obtenido seal positiva para las PAO y para las GAO pertenecientes a los organismos defluvicoccus cluster II. Con ayuda del programa de cuantificacin, se hizo el anlisis cuantitativo de las muestras que resultaron positivas. Las bacterias PAO resultarn un 2% (+/- 1), mientras que las GAO fuerno un 4% (+/- 2) del total de las bacterias hibridadas con las sondas generales de dominio eubacteria y archaea (EUBMIX + ARCH915). Como se puede observar, hay mayor porcentaje de la presencia de las GAO cluster II que las PAO, sin embargo entre las dos tienen poca presencia en la poblacin microbiana. Realizando el anlisis cuantitativo de la presencia de estas bacterias podemos observar que no hay un porcentaje alto de ellas, en total representan un 6% de la poblacin total de bacterias que hay en el fango activo. En cuanto a las observaciones ambas bacterias son pequeas de tamao, la diferencia es que las PAO se agrupan de froma muy densa, mientras que las GAO estn de ms dispersas (figura 14 y 15). La presencia de estas bacterias en el tanque aerobio puede deberse a que existen zonas anaerobias dentro del reactor.
53
Figura 14. Bacterias PAO en el Reactor aerobio. La seal en verde corresponde a diversas bacterias presentes en la muestra. La seal en rojo corresponde a las bacterias PAO. Imagen a 630x.
Figura 15. Bacterias GAO en el Digestor anaerobio. La seal en verde corresponde a la poblacin bacteriana presente en la muestra. La seal en rojo corresponde a las bacterias GAO. Imagen a 630x.
54
5.3
Deteccin y cuantificacin de las bacterias Desnitrificantes
Para las hibridaciones de las bacterias desnitrificantes se usaron 3 sondas especficas que se muestran en la tabla 11 descrita en materiales y mtodos. En ambas muestras (Digestor anaerobio y Reactor aerobio) se detect presencia de las bacterias desnitrificantes. Existen muchas bacterias con capacidad para cambiar su metabolismo pasando de utilizar oxgeno como aceptor final de electrones a utilizar nitrato (Ferrer, 2007). La utilizacin de oxgeno se ve favorecida frente a la de nitrato, por lo que si existen ambos compuestos, no se producir la desnitrificacin. Sin embargo bajas concentraciones de oxgeno disuelto se pueden encontrar en determinadas zonas del reactor, debido a la configuracin que pudiera tener, o dentro del flculos (fango granular) debido a una limitacin en la transferencia de oxgeno en el interior del mismo. En ambos casos aparecen zonas donde se da la desnitrificacin (Ferrer, 2007). Utilizando el software de cuantificacin, se realiz el anlisis cuantitativo de las muestras que resultaron positivas, tanto en el digestor anaerobio como las del reactor aerobio. En el Digestor anaerobio la presencia de las bacterias dsnitrificantes es del 10% (+/- 5), mientras que para el Reactor aerobio estas bacterias estan presentes con un 19% (+/- 2) del total de bacterias hibridadas con las sondas EUB MIX y ARCH 915. Las bacterias desnitrificantes tanto en el reactor aerobio como en el digestor anaerobio se encuentran dispersas y algunas formando flculos, excepto para las bacterias Thiobacillus que son filamentosas (figura 16). La presencia de bacterias desnitrificantes se puede ver afectada por varios factores, siendo alguno de ellos: 1. Presencia de oxigeno disuelto: las concentraciones superiores a 0.3-1.5 mg O2/l inhiben el mecanismo de la desnitrificacin. El oxgeno impide la formacin de la nitrato reductasa, enzima que cataliza el paso de nitrato a nitrito bloqueando el proceso de desnitrificacin (Barajas, 2002).
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Figura 16. Bacterias desnitrificantes. A) Bacterias Azoarcus-Thauera-Castellaniella cluster en el Digestor anaerobio. B) Bacterias Azoarcus-Thauera-Castellaniella cluster en el Reactor aerobio.C) Bacterias Paracoccus en el Digestor anaerobio. D) Bacterias Paracoccus en el Reactor aerobio. E) Bacterias Thiobacillus en el Digestor anaerobio. Las seales en verde son la poblacin bacteriana mientras q las seales en rojo son las bacterias desnitrificantes. Imagenes a 630x.
2. Fuente de carbono orgnico: diversos grupos de bacterias compiten con las desnitrificantes para utilizar el nitrato y transformarlo en otros productos distintos al N2. Por tanto es importante la existencia de una relacin C/N adecuada y una fuente de carbono fcilmente biodegradable. Las fuentes de carbono propuestas (Garca, 1997) para llevar a cabo la desnitrificacin son variadas y entre ellas destacan el metanol, el acido actico, el etanol, la acetona y algunos azcares, as como fuentes de carbono interno del proceso como la materia orgnica del agua residual, el carbono endgeno e incluso el metano que se produce en el proceso anaerobio. Se han llevado a acabo estudios para utilizar fango hidrolizado para llevar a cabo el proceso de desnitrificacin ya que contiene fuentes de carbono fcilmente biodegradables (Henze, 1991).
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3. Temperatura: Henze (1991) encontr que a medida que aumenta la temperatura, el rendimiento de la desnitrifiacion aumenta. La desnitrificacin es el proceso que tolera un rango de temperatura amplio, ya que existen bacterias con temperaturas ptimas de crecimiento de 28 a 32C (Kelly et al., 2000). En el digestor anaerobio las bacterias desnitrificantes hallan las condiciones para su crecimiento ya que no hay oxgeno que inhiba su proceso, cuentan con fuente de carbono fcilmente biodegradable, se encuentran en temperaturas ptimas, as como tambin influye que en el reactor aerobio se produce la nitrificain, de forma que al digestor le llegan nitratos, lo cual favorece el desarrollo de las desnitrificantes en el digestor. Se realiz un anlisis de corroboracin de los resultados obtenidos en la muestra del digestor anaerobio, por lo que se tom una muestra de la EDAR CARRAIXET con 6 meses de diferencia con la primera muestra. A esta nueva muestra se le realiz el mismo procedimiento de fijacin y de hibridacin que a la primera muestra y se analiz cuantitativamente obteniendo los resultados muy similares a los de la primera muestra hibridada. Por lo que la presencia de las bacterias desnitrificantes en el Digestor Anaerobio no se debe a algo puntual.
