Efecto de la suplementacin proteica Apipromotor a distintos

pH sobre los niveles de expresin de vitelogenina y protenas

totales en cuerpos grasos abdominales de Apis mellifera
Sar|o, L.
1
, u|ntana, S.
3
, Med|c|, S.
1,2,3
,, Lguaras, M.
1,2
Iey, M.
4

1
Laborator|o de Artrpodos, Un|vers|dad Nac|ona| de Mar de| |ata.
2
CCNICL1
3
Iares 1a|e
Inst|tuto de An||s|s.
4
Ap|fey SA


Introduccin
Uno de los mecanismos que median el control de la organizacin social del
trabajo de las abejas es la variacin en la expresin del gen de la vitelogenina. El nivel
de expresin o de otra manera, la cantidad de mensajero gentico (ARNm) que la
abeja obrera fabrica para que se sintetice Vitelogenina (Vg) en la etapa temprana de la
vida, determinar su comportamiento posterior. La Vg resulta ser la protena ms
abundante en la hemolinfa de A. mellifera L. y es sintetizada por las obreras los
primeros 7 a 10 das de emergidas.
La expresin de vitelogenina en los primeros cuatro das de vida de la abeja
determina la edad de inicio y destino del pecoreo (nctar o polen). La longevidad de
las abejas, la cra, produccin de miel y la resistencia a las enfermedades son
parmetros que se reducen cuando la disponibilidad de protenas es inadecuada. La
produccin de Vg es fuertemente dependiente de la disponibilidad de alimento
proteico.
El manejo productivo de las colonias en Argentina sostiene un inicio temprano
del desarrollo de la colonia con respecto a la floracin. Sea cual sea el objetivo
productivo, se expone a las colonias a una situacin de dependencia de reservas
nutricionales (pan de abeja o polen ya ensilado) que no siempre estn presentes, por
lo que resulta imprescindible suministrar alguna dieta de constatado valor nutricional si
se desea mantener el flujo de protenas dentro de las colonias y evitar los efectos
adversos que produce su carencia.
El objetivo del presente trabajo fue comparar los niveles de expresin de Vg y
protenas totales presentes en los cuerpos grasos abdominales de abejas con
disponibilidad y carencia de reservas polnicas versus el efecto del suministro a
distintos pH del suplemento proteico Apipromotor.
Materiales y Mtodos:
Obtencin del material vivo
Las 300 abejas implicadas en la presente investigacin fueron obtenidas a
partir de un panal de cra operculada proveniente de una colonia de Apis mellifera.
Seleccionados los individuos por sus condiciones morfolgicas normales, se
procedi en forma aleatoria a distribuirlos en contenedores con el objeto de conformar
seis grupos. Las abejas de cada grupo fueron marcadas con una gota de pintura del
color correspondiente en el trax y sometidas a cada tratamiento experimental segn
se presenta en la Tabla 1 y Fig. 1.
Las abejas correspondientes a cada grupo fueron divididas a la mitad (n=25) y
alojadas en 2 unidades experimentales de campo (uec) de tamao reducido (n=12)
(Fig. 2)
Las uec receptoras de las abejas de los distintos grupos de tratamiento
contaban con no menos de 600 gramos de abeja, una abeja reina joven en postura y
al menos 3 panales con cra en distintos estadios de desarrollo.
Con el objetivo de evitar el acopio de polen en las uec destinadas a los grupos
3 a 6, fueron instalados con una anticipacin de 10 das placas perforadas de 0,55 mm
de dimetro en la piquera de forma tal que al ingresar las abejas, las corbculas
pierdan el polen recolectado.


