UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CINCIAS BIOLGICAS PS-GRADUAO EM MICROBIOLOGIA

Elaine Gonalves Ferreira

Leveduras associadas a diferentes substratos naturais com potencial de produo de enzimas e substncias bioativas

2007

Elaine Gonalves Ferreira

Leveduras associadas a diferentes substratos naturais com potencial de produo de enzimas e substncias bioativas

Monografia apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Microbiologia do Instituto de Cincias Biolgicas da Universidade Federal de Minas Gerais, como parte dos requisitos para obteno do grau de Especialista em Microbiologia.

Orientadora: Dra. Beatriz M. Borelli Co-orientador: Dr. Carlos A. Rosa

Belo Horizonte 2007

ii

OFERECIMENTO

Ao Deus, Criador, Salvador e Consolador.

Nossos problemas se transformam nas oportunidades de Deus em nossas vidas para nos aproximarmos mais dEle enquanto Ele revela Seu poder e Sua glria em nosso favor. Ele ama transformar os nossos erros mais caros em pedras preciosas de sabedoria, nossos lugares feridos e sangrentos em fontes de maior fora, e nossos medos mais profundos em f inabalvel. (Pr.Wilson Ribeiro)

iii

AGRADECIMENTOS

Ao nico Deus Criador que tem me guiado todos os dias pelos caminhos traados por Ele. A querida Prof.Dr. Beatriz Martins Borelli, pela orientao, carinho, e principalmente pela disposio em me ensinar os primeiros passos ainda na graduao. Ao admirado Prof.Dr.Carlos Augusto Rosa, pela co-orientao, ateno e presteza, e acima de tudo, por ter um dia acreditado em mim e investido na minha formao cientfica. Ao meu querido Joo que me apoiou incondicionalmente durante os meses de execuo desta monografia. minha querida famlia que mesmo distante me apia amorosamente.

iv

RESUMO
O objetivo deste trabalho foi realizar um levantamento bibliogrfico sobre a associao de leveduras aos substratos naturais como flores, frutos, folhas, insetos, gua e solo e descrever o potencial biotecnolgico dessas leveduras quanto produo de enzimas extracelulares e toxinas micocinognicas. As principais enzimas produzidas por leveduras so lipases, -glucanases, proteases, quitinases e as pectinases. A atividade micocinognica tem sido detectada em vrias leveduras isoladas do ambiente, frutos, exsudatos e estruturas de plantas, mas raramente de solos. Vrias novas espcies de leveduras tm sido identificadas em muitos pases nos mais diversos ambientes naturais. Diante disso, imprescindvel a caracterizao dos microrganismos que ocupam os substratos naturais, assim como a investigao da potencialidade dessas leveduras na produo de substncias bioativas para aplicao na indstria e na biotecnologia.

ABSTRACT

The purpose of this study was holding a bibliographic survey on the association of natural yeasts to substrates such as flowers, fruit, leaves, insects, water and soil and describe the potential of biotechnology as yeast for the production of extracellular enzymes and toxins micocinogenics. The main enzymes produced by yeasts are lipases, - glucanases, proteases, quitinases and pectinases. The activity micocinogenic has been detected in several yeast isolated from the environment, fruit, exsudatos and structures of plants, but rarely on land. Several new species of yeast have been identified in many countries in different natural environments. Therefore, it is essential to characterization of microrganisms that occupy the natural substrates, and the research capability of these yeasts in the production of substances bioactives for application in industry and biotechnology.

