Determinarea activitatii antioxidante

Material nr. 1: Determinarea originii florale a unor mieri romanesti pe baza proprietatilor fizice si biochimice 1.1. Activitatea antioxidanta Activitatile antioxidante ale mierii au fost determinate prin doua metode:DPPH si ABTS. Capacitatea probelor de miere, dizolvate in etanol absolut, pentru a anihila radicalii DPPH liberi semi-stabili, a fost monitorizata prin spectroscopie EPR. Testul DPPH a fost realizat in conformitate cu metoda lui Meda. 0.3 mL de solutie apoasa de miere (10%) au fost amestecati cu 1.5mL etanol si 1.2mL solutie etanolica de DPPH (0.09mg/ml). Amestecul a fost incubat la temperatura camerei pentru 15 min si absorbanta a fost masurata la 517nm. Martorul folosit a fost 0.3mL solutie etanolica de miere amestecata cu 2.7mL de etanol. Solutia standard de acid ascorbic (0-100mg/ml)pregatita cu apa distilata a fost folosita pentru a trasa curba de etalonare. Rezultatele au fost exprimate ca g de acid ascorbic per 1g de miere. Testul ABTS este bazat pe capacitatea compusilor antioxidanti de a anihila radicalul cationic ABTS si de a reduce radicalul la forma neutra incolora. Acest test a fost efectuat conform metodei lui Re, partial modificata de grupul nostru. 0.1mL de solutie apoasa de miere (50%) au fost amestecati cu 3 mL ABTS +. Radicalul a fost generat prin amestecarea solutie de ABTS (2mM) si solutie de K2O8S2 (2.45mM) in raport volumetric 1:1. Solutia a fost tinuta la intuneric 24h si apoi a fost diluata, astfel incat absorbanta a fost 0.800. Dupa 15 min, absorbanta a fost citita la 734nm. Martorul folosit a fost 0.1mL solutie apoasa de miere amestecata cu 3mL apa distilata. Solutii standard de Trolox (0.05-0.4mol/ml), preparate in apa distilata, au fost folosite pentru a reprezenta grafic curba de etalonare. Rezultatele au fost exprimate ca mol de Trolox per 100g de miere. Trolox este acid 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxilic, derivat de vitamina E, solubil in apa. Este un antioxidant utilizat in aplicatii biologice sau biochimice, pentru a reduce stresul oxidativ. 1.2. Rezultate si discutii Activitatea antioxidanta a mierii a fost determinata de testele DPPH si ABTS, utilizate pe scara larga ca metode de examiniare pentru activitatea antioxidanta in alimente si bauturi, inclusiv miere. Activitatea antioxidanta a mierii variaza foarte mult in functie de sursa florala a mierii. (Tab. 2). Mierea de padure a avut cea mai mare activitate antioxidanta, in timp ce, cea mai mica
1

a fost gasita in mierea de salcam. Rezultatele testelor DPPH si ABTS au fost similare, sugerand ca doua teste sun aproape comparabile si interschimbabile in cazul mierii, atunci cand este necesara o evaluare a activitatii antioxidante. Mai mult, capacitatea mierii din probe de a anihila radicalii liberi, semistabili DPPH a fost monitorizata prin spectroscopie EPR. Radicalul DPPH semistabil poate reactiona cu antioxidanti de-a lungul a diferite cai; reactia predominanta reprezinta transferul hidrogen/electron de la antioxidant. Intensitatea semnalului este proportionala cu numarul de rotiri si, prin urmare, poate fi folosit ca estimare pentru concentratia relativa a speciilor paramagnetice. Intensitatea semnalului relativ EPR pentru DPPH, dezvoltat in timpul reducerii, a fost dependenta, de asemenea, de timpul de reactie. Semnalele se descompun intr-un timp scurt, pe o scara de minute. Rata de reactie intre compusii antioxidanti si DPPH a fost indicata cu ajutorul integralei relativa a spectrelor de absorbtie EPR, intensitati proportionale cu su dublul semnalului integralei EPR. O proportionalitate inversa intre capacitatea antioxidanta a mierii si dezintegrare intensitatii semnalului radicalului liber este indicata. Se poate observa, de asemenea, din Fig. 4, tendinta generala in scadere exponentiala a concentratie relative a radicalilor liberi DPPH in timp, cu diferite rate pe parcursul evolutiei probelor, concentratia ramanand constanta dupa 20 min.

Material nr. 2: Activitatea antioxidanta la probe de miere portugheza: Contributii diferite a mierii intregi si extractului fenolic 2.1. Activitatea antioxidanta activitatea de anihilare de radicali DPPH Concentratii diferite de solutii apoase de miere sau extracte fenolice (0.3mL) au fost amestecate cu 2.7 ml de solutie metanolica ce continea radicali DPPH (610 5mol/l). Amestecul a fost agitat puternic si lasat in repaus pentru 60 min in intuneric (pana au fost obtinute valori stabile ale absorbantei). Reducerea radicalului DPPH a fost determinata prin masurarea absorbantei la 517 nm. Activitatea de anihilare a radicalilor (RSA) a fost calculata ca procent al decolorarii DPPHului folosind ecuatia: % RSA= [ ADPPH AS) / ADPPH] 100, Unde: AS = absorbanta solutie atunci cand extractul de proba a fost adaugat la un anumit nivel ADPPH = absorbanta solutie de DPPH Concentratia extractului, ce furnizeaza 50% din activitatea de a anihila radicali (EC 50), a fost calculata prin interpolare din graficul de procentaj RSA impotriva concentratiei extractului. BHA si - tocoferolul au fost folosite ca standarde.
2

Materialul nr. 3. Caracterizarea mierii din diferite surse florale. Proprietatile sale functionale si efectele sorturilor de miere in stocarea hranei (conservarea carnii) 3.1. Anihilarea radicalului DPPH Anihilarea radicalului DPPH a fost evaluata prin metoda lui Okada, cu o usoara modificare. Amestecul de testat continea 0.3 ml de solutie de radical DPPH in etanol 1.0 mM, 2.4ml de etanol 99% si 0.3 ml de solutie din proba. Solutia a fost amestecata rapid si capacitatea de anihilare a fost masurata spectrofotometric prin monitorizarea scaderii absorbantei la 517nm. Acidul ascorbic (0.1 si 1.0 mM) si - tocoferolul (1mM) au fost folosite ca si controale pozitive. Apa distilata a fost folosita ca si control negativ. 3.2. Rezultate Activitatile de anihilare a DPPH la sorturile de miere si produsele derivate sunt prezentate in tabelul 2. Activitatea la 1mM acid ascorbic a fost cea mai mare, urmata de cea de 1mM tocoferol. Mierea cu hrisca a expus cea mai puternica activitate de anihilare dintre derivatele cu miere, urmata de amestecul de miere, miere (albina japoneza), laptisor de matca si miere pura (Chinese milk vetch- lapte chinezesc mazariche). Acidul ascorbic la concentratie mai mica (0.1mM) a aratat activitate similara la mierea disponibila in comert si miere pura (salcam). DPPH este un radical liber si a fost utilizat pe scara larga pentru a testa capacitatea de a anihila radicalul liber la probe diferite. In experimentul prezentat, s-a constatat ca multe sorturi de miere arata activitati de anihilare a radicalului DPPH. Amakura a raportat ca activitatile de anihilare a radicalului DPPH la 9 fructe de padure au fost asociate cu continutul fenolilor totali. Acest lucru sugereaza ca mierea cu hrisca poate avea continut ridicat de fenoli totali.