Cuatro das antes de la introduccin de las abejas marcadas, se reemplazaron
en los grupos 3 a 6 los panales con acopio de miel y polen por vacos, mientras que en
los uec correspondientes a los grupos 1 y 2 se reemplazaron por uno vacio y uno con
polen ensilado. Conjuntamente se administraron los tratamientos en alimentador
interno a razn de 200 ml cada 2 das hasta concluir con el experimento (Fig. 3),
Las soluciones correspondientes a cada tratamiento se realizaron en base a
jarabe de caa de azcar al 66% en agua. A los grupos 5 y 6 se le agreg un volumen
del complemento Apipromotor a razn de 7 ml/ l segn la recomendacin de
marbete.
Salvo para el caso del grupo 5 ya que el pH resultante de la solucin de
jarabe mas Apipromotor es de 7,48, se procedi a acidificar con cido actico glacial
hasta obtener por peachmetro (Hannah digital) los valores del diseo experimental. El
valor de pH de 5,86 experimentado en los grupos 2, 4 y 6 fue determinado por solicitud
de la empresa y es el valor resultante de agregar un volumen de 1,5 ml/l de vinagre
de alcohol al jarabe con Apipromotor.
A los 0, 5, 10 y 21 das de alojados los individuos, se recolectaron al azar 6
abejas vivas de cada grupo de tratamiento (3 por uec).
El trabajo de campo se realiz durante el mes de diciembre de 2010 bajo
condiciones ambientales de temperatura media de 21.0C, y humedad relativa media
de 67.2%.

Estudios de expresin gnica
Los abdmenes de cada abeja fueron obtenidos por seccin del propodeum.
Los segmentos abdominales, junto con los cuerpos grasos adheridos a ellos por
defecto, fueron procesados segn TriReagent (Ambion) para obtener el ARN.
La retrotranscripcin se realiz mediante la enzima MMLV (Invitrogen Corp.,
Carlsbad, CA) a partir de 1 g del ARN tratado previamente obteniendo as el
ADNcopy.
Las reacciones de PCR en tiempo Real se llevaron a cabo utilizando una
mezcla preformada y optimizada (EvaGreen, Biodynamics). La deteccin del producto
amplificado por aumento de la fluorescencia en el tiempo se registr en un equipo
Rotor Gene.
Con el fin de corroborar la amplificacin del producto del peso molecular
esperado, los productos de la PCR fueron corridos en geles de agarosa 2,5% y
teidos con una solucin 0,5 g/ml de bromuro de etidio en buffer TBE 1X y
visualizados en un transiluminador U.V.
Determinacin de Protenas Totales en cuerpos grasos
Las protenas totales fueron precipitadas del sobrenadante producto de la
sedimentacin del pellet de RNA y la cuantificacin midiendo absorbancia a 595
nm. Se realiz por la tcnica de Bradford (Bradford, 1976). Para la curva de
calibracin se utiliz seroalbmina bovina como protena estndar.

Resultados:
Los negativos de retrotranscripcin para los dos pares de primers de beta
actina y Vg no presentaron producto de PCR y se obtuvo en todas las reacciones la
amplificacin del producto del peso molecular esperado.
Las eficiencias de amplificacin fueron para ambos genes cercanas al 100%
El resultado de de la corrida electrofortica en geles de agarosa (Fig. 4)
corrobor la presencia de las bandas de los pesos moleculares esperados para cada
gen en los productos amplificados.
Los niveles de expresin de Vg (Fig. 5) y protena total (Fig. 6)
correspondientes tiempo 1 no presentaron diferencias significativas entre los Grupos 1,
2, 5 y 6, pero si resultaron significativamente diferentes a los obtenidos en los
Grupos 3 y 4.
Para el tiempo 2, los niveles de Vg de los grupos 3 y 4 resultaron superiores al


resto de los grupos, si bien son estadsticamente diferentes a los grupos 5 y 6, no se
encontraron diferencias significativas con los grupos 1 y 2, debido a la alta dispersin
registrada por estos grupos en este tiempo de estudio. En contraposicin a este
resultado, los valores de protena total para estos grupos fueron significativamente
menores que en los grupos 1, 2, 5 y 6.
En el tiempo 3 los niveles tanto de Vg como de protena total no presentaron
diferencias significativas entre los grupos.

