UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

CURSO TEMA

: :

Alimentacin y Nutricin Humana Determinacin de la digestibilidad in vitro del almidn Aguilar Glvez, Ana Abensur Trigoso, Evelyn Ratto Vergaray, Bruno Alejandro

PROFESOR ALUMNOS

: :

2012

I.

INTRODUCCION

La digestibilidad, es la propiedad por la cual, se disocia y luego asimila un alimento, teniendo en consideracin la facilidad con la que es convertido en sustancias de menor peso molecular en el aparato digestivo, siendo estas ms tiles y fciles de asimilar para el organismo. Los carbohidratos representan una gran proporcin de los alimentos diarios que consume el ser humano, pues constituyen la fuente de energa ms importante para la poblacin mundial. En el presente trabajo se determina la digestibilidad in vitro del almidn del pan blanco de molde. Esto con el fin de cuantificar la capacidad de absorcin que se podra llegar a tener de este producto. Se utilizara enzimas amilasas para la disociacin del almidn y para la cuantificacin de las mismas se empleara el el mtodo del cido dinitrosaliclico (DNS). El grado de hidrlisis se expresa como el porcentaje de almidn hidrolizado por la enzima con relacin al almidn total, en unidades internacionales de maltosa. As mismo debemos decir que la digestibilidad de nutrientes en el organismo humano, depender de muchos factores, que se relacionan con la propia salud de la persona.

El presente informe cumple los siguientes objetivos.

Conocer el mtodo estndar para la hidrlisis de almidn con amilasa y su aplicacin en productos alimenticios con el fin de conocer su grado de digestibilidad in vitro. Determinar el grado de digestibilidad del almidn de muestras sometidas a coccin por tiempos diferentes.

II.

MARCO TEORICO

2.1.

Definicin del almidn resistente

La fraccin del almidn que escapa a la accin de las enzimas digestivas se denomin almidn resistente y fue definida como: la suma del almidn y sus productos de degradacin que no son absorbidos en el intestino delgado de individuos sanos. Esta definicin surge de la concentracin de diferentes grupos de trabajo de la Comunidad Europea, en un proyecto multinacional conocido como EURESTA, el cual en una forma organizada acometi el estudio del almidn resistente, abordando tema como el desarrollo de tcnicas para su anlisis, la produccin tecnolgica de almidn resistente, as como los efectos fisiolgicos y la contribucin energtica de ste (Asp 1992, citado porMara y Wenzel, 2006). As mismo, surge tambin la elaboracin de tablas para la clasificacin del almidn de acuerdo a la velocidad y extensin de la hidrlisis por la amilasa pancretica, propuestas por Englystet al. (1992), estrategia que permiti establecer tres subtipos relevantes desde el punto de vista nutricional: ARD almidn rpidamente digerible, ADL almidn lentamente digerible y AR almidn resistente.

2.2.

Digestin de carbohidratos

La funcin que cumplen los carbohidratos en el metabolismo es la de un combustible que va a ser oxidado para suministrar energa para otros procesos metablicos, a nivel celular y principalmente en forma de monosacridos: glucosa (Muoz 1990, citado por Tarazona, 1995). Los carbohidratos que incluye a los azcares, almidn, celulosa, gomas y sustancias a fines no se encuentran como tales en los tejidos del cuerpo, donde s encontramos glucosa y glucgeno como productos finales del metabolismo de os diversos carbohidratos.

Segn Tarazona (1995), cuando el alimento (que contiene almidn) es masticado se mezcla con la saliva, que lo hidroliza en el disacrido maltosa y otros pequeos polmeros de glucosa y se mantiene en la boca slo un corto tiempo, probablemente no ms del 3 a 5 % de todos los almidones que son ingeridos se hidrolizan al momento en que pasan al esfago; esto porque los grnulos del almidn al estado natural tienen una membrana protectora muy fina hecha de celulosa, a menos que el alimento haya sido cocido a fin de destruir la membrana protectora.

Al salir del quimo del estmago hacia el duodeno, se mezcla con el jugo pancretico que contiene gran cantidad de - amilasa hidrolizndose todo el almidn en maltosa y muy pocos pequeos polmeros de glucosa, los que al pasar por las secreciones intestinales de clulas epiteliales que secretan lactasa, sucrasa, maltasa y -dextrinasa degradan los disacridos y los pequeos polmeros de glucosa en sus monosacridos constituyentes, los que son absorbidos inmediatamente en la circulacin portal. En la dieta ordinaria que contiene mucho almidn que sucrosa o lactosa, la glucosa representa ms del 80% de los productos finales de la digestin de los carbohidratos (Guyton 1986, citado por Tarazona, 1995).