5.4
Deteccin y cuantificacin de las bacterias Metanotrofas
Con las dos sondas que se reportan en la tabla 12 se cubre todos los gneros conocidos y reportados en bibliografia como bacterias metanotrofas. Estas bacterias no es muy comn hallarlas en los sitemas convencionales de fango activo. Las hibridaciones correspndientes se realizaron para ambas muestras (Digestor anaerobio y Reactor aerobio). Para las muestras del digestor anaerobio, las hibridaciones resultaron negativas. En las muestras del reactor aerobio la sonda Ma464 que pertenecen a las metanotrofas del tipo II, da seal positiva, mientras que con la otra sonda, se detecta tan solo una muy baja presencia. Con el software de cuantificacin, se realiz el anlisis cuantitativo de las muestras que resultaron positivas del reactor aerobio. Las bacterias metanotrofas se encuentran en la muestra del Reactor aerobio con una abundancia del 1 +/- 1% (figura 17). Se ha reportado que la temperatura ptima para la metano oxidacin es de 25C (Hanson et al., 1996). Las Metanotrofas del tipo II se ven favorecidas frente a las del tipo I en condiciones de bajo contenido de metano. Adems, tambien influye si est limitado el medio en nitrgeno (Hanson et al., 1996). La hiptesis es que la concentracin de metano y oxgeno combinado con nitrgeno, son los factores determinantes del tipo de metanotrofa que se encuentre (Hanson et al., 1996).
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Figura 17. Bacterias Metanotrofas en el Reactor aerobio. La seal en verde corresponde a la poblacin de bacterias presentes en la muestra. La seal en rojo corresponde a las bacterias metanotrofas presentes en la muestra. Imgenes a 630x.
5.5
Deteccin y cuantificacin de las bacterias Sulfato-reductoras (SRB)
Para la deteccin de las bacterias Sulfato reductoras se hace uso de las sondas de la tabla 13 antes descrita. Las sondas SRB385 y la SRB385Db son sondas que detectan tipos de bacterias sulfato reductoras de la clase deltaproteobacteria, pero no todas las deltaproteobacteria y dems sulfato reductoras fuera de la clase deltaproteobacteria (Ashelford et al 2002; Loy et al 2002; Lcker et al 2007). Rabus (1996) compar la deteccin de ambas sondas entre una gran cantidad de bacterias. El resultado fue que la sonda SRB385Db detecta ms familias de sulfato reductoras que la sonda SRB385. Las dems sondas son mas restrictivas en cuanto a la deteccin de familias o gneros de las bacterias sulfato reductoras dentro de la clase deltaproteobacteria. Se detectaron seales positivas para ambas muestras (Digestor anaerobio y Reactor aerobio), con las sondas generales de sulfato reductoras. La diferencia entre ambas muestras es la abundancia de bacterias (figura 18 y 19).
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Figura 18. Bacterias Sulfato-reductoras en el Digestor anaerobio. A) Muchas Desulfovibrionales y otras Bacterias. B) Desulfobacteracea (Desulfobacterales, Desulfuromonales, Syntrophobacterales, Myxococcales, y otras Bacterias. C) Desulfonema. Las seales en verde corresponden a la poblcin bacteriana presente en la muestra, mientras q las seales en rojo corresponden a las bacterias SRBs. Imgenes a 630x.
En las anteriores imgenes se puede ver que las bacterias, en su mayora, se encuentran dispersas, y unas pocas agrupadas en pequeos flculos. El anlisis cuantitativo se realiza con la ayuda del software de cuantificacin para todas las muestras que dieron un resultado positivo. Las sulfato reductoras en el Digestor anerobio es un 20% (+/- 4) de la poblacin de bacterias total hibridada con las sondas generales de dominio (EUBMIX + ARCH915). Mientras que la presencia de bacterias sulfato reductoras en el Reactor aerobio es de un 27% (+/- 4). Ambos resultados son significativos.
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Figura 19. Bacterias Sulfato-reductoras en el Reactor aerobio. A) Muchas Desulfovibrionales y otras Bacteria. B) Desulfobacteracea (Desulfobacterales, Desulfuromonales, Syntrophobacterales, Myxococcales, y otras Bacterias. C) Desulfonema. Las seales en verde corresponden a la poblcin bacteriana presente en la muestra, mientras q las seales en rojo corresponden a las bacterias SRBs. Imgenes a 630x.
En general, en las muestras del Digestor Anaerobio, las seales de hibridacin eran menos intensas que las del Reactor Aerobio. Tambin en las muestras del Digestor anaerobio se detectan menores seales fluorescentes en comparacin con las del Reactor aerobio. En principio, no cabra esperar una presencia tan elevada de bacterias SRB en el reactor aerobio (27%), que incluso es mayor que en el digestor anaerobio (20%). A continuacin, se discuten las posibles causas de este hecho. Aunque tradicionalmente se considera a las SRB anaerobias estrictas, en los ultimos aos se ha reportado actividad sulfato reductora en ambientes aerobios, demostrando el amplio rango ecolgico de las SRB (Baumgartner et al., 2006). Un estudio realizado en 1985, demuestra que varias cepas de SRB pueden sobrevivir periodos largos en zonas xicas y mantener su capacidad para la reduccin del sulfato (Cypionka et al., 1985). Ms tarde se estudi la capacidad de las SRB para reducir el oxgeno y el nitrato en los procesos aerobios (Dillin y Cypionka 1990; Dannenburg et al., 1992). En otro estudio realizado aos ms tarde, se demostr que las SRB utilizan distintos aceptores de electrones en funcin de su rendimiento energtico:
