Factores que modifican la actividad de las enzimas: Efecto de la concentracin de sustrato y de un inhibidor

RESUMEN. La cintica enzimtica es el estudio cuantitativo de la catlisis enzimtica y las velocidades de reaccin, las cuales se
miden en las condiciones ptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, de manera que puede observarse una velocidad mxima (Vmax) de reaccin que se determina midiendo la aparicin de los productos o la desaparicin de los reactivos. Sin embargo, dicha actividad enzimtica es modificada por la concentracin de sustrato y por molculas que disminuyen la velocidad de reaccin llamadas inhibidores, que pueden ser antibiticos, pesticidas o herbicidas, etc. El objetivo de este experimento fue determinar la concentracin de sustrato a la cual la enzima lactato deshidrogenasa de msculo de pollo alcanza su velocidad mxima para la reaccin en el sentido de piruvato a lactato, para lo cual se determinaron las constantes cinticas, Km y Vmax, midiendo la actividad de la enzima a diferentes concentraciones de sustrato. Adems se determin el efecto y el tipo de inhibicin que el oxamato (inhibidor de lactato deshidrogenasa) produce en la actividad de la enzima, a travs del anlisis del efecto que produce en los parmetros cinticos de la enzima.

INTRODUCCIN
La cintica enzimtica es el estudio de la velocidad de una reaccin catalizada por una enzima y mide tambin la afinidad de las enzimas por los sustratos y los inhibidores, proporcionando conocimientos sobre los mecanismos de reaccin. La velocidad de la reaccin anterior es proporcional a la frecuencia con la que las molculas reaccionantes forman el producto y siempre se medir en condiciones ptimas de pH, temperatura, presencia de cofactores, etc, de manera que la velocidad de reaccin observada ser la velocidad mxima (Vmax).y puede determinarse midiendo la aparicin de los productos o la desaparicin de los reactivos. Efecto de la concentracin de sustrato en la actividad de la enzima. Al principio de una reaccin enzimtica un aumento de la concentracin de sustrato produce un aumento rpido de la velocidad de reaccin, pero si se sigue aumentando la concentracin de sustrato, la velocidad de reaccin comienza a disminuir; observndose que a muy altas concentraciones de sustrato no cambia la velocidad de reaccin, ya que los centros activos de la enzima se encuentran saturados. La velocidad de reaccin que se obtiene a esa alta concentracin de sustrato se define como la velocidad mxima (vm) de la reaccin enzimtica bajo las condiciones especificadas. Inhibicin enzimtica Existen molculas que reducen la actividad de una enzima denominadas inhibidores, entre los que se incluyen frmacos, antibiticos, conservantes alimentarios, venenos o pesticidas. La inhibicin enzimtica puede producirse cuando un compuesto compite con el sustrato por el activo de la enzima libre, se une al complejo ES en un lugar separado del lugar activo, o se une a la enzima libre en un lugar separado del lugar activo. Se describen tres clases de inhibidores enzimticos:

Competitiva: Los inhibidores competitivos se unen de forma reversible a la enzima libre, y no al complejo ES, para formar un complejo enzima inhibidor (EI). Las sustancias que se comportan como inhibidores competitivos, que reducen la afinidad aparente de una enzima por el sustrato, suelen tener una estructura semejante a la del sustrato. Entre estas molculas hay productos de reaccin o anlogos que no se metabolizan, o derivados del sustrato. No Competitiva: En algunas reacciones catalizadas por enzimas el inhibidor puede unirse tanto a la enzima como al complejo enzima sustrato, el inhibidor se une a un lugar diferente del sitio activo. La unin del inhibidor ocasiona la modificacin de la conformacin de la enzima que impide la formacin del producto. Acompetitivos: En la inhibicin acompetitiva, el inhibidor slo se une al complejo enzima sustrato, y no a la enzima libre. La adiccin de ms sustrato a la reaccin da lugar a un aumento de la velocidad de reaccin, pero no hasta el grado que se observa en las reacciones sin inhibir. La inhibicin acompetitiva suele observarse en las reacciones en las que las enzimas unen ms de un sustrato. Reversible: En la inhibicin reversible (es decir, inhibicin competitiva, acompetitiva y no competitiva), el inhibidor puede disociarse de la enzima debido a que se une mediante enlaces no covalentes. Irreversible: Los inhibidores irreversibles normalmente se unen covalentemente a la enzima, con frecuencia a una cadena lateral del lugar activo. Es importante considerar que en la inhibicin competitiva aumenta la Km de la enzima y mantiene la Vmx inalterada. En la inhibicin acompetitiva se modifican ambas Km y Vmx, aunque su cociente permanece igual. En la inhibicin no competitiva, disminuye Vmx y aumenta Km.