La susceptibilidad a las enzimas digestivas entre almidones de diferentes fuentes es variable. Tsou y Hong (1989), citados por Tarazona (1995), dicen que almidones de races y tubrculos son generalmente ms resistentes a la digestin, aunque la razn de este comportamiento aun no es muy clara.

El cocimiento con calor hmedo produce la gelatinizacin del almidn hacindose ms susceptible al ataque enzimtico durante el metabolismo (Muoz 1990, citado por Tarazona, 1995).

2.3.

Rol nutricional del almidn resistente

En algn sentido el conocido rol de las dietas de almidn ha sido negativo. Se pens que la diferencia entre el almidn y los azcares simples recaa solamente en la relativa lenta digestin del primero (almidn). Esta hidrlisis lenta se manifiesta en los ndices glicmicos cuando se determina glucosa en la sangre como respuesta de varios alimentos a base de carbohidratos, que generalmente (pero no siempre) producen valores de ndice glicmico. Consecuentemente la hidrlisis del almidn vara de muy rpida a muy lenta. Esto puede indicar que la digestin intestinal de almidones pequeos pueda ser tan retardada que el almidn se pase al intestino grueso. Esta fraccin se ha ganado el nombre de almidn resistente y los factores que lo controlan estn dando una direccin completamente nueva a las investigaciones en la dieta de almidones complejos. Estos factores incluyen atributos fsicos y qumicos ya sea del almidn o del alimento completo tanto como las consecuencias fisiolgicas de que el almidn entre en el intestino grueso (Annison y Topping 1994, citados por Tarazona, 1995).

Cuadro 2.1: Clasificacin de los almidones resistentes Probable digestin en Tipo de almidn Ejemplo de ocurrencia el intestino delgado Almidn digestible Alimento amilceo Rpido rpidamente recientemente cocinado. Almidn digestible La mayor parte de cereales Lento pero completo lentamente crudos. Almidones resistentes: 1) Almidones Granos y semillas parcialmente Resistente indigestible molidos. fsicamente 2) Grnulos de almidn Races, papas y banana. Resistente resistente. 3) Almidn Almidn fro, papa cocida, pan Resistente retrogradado y hojuelas de maz Fuente: Englystet al. 1992, reportados por Tarazona, 1995.

2.4.

Factores de la digestibilidad

Entre los principales factores del almidn se tiene el tamao de las partculas, que pueden afectar la digestin del mismo por las amilasas como un resultado de su rea de superficie, debido a que las pequeas partculas son digeridas ms rpidamente que las grandes (Tarazona 1995). Otro factor es el tamao de los grnulos, porque cuanto menores el tamao del grnulo mayor es la digestin in vitro por la -amilasa bacteriana y amiloglucosidasa fngica. La digestin incompleta de carbohidratos en el intestino delgado puede resultar en una mala absorcin de los carbohidratos simples, lo cual puede llevar a serios problemas de salud. La intolerancia a la lactosa es consecuencia de la falta de la disacaridasa apropiada. Los sntomas son los mismos que los de los otros azcares pobremente absorbidos cuando se ingieren en cantidad: diarrea, dolores abdominales y entumecimiento. Estas reacciones resultan de la acumulacin de los azcares en el intestino grueso en cantidades muy grandes para la fermentacin por la microflora lo cual conduce a una diarrea osmtica.

2.5.

Mtodo del DNS

Esta prueba se basa en la colorimetra. Su eficacia consiste en que los azucares reductores reaccionan con el 3.5 cido dinitrosalicilico en una solucin alcalina. La prueba positiva da un color rojo-marrn. La coloracin se mide con un espectrofotmetro para mediciones cuantitativas. Esta prueba funciona para la glucosa, y otros azucares reductores. El manejo del DNS es complicado, cabe anotar que su preparacin debe realizarse muy cuidadosamente, el color debe ser amarillo, al aadir distintas cantidades de fenol, se obtiene un color rojizo. (Garzn, 2003)

III.