Discusin:
En base a los resultados obtenidos, se puede constatar que ante la
disponibilidad de una fuente proteica, los niveles de protenas totales, junto con la
expresin gnica de Vg presentan un mximo en la edad correspondiente a la obrera
nodriza, para luego decrecer paulatinamente en concordancia con lo propuesto por
numerosos autores (Fluri et al., 1982; Amdam et al., 2006)
Estos resultados se presentaron ante la disponibilidad ad libitum de una fuente
proteica, ya sea natural (polen ensilado) o artificial como el compuesto Apipromotor
sin una diferencia significativa entre ambos.
De esto se desprende que el formulado nutricional para abejas Apipromotor
resulta capaz de suplir las demandas proteicas de la abeja nodriza, permitiendo en
condiciones de carencia natural que la abeja cumpla con normalidad las distintas
etapas de su desarrollo.
Esta conclusin se refuerza al analizar el comportamiento de los niveles de
expresin de Vg en los grupos carentes de oferta proteica.
Bajo estas condiciones, los organismos presentaron el nivel de expresin
gnica mximo a los 10 das de emergidas mientras que en las abejas con
disponibilidad de protenas se present a los 5 das. Pese a este incremento tardo de
ARNm los ttulos de protenas totales registrados no respondieron de igual forma
debido a la carencia de materia prima.
En todos los casos, a los 21 das se registraron los niveles ms bajos en
ambos parmetros, demostrando que en presencia o ausencia de protenas
disponibles, la produccin de ARNm para la sntesis de Vg disminuye, evidenciando el
hecho de que la abeja no fabricar mas Vg, pese a no haber logrado las reservas
necesarias.
De esta forma podemos establecer que la disponibilidad de protena natural
(pan de abeja) o artificial (Apipromotor) estimulan tempranamente en la vida de la
obrera la produccin de ARNm de Vg, y por ende, los ttulos de protenas totales
necesarios para el normal desarrollo y longevidad del organismo.

Conclusiones

El consumo del compuesto Apipromotor genera en la abeja A. mellifera un efecto en
los niveles de expresin gnica y consecuente sntesis de vitelogenina similar al pan
de abejas, por lo que puede ser utilizado en la industria apcola en reemplazo de polen
cuando la oferta es escasa o nula.

El consumo del compuesto Apipromotor genera en la abeja A. mellifera
niveles de protenas similares a los producidos por el consumo del pan de abejas,
asegurando as la normal atencin de la cra, la recoleccin de polen y longevidad de
la abeja.

La expresin gnica de vitelogenina ha demostrado ser un parmetro
cuantificable vlido al momento de comparar la eficacia de las dietas proteicas y es de
esperar que tambin lo sea al evaluar la calidad nutricional de los distintos plenes
que recolecta la abeja.
N de abejas Polen
pH
Jarabe
Concentracin
Apipromotor
ml/lt de jarabe
Grupo 1 50 + 7,48 0
Grupo 2 50 + 5,86 0
Grupo 3 50 - 7,48 0
Grupo 4 50 - 5,86 0
Grupo 5 50 - 7,48 7
Grupo 6 50 - 5,86 7
Tabla1. Conformacin de los grupos y tratamiento administrado.


Figura 1. Un grupo de tratamiento ya identificados por marcado.

Figura 2. Unidades experimentales de campo

Figura 3. Administracin de los tratamientos a razn de 200 ml cada 2 das hasta concluir
con el experimento.

Figura 4. Electroforesis en gel de Agarosa 2% de los productos de PCR amplificados con los
primers de Vitelogenina

Figura 5. Comparacin de los distintos niveles de expresin de vitelogenina encontrados
para los 6 grupos estudiados. Doble letra indica diferencias significativas para cada tiempo.


Figura 6. Comparacin de los valores de protena total en cuerpos grasos de abejas
encontrados para los 6 grupos estudiados. Doble letra indica diferencias significativas para cada
tiempo.