vi

SUMRIO
Pgina Oferecimento .......................................................................................................... iii Agradecimentos...................................................................................................... iv Resumo................................................................................................................... v Abstract .................................................................................................................. vi 1 2 3 Introduo............................................................................................................... 01 Objetivos................................................................................................................. 04 Reviso Bibliogrfica ............................................................................................. 05 3.1 Leveduras: classificao................................................................................... 05 3.2 Ecologia das leveduras associadas aos frutos e substratos naturais ................. 06 3.2.1 Superfcie foliar....................................................................................... 06 3.2.2 Frutos e Flores......................................................................................... 07 3.2.3 Polinizadores ........................................................................................... 09 3.2.4 gua ........................................................................................................ 13 3.2.5 Solo.......................................................................................................... 15 3.3 Produo de enzimas extracelulares por leveduras .......................................... 19 3.3.1 Lipases..................................................................................................... 20 3.3.2 Proteinases............................................................................................... 24 3.3.3 Pectinases ................................................................................................ 27 3.3.4 -glicosidase............................................................................................ 30 3.3.5 -galactosidase ........................................................................................ 31 3.4 Toxinas killer ou leveduras micocinognicas .................................................. 32 3.5 Perspectivas de descoberta de novas substncias bioativas de fungos endofticos e leveduras isoladas de plantas do Cerrado ......................................... 36 4 5 Concluses.............................................................................................................. 39 Referncias Bibliogrficas...................................................................................... 42

1-

INTRODUO
H milhares de anos a humanidade tem se beneficiado das leveduras. Foram os

primeiros microrganismos estudados cientificamente e certamente os que mais contriburam para o avano da microbiologia, bioqumica, gentica e reas correlatas, influenciando significativamente o desenvolvimento scio-econmico do homem. A sua utilizao remonta antiguidade, pelos sumerianos (povo de elevado grau de civilizao que viveu entre os rios Tigre e Eufrates, h 7000 anos antes de Cristo) na produo de uma bebida fermentada feita base de cereais e que seria uma similar cerveja atual. O po, a cerveja e o vinho representam os produtos mais expressivos da manipulao das leveduras. A levedura Saccharomyces cerevisiae considerada um dos microrganismos mais teis ao homem e talvez o mais conhecido. Com seu genoma totalmente seqenciado foi possvel o desenvolvimento de sofisticadas abordagens genticas, como o sistema duplohbrido que proporcionou a identificao de vrios genes. Na pesquisa aplicada permitiu a expresso de genes heterlogos de interesse biotecnolgico e classificado como microrganismo GRAS (Generally Regonized As Safe), ttulo importante no que se refere produo de biofrmacos por engenharia gentica (TORRES et al., 2000). Durante o sculo XX, as leveduras foram utilizadas como modelo para alguns trabalhos notveis, como o de Buchner (1897) com a fermentao de extratos de clulas para o entendimento da gliclise; o de Dienert (1900) na adaptao das leveduras aos diferentes acares e o desenvolvimento de conceitos da induo enzimtica (MONOD, 1947); Harden & Youngs (1905) que descobriram a D-frutose 1,6-bifosfato e algumas coenzimas; e Hartwell & Nurses (1991) que desvendaram o ciclo celular (BARNETT, 2003). As leveduras so amplamente distribudas nos ambientes ou substratos naturais, e dentro do ecossistema terrestre podem ser identificados quatro grandes habitats para as leveduras: solo, plantas, animais e a atmosfera. Nas plantas, podem ser encontradas: na superfcie foliar, na seiva, nctar das flores e frutos. Devido ao alto teor de acares os frutos e flores so as fontes prediletas das leveduras (CARMO SOUZA, 1969). O estabelecimento e manuteno de uma comunidade natural de leveduras podem ser influenciados por vrios fatores, dentre estes, a produo de enzimas extracelulares, como as proteinases, pectinases e -glicosidases que alm de influenciarem na colonizao dos substratos, apresentam interesse industrial diversificado (TRINDADE, 2001). Nas ltimas dcadas, a relao estabelecida das comunidades de leveduras com seu habitat comearam a ser mais estudadas. Anteriormente, os estudos se limitavam a listar as 1

