Universidade do Minho Mestrado Integrado em Engenharia Biolgica Laboratrios de Tecnologia Alimentar

Trabalho realizado por: Ana Teixeira n 52488 Joo Sousa n 52489 Marina Oliveira n 55520 Teresa Conde n 55511

ndice

1.

Introduo ........................................................................................................................ 3 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.6. 1.7. 1.8. 1.9. 1.10. A indstria alimentar ................................................................................................. 3 Conservantes ............................................................................................................. 3 Filmes e revestimentos .............................................................................................. 4 O quitosano ............................................................................................................... 4 O alginato .................................................................................................................. 6 Filmes compostos ...................................................................................................... 6 Filmes de alginato e pectina....................................................................................... 7 Teste do halo ............................................................................................................. 8 Contagem de clulas.................................................................................................. 8 Objectivos.............................................................................................................. 9

2.

Materiais e mtodos ....................................................................................................... 10 2.1. Materiais e reagentes ................................................................................................... 10 2.2. Procedimentos ........................................................................................................ 10 Procedimentos de Produo de Filmes Antimicrobianos .................................. 10 Procedimentos para testar a actividade antimicrobiana ................................... 12 Procedimentos de contagem de clulas ........................................................... 13 Procedimentos de hidratao do alimento ....................................................... 13

2.2.1. 2.2.2. 2.2.3. 2.2.4. 3. 4. 5. 6. 7.

Resultados ...................................................................................................................... 15 Discusso de resultados .................................................................................................. 19 Concluses ...................................................................................................................... 25 Bibliografia ...................................................................................................................... 26 Anexos ............................................................................................................................ 27 7.1. Rtulo do fuet .............................................................................................................. 27 7.2. 7.3. Exemplos de Clculo ................................................................................................ 28 Procedimentos Iniciais ............................................................................................. 28

7.3.1. Aula 1 14 de Novembro ....................................................................................... 28 7.3.2. Aula 2 21 de Novembro ....................................................................................... 29 7.3.3. Aula 3 28 de Novembro ....................................................................................... 31 7.3.4. Aula 4 5 de Dezembro .......................................................................................... 32

Sumrio
Nesta actividade experimental os principais objectivos so a preparao de filmes compostos de quitosano e alginato de sdio em diferentes propores, a sua avaliao relativamente actividade antimicrobiana e seleco do filme que apresentar melhores caractersticas antimicrobianas. Na concretizao deste trabalho laboratorial recorre-se elaborao de filmes compostos de quitosano e alginato de sdio em diferentes propores com a adio de cloreto de clcio a 1 e 2% para facilitar a ocorrncia de reticulao dos filmes. Podem considerar-se como principais resultados obtidos o nmero de clulas da cultura isolada de S. cerevisiae, igual a 6,59107 clulas/mL e os valores da contagem de clulas nas diversas actividades da gua so de 1,59107, 4,38106 e 2,86107 clulas/mL para os 25%, 50% e 100%, respectivamente. H ainda os valores de contagem das clulas de actividade da gua de 50% do fuet protegido por um filme contendo apenas alginato de sdio de 1,24107 clulas/mL e um contendo alginato de sdio e quitosano, numa proporo 75:25, de 2,25107 clulas/mL. Verificam-se zonas de inibio na placa que contm glucose nas percentagens de 40, 50 e 70 de quitosano e na que contm lactose nas de 10, 30 e 40. Note-se que no filme de alginato de sdio no h qualquer inibio. Por fim, constata-se que tanto no filme contendo apenas alginato de sdio como no filme que contm alginato de sdio e quitosano na proporo de 75:25, que envolve o fuet numa actividade da gua de 50%, h inibio do crescimento microbiano visvel, j o fuet exposto a actividades da gua de 50% e 100% apresentaram um desenvolvimento microbiano acentuado. Todas estas amostras foram previamente contaminadas com S. cerevisiae. Este trabalho experimental apresenta as seguintes concluses fulcrais, qualquer filme apresenta propriedades barreira para o desenvolvimento microbiano perante atmosferas de actividade da gua elevadas, os filmes so uma mais-valia para os alimentos, o quitosano apresenta de facto propriedades antimicrobianas, o alginato de sdio propriedades que conferem consistncia aos filmes e o cloreto de clcio um agente reticulante eficaz. Mais uma vez tambm verificado que o sal presente no fuet actua como proteco do alimento relativamente contaminao microbiana e que o objectivo de todo este trabalho aumentar o tempo de prateleira do alimento.

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1. Introduo

1.1. A indstria alimentar

Actualmente, o conhecimento adquirido pelos consumidores acerca dos potenciais benefcios provenientes de uma alimentao saudvel tornou-os mais exigentes nos seus padres de qualidade, levando-os a optar sempre por alimentos frescos e minimamente processados. Estes alimentos so, portanto, isentos de substncias sintetizadas quimicamente e/ou enriquecidos com substncias naturais benficas para a sade, mantendo as suas caractersticas nutricionais e sensoriais. Tudo isto obrigou a uma dinamizao da indstria alimentar na busca de processos alternativos para o processamento dos alimentos, nomeadamente a sua conservao e armazenamento. Como tal, os estudos focam-se na descoberta de novas substncias naturais que venham substituir os antioxidantes e antimicrobianos de forma a manter o alimento adequado para o consumo, com uma vida til prolongada, mantendo a sua qualidade nutritiva e sensorial, melhorando a variedade da dieta ao fornecer os nutrientes necessrios para a manuteno da sade, com gerao de lucros para os fabricantes e satisfao para os clientes [1][2].

1.2. Conservantes

Entende-se por aditivo alimentar qualquer ingrediente intencionalmente adicionado aos alimentos, que no tendo o propsito de nutrir, altera as caractersticas fsicas, qumicas, sensoriais ou biolgicas, durante a fabricao, processamento, preparao, tratamento, embalamento, acondicionamento, armazenagem, transporte ou manipulao de um alimento com o objectivo de evitar ou abrandar a deteriorao microbiana e/ou enzimtica dos alimentos. Nos dias que correm a utilizao de conservantes qumicos ou outro tipo de aditivos alimentares, que ajudem na manuteno da qualidade dos produtos alimentares durante o seu tempo de prateleira, uma prtica comum. Na verdade, a segurana alimentar palavra de ordem quando se trabalha com alimentos. Contudo, a crescente exigncia dos consumidores por produtos seguros com o mnimo de aditivos qumicos veio complicar a

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produo de alimentos, tornando urgente a descoberta e recurso a meios alternativos de conservar os alimentos [2].