MATERIALES Y MTODOS

3.1. Muestra alimenticia Pan de molde blanco 3.2. Materiales Material de vidrio: Erlenmeyer, pipetas, tubos de ensayo. Micropipeta de 20-200 y de 100-100 3.3. Reactivos - amilasa SIGMA TIPO IA 1200U/mg (27 mg/mL). Diluir 56 de tampn fosfato (preparar 30 minutos previos al comienzo de la hidrolisis). Tampn fosfato. Disolver en aproximadamente 700 mL de agua destilada 3.03g de KH2PO4, 3.96g de NaHPO4.2H2O y 0.40 g de NaCl. Llevar a pH 6.9 y aforar a 1000mL. Solucin de DNS. disolver 11g de NaOH, 10g de cido dinitrosalicilico (DNS), 2g de fenol y 0.5g de bisulfito de sodio en agua destilada; enrasar en una fiola de 1000mL. Sal de Rochelle. Preparar una solucin al 40% (p/v) de tartrato de sodio y potasio en agua destilada. Maltosa anhidra (solucin estndar de 2mg/mL).

3.4. Equipos Balanza analtica Bao mara con agitacin Cocina Espectrofotmetro Vortex

3.5. Procedimiento experimental Grafico 1: Diagrama de flujo para la determinacin de la digestibilidad in vitro del almidn

Seguidamente se lee la curva de calibracin de maltosa preparada segn se indica en el cuadro 3.2.

Cuadro 3.1. Procedimiento de la batera de trabajo Muestra BM 0 min 5 min 15 min 30 min 60 min BT DNS (mL) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 Muestra ( ) 0.0 200 200 200 20 200 200 tampn Agua ( 500 300 800 800 800 800 800 ) Estndar ( 500 500 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 )

Cuadro 3.2. Curva estndar de maltosa Maltosa (mg) 0.0 0.4 0.6 0.8 1.0 1.3 Estndar ( 0.0 200 300 400 500 650 ) Agua ( ) 1000 800 700 600 500 350 DNS (mL) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0

IV.

RESULTADOS Y DISCUCIONES

Tiempo (min) 0 5 15 30 60

M1
0.000 1.917 3.002 2.134 2.857

REPETICIONES M2
0.000 5.025 6.566 9.793 16.102 0.000 1.871 8.253 3.044 2.971

Porcentaje de hidrlisis de almidn PROMEDIO D.S. M3 M1 M2 M3 M1 M2

8.446 0.986 5.476 3.231 10.238 0.000 3.725 6.257 4.593 5.399 0.000 3.448 7.409 6.419 9.537 8.539 0.952 3.605 2.449 8.231 0.620 2.557 4.603 3.478 3.596 0.030 2.231 1.193 4.772 9.285

M3
0.132 0.048 2.646 1.106 2.838

M1
0.687 0.736 0.757 0.666

C.V. M2
0.647 0.161 0.743 0.974

M3
0.015 0.051 0.734 0.452 0.345

0.000 5.533 9.511 7.052 7.942

8.632 0.918 1.735 1.667 6.225

Cuadro 4.1.- Porcentaje de hidrlisis del almidn de pan blanco de molde PyC durante 60 minutos de accin.

Comparacin del porcentaje de hidrlisis de almidn en las 3 mesas respecto al tiempo de accin de enzima
12.000 10.000 8.000 % Hidrlisis 6.000 4.000 2.000 0 -2.000 Tiempo (min) 10 20 30 40 50 60 70

M1 M2 M3

Grfico 2.- Comparacin del porcentaje de hidrlisis promedio de almidn de pan de molde PyC durante 60 minutos de accin de las muestras analizadas por las mesas 1, 2 y3.

Al observar el grfico 2 y el cuadro 4.1 podemos decir que los porcentajes de hidrlisis iniciales obtenidos por la mesa 3 son errneos ya que el blanco reportado por este grupo hace variar los resultados, por lo tanto los datos obtenidos por esta mesa no se tomarn en cuenta ya que son ilgicos. Al comparar los resultados obtenidos por la mesa 1 y la mesa 2, vemos que la mesa 2 obtiene datos mayores con respecto a la uno. Entonces segn lo anteriormente expuesto vemos que la mxima hidrlisis se da a los 15 minutos, luego comienza a descender, esto no coincide con lo encontrado en la literatura, ya que segn Tejero (2012): la alfa amilasa se produce a partir de la bacteria Bacillus subtilis, y es muy resistente al calor por lo que a temperaturas de 70 a 90 C alcanza su mxima velocidad de reaccin. Adems acta en el enlace -1,4. Por lo que el porcentaje de hidrlisis debi aumentar a mayor temperatura, este error en el laboratorio puede deberse a que la fuente de calor no era buena y por esto no se lleg a la temperatura adecuada. Segn Garca (2009) la digestibilidad en pan blanco a los 30 minutos es de 3% 1,12%, este valor es cercano al obtenido por la mesa 1 (4,603%). El mismo autor indica que a los 60 minutos la digestibilidad del almidn es de 10,08% 1,09%; Este valor es cercano al obtenido por la mesa 2 (9,285 %) El mismo autor nos muestra el grfico 3, en el cual se ve que el porcentaje de hidrlisis es creciente conforme avanza el tiempo en un pan blanco, esto se observ en la prctica pero solo hasta el minuto 15, donde se produce un descenso, por lo que los resultados obtenidos en el laboratorio no seran los correctos. Estos errores los demuestra el coeficiente de variabilidad ya que es muy variable para cada mesa y cada tiempo. Grfico 3. Porcentaje de hidrlisis versus tiempo en pan blanco