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el oxgeno en primer lugar, a continuacin el nitrato/nitrito y luego los compuestos de azufre (sulfato, sulfito, tiosulfato y azufre elemental) (Krekeler y Cypionka 1995). Otros estudios realizados se centraron en los procesos bioqumicos durante la reduccin del oxigeno por SRB (Baumgartner et al., 2006). Chen et al., (1993) descubrieron que Desulfovibrio gigas utiliza un par de proteinas para reducir el oxigeno mientras oxida NADH (dinucleotido de nicotiamida adenina oxidada). Otros estudios demostrarn que las SRB contienenen superoxidos que protegen a la clula cuando se encuentra en ambientes de estrs oxidativo (Louro, 2009). Estos superxidos reductasas participan en las reacciones redox (Carvajal, et al., 2008), y los que podemos encontrar en las SRB son, neelaredoxina, desulfoferredoxina y rubredoxina (Fauque y Olliver, 2004). En ausencia de sulfatos, ciertas SRB pueden utilizar compuestos carbonatados simples como dadores y aceptores de electrones por un proceso llamado dismutacin. Es decir, ciertas SRB son capaces de desproporcionar compuestos intermediarios de azufre. Las desproporcin se refiere a desintegrar compuestos reducidos de azufre, tales como tiosulfato, sulfito o azufre elemental (S0), a un nuevo compuesto, el cual est ms oxidado y/o reducido comparado con el substrato original (Salazar, 2008). Por otro lado, al igual que las archaeas metanognicas, algunas SRB se agrupan, por lo que pueden quedar en las capas mas profundas de los grnulos en microambientes anaerobios. Sin embargo, en ninguna de las muestras se observ fango granular. La presencia de estas bacterias en el reactor aerobio, como en el caso de las archaeas metanognicas, se debe, entre otras causas, a la existencia de la recirculacin del fango del digestor al decantador primario. Tambien se debe tomar en consideracin que las aguas de la zona son ricas en sulfatos, lo que proporciona una relacin DQO/S baja, favoreciendo la proliferacin de las SRB. Por otr parte, existe en el proceso un paso de sulfato a sulfuro (proceso biolgico) pero tambien existe un paso de sulfuro a sulfato (proceso qumico), dando as un ciclo continuo y proporcionando el medio adecuado para la existencia de las SRB. Para corroborar los resultados obtenidos en el Reactor aerobio, se repiti el anlisis con fango procedente de la planta del CARRAIXET con 6 meses de diferencia con la primera muestra. A esta nueva muestra se le someti al mismo procedimiento que a la primera muestra en cuanto a fijacin e hibridacin. Los resultados son muy similares, esto queda confirmado que en ambas muestras se detectan las sulfato reductoras de manera muy abundante.
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5.6
Deteccin y cuantificacin de las bacterias Metanognicas
Las sondas especficas correspondientes para las hibridaciones de las archaeas metanognicas se detallan en la tabla 14 descrita en el capitulo de materiales y mtodos. En las muestras del Digestor anaerobio tres de las sondas (MSMX860, MG1200b y MB311) dan seal positiva y de mucha intensidad, por lo que se ha de suponer que el porcentaje de presencia de las bacterias metanognicas es significativo en la poblacin microbiana total. En las muestras del Reactor aerobio dos de las sondas dan resultados positivos (MG1200B y MB311), aunque las dos sondas dan poca seal de hibridacin en comparacin a la hallada en el Digestor anaerobio. Utilizando el software de cuantificacin, se realiz el anlisis cuantitativo de las muestras que dieron seales positivas tanto del digestor anaerobio como las del reactor aerobio. Los resultados de la cuantificacin para el Digestor anaerobio muestran un 30% (+/- 6) de abundancia y un 11 % (+/- 2) de abundancia para el Reactor aerobio. Los resultados muestran porcentajes de presencia altos en ambos procesos. Cabra esperar una ausencia total de organismos metanognicos en el Reactor aerobio, sin embargo, un 11% supone una presencia importante de estos organismos. A continuacin se discuten las causas ms probables de este hecho. En el digestor anaerobio, la mayora de estas bacterias, se agrupan de forma muy peculiar, pues aparentan racimos no muy grandes. Tambin hay algunas bacterias que forman cadenas y otra parte que estn dispersas (figura 20). En el reactor aerobio se visualizan bacterias agrupadas y bacterias dispersas. Los organismos metanognicos encontrados en el reactor aerobio parecen ser de menor tamao que los encontrados en el digestor anaerobio (figura 21). En el Reactor aerobio una concentracin de O2 disuelto inferior o igual a 0.1-1 mg/l, puede inhibir el crecimiento de las bacterias aerobias, pero se sabe que concentraciones alrededor de 0.01-0.001 mg/l, puede inhibir el crecimiento de algunos organismos metanognicos hidrogenotrficos y la produccin de CH4 (Macarie, et al., 1996). Sin embargo, un nmero elevado de organismos metanognicos, as como bacterias acetognicas anaerobias estrictas, han sido encontrados en los fangos activados de varias plantas de tratamiento aerobio (Macarie, et al., 1996). La presencia de microorganismos anaerobios estrictos en ambientes aerobios corresponde a la formacin de micronichos anaerobios. Los micronichos se relacionana con la formacin de los grnulos en los que se ve limitada la transferencia de O2 al interior de l (Macarie, et al., 1996). Varios trabajos han demostrado que los flculos desarrollados presentan una organizacin multicapas de su poblacin bacteriana (Macarie, et al., 1996). Las bacterias fermantativas, las cuales son en parte anaerobias facultativas, se encuentran exclusivamente en la parte externa del grnulo, mientras que los microorganismos ms 62