1.3. Filmes e revestimentos

Os filmes e revestimentos comestveis tornaram-se numa das alternativas mais promissoras para proteger os produtos contra danos mecnicos, fsicos, qumicos e actividade microbiolgica. Estes so finas camadas de materiais comestveis que ao serem aplicados nos produtos alimentares ajudam na sua conservao, distribuio e marketing. So de grande utilidade em alimentos e produtos altamente perecveis e possuem propriedades particulares como o custo, a disponibilidade, atributos funcionais, propriedades mecnicas (tenso, flexibilidade), propriedades pticas (brilho e opacidade), o efeito barreira contra gases de fluxo, resistncia estrutural gua e microrganismos e aceitabilidade sensorial. A principal diferena entre ambos a forma como so aplicados nos alimentos, sendo que os revestimentos so aplicados sob a forma lquida por imerso do produto numa soluo formada pela matriz estrutural (mistura de hidratos de carbono, protenas, lpidos ou multicomponentes) e os filmes so primeiramente moldados como folhas slidas e s depois aplicados sobre o alimento, como se de um embrulho se tratasse. A embalagem dos produtos alimentares sempre desempenhou um papel fulcral na sua conservao, distribuio e comercializao, dado que cria uma atmosfera modificada que restringe a transferncia de gases, como o O2 e o CO2, funcionando tambm como barreira para a transferncia de compostos aromticos. Hoje em dia, os estudos tm-se orientado para a possibilidade destes filmes transportarem de agentes antimicrobianos naturais, como o quitosano, com a finalidade de retardar as mudanas de sabor durante o armazenamento dos alimentos. Foi ainda estudada a possibilidade de encapsular compostos aromticos nestes filmes como estratgia para a reduo do efeito das reaces degradantes, como a oxidao [1].

1.4. O quitosano

A quitina (figura 1 (a)) um polmero natural abundante, um polissacardeo linear, lcalicido insolvel, que apresenta como unidade monomrica a -1,4 N-acetilglucosamina.

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O quitosano (figura 1 (b)) um hetero-polmero natural, amino-catinico, composto por unidades -1,4 D-glucosamina ligadas a resduos de N-acetilglucosamina que pode ser obtida atravs da deacetilao da quitina. Deste modo, o grupo N-acetil pode sofrer diversos graus de acetilao, dando origem diferentes derivados [2]. Ambos podem ser encontrados no exoesqueleto dos crustceos, insectos e na parede celular de fungos.

Figura 1. Estrutura qumica da quitina (a) e do quitosano (b).

O quitosano vem sendo estudado devido s suas propriedades particulares como: bioactividade, biodegradabilidade, biocompatibilidade, reactividade do grupo amino deacetilado, permeabilidade selectiva, aco polieletroltica, habilidade de formar gis, filmes e quelao e capacidade adsortiva. Estas propriedades tornam-no num composto verstil que pode ser usado em diversas reas como: carregador de frmacos de libertao controlada e DNA; regenerao de tecidos epiteliais; confeco de membranas artificiais; promotor de osteognese; antibacteriano; potencial antimicrobiano e antioxidante; coadjuvante da higiene oral; absoro de gordura e reduo do colesterol srico; componente de cosmticos; remoo e recuperao de diferentes resduos; biotransformao e deteco de pesticidas; recobrimento de sementes na agricultura; remoo de corantes, aminocidos e protenas e como agente floculante no tratamento de efluentes aquosos. Este pode ainda ser preparado de diferentes formas como: solues de viscosidade controlada; gis; filmes e membranas; microesferas e nanopartculas. A literatura relata que o quitosano um antimicrobiano eficiente contra microrganismos como: Staphylococcus aureus; Escherichia coli; Salmonella typhimurium; Streptococcus faecalis; Salmonella entrica; S. paratyphi; Pseudomonas aeruginosa; Listeria monocytogenes; Bacillus cereus; Shigella dysenteriae; Aeromonas Sacharomyces cerevisiae; S. hydrophila; Fusarium; Alternaria; Zygosaccharomyces baillii;

Helminthosporium;

ludwigii;

Cryptococcus albidus; Candida sp.; Rhodotorula sp..

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1.5. O alginato

O alginato (figura 2) um hidrato de carbono coloidal hidroflico que se encontra na parede celular e espaos intercelulares de algumas espcies de algas marinhas castanhas da classe Phaeophyceae. Estes so polmeros lineares de alta massa molecular constitudos por resduos de cido -L-gulurnico (G) e cido -D-manurnico (M) associados por ligaes glicosdicas do tipo (1-4) e distribudos em diferentes propores ao longo da cadeia. Os alginatos possuem diversas propriedades como: espessantes, emulsificantes, estabilizantes, gelificantes, biocompatveis e no txicos. Estes so comummente comercializados sob a forma de sal, como o alginato de sdio, potssio e amnio. Estudo recorrendo aos alginatos usam-nos para imobilizao e encapsulao, entre outras aplicaes biotecnolgicas [3].

Figura 2. Composio do alginatos: (a) cadeia de resduos de cido manurnico; (b) cadeia de resduos de cidos gulurnicos; (c) cadeia de resduos de cidos manurmicos e gulurnicos alternados.

1.6. Filmes compostos

Uma tecnologia relativamente recente explora filmes compostos, isto , filmes constitudos pela combinao de diversos polissacardeos, protenas e lpidos, que segundo as 6

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suas compatibilidades conferiro aos filmes melhores caractersticas, nomeadamente as suas propriedades mecnicas e de barreira, quando comparados com filmes de compostos puros. Exemplificando, um filme composto por uma mistura de alginato e pectina tem a capacidade de formar gis a valores de pH inferiores a 4, na ausncia de clcio e em actividades de gua elevadas e em outras condies nas quais os seus compostos puros em separado no seriam [3].

1.7. Filmes de alginato e pectina

Os filmes compostos que recorrem ao alginato e pectina como matrias-primas revelam alta tenso na ruptura e pouca resistncia gua por serem hidroflicos. Tais filmes podem ser melhorados pela adio de ies divalentes, levando a pectina e o alginato a associaes do tipo cadeia-cadeia, aumentando a resistncia e insolubilidade dos filmes. De entre todos os ies divalentes o clcio mostrou ser o mais eficiente ao apresentar melhores resultados para concentraes menores. Este processo de reticulao das cadeias do alginato e pectina pode fazer-se por dois mtodos: o clcio pode ser adicionado directamente soluo e depois esta seca num molde; ou o clcio pode ser difundido para a matriz de um filme pr-formado. O mecanismo de aco do clcio baseia-se na induo da gelificao pela sua interaco com blocos guluronatos e galactouronatos existentes no alginato e na pectina, respectivamente, figura 3 [3].