espcies isoladas nos diferentes habitats, e desconsideravam as possveis interaes entre estes e as leveduras (HAGLER et al. 1995). Atualmente, considera-se que a distribuio das leveduras no ocorre aleatoriamente em substratos aucarados, e sim, est intimamente ligada s relaes e interaes que ocorrem entre os microrganismos, entre estes os insetos vetores e o substrato (PHAFF, 1980). Certamente, uma variedade de substratos possivelmente colonizados por leveduras ainda no foram explorados, ainda que na ltima dcada o nmero de descries tenha aumentado significativamente no mundo e no Brasil. Nos diversos ecossistemas brasileiros h uma diversidade de organismos no descritos e uma variedade de substratos pouco explorados em relao ao potencial biotecnolgico de leveduras e fungos associados a estes, sendo que vrias espcies novas de leveduras tm sido isoladas de diversos substratos naturais brasileiros. MORAIS et al. (1995) isolaram leveduras de frutas tpicas da regio da floresta amaznica e descreveram uma nova espcie associada ao fruto Amap (Paranhancornia amapa) e outros autores como LACHANCE et al. (1998) e ROSA et al. (1999) descreveram vrias novas espcies de leveduras isoladas de substratos naturais como gua, flores, frutos, exsudatos de plantas, cactos e insetos vetores, vertebrados e invertebrados de ambientes tropicais. Entre os biomas brasileiros, destaca-se o Cerrado por ser considerado um dos hot spots do planeta e o segundo maior bioma do pas, com uma rea de ocupao entre 20-25% do territrio brasileiro. Apresenta uma diversidade de espcies pouco estudada e estimada em 10 mil espcies de plantas, sendo que destas, aproximadamente 4.400 so consideradas endmicas. Limita-se com todos os complexos ecossistemas do pas: Floresta Amaznica, Caatinga, Mata Atlntica, Campos limpos e Pantanal. O cerrado assume grande importncia tanto pela sua heterogeneidade vegetal, como por ser cortado pelas trs maiores bacias hidrogrficas sul-americanas. H plantas e frutos nativos com altos valores nutricionais, descritos na literatura, sendo fonte de renda e alimentao para populao rural, alm do vasto potencial de pesquisa cientfica, seja relacionada descoberta de novos frmacos ou a descrio de novas espcies, incluindo leveduras associadas sua flora endmica pouco preservada (POZO, 2001). Atualmente, o potencial biotecnolgico e industrial dos microrganismos tm estimulado as pesquisas relativas explorao das atividades enzimticas extracelulares (EEA) de diversas espcies de leveduras. Muitas delas so utilizadas na indstria de alimentos, de laticnios, farmacuticas, txtil, etc. Entre as principais enzimas produzidas por leveduras esto as hidrolticas ou hidrolases, - como as -glucanases-, proteases, quitinases e as lipases-, sendo que vrias substncias tm sido obtidas das clulas de leveduras, como os 2

peptdeos, cidos nuclicos, protenas recombinantes, polissacardeos, pigmentos, enzimas, lipdeos, dentre outras (FLEURI et al., 2005). As enzimas extracelulares so importantes para as leveduras e fungos no somente para defesa nos processos patognicos - o que confere uma resistncia natural contra os hospedeiros - mas tambm auxiliam na solubilidade de produtos que so absorvidos e usados como alimentos (MOREIRA et al., 2005). Muitos antibiticos de uso clnico foram obtidos a partir de fungos ou dos seus metablitos e os ecossistemas tropicais so as principais fontes de pesquisas para a descoberta de novos compostos bioativos e de novas espcies de leveduras. Estima-se que exista aproximadamente 1,5 milhes de espcies diferentes de fungos e somente cem mil descritos, ou seja, apenas 7% dos fungos do mundo foram descritos. Estima-se que essas espcies desconhecidas estejam principalmente em florestas tropicais e habitats inexplorados (HAWKSWORTH, 2004; STROBEL et al., 2004). Devido o grande potencial dos biomas brasileiros e a crescente aplicabilidade de enzimas na rea biotecnolgica, imprescindvel o estudo dos microrganismos que ocupam esses substratos naturais, assim como a investigao da potencialidade de leveduras isoladas de diferentes substratos naturais na produo de substncias bioativas para aplicao na indstria e na biotecnologia.