Fuente: Garca (2009)

Grfico 4. Hidrlisis de almidn nativo

Fuente: Barrera et. al (2004). En el grfico 4, se presenta la hidrlisis enzimtica progresiva de los diferentes almidones nativos, con -amilasa a 37 C. A travs de su accin hidroltica se alcanz el grado de hidrlisis de 16 % en trigo, por lo que una vez ms se demuestra que los datos obtenidos en el laboratorio son errados. Adems segn Taggart (2004) citado por FAO (2012) el trigo posee almidn con un contenido de 25% de amilosa y 75% de amilopectina, su temperatura de gelatinizacin es 58-64C, es por esto que al final de realizar los tiempos de accin de la enzima se llevo al bao mara por 5 minutos con la finalidad de inactivar a la enzima y adems gelatinizar el almidn. Segn Ortega, R; Lpez, A; Requejo, A y Carvajales (sin ao) en Info alimentacin (2012) el pan molde posee 49.9% de carbohidratos.

V.

CONCLUSIONES

El porcentaje de hidrlisis de almidn es mayor conforme mayor tiempo de hidrlisis ha transcurrido. Los datos obtenidos en el laboratorio presentan errores, sin embargo se observ que la grfica de hidrlisis es creciente a mayor tiempo. A los sesenta minutos el porcentaje de hidrlisis de almidn en pan molde debe ser alrededor de los 10,08% 1,09%. La enzima amilasa hidroliza al almidn en amilosa y amilopectina escindiendo el enlace - 1,4.

VI.

CUESTIONARIO

6.1. Qu factores afectan la digestibilidad de los almidones? El principal factor viene dado por la proporcin entre amilasa/amilopectina y a la longitud de las cadenas de estos polmeros, ya que esta ltima tiene influencia sobre la formacin de complejos con otras molculas, o entre ellas mismas, favoreciendo la retrogradacin, en cuya forma fsica los almidones son menos susceptibles al ataque enzimtico. La estructura del grnulo, por su parte, tambin influye en la digestibilidad, debido a que los grnulos de menor tamao presentan una relacin mayor entre la superficie y el volumen, por lo que el rea expuesta para la hidrlisis se incrementa; de igual forma ocurre con el tamao de la partcula del alimento que depender a su vez del tiempo y de la intensidad de la masticacin. La presencia en el alimento de otros componentes, como ciertos tipos de lpidos, puede dar lugar a la formacin de complejos con los glucanos, traducindose esto en un descenso en la digestibilidad; un efecto similar puede atribuirse a las protenas que a menudo rodean a los grnulos de almidn, lo cual se ha sugerido como explicacin para el incremento de la digestibilidad in vitrodel almidn despus de un tratamiento con proteasas (Tovar et al.1990, citado por Mara y Wenzel, 2006). Algunos otros factores que pueden modular la digestibilidad son propios del individuo, y entre ellos se mencionan: el tiempo de trnsito intestinal, tiempo de masticacin, estado de salud y cantidad de enzimas secretadas (Tharanathan&Mahadevamma 2003, citado por Mara y Wenzel, 2006) VII. Qu relacin existe entre la digestibilidad in vitro del almidn y porcentaje de gelatinizacin?

La principal relacin entre almidn en alimentos procesados y la gelatinizacin, es que estos pueden ser parcial o totalmente gelatinizado o retrogradados. Los almidones crudos son altamente resistentes a la hidrlisis enzimtica comparada con los almidones gelatinizados. La hidrlisis del almidn de arvejas, maz, trigo y papa es aumentada gradualmente por la gelatinizacin particularmente a bajos niveles de enzimas hidrolticas (Tarazona, 1995). Esto debido a que se obtiene un acomodo molecular favorable para la interaccin entre sustrato y encima.

VIII. BIBLIOGRAFIA BARRERA, V; TAPIA, C y MONTEROS, A. 2004. Races y tubrculos andinos: Alternativas para la conservacin y uso sostenible en el Ecuador. Instituto Nacional Autnomo de Investigaciones Agroprecuarias (INIAP).

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