Figura 3. Representao das cadeias de pectina (a) e alginato (b).

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1.8. Teste do halo

O mtodo da difuso em agar ou teste de halo foi realizado com o objectivo de avaliar a eficincia antimicrobiana do filme. Esta actividade pode ser medida determinando a concentrao inibitria mnima (CIM OU MIC) de um dado composto. Este a concentrao mnima do composto que inibe o crescimento microbiano. Para o determinar recorre-se a mtodos como o das diluies sucessivas ou difuso em agar. Na difuso em agar, uma amostra circular do agente microbiano depositado na superfcie de um meio de cultura slido apropriado para o microrganismo a testar e previamente inoculado nesse meio, numa placa de Petri. A placa de Petri depois inoculada temperatura ptima de crescimento do microrganismo teste, medida que o agente microbiano se difunde para o meio, formando um halo de inibio. O dimetro deste halo o valor de MIC e a zona onde no crescem colnias do microrganismo. Este dimetro depois medido e este proporcional quantidade de agente antimicrobiano colocada no meio, solubilidade do agente, ao coeficiente de difuso no meio de cultura slido e eficcia global do agente antimicrobiano [4].

1.9. Contagem de clulas

O mtodo de contagem directa de clulas totais atravs da cmara de contagem Neubauer feito com recurso ao microscpio. Neste procede-se ao enchimento da cavidade localizada no centro da uma lmina, situada entre esta e uma lamela com uma suspenso de clulas que se pretende contar. Esta cavidade est dividida em quadrados de dimenses definidas e de volume conhecido, onde se conta o nmero de clulas presentes em cada quadrado, para depois se calcular o nmero de clulas por unidade de volume. Para a contagem recorre-se cmara de contagem de Neubauer melhorada que possui uma rea de 1 mm2 e 0,1 mm de profundidade e est subdividida em 25 quadrados grandes. Cada um dos quadrados do centro est ainda subdividido em 16 quadrados mais pequenos. Existem portanto 25 x 16 = 400 (no centro, com uma rea total de 1 mm 2. O volume total dos 400 quadrados pequenos de 1 mm2 (rea) x 0,1 mm (altura) = 0,1 mm3, correspondente a 0,1 L. Com base nestes dados possvel calcular o volume de cada quadrado mais pequeno do centro e estimar o nmero de clulas por mL da cultura microbiana inicial, a partir dos resultados obtidos pela contagem de 5 quadrados grandes, correspondentes a 80 quadrados pequenos. Contudo, este mtodo possui algumas limitaes como o facto de no distinguir 8

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clulas viveis de clulas mortas, clulas muito pequenas, ser pouco preciso, apresentar um fraco contraste entre as clulas transparentes e o meio circundante, quando a amostra no corada, dificultando a contagem, no ser adequado para quantificar suspenses celulares pouco densas, entre outros [5][6].

1.10.

Objectivos

Os objectivos principais desta experincia so formar filmes compostos de quitosano e alginato em diferentes propores; avaliao da sua actividade antimicrobiana e posterior escolha do filme que apresentar melhores caractersticas antimicrobianas.

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2. Materiais e mtodos
2.1. Materiais e reagentes

gua destilada; bales volumtricos; placas de Petri; placa de aquecimento com agitao magntica; pipeta conta-gotas; pipetas graduadas; estufa; cido actico; acetona; quitosano; alginato de sdio; ansa de inoculao;

pipetas volumtricas; cmara de contagem Neubauer; microscpio; balana digital; fuet; cido sulfrico; exsicadores; micropipeta; bico de Busen; lamelas; cadinhos de papel de alumnio; copos de vidro; pelcula aderente.

2.2. Procedimentos

2.2.1. Procedimentos de Produo de Filmes Antimicrobianos

2.2.1.1. Preparao de uma soluo de alginato de sdio a 1%

Pesar 2 gramas de alginato de sdio; Diluir em 200 mL de gua destilada; Manter a soluo a 100oC at o alginato de sdio se encontrar totalmente dissolvido na gua destilada [7].

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2.2.1.2. Preparao de solues de cloreto de clcio (CaCl2 )

2.2.1.2.1.

Preparao de uma soluo de cloreto de clcio a 1%

Pesar 0,5 gramas de cloreto de clcio; Transferir a massa de cloreto de sdio para um balo volumtrico de 50 mL; Perfazer o volume com gua destilada.

2.2.1.2.2.

Preparao de uma soluo de cloreto de clcio a 2%

Pesar 0,26 gramas de cloreto de clcio; Transferir a massa de cloreto de sdio para um balo volumtrico de 20 mL; Perfazer o volume com gua destilada.

2.2.1.3. Preparao dos filmes a testar Adicionar gota a gota os volumes apresentados na tabela 1 de solues de quitosano e alginato de sdio, respectivamente;

Tabela 1. Volumes adicionados na preparao das solues para produzir os vrios filmes. Propores do filme Volume de quitosano (mL) Volume de alginato de sdio (mL) 20:80 50:50 80:20 2,0 5,0 8,0 8,0 5,0 2,0

Manter a agitao e temperatura das trs solues preparadas; Colocar numa placa de Petri as suspenses resultantes; Deixar secar temperatura ambiente durante uma semana; Caso os filmes no estejam completamente secos deix-los na estufa a 30oC at no se observar lquido algum.

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2.2.1.4. Preparao do filme seleccionado

Adicionar, gota a gota, 15 mL de alginato de sdio a 5mL de quitosano; Manter a agitao e temperatura da soluo; Colocar numa placa de Petri a suspenso resultante; Deixar arrefecer a suspenso temperatura ambiente e seguidamente colocar a placa
de Petri no frigorfico;

Retirar a placa do frigorfico e adicionar 10 mL de cloreto de clcio a 1% com uma

micropipeta, mL a mL;

Retirar o excesso de cloreto de clcio da placa de Petri com uma micropipeta. Ter
cuidado para no extrair fragmentos do filme;

Adicionar 10 mL de cloreto de clcio a 2% com uma micropipeta, mL a mL, Retirar o excesso de cloreto de sdio com uma micropipeta. Mais uma vez ter cuidado
para no extrair fragmentos do filme.
Nota: Realizar o procedimento descrito anteriormente para uma placa de controlo com 20 mL de alginato de sdio.