sensibles al O2 (metanognicos, tanto acetoclsticos como hidrogenotroficos) se ubican en las capas ms profundas del grnulo (Macarie, et al., 1996).
Figura 20. Bacterias Metanognicas en el Digestos anaerobio. A) Methanosarcinales. B) Methanomicrobiales. C) Methanobacteriales. Las seales en verde corresponden a toda la poblacin bacteriana presente en la muestra, mientras que las seales en rojo corresponden a las archaea metanognicas. Imgenes a 630x.
En los resultados de un estudio realizado por Anzola (Anzola, et al., 2008) sobre reactores anaerobios-aerobios de lecho fijo, se muestra que el contenido del O2 disuelto en una de las zonas del reactor no afect la metanognesis, sino que aument la velocidad y mejor la produccin de CH4. Sin embargo en las muestras analizadas en el presente trabajo no se visualiz fango granular. Por lo que la causa ms probable de la presencia de estas archaeas se debe a que en la EDAR existe la recirculacin de los fangos del digestor hasta la decantacin primaria. Llegamos a detectar estas archaeas debido que el tiempo de retencin celular del reactor aerobio es bajo, por lo que no da tiempo a que desaparezcan todas estas especies. Se realiz una prueba para corroborar los resultados obtenidos en el Reactor aerobio en cuanto a la presencia de los organismos metanognicos.
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Se tomo una muestra del reactor aerobio de la planta del CARRAIXET con una diferencia de fechas de 6 meses. La muestra se someto al mismo procedimiento de fijacion e hibridacin que las muestras anteriores y se le realiz la cuantificacin.
Figura 21. Bacterias Metanognicas en el Reactor aerobio. A) Methanomicrobiales. B) Methanobacteriales. Las seales en verde corresponden a toda la poblacin bacteriana presente en la muestra, mientras que las seales en rojo corresponden a las archaea metanognicas. Imgenes a 630x.
Los resultados de estas pruebas fueron similares a las primeras hibridaciones con lo que se corrobora la presencia y porcentajes significativos en ambas muestras. En las figuras 20 y 21 podemos observar que las metanognicas podemos encontrarlas dispersas, aglomeradas y formando filamentosas. 5.7 Comparacin del total de las poblaciones bacterianas encontradas en el Fango activado y en la Digestin anaerobia
En la figura 22 se puede ver la comparacin de los distintos grupos de bacterias tanto en la muestra del Reactor aerobio como en la del Digestor anaerobio. Comparando los microorganismos detectadas en las hibridaciones realizadas se ha encontrado que la poblacin bacteriana con la que cuenta el reactor aerobio (figura 22) es: 1. Bacterias nitrificantes 2. Bacterias PAO 3. Bacterias GAO 4. Bacterias desnitrificantes 5. Bacterias metanotrofas 6. Bacterias sulfato-reductoras 7. Archaeas metanognicas 8. Restos de poblacin heterotrofa
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Mientras que la poblacin microbiana del Digestor anaerobio (figura 22) esta formado por: 1. 2. 3. 4. Bacterias desnitrificantes Archaeas metanognicas Bacterias sulfato-reductoras Resto de poblacin anaerobia
Presencia por grupo de bacterias en la poblacion microbiana en el Reactor aerobio 9% 27%
2%
4% 19%
1% 27% 11%
Bacterias Nitritrificantes
Bacterias PAO
anaerobio
Bacterias GAO
por grupo de bacterias en la poblacion microbiana en el Digestor BacteriasPorcentaje Desnitrificantes Bacterias Metanotrofas Archaeas Methanognicas
Bacterias SRB
Resto de bacterias
10%
Porcentaje 40% por grupo de bacterias en la poblacion microbiana en el Digestor anaerobio 10% 40%
20% 30%
30%
20%
Figura 22. Comparacin de los grupos de bacterias en cada proceso analizado. En la grfica de arriba, poblacin microbiana en el Reactor aerobio. En la grfica de abajo, poblacin microbiana del Digestor anaerobio.
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Los resultados obtenidos estn dentro de lo esperado, sin embargo, existen tres grupos de microorganismos (desnitrificantes, metanognicos y sulfatoreductores) que a priori no deberan aparecer en ambos procesos simultneamente. A continuacin, se exponen las razones que justifican la presencia de estos organismos en ambos procesos: a) Bacterias Desnitrificantes.