Tabla2. Composicin del medio de reaccin para medir el efecto del oxamato en la actividad de la LDH.

MATERIAL Y MTODOS
Material biolgico Fraccin tres obtenida en la prctica de purificacin de protenas. Efecto de la concentracin de sustrato. Se comenz realizando una dilucin 1:500 para la fraccin tres, posteriormente en celdas de plstico se adiciono amortiguador de fosfatos, agua, piruvato y la enzima de acuerdo a lo indicado en la tabla 1: Tabla1. Efecto de la concentracin de sustrato. Solucin [Piruvato final] Amortigua dor fosfatos pH:7 (L) H2O L Piruvato (L)NADH NADH (L) Enzima (L) 1
0.06

RES ULT ADO S

Solucin [Piruvato final] Amortiguador fosfatos pH:7 (L) H2O L Oxamato (L) Piruvato (L)NADH NADH (L) Enzima (L)

1
0.06

2
0.09

3
0.15

4
0.25

5
0.36

600

600

600

600

600

6 0.5 600

287 34 6 63 10

284 34 9 63 10

278 34 15 63 10

268 34 25 63 10

257 34 36 63 10

243 34 50 63 10

Efecto de la concentracin de sustrato. Se midi la absorbancia de cada una de las fracciones con piruvato y NADH, las lecturas obtenidas a cada 30 segundos de la fraccin tres se presentan en la tabla 3: Tabla3. Lecturas de la absorbancia de la actividad de la LDH a diferentes concentraciones de sustrato.

2
0.09

3
0.15

4
0.25

5
0. 36

600

600

600

600

60 0

6 0. 5 60 0

321 6 63 10

318 9 63 10

312 15 63 10

302 25 63 10

29 1 36 63 10

27 7 50 63 10

Tiempo(min) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3

0.06 1.216 1.212 1.198 1.189 1.177 1.164 1.154

0.09 1.222 1.205 1.182 1.165 1.15 1.135 1.12

Piruvato (Mm) 0.15 0.25 1.211 1.236 1.194 1.214 1.174 1.196 1.154 1.178 1.136 1.161 1.118 1.144 1.099 1.126

0.36 1.226 1.197 1.171 1.148 1.127 1.105 1.083

0.5 1.251 1.234 1.216 1.199 1.181 1.162 1.145

Se ajust el espectrofotmetro a 340nm, tomando como blanco agua destilada, posteriormente se agreg 63 L de NADH a cada celda, se tap con parafilm y agit por inversin e inmediatamente se ley en el espectrofotmetro para comprobar que la mezcla de reaccin contiene NADH. Despus de realizar la lectura, en la misma celda se colocaron 10L de la enzima diluida, nuevamente y por inversin se agit la celda y se registraron las absorbancias cada treinta segundos durante 3 minutos, para cada una de las seis celdas. Efecto de un inhibidor en la actividad de la LDH. En seis celdas de plstico se adicionaron los reactivos de acuerdo al volumen y el orden indicado en la tabla 2, y se realizo el procedimiento indicado anteriormente, obteniendo las absorbancias a 340nm, cada 30 segundos por durante cinco minutos para cada una de las mezclas.

En la tabla 3, se muestra una disminucin en la absorbancia para cada diferente concentracin de piruvato adicionada en las diferentes celdas. Posteriormente con dichos valores se realiz un grfico (Grfico 1) de absorbancia vs tiempo, a partir de las cuales se obtuvieron las pendientes para cada concentracin de piruvato, resultados que se muestran en la tabla 4.1, considerando adems el volumen de reaccin de reaccin, cantidad de enzima (mg) y la ecuacin 1, se calcula la actividad de la enzima para cada concentracin de piruvato adicionada, los datos se muestran en la tabla 4.2

Grfico 1.0 Absorbancia vs tiempo a diferentes concentraciones de piruvato

1.26 1.24 1.22 1.2 1.18 1.16 1.14 1.12 1.1 1.08 1.06 0 2 4 t (min) 0.06 0.09 0.15 0.25 0.36 0.5

[Piruvato] (mM) 0.06 0.09 0.15 0.25 0.36 0.5

Actividad enzimtica (mmol min-1 mg-1)

0.1501 0.2369 0.2612 0.2508 0.3259 0.2515

Ecuacin 1: ( ( ) ) ( ) ( )

Una vez obtenida la actividad enzimtica, se realizaron tres graficas diferentes (MichaelisMenten, Lineweaver-Burk y Hanes) para obtener las constantes cineticas Km y V max, los resultados obtenidos se muestran en la tabla 4.3. Grfico 2.0 Michaelis-Menten