2.2.2. Procedimentos para testar a actividade antimicrobiana

2.2.2.1. Teste do Halo Fazer duas placas de Petri com meio de agar; Deixar solidificar; Dividir cada uma das placas em 4 partes iguais; Inocular cada parte com 100L de suspenso de S. cerevisiae; Espalhar o inculo recorrendo a uma ansa; Colocar cerca de 1 cm de dimetro dos diversos filmes realizados assepticamente sobre a superfcie de cada meio de cultura; Incubar as placas de Petri a 35oC durante uma semana [8].

2.2.2.2. Anlise Microbiolgica Cortar fatias finas de fuet; Inocular com 500L de uma cultura de S. cerevisiae previamente preparada; 12

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Embalar as amostras com o filme e envolve-las em papel alumnio; Armazenar as amostras sob atmosfera controlada de 50% de gua; Analisar as amostras quanto contagem de microrganismos ao fim de 7 dias [8].

2.2.3. Procedimentos de contagem de clulas Retirar com uma micropipeta, cerca 100 L da suspenso celular que pretende analisar; Transferir uma pequena parte deste volume para a cmara de contagem; Proceder contagem das clulas [5].

Figura 4. Exemplo ilustrando o procedimento de contagem directa (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003) [9].

2.2.4. Procedimentos de hidratao do alimento Pesar 10 gamas de fuet; Colocar em papel de alumnio; Colocar as amostras em gua a ferver durante 10minutos (atmosfera com 100% de humidade); Retira o fuet e deixar escorrer o excesso de gua; Pesar o fuet [10].

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2.2.4.1. Curva de dessoro Realizar trs solues com as seguintes concentraes de gua destilada: 100%, 50% e 25%; Perfazer as solues acima referidas com cido sulfrico, lentamente; Aps a adio do volume total de cido, arrefecer a soluo at temperatura ambiente, num exsicador; Colocar o alimento nas diversas condies de humidade; Pesar as vrias amostras e anotar as mudanas de peso, at peso constante [10].
Nota: O cido muito corrosivo, especialmente a baixas actividades da gua (alta concentrao), devendo ser manipulado com cuidado, evitando respingos da soluo no alimento.

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3. Resultados
Na tabela 2 apresentado o valor correspondente ao nmero de clulas obtidas da cultura de S. cerevisiae previamente preparada, este valor de 6,59107 clulas/mL. Na tabela 3 observam-se os valores obtidos na contagem de clulas para as actividades da gua de 25%, 50% e 100%, de 1,59107, 4,38106 e 2,86107 clulas/mL, respectivamente. Observam-se, ainda, os valores obtidos para uma actividade da gua de 50% do fuet protegido por um filme contendo apenas alginato de sdio de 1,24107 clulas/mL e um filme contendo 75% de alginato de sdio e 25% de quitosano de 2,25107 clulas/mL. Na figura 5 visualiza-se as placas de Petri realizadas com meios contendo glucose e lactose, onde foi inoculada uma cultura de S. cerevisiae. Estas foram utilizadas com o intuito de realizar o teste do halo para atestar a actividade antimicrobiana dos filmes preparados. A figura 6a ilustra os halos de inibio na placa que contm glucose, relativos aos filmes de percentagens de 40, 50 e 70% de quitosano. Na diviso respectiva ao filme que possui 10% de quitosano visvel uma contaminao. Na figura 6b, placa que contm lactose no meio, notam-se os halos de inibio nas divisrias relativas aos filmes possuidores de 10, 30 e 40% de quitosano e a ausncia de inibio do filme de controlo de alginato de sdio, verificando-se crescimento microbiano em toda a diviso correspondente. Na figura 7a observa-se o filme 100% de alginato de sdio, utilizado como controlo, que envolve o fuet previamente contaminado para uma actividade da gua de 50%. Na figura 7b pode observar-se o filme composto constitudo por 75% de alginato de sdio e 25% de quitosano que tambm envolveu o fuet previamente contaminado numa actividade da gua de 50% protegendo-o dos microrganismos que se pudessem desenvolver. Na figura 8a pode observar-se o fuet previamente contaminado sem filme colocado aps exposio numa atmosfera de gua de 50%. Na figura 8b evidenciado o fuet previamente contaminado sem filme exposto a uma atmosfera de actividade da gua de 100%.

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Tabela 2. Dados referentes contagem de clulas efectuada antes da exposio a atmosferas controladas do inculo isolado. Nmero de clulas (clulas/ml) 6,59E+07

a Figura 5. Placas de Petri contendo os filmes antimicrobianos, aps contaminao.

Figura 6. Placas de Petri contaminadas com aplicao dos vrios filmes antimicrobianos para testar a formao do halo, (a) meio contendo glucose, (b) meio contendo lactose.

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Figura 7. Ilustrao das amostras contendo os filmes aps exposio a atmosfera controlada a aw = 50%: (a) filme de controlo de alginato de sdio, (b) filme com 75% de alginato de sdio e 25% de quitosano.

Figura 8. Ilustrao do fuet aps exposio a atmosfera controlada: (a) de 50% de actividade da gua, (b) de 100% de actividade da gua.

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Tabela 3. Dados referentes contagem de clulas efectuada aps atmosfera controlada. Amostra contaminada com filme de 25% quitosano + 75% alginato de sdio em atmosfera a 50% de gua 2,25E+07 Nmero de clulas (clulas/mL)