- se observan 3 grupos de desnitrificantes (Azoarcus-Thauera-Castellaniella, Paracoccus y Thiobacillus) en el Digestor anaerobio con un porcentaje de abundancia de 10%, mientras que en el Reactor aerobio tan solo se han encontrado 2 grupos (Azoarcus-Thauera- Castellaniella, Paracoccus) con un 19% de abundancia. El grupo de estas bacterias del que carece el reactor (Thiobacillus) forma filamentosas. En principio, no se esperaba la presencia de bacterias desnitrificantes en el digestor anaerobio. La elevada presencia de bacteris desnitrificantes en el digestor anaerobio se debe, principalmente, a que se detect una alta concentracin de nitratos a la entrada del digestor anaerobio, lo que favorecera el desarrollo de estas bacterias. En cuanto a las especies concretas, la bacteria Paracoccus puede crecer bajo diferentes concentraciones de O2, utilizando N-xidos como aceptores de electrones y con una variedad de fuentes de carbono incluyendo aminas y alcoholes (Beker et al., 1998). Se ha visto que especies como Paracoccus solventivorans crecen con acetona, Paracoccus aminovorans y aminophilus con dimetilformamida, Paracoccus thiocynatus con tiocinato y Paracoccus desnitrificans puede usar disulfuro como fuente de carbono (Beker et al., 1998). La Paracoccus denitrificans usa tanto compuestos de sulfuro como tiosulfato como dadores de electrones en la desnitrificacin (Lee et al, 2008). Su capacidad de utilizacin de diferentes dadores de electrones hace posible encontrar estas bacterias en ambientes anxicos. Las bacterias Azoarcus y Thauera consumen una amplia gama de acidos grasos de cadena corta (Morgan et al., 2008). Esta caracterstica permite encontrarlas tando en el reactor como en el digestor anaerobio. Sin embargo la abundancia de la bacteria Azoarcus en los reactores de plantas a gran escala varia entre un 3-16% de la biomasa total (Thompsen et al., 2007). Si adems las plantas cuentan con adicin de Metanol como fuente de carbono, esta abundancia puede llegar a superar el 30% (Hagman et al., 2008). La abundancia de la Thaurea en plantas a gran escala varia entre un 2-11% del total de la biomasa (Thompsen et al., 2007). La bacteria Thiobacillus puede crecer tanto en medios aerobios como anaerobios, sin embargo, su temperatura ptima es de 28 a 32C con un pH de 6 a 8 (Kelly et al., 2000). Como la temperatura del reactor aerobio es de aproximadamente 20 C, no se favorece el desarrollo de Thiobacillus en l. Estas bacterias se han encontrado en aguas residuales, lagunas de tratamiento de residuos industriales y en los tanques de digestin especialemente bajo condiciones de anoxia (Kelly et al., 2000). La especie Thiobacillus denitrificans crece como los organismos auttrofos quimiosintticos en medios anaerobios (anxicos) utilizando tiosulfato, tetrationato, tiocinato, sulfuro o azufre elemental mediante el uso de nitrato, nitrito u xido nitroso como aceptores de electrones (Kelly et al., 2000; Lee et al, 2008).
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Por otra parte, las bacterias Thiobacillus y Paracoccus juegan un papel importante en el digestor anaerobio ya que participan en el ciclo del azufre estableciendo una relacin con la presencia de las SRB. Por lo que su presencia en el Digestor anaerobio es justificable.
b) Archaea Metanognicas.- Se observan que son 3 grupos de estos microorganismos (Methanosarcinales, Methanomicrobiales y Methanobacteriales) en el Digestor anaerobio y tan solo 2 en el Reactor aerobio (Methanomicrobiales y Methanobacteriales). El grupo del que carece el Reactor aerobio (Methanosarcinales), forma filamentosas y se agrupa, a diferencia de todos los dems microorganismos hallados en las muestras, en forma de racimos. En principio, no cabra esperar la presencia de organismos metanognicos en el reactor aerobio. Sin embargo, la existencia de una recirculacin de fangos del digestor anaerobio al decantador primario de la EDAR, hace que sea posible su presencia en el reactor aerobio. Estos microorganismos no llegan a desaparecer completamente en el reactor aerobio debido a que el tiempo de retencin celular es bajo, aunque se llega a obtener una disminucin aproximada de un 60% (30% de estas archaeas en el digestor y 11% en el reactor). En cuanto a la diferencia de especies, hay que decir que los microorganismos Methanosarcinales son acetotrficos. Etos estan presentes en el Digestor anaerobio pero no en el Reactor aerobio, lo que se puede deber a que en el Reactor aerobio no exista actico sufiente para la proliferacin de estas archaeas, ya que pueden entrar en competencia por el actico con las bacterias PAO, GAO y otros organismos. Adems, la velocidad de crecimiento de los organismos metanognicos acetotrficos es ms lenta que la de los hidrogenotrficos. c) Bacterias Sulfato-reductoras.- encontramos los mismos grupos de estas bacterias (Desulfovibrionales y Desulfobacteraceae) en los dos procesos estudiados (Digestor anaerobio y Reactor aerobio). La diferencia est en que las bacterias del Reactor aerobio son ms grandes y abundantes (27%) que las que aparecen en el Digestor anaerobio (20%). En principio, se puede pensar que no debera haber muchas de estas bacterias en el Reactor aerobio. Sin embargo, existen una serie de factores que hacen posible su proliferacin en este tipo de ambientes. En primer lugar, ya se ha comentado que existe una recirculacin de los fangos del digestor anaerobio al decantador primario, lo que hace posible la presencia de estas bacterias en el reactor. En segundo lugar, las aguas residuales que llegan a la EDAR del Carraixet contienen gran cantidad de sulfatos, dando una relacin DQO/S baja, lo que favorece el desarrollo de estos microorganismos en el reactor aerobio. Adems, cabe destacar que el sulfato que es transformado a sulfuro por estas bacterias, pasa de nuevo a sulfato por la presencia de oxgeno en el reactor aerobio. Esto hace que siempre exista una fuente de sulfatos en el reactor, favoreciendo as el crecimiento de las SRB, lo que no ocurre en el digestor anaerobio.