Donde: A: A m: pendiente de la recta abs vs tiempo : coeficiente de extincin molecular para NADH B: distancia de la celda. Volumen de reaccin: 1 mL. Tabla 4.1 pendientes obtenidas de las graficas Abs vs tiempo. [Piruvato] Pendiente (mM) *(m) 0.0216 0.06 0.0341 0.09 0.0376 0.15 0.0361 0.25 0.0469 0.36 0.0362 0.5 *Se considera el valor absoluto de la pendiente. La cantidad de enzima que se utilizo para calcular la actividad enzimtica se obtuvo considerando que la concentracin de la fraccin tres fue de 1.57g/L, se hizo una dilucin 1:500 y se tomo u volumen de 10L, por lo cual la cantidad de enzima aadida fue de: Tabla 4.2 Obtencin de la actividad enzimtica.

Actividad

0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 0.2 0.4 0.6

[S]

Grfico 2.1 Lineaweaver-Burk 7 6 5 4 3 2 1 0 0 5 10 15 20 1[S] 1/[V]

Grfico 2.3 Hanes

[S]/V

0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 0 0 0.1 0.2 0.3 [S] 0.4

En la tabla 5.1, se observa una relativa tendencia de disminucin en la absorbacia a medida que el tiempo avanza, para cada concentracin de piruvato. Con dichos valores se realizaron las diferentes graficas de absorbancia vs tiempo, a partir de las cuales se obtuvieron los pendientes para cada concentracin de piruvato, resultados que se muestran en la tabla 5.2.

Tabla 5.2 Pendientes obtenidas de las graficas Abs vs tiempo. [Piruvato] (mM) 0.06
Pendiente (m)

0.0015 0.014 0.0065 0.015 0.0197 0.0156

Tabla 4.3 Obtencin de las constantes cinticas Km y Vmax.

0.09 0.15 0.25 0.36 0.5

Km Vmax Grafica usada 0.2001 0.1954 MichaelisMenten 0.0639 0.3404 LineweaverBurk 0.0196 7.6045 Hanes Efecto de un inhibidor en la actividad de la LDH. Se realiz el mismo tratamiento de datos para obtener los pararemetros cinticos (Km y Vmax) para la inhibicin de la actividad enzimtica por oxamato, las lecturas de la absorbancia de cada una de las fracciones con piruvato y oxamato, se presentan en la tabla 5.1: Tabla 5.1 Lecturas de la absorbancia de la actividad de la LDH a diferentes concentraciones de sustrato ms inhibidor Tiempo (min) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 . [Piruvato mM] 0.25 0.36 1.124 0.492 1.117 0.476 1.168 0.463 1.102 0.454 1.096 0.449 1.0.96 0.436 1.085 0.426 1.079 1.074 1.070 1.064 0.416 0.407 0.399 0.390

Tabla 5.3 Obtencin de las constantes cinticas Km y Vmax.

Grfica usada MichelisMenten LineweaverBurk Hanes

Km 0.0389 0.0856 0.0187

Vmx. 0.1906 0.2956 3.7646

0.06 1.212 1.228 1.227 1.230 1.230 1.229 1.229 1.229 1.229 1.227 1.229

0.09 1.158 1.159 1.152 1.142 1.132 1.125 1.117 1.111 1.105 1.099 1.096

0.15 1.177 1.174 1.173 1.172 1.167 1.162 1.158 1.158 1.153 1.148 1.146

0.5 1.040 1.033 1.026 1.014 1.006 0.999 0.990 0.982 0.974 0.967 0.968

Posteriormente y considerando el volumen de reaccin de reaccin, cantidad de enzima (mg) y la ecuacin 1, se calcula la actividad de la enzima para cada concentracin de piruvato adicionada, los datos se muestran en la tabla 5.4

Tabla 5.4 Obtencin de la actividad enzimtica. [Piruvato] (mM) 0.06 0.09 0.15 0.25 0.36 0.5
Actividad enzimtica (mmol min-1 mg-1)

CONCLUSIN

0.0104 0.0973 0.0452 0.1042 0.1369 0.1084

Una vez obtenida la actividad enzimtica, se realizaron tres graficas diferentes (michaelis-menten, lineweaverburk y hanes) para obtener las constantes cineticas km y v max, los resultados obtenidos se muestran en la tabla 5.3. Grfico 3.0 Michaelis-Menten con inhibidor 0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 Actividad 0.02 0 0 0.2 0.4 [S] 0.6

BIBLIOGRAFA

http://www.angelfire.com/ult/bioquimicae07/intento cucs.html

Grfico 3.0 Lineaweaver-Burk con inhibidor