Amostra contaminada com filme de 100% alginato de sdio em atmosfera a 50% de gua

Nmero de clulas (clulas/mL) 1,24E+07

Amostra contaminada Sem filme em atmosfera a 25% de gua

Nmero de clulas (clulas/mL) 1,59E+07

Amostra contaminada Sem filme em atmosfera a 50% de gua

Nmero de clulas (clulas/mL) 4,38E+06

Amostra contaminada Sem filme em atmosfera a 100% de gua

Nmero de clulas (clulas/mL) 2,86E+07

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4. Discusso de resultados
O objectivo fulcral da actividade experimental centrava-se na produo de filmes para efectuar testes posteriores em alimentos contaminados a fim de se verificar se possuam actividade antimicrobiana. Para tal, necessitava-se de uma cultura previamente isolada de um microrganismo. O microrganismo seleccionado foi a Saccharomyces cerevisiae devido aos inmeros estudos sobre as caractersticas deste microrganismo e o facto de ser acessvel, barato e comum [11]. Deste modo, este serviu de inculo para a contaminao de todas as amostras realizadas, apresentando uma contagem inicial de 6,59107 clulas/mL, como se pode observar pela anlise da tabela 2. Assim sendo, este valor pode ser considerado relativamente baixo, dado cultura no ter crescido o suficiente, por ter sido preparada em pouco tempo. Este facto pode, portanto ter levado a um crescimento reduzido do inculo e, por conseguinte a uma menor multiplicao de clulas, afectando a contagem. De seguida, procedeu-se preparao de filmes de diferentes percentagens de quitosano e alginato de sdio e adicionando ou no cloreto de clcio, com o intuito de se testar quais as percentagens que resultariam no filme antimicrobiano mais eficiente. Na figura 5 podem observar-se os filmes testados nas duas caixas de Petri diferindo no agar utilizado. Assim, na figura 5a visualiza-se um meio YPD contendo 2% de glucose e na figura 5b um meio YPD contendo 2% de lactose. Estas placas foram divididas em quarto partes iguais e em cada diviso foi espalhada uma cultura isolada de S. cerevisiae, recorrendo a uma ansa de Busen. Posteriormente, foi nelas aplicada uma pequena amostra circular dos filmes antimicrobianos com as diferentes percentagens de quitosano a estudar. Pela anlise desta figura pode verificar-se que os filmes foram correctamente aplicados, dado que aparentemente no se observam quaisquer contaminaes visveis ou deslocamentos dos filmes para as divises circundantes. Contudo, pode visualizar-se que os pedaos circulares dos filmes foram de difcil colocao devido fraca consistncia dos filmes, resultando em amostras demasiado lquidas e com um formato geomtrico irregular. A figura 6 ilustra as mesmas caixas de Petri aps uma semana na estufa a 35oC, temperatura ptima de crescimento da S. cerevisiae [12], mostrando o crescimento microbiano em torno dos filmes e verificando-se na maioria das amostras a formao de um halo. Assim sendo, somente o filme constitudo de alginato de sdio puro no evitou o crescimento de microrganismos nem inibiu o seu desenvolvimento e, consequentemente no se formou em seu torno nenhum halo, concluindo assim que o alginato de sdio no possui propriedades antimicrobianas, sendo usado somente para conferir consistncia aos filmes 19

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preparados [3]. Por outro lado, na placa contendo o meio rico em glucose verifica-se uma contaminao na zona correspondente ao filme de 10% de quitosano. Tal contaminao pode ter ocorrido fruto de uma m desinfeco do material ou das mos aquando a inoculao do microrganismo naquele local. Esta contaminao inviabilizou este resultado ao no permitir que dela se retire qualquer concluso acerca da inibio ou no do desenvolvimento microbiano. Relativamente aos demais resultados nesta placa, todos eles demonstram alguma inibio microbiana em maior ou menor grau, no entanto, somente o filme constitudo por 40% de quitosano mostra um halo geomtrico, enquanto as outras duas amostras de 70% e 50% de quitosano por terem sofrido deslocao devido consistncia demasiado lquida dos filmes aquando a sua colocao na placa. Contudo, possvel verificar que os filmes com as percentagens de 40% e 50% de quitosano evidenciam uma zona de inibio do crescimento/desenvolvimento dos microrganismos maior que a zona com o filme de 70% de quitosano, apontando para uma maior eficcia dos filmes com concentraes intermdias de quitosano quando comparados com os filmes de concentraes mais elevadas. Na figura 6b, isto , no meio contendo lactose verifica-se que o halo de maior dimetro referente ao filme com 30% de quitosano, o que vem confirmar que as concentraes intermdias de quitosano so de facto menos favorveis ao crescimento e desenvolvimento dos microrganismos. Quanto aos filmes com percentagens de quitosano de 10 e 40, os seus halos ultrapassaram as divises respectivas afectando a correcta anlise do seu halo de inibio. Todavia, estes halos adivinhavam-se menores que o correspondente ao filme com 70% de quitosano. Em concluso, o filme mais eficaz na sua actividade antimicrobiana foi o constitudo por 30% de quitosano, apresentando um maior halo de inibio. Concluiu-se, portanto que ao contrrio do que se poderia pensar, um filme de quitosano no to mais eficaz quanto maior for a sua concentrao de quitosano. Assim se constata que existe uma proporo ideal de quitosano e alginato de sdio para a formao de filmes compostos. Pela anlise da figura 6 pode ainda reportar-se um maior desenvolvimento/crescimento microbiano no meio contendo glucose em relao ao meio que contm lactose, o que permite afirmar que a glucose um substrato mais propcio ao crescimento da S. cerevisiae do que a lactose [12]. Na seleco dos filmes para colocar no alimento contaminado escolheu-se fazer um filme de alginato de sdio puro (100%) e outro filme composto com 75% de alginato de sdio e 35% de quitosano. O primeiro filme servir de controlo e o segundo foi escolhido com base nos testes realizados previamente, assim, 25% de quitosano est prximo dos 30% determinado como mais eficaz e aumentou-se um pouco a percentagem de alginato de sdio para melhorar a consistncia dos filmes. Ainda, para melhorar a consistncia, espessura e textura dos filmes

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adicionaram-se placa 20 mL de soluo total invs dos 10 mL usados na preparao dos filmes de testes e adicionou-se como reticulante 10 mL de cloreto de clcio a 1% e depois de drenar o excesso tornou-se a acrescentar 10 mL de cloreto de clcio a 2%, drenando novamente o excesso [3]. Inicialmente adiciona-se a soluo de 1% pois a de 2% tem uma concentrao demasiado elevada e poderia levar a uma reticulao demasiado intensa o que provocaria a formao de pregas acentuadas nos filmes, o que no aconselhvel para a textura que se pretende obter [3]. Com o intuito de evitar novamente um excesso de lquido nos filmes estes foram secos numa estufa a 30oC. Estes filmes foram depois envolvidos no fuet previamente contaminado com o inculo de S. cerevisiae e estas amostras foram colocadas numa atmosfera controlada a 50% de gua. A par destas amostras possuindo filmes colocaram-se outras trs sem filme em atmosferas de humidade crescente a 25%, 50% e 100% de gua. A figura 7 ilustra as amostras que continham filmes aps exposio a atmosfera controlada de 50% de actividade da gua. A imagem (a) corresponde ao filme de alginato de sdio puro que manteve a sua cor e consistncia, aps uma semana numa atmosfera hidratada a 50% de actividade da gua. J a imagem (b) correspondente ao filme com 25% de quitosano e 75% de alginato de sdio apresentou uma colorao mais amarelada que no incio e desfezse aps ter estado numa atmosfera controlada com uma actividade da gua de 50%. Tal pode ter sido devido ao facto de o filme composto no estar completamente seco aquando a sua colocao no alimento ou a uma drenagem deficiente do reticulante. Para evitar que ocorresse esta deficincia no filme poderia ter-se aumentado o intervalo de tempo na estufa, drenado melhor o excesso de reticulante, adicion-lo em menor quantidade ou adicion-lo por imerso ou numa percentagem diferente, dado que acima de 1,4% de CaCl2 os filmes costumam apresentar alta viscosidade e gelificao localizada [3]. Poder-se-ia, ainda, aumentar o volume total de soluo utilizado, pois tal poderia facilitar a aquisio da consistncia requerida para uma utilizao mais eficaz destes filmes antimicrobianos. A figura 8 mostra duas das trs outras amostras contaminadas sem filmes colocadas nas atmosferas controladas. A imagem (a), correspondente atmosfera de 50% de actividade da gua, manteve a sua cor e a sua integridade fsica. O mesmo no sucedeu com a amostra ilustrada na imagem (b), correspondente amostra colocada na atmosfera de 100% de gua, que se desfez completamente, havendo um crescimento/desenvolvimento da contaminao previamente realizada bastante extenso e acentuado. A tabela 3 apresenta a contagem de clulas de todas as amostras de fuet aps a sua exposio s diversas atmosferas controladas. Assim sendo, esperava-se que a amostra