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Por otra parte, algunas SRB no son completamente dependientes del sulfato. Estas pueden usar como aceptor de electrones alternativamente Fe(III) y nitrato, pueden desproporcionar compuestos sulforados y pueden crecer bajo condiciones fermentativas (Ravenschlang et al, 2000). Se ha observado que las SRB tienen la capacidad de utilizar diversos dadores de electrones para la reduccin de sulfatos. Entre estos dadores cabe destacar: hidrgeno, cidos grasos y subproductos orgnicos formados por las bacterias aerobias durante su crecimiento (Rabus et al. 1996). En el anexo se muestran algunas de las reacciones ms importantes que se llevan a cabo durante el ciclo del azufre. Es de suponer que las bacterias no detectadas mediante las sondas utilizadas corresponden al resto de poblacin bacterian, probablemente bacterias hetertrofas. Em el caso de la poblacin de las bacterias em el Digestor anaerobio, las bacterias no detectadas y reportadas como Resto de poblacin bacteriana estn asociadas con bacterias acidognicas. A la vista de los resultados obtenidos, cabe destacar que la diversidad de microorganismos es mayor en el reactor aerobio que en el digestor anaerobio.
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Conclusiones
Las principales conclusiones que se pueden extraer de este trabajo se detallan a continuacin. Debido a la falta de intensidad en la seal de hibridacin, la cuantificacin de los microorganismos en el reactor aerobio es ms fcil que la cuantificacin de los microorganismos del digestor anaerobio. Las muestras del digestor anaerobio emiten poca fluorescencia debido a obstculos como suciedad (material no biodegradable inerte) y el poco contenido de ribosomas. Variando los tiempos de fijacin e hibridacin se puede llegar a mejorar la fluorescencia emitida por las muestras del digestor anaerobio (aumento de la intensidad lumnica). Esto ayuda en el momento de la cuantificacin de los microorganismos. Los tiempos ptimos para nuestra muestra son 90 min. de fijacin y 90 min. de hibridacin. En el reactor aerobio las especies ms abundantes de microorganimos identificados son: 27% de bacterias SRB, 19% de bacterias desnitrificantes, 11% de archaeas metanognicas, un 9% de bacterias nitrificantes, 4% de bacterias GAO, 2% de bacterias PAO, 2% y un 1% de metanotrofas. Los microorganismos identificados en el digestor anaerobio son: 30% de archaeas metanognicas, 20% de bacterias SRB y 10% de bacterias desnitrificantes. Muchas de las poblaciones presentes en el digestor anaerobio, como los microorganismos metanognicos y las bacterias sulfato reductoras, llegan a los Fangos activados por la recirculacin de los fangos que se lleva cabo en la planta. Sin embargo estas permanecen con abundancias importantes por diversas razones: Las archaeas metanognicas son detectadas con una abundancia del 11% en el reactor aerobio y un 30% en el digestor anaerobio. Esto se debe, entre otras cosas, a que el tiempo de retencin celular del reactor aerobio es bajo y por tanto no es tiempo suficiente para que estos microorganismos lleguen a desaparecer completamente. En el caso de las bacterias sulfato reductoras, estas estan presentes en el fango activado debido a que muchas especies toleran el oxigeno, llegando a detectar un 27% en el reactor aerobio y un 20% en el digestor anaerobio. En el reactor aerobio se detecta incluso mayor porcentaje de SRB por que las aguas son ricas en sulfatos. Adems, su capacidad para utilizar una gran diversidad de dadores de electrones hace que el medio sea apropiado para su proliferacin y que puedan entrar en competencia con las dems bacterias. Tambien en el digestor anaerobio se observa la presencia de las bacterias desnitrificantes. Esto se debe principalmente a que al digestor llega una elevada concentracin de nitratos. Adems, existe una gran diversidad de bacterias desnitrificantes entre las que podemos encontrar, aerobias o anaerobias facultativas, esto hace que las podamos encontrar tanto en el Reactor aerobio como en el Digestor anaerobio. En el caso de la especie Thiobacillus su rango de temperatura (28-32C) es
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un poco ms alto que las temperaturas normales que se encuentran en los reactores aerobios, por lo que es ms fcil encontrarlas en los digestores. Las bacterias Paracoccus tienen un amplio rango de sustratos, crecen bajo diferentes condiciones de O2 utilizando nitratos como aceptores de electrones, esto hace posible encontrarlos tanto en el reactor aerobio como en el digestor anaerobio con presencia de nitratos (anxicos). Un punto muy importante sobre las desnitrificantes Thiobacillus y Paracoccus es que pueden realizar la desnitrificacin usando como dadores de electrones compuestos inorganicos de azufre, por lo que juegan un papel importante en el ciclo del azufre y tienen relacin con la presencia de SRB en los procesos anaerobios. En el reactor aerobio hay ms diversidad de grupos de microorganismos que en el digestor anaerobio. Comparando las distintas poblaciones, en cada uno de los procesos estudiados (Fango activado y Digestor anaerobio), se comprueba la diversidad de los microorganismos y la abundancia de cada especie desarrollada. Adems, es posible relacionar la presencia de algunas especies, ya que subproductos de alguna especie pueden ser el sustrato o el aceptor de electrones de otras especies, estableciendo una relacin simbiotica entre ellas.
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Recomendaciones
Con la informacin y los datos obtenidos es un poco difcil dar una explicacin concreta de lo que est sucediendo en los procesos biolgicos, por lo que se recomienda hacer un anlisis de los grupos de microorganismos faltantes en cada uno de los procesos, tales como las bacterias acidognicas y dems organismos hetertrofos que no se realizaron en este estudio. Esto nos ayudara a detallar ms la poblacin y ver si exiten especies de bacterias que no se han detectado de los grupos estudiados en el presente trabajo. Tambin se recomienda realizar analisis de sulfatos, nitratos y oxgeno en las entradas de los procesos estudiados (reactor aerobio y digestor anaerobio). La realizacin de un estudio ms amplio sobre las poblacines microbianas en los procesos biolgicos en otras plantas de tratamiento de aguas residuales con distintas caractersticas de agua residual (con y sin sulfatos) y esquemas de tratamiento (con y sin recirculacin de fangos desde el digestor), permitira establecer las relaciones entre las especies bacterianas presentes y as entender mejor lo que ocurre durante cada proceso biolgico. El conocimiento de las relaciones simbiticas entre los microorganismos dentro de la poblacin total, es importante por que con ello se obtendra la informacin necesaria para poder completar los modelos matemticos que permiten simular el comportamiento de los procesos biolgicos, permitiendo optimizar el funcionamiento de las plantas de tratamiento de aguas residuales. Por ltimo se recomienda no slo una busqueda exhaustiva de sondas para analizar los microorganismos faltantes en este trabajo, si no la realizacin y diseo de sondas especficas nuevas para detectar las especies de inters. Esto permitir afinar el anlisis de las posibles bacterias y archaeas que pudieran encontrarse en los procesos biolgicos de las aguas residuales y que no estan reportadas en la bibliografa.
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Referencias
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84
Anexo
Reacciones de las Bacterias Amonio-oxidantes NH4+ + 3/2 O2 NO2- + 2H+ + H2O (Ferrer et al, 2007) Bacterias: Nitrosomonas Nitrosospira Nitrosococcus Nitrito-oxidantes NO2- + O2 NO3Bacterias: Nitrobacter Nitrospira PAO Condiciones anaerobias 2C2H4O2 + (HPO3) + H2O (C2H4O2)2 + PO4-3 + 3H+ (Ferrer et al, 2007)
(Ferrer et al, 2007)
Condiciones aerobias (C2H4O2)2 + 0.2 PO4-3 + 1.2 O2 + 0.16 NH4+ 0.16C5H7NO2 + 1.2 CO2+ 0.2 (HPO3) + 0.44 OH- + 1.44 H2O (Ferrer et al, 2007) HPO3= Poli-p C2H4O2= Acido actico C5H7NO2= Biomasa GAO Condiciones anaerobias C2H4O2 + 1.12CH10/6O5/6 PHA(1.358PHB + 0.456PHV + 0.0367PH2MV) + 0.27CO2 (Oehmen et al, 2005) Condiciones aerobias 4/3CH1.5O0.5 + 4/6 ATP + 5/6 H2O CH10/6O5/6 (Oehmen et al, 2005) CH10/6O5/6 = Glicgeno CH1.5O0.5 = PHA Desnitrificantes 6NO3- + 2CH3OH 6NO2- + 2CO2 + 4H2O (Ferrer et al, 2007)
85
6NO2-+ 3CH3OH 3N2 + 3CO2 + 3H2O + 6OHCH3OH= Metanol Bacterias:
(Ferrer et al, 2007)
Paracoccus.- Fuentes de carbono: glicerol, glucosa, succinato, citrato, acetato, etanol, metanol, formiato (Takaya et al., 2003). Azoarcus y Taurea.- Tienen una amplia gama de acidos grasos de cadena corta como fuente de carbono como el acetato (Morgan et al., 2008) y metanol (Hagman, 2008). Thiobacillus.- Su fuente de carbono son compuestos inorgnicos (Kelly et al., 2000). Reaccion enzimtica que se realiza por las desnitrificantes es (Sunil et al., 2010): Nitrato reductasa NO3Metanotrofas CH4 + 1.02 O2 + 0.786 NO3- +0.786 H+ 0.393 N2 + 2.39 H2O + CO2 (Modin et al., 2007) Metanognicas Bacterias: Hidrogenotrofas H2 + CO2 + formato segn especies CH4 (Garca, 1991) Grupo Methanomicrobiales y Methanobacteriales (Methanobrevibacter) Acetoclsticas Acetato + segn especies H2 + CO2 + Formato, Metanol y Metilaminas CH4 (Garca, 1991) Grupo: Methanosarciales Metilotroficas Metanol + Metilaminas CH4 (Garca, 1991) Grupo: Methanobacteriales (Methanobacterium) Hidrogeno-metilotrfica H2 + Metanol CH4 (Garca, 1991) Grupo: Methanobacteriales (Methanosphaera) Alcoholotrficas CO2+ alcohol (2-propanol, 2-butanol, etanol) (Garca, 1991) Grupo: Methanobacteriales (Methanobacterium) Nitrito Oxido nitrico Oxido nitroso reductasa reductasa reductasa [NO] N2O N2
NO2-
86
Methanomicrobiales (Methanogenium, Methanocorpusculum, Methanospirillum) Sulfato Reductoras (SRB) CH3COO- + SO42- HS- + 2HCO3- (Hidalgo et al., 2001) 4H2 + H+ + SO4 2- HS- + 4H2O (Hidalgo et al., 2001) Pueden tener variedad de aceptores de electrones, tales como tiosulfato (S2O32-); sulfito (SO32-); azufre y nitrato, de hecho pueden usar el Fe (III) y disproporcionar compuestos de azufre (Ravanschlag et al., 2000). Como fuente de carbono usan una variedad de cidos grasos voltiles, alcoholes y compuestos aromticos. Sin embargo en el ciclo del azufre podemos encotrar una gran variedad microorganismos, tales como Thiobacillus y Paracoccus. de
Procesos que ocurren en el ciclo del azufre (Kelly, 1999; Kelly et al., 2000; Perz. 2008): Oxidacin del azufre Este proceso consiste en: H2S S0 SO42Las reacciones de la sulfuro oxidacin son: H2S+1/2 O2 S0 +H2O S0+3/2 O2 +H2O SO4H4 Algunas bacterias que realizan este proceso son: Thiobacillus S2- S0 S2- + 3H2O SO32- +6H+ + 6e- SO42Paracoccus S2O3 2-- +2 O2+ H2O 2SO4 2- + 2H+ El paso del tiosulfato a sulfato puede darse de dos maneras estas son: S0 SO42S2O32SO32- + SO42S2O32- = Tiosulfato SO32= Sulfito
87
Reduccin del Azufre Este proceso es el paso de un compuesto oxidado a otro menos oxidado: SO4- - H2S S0 H2S SO4 -- R-SHH2S Reacciones de la sulfato reduccin: H2+SO4 2 H2S+2H2O+OH CH3COOH+2H2O+S04 H2S+2CO2 CH3COOH= cido actico Estas reaciones son las de las SRB. Desproporcin del Azufre (algunas SRB) S2O3 2-+ H2O SO4 2- + H2S 4SO3 2- + 2H+ 3SO4 2- + H2S 4S0+2H2O + MnO2 3H2S+SO42- +2H+ + Mn2+ + 2OH-
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Escuela Tcnica Superior de Ingenieros de Caminos, Canales y Puertos Departamento de Ingeniera Hidrulica y Medio Ambiente