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contendo o filme com 25% de quitosano apresentasse o menor nmero de clulas por mL, dado que o quitosano apresenta propriedades antimicrobianas que impediriam ou minimizariam o desenvolvimento microbiano. De seguida, acreditava-se que a amostra contendo o filme de alginato puro apresentaria uma contagem de clulas reduzida, uma vez que, apesar do alginato de sdio no possuir qualquer propriedade antimicrobiana, este funcionaria como barreira fsica protectora relativamente ao ambiente circundante, minimizando o desenvolvimento to efectivo de microrganismos para alm dos j adicionados para contaminar a amostra. Seguidamente, esperava-se que a amostra sem filme colocada na mesma atmosfera a 50% de gua apresentasse o maior nmero de clulas por mL dos trs, dado que no possua qualquer proteco como as outras duas amostras. Quanto s outras duas amostras colocadas em actividades da gua crescentes sem filmes antimicrobianos (25% e 100% de gua) supunha-se que possuiriam maior nmero de clulas por mL que as amostras com filmes, pelo mesmo motivo. Esperava-se ainda constatar que quanto maior fosse a percentagem de gua das atmosferas a que foram colocadas estas amostras sem filmes, maior seria a sua contagem celular, dado que a maior humidade do ambiente que os rodeava aumentava a probabilidade de contaminao microbiana do fuet, e por conseguinte maior nmero de clulas por mL. Contudo, como se pode atestar pela anlise da tabela 3, o descrito anteriormente no se verifica literalmente. Assim sendo, observa-se que as amostras colocadas em actividades de gua crescentes e sem filmes antimicrobianos verificam uma contagem de clulas decrescente de 2,86107 clulas/mL para uma actividade da gua de 100%, seguida de 1,59107 clulas/mL para uma actividade da gua de 25% e por fim, 4,38106 clulas/mL para uma actividade da gua de 50%. A atmosfera a 100% de gua o resultado obtido vai de encontro ao que era esperado, uma vez que a atmosfera onde se prev que ocorra uma maior actividade da gua e consequente crescimento/desenvolvimento microbiano mais evidenciado. Contudo, nas amostras respectivas s atmosferas de 25% e 50% de gua deveria observar-se um crescimento menor na atmosfera a 25% de gua quando comparado atmosfera de 50% de gua, dado que quanto maior a actividade da gua mais perecvel se torna o alimento e mais susceptvel se torna contaminao e deteoriao microbiana [13]. Tal facto pode ter ocorrido devido deficiente contaminao da amostra exposta atmosfera a 50% de gua, o que levaria em ltima instncia a um menor nmero de clulas iniciais e consequente menor desenvolvimento de colnias. Pode tambm ter ocorrido interferncia da concentrao salina verificada no nosso alimento nas diversas actividades da gua o que, em concreto na

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atmosfera a 50% de gua, ter mascarado o crescimento/desenvolvimento microbiano que de facto deveria ter ocorrido. No que respeita s amostras envolvidas em filmes, em atmosfera a 50% de gua, obtevese uma contagem de clulas decrescente de 2,25107 clulas/mL e 1,24107 clulas/mL nos para os filmes de 75% de alginato de sdio e 25% quitosano e alginato de sdio puro, respectivamente. Tal contradiz o que era esperado pois, tal como dito anteriormente, o quitosano aquele que possui actividade antimicrobiana, impedindo a proliferao e desenvolvimento de microrganismos, caracterstica que no partilhada pelo alginato de sdio que apenas confere consistncia matriz dos filmes [3]. Tal poder ter sido devido ao facto de o filme composto ter ficado com demasiado lquido, tornando-o demasiado hidratado, o que potenciou a gua j existente na atmosfera controlada a que foi sujeito. Poder ter ocorrido tambm algum tipo de interferncia do sal naturalmente presente no alimento curado com o filme [14]. Para impedir este insucesso poderia recorrer-se a outro alimento ou a uma drenagem e secagem do filme mais eficientes. Os filmes e revestimentos comestveis so uma ideia inovadora de embalagem e conservao dos alimentos, mantendo-os naturais, minimizando o seu processamento, isentando-os de substncias sintetizadas quimicamente, protegendo-os contra danos mecnicos, fsicos, qumicos e actividade microbiolgica e enriquecendo-os com substncias naturais benficas para a sade [1][2][3]. Ao trazerem tantas vantagens para a conservao dos alimentos e ao apresentarem-se como alternativas to promissoras ao embalamento de produtos alimentcios, a constante procura pela sua melhoria exige-se, experimentando novos compostos, diferentes combinaes, diversos reticulantes e outros processos envolvidos na sua formao. A sua aplicao em grande escala criaria novas indstrias, mais postos de trabalho, menores custos de embalamento e processamento dos alimentos e uma minimizao do impacto ambiental das embalagens alimentares [2]. Entre as tendncias de uso encontram-se linhas de pesquisa envolvendo filmes para a reduo do consumo de gordura e melhoria de textura em produtos fritos, transporte de compostos bioactivos e extenso da vida til de produtos altamente perecveis, como os produtos hortcolas [2][3]. Outros estudos relatam tambm o recurso a filmes biodegradveis base de amido de mandioca ou goma de alfarroba e sob o efeito de vrios plastificantes, como o glicerol ou o polietilenoglicol e cross-linkers como glutaraldedo ou CaCl2. Actualmente, as tendncias da pesquisa consideram tambm o uso da nanotecnologia, nomeadamente ao uso de nanopartculas encapsuladas de compostos bioactivos e funcionais, que podem ser

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libertados a partir da matriz que os contm, num ritmo controlado [2]. Tais avanos permitem aumentar a satisfao dos consumidores quando usados conscientemente, porque inserir nos produtos alimentcios alteraes demasiado dramticas ao que esto habituados, como a aplicao de revestimentos com cores estranhas em frutas, pode ser susceptvel a reaces negativas por parte dos consumidores, mesmo que muitas vezes estas alteraes sejam benficas para a sade, sendo rejeitados devido ao impacto visual negativo que causou nos clientes. Relativamente aos protocolos iniciais, este sofreram bastantes alteraes ao longo do trabalho experimental realizado. Uma das alteraes ocorridas foi durante a preparao da soluo de alginato de sdio, onde se procedeu preparao de uma soluo mais diluda do que a inicialmente proposta, dado que a sua solubilidade em gua no ideal, no sendo necessria a utilizao de uma soluo to concentrada, esta foi reajustada para 1%. Outra das alteraes realizadas foi a insero de um agente reticulante, o cloreto de clcio, para optimizar o processo de reticulao do filme, uma vez que o tempo disponvel para a sua secagem era curto. Utilizaram-se duas solues deste mesmo composto, uma a 1% e outra a 2%, pois devido espessura e textura do filme no seria possvel utilizar concentraes muito elevados, pois os filmes teriam a tendncia de formar pregas demasiado acentuadas que inviabilizariam a aplicao pretendida. Tambm os volumes destes filmes foram alterados sendo testados volumes de 10 mL, que apresentaram baixa consistncia e espessura insuficiente, e 20 mL melhorando estes parmetros mas necessitando de um maior tempo de secagem. Em relao s propores de quitosano e alginato de sdio estudadas foram distribudas diversas propores entre o turno, sendo que cada grupo ficou com trs propores diferentes para testar. Por ltimo, os pequenos ajustes que foram necessrios realizar, como os tempos de secagem, apenas sucederam devido s limitaes de material e reagentes do laboratrio ou mesmo a tempo para a sua adequada realizao.

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5. Concluses
As concluses principais desta actividade experimental so que o quitosano de facto um agente com propriedades antimicrobianas, o alginato de sdio essencial para conferir consistncia e o cloreto de clcio um reticulante bastante eficiente. A actividade da gua interfere na probabilidade que os alimentos tm de sofrer contaminao e deteoriao microbiana, sendo que quanto maior for a actividade da gua, mais perecvel o alimento e menor ser o seu tempo de prateleira. O sal, ao funcionar como conservante, pode interferir no s com a soro da gua como com o funcionamento dos filmes. Pelo facto de trabalharmos com tantas variveis, nomeadamente a temperatura de secagem, a percentagem dos compostos nos filmes, a actividade da gua, entre outros, este um trabalho de difcil reprodutibilidade, sendo difcil concluir se o filme de 25% de quitosano e 75% de alginato de sdio com a adio de solues de 1% e 2% de cloreto de clcio so efectivamente uma mais-valia na conservao de fuet, numa atmosfera a 50% de actividade da gua. Pode ainda verificar-se que a aplicao de qualquer dos filmes testados vantajosa pois mesmo nem todos apresentando propriedades antimicrobianas todos funcionaram como barreira fsica na proteco da propagao microbiana no fuet numa atmosfera de 50% de actividade da gua. Em suma, existem inmeros parmetros que influenciam a preparao de um bom filme antimicrobiano, tornando esta tcnica numa descoberta relativamente recente com muito caminho por percorrer e inovaes por explorar.

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6. Bibliografia
[1] FALGUERA, V.; QUINTERO, J.P.; JIMNEZ, A.; MUOZ, J.A.; IBARZ, A., Edible films and coatings: Structures, active functions and trends in their use, Trends in Food Science & Technology 22 (2011), pp. 292-303; [2] FAI, A.E.C.; STAMFORD, T.C.M.; STAMFORD, T.L.M., Potencial Biotecnolgico de quitosana em sistemas de conservao de alimentos (2008), Revista Iberoamericana de Polmeros, Volume 9(5), Quitosanos en alimentacin; [3] BIERHALZ, A.C.K., Confeco e caracterizao de biofilmes ativos base de pectina BTM e de pectina BTM/alginato reticulados com clcio (2010); [4] http://www.e-escola.pt/topico.asp?id=368, consultado em 03/11/2011; [5] Schuller, D.; Bjrn, J.; 2009/2010, Laboratrios Integrados de Biologia, Guia de Laboratrio; [6] http://www.e-escola.pt/topico.asp?id=235&ordem=2, consultado em 03/11/2011; [7] YAN, X.; KHOR, E.; LIM, L.; Chitosan-Alginate Films Prepared with Chitosans of Different Molecular Weights, (2001); [8] MORAES, A.; GOUVEIA, L.; SOARES, N.; SANTOS, M.; GONALVES, M.; Desenvolvimento e avaliao de filme antimicrobiano na conservao de manteiga, (2007); [9]http://www.biomedicina3l.com/2009/08/fases-de-crescimento-microbiano.html, consultado em 12/04/2011; [10] DITCHFIELD, C.; Estudo dos Mtodos para a Medida de Atividade de gua, (2000); [11]http://pt.wikibooks.org/wiki/Engenharia_gen%C3%A9tica/Saccharomyces_cerevisiae_com o_modelo_biol%C3%B3gico_em_engenharia_gen%C3%A9tica, consultado em 08/12/2011; [12] SLAA, J., GNODE, M., & ELSE, H., Yeast and fermentation: the optimal temperature (2009), Journal of Organic Chemistry. [13] http://www.hipersuper.pt/2006/12/08/A_import_ncia_da_actividade_da_/, consultado em 29/10/2011; [14]http://tdx.cat/bitstream/handle/10803/6675/24AwResultats.PDF?sequence=24, consultado em 01/12/2011.

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7. Anexos

7.1. Rtulo do fuet

Tabela 4. Dados de densidade e actividade da gua de cido sulfrico a 25oC em vrias concentraes (0-90% Peso) [10]. % Peso 0 5 10 15 20 25 30 40 50 60 70 80 90 a 25oC (g/cm3) Aw a 25oC 0,9971 1,0300 1,0640 1,0994 1,1365 1,1750 1,2150 1,2991 1,3911 1,4940 1,6059 1,7221 1,8091 1,0000 0,9809 0,9562 0,9236 0,8808 0,8237 0,7515 0,5650 0,3498 0,1624 0,0456 0,0053 0,0002

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7.2. Exemplos de Clculo

7.3. Procedimentos Iniciais

7.3.1. Aula 1 14 de Novembro

7.3.1.1. Preparao da Amostra e Pasteurizao Partir o fuet em rodelas finas; Colocar as rodelas em caixas de Petri; Colocar na estufa a 71-74oC durante 40 segundos; Retirar da estufa e deixar arrefecer com gua fria corrente.