Trabajo de investigacin Autor:

Mariela Beatriz Reyes Sosa

Mariela Beatriz Reyes Sosa

Procesos biolgicos en aguas residuales

Mariela Beatriz Reyes Sosa

En la figura 2 se muestran las reacciones que se dan dentro de un digestor anaerobio.

Bacterias fermentativas BHA

Propionato Butirato Valerato Caproato

BSR Bacterias sincrnicas

Figura 2. Reacciones que se llevan a cabo en la Digestin anaerobia. Garca 1991.

Mariela Beatriz Reyes Sosa

Mariela Beatriz Reyes Sosa

Mariela Beatriz Reyes Sosa

Mariela Beatriz Reyes Sosa

Mariela Beatriz Reyes Sosa

Tabla 1. Bacterias acidognicas hidrolticas de la digestin Anaerobia (Garca, 1983)

Termoflicas Clostridium thermocellum Clostridium thermohydrosulfuricum Celulosa Almidn y Pectinas

Acetato, Butirato, Etanol Acetato, Propionato

Acetato, Etanol, Lactato Acetato, Lactato Acetato, Lactato, Formato Lactato

Butirato, Isobutirato, Valerato, Isovalerato, Caproato

Mariela Beatriz Reyes Sosa

Tabla 3. Bacterias acetognicas sintrficas obligatorias de la digestin anaerobia (Garca, 1991)

Reaccin Etanol+H2Oacetato+H2O Propionato+3 H2Oacetato+3 H2O+CO2 Butirato+2 H2O2 acetato+2 H2O

Benzoato+7 H2O3 acetato+3 H2O+CO2

Grupo 1: H+ (reduccin de un compuesto carbonado) + CO2 acetato Gnero Especie

Grupo 2: H2 + CO2 acetato Gnero

Acetofilamentum Acetohalobium Acetothermus Acetitomaculum Clostridium

Mariela Beatriz Reyes Sosa

Mariela Beatriz Reyes Sosa

Mariela Beatriz Reyes Sosa

Mariela Beatriz Reyes Sosa

Mariela Beatriz Reyes Sosa

Mariela Beatriz Reyes Sosa

Tabla 5. Grupos nutricionales de las bacterias metanognicas (Garca, 1991)

Mariela Beatriz Reyes Sosa

Figura 4. Esquema de la Hibridacin Fluorescente in situ FISH. www.iqb.es

Fijacin de la biomasa para la hibridacin

Mariela Beatriz Reyes Sosa

Figura 6. Representacin esquemtica de los peptidosglicanos (Saenz 1998-2008).

Mariela Beatriz Reyes Sosa

Figura 7. Esquema de la EDAR del Carraixet.

Mariela Beatriz Reyes Sosa

Hibridacin Fluorescente in situ, FISH

Tratamiento de los portaobjetos cubiertos con Tefln

Mariela Beatriz Reyes Sosa

Tabla 6. Cantidades de Formamida y agua para la preparacin de la solucin de hibridacin

% formamida para la sonda 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Mariela Beatriz Reyes Sosa

Tabla 8. Sondas Generales

Tabla 9. Sondas especficas para grupo Nitrificantes

NSO 1225 LNA

Betaproteobacterial ammonia.oxidizing bacteria Muchos miembros de Nitrospirae

Alonso, et al., 2009

Daims et al., 2001

Nitrobacter spp. NIT3

Wagner et al., 1996

Tabla 10. Sondas especficas para el grupo PAO y GAO

35 H966 (DF 988 compet)

35 H1038 (DF 988 compet 2)

Mariela Beatriz Reyes Sosa

Tabla 11. Sondas especficas para el grupo de las bacterias desnitrificantes

Azoarcus-ThaueraCastellaniella Paracoccus Thiobacillus denitrificans