7.3.1.2. Material e reagentes gua destilada; bales volumtricos; placas de Petri; placa de aquecimento com pipetas graduadas; estufa; cido actico; acetona; quitosano; alginato de sdio.

agitao magntica; pipeta conta-gotas;

7.3.1.3. Procedimentos de Produo de Filmes Antimicrobianos

7.3.1.3.1. Preparao de uma soluo de quitosano Pesar 25 gramas de quitosano; Preparar uma soluo de 50 mL de cido actico a 2%; Diluir a soluo de cido actico preparada previamente com 50 mL de acetona; Adicionar o quitosano soluo preparada.
Nota: A soluo de quitosano j nos dada previamente preparada em 2% de HCl.

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7.3.1.3.2. Preparao de uma soluo de alginato de sdio

Pesar 25 gramas de alginato de sdio; Diluir em 100 mL de gua destilada.

7.3.1.3.3. Preparao do Filme

Adicionar gota a gota 5 mL de soluo de quitosano a 5 mL de soluo de alginato de sdio (proporo 50:50); Manter a agitao vigorosa durante 20 minutos; Colocar numa placa de Petri a suspenso resultante; Deixar secar temperatura ambiente (25oC) durante, aproximadamente, 12 horas; Depois de secos emergir em 50 mL de gua destilada durante 1 hora; Lavar os filmes trs vezes com gua destilada, para remover componentes que no reagiram; Posteriormente secar a 30oC sob vcuo

Notas: Realizar este ensaio mais duas vezes mas com uma proporo de 2,5 mL de soluo de quitosano e 7,5 mL de soluo de alginato de sdio (proporo 25:75) e uma proporo com 7,5 mL de soluo de quitosano e 2,5 mL de soluo de alginato de sdio (proporo 75:25). Realizar de novo este ensaio com uma placa de Petri com apenas 10 mL de soluo de quitosano e outra com 10 mL com soluo de alginato de sdio. Estas duas solues sero consideradas os controlos.

7.3.2. Aula 2 21 de Novembro

7.3.2.1. Material e reagentes

Placas de Petri; Ansa de inoculao; Bico de Busen; Estufa.

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7.3.2.2. Procedimento de infeco dos filmes

Dividir uma placa de Petri em quatro partes iguais; Retirar uma pequena seco circular de cada filme preparado; Colocar no meio slido (previamente coberto com uma cultura de microrganismos).

7.3.2.3. Procedimentos para testar a actividade antimicrobiana

7.3.2.3.1. Teste de Halo

Fazer vrias placas de Petri com agar; Deixar solidificar; Inocular com 0,1 mL de suspenso de um microrganismo; Colocar cerca de 2,1 cm de dimetro de filme assepticamente sobre a superfcie do meio de cultura; Incubar as placas de Petri a 35oC durante 3 a 5 dias. 7.3.2.3.2. Anlise Microbiolgica

Cortar fatias finas de fuet; Inocular com uma cultura de microrganismos previamente isolada;

Embalar as amostras com o filme e envolve-las em papel alumnio; Armazenar as amostras sob temperatura de refrigerao; Analisar as amostras quanto contagem de microrganismos ao fim de 7 e 14 dias.

7.3.2.4. Procedimento de secagem do alimento

Pesar 40 gramas de fuet; Colocar as amostras em caixas de Petri; Colocar as caixas na estufa a 100oC durante 4 horas; Retirar e pesar o fuet.

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7.3.3. Aula 3 28 de Novembro

7.3.3.1. Material e reagentes

Micropipeta; Cmara de contagem Neubauer; Microscpio; Estufa; Fuet; cido sulfrico; gua destilada;

Bales volumtricos; Caixas de Petri; Balana digital; Pipetas volumtricas; Exsicador.

7.3.3.2. Procedimento de contagem de clulas Retirar com uma micropipeta, cerca 100 L da suspenso celular que pretende analisar; Transferir uma pequena parte deste volume para a cmara de contagem; Proceder contagem das clulas.

Figura 5. Esquema representativo da cmara de Neubauer [6].

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7.3.3.3. Procedimento do teste de actividade da gua

Preparar uma soluo me num balo de 100 mL com uma concentrao de 100% de cido sulfrico; Realizar trs solues com as seguintes concentraes de gua destilada: 100%, 50% e 25%; Perfazer as solues acima referidas com cido sulfrico, lentamente; Aps a adio do volume total de cido, arrefecer a soluo at temperatura ambiente, num exsicador; Medir a sua concentrao exacta; No final da experincia, medir novamente a sua concentrao para verificar se houve alterao na humidade relativa; Colocar o alimento em condies de humidade crescentes, isto , em contacto com as solues realizadas comeando pela que contm apenas cido sulfrico e terminando com a que contm apenas gua destilada; Pesar as vrias amostras e anotando as mudanas de peso, at peso constante.

Nota: O cido muito corrosivo, especialmente a baixas actividades da gua (alta concentrao), devendo ser manipulado com cuidado, evitando respingos da soluo no alimento.

7.3.4. Aula 4 5 de Dezembro

7.3.4.1. Material e reagentes Fuet; cido sulfrico; gua destilada; Bales volumtricos; Caixas de Petri; Balana digital; Pipetas volumtricas; Exsicador.

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7.3.4.2. Procedimento do teste de actividade da gua do filme seleccionado

Preparar uma soluo me num balo de 100 mL com uma concentrao de 100% de cido sulfrico; Realizar uma soluo com a concentrao de 50% de gua destilada; Perfazer a soluo com cido sulfrico, lentamente; Aps a adio do volume total de cido, arrefecer a soluo at temperatura ambiente, num exsicador; Medir a sua concentrao exacta; No final da experincia, medir novamente a sua concentrao para verificar se houve alterao na humidade relativa; Colocar o alimento na condio de 50% de humidade relativa; Pesar a amostra e anotar as mudanas de peso, at peso constante.

Nota: O cido muito corrosivo, especialmente a baixas actividades da gua (alta concentrao), devendo ser manipulado com cuidado, evitando respingos da soluo no alimento.

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