2-

OBJETIVOS Objetivo geral

Realizar levantamento bibliogrfico sobre a associao de leveduras aos substratos

naturais.

Objetivos especficos
1-Caracterizar a distribuio de leveduras em diversos ambientes ou substratos naturais (flores, frutos, folhas, insetos, gua e solo). 2-Descrever o potencial biotecnolgico das leveduras isoladas de substratos naturais quanto produo de enzimas extracelulares e produo de toxinas micocinognicas. 3-Relatar as perspectivas de novas substncias bioativas produzidas por fungos endofticos de ambientes com espcies endmicas.

3-

REVISO BIBLIOGRFICA Leveduras: classificao

Agrupadas no Reino Fungi, as leveduras so fungos predominantemente unicelulares e

3.1

que se reproduzem por brotamento ou fisso. H aproximadamente 1400 espcies descritas, classificadas nos dois grandes filos de fungos, os Basydiomycetes e os Ascomycetes. Quando apresentam forma de reproduo sexuada descrita so designados teleomorfos, e as espcies cuja reproduo sexuada desconhecida recebem a designao de formas imperfeitas ou anamorfas. Os Ascomycetes constituem um grupo monofiltico que abrange cerca de 70 % de todos os fungos j descritos, entre os mais conhecidos esto: Saccharomyces cerevisiae, Penicillium chrysogenum, Neurospora crassa, Aspergillus flavus, Candida albicans (ALEXOPOULOS et al., 1996; ROSA et al., 2006). O filo Basydiomycetes constitudo por leveduras ou fungos filamentosos saprbios, que vivem predominantemente em ambiente terrestre, alguns so parasitas de animais, algas, vegetais e de outros fungos. Os mutualistas formam ectomicorrizas e podem ocorrer como endofticos. Algumas espcies formam associaes simbiticas com algas ou cianobactrias, formando os liquens e muitos basidiomicetos so deterioradores de diversos produtos, principalmente madeira e txteis. Entretanto, no setor alimentcio que se destacam, especialmente devido aos basidiomicetos comestveis, como por exemplo, o champignon (CARLILE & WATKINSON, 1994). A diversidade de espcies de leveduras descrita pelo The Yeasts - a taxonomic study, de KURTZMAN e FELL (1998). Essa chave taxonmica reconhece cerca de 700 espcies de leveduras distribudas em 100 gneros, sendo 56 de ascomicetos (15 teleomorfos e 41 anamorfos) e 44 de basidiomicetos (16 teleomorfos e 28 anamorfos). Na primeira edio do livro, o nmero de espcies descritas cresceu de 164 em 1952 para 349 em 1970, de 500 em 1984 para 700 em 1998. A prxima edio contar aproximadamente com 1000 espcies. O acrscimo de espcies devido principalmente aplicao do sequenciamento do DNA, a identificao de leveduras por reconstruo filogentica, o que resultou em fuso de espcies e subdivises. De acordo com a transposio da predio de diversidade de fungos associados a plantas de Hawksworth (1991), haveria aproximadamente 12.000 espcies de leveduras. O grupo dos Basidiomycota agrega aproximadamente 30.000 espcies descritas sendo composto por 03 Classes (Hymenomycetes, Uredinomycetes, Ustilaginomycetes) 09 Ordens e 57

Famlias. O grupo Ascomycota composto por 04 Classes (Neolectomycetes, Pneumocystidomycetes, Schizosaccharomycetes e Taphrinomycetes) (ROSA et al., 2006).

3.2

Ecologia das leveduras associadas aos frutos e substratos naturais

A distribuio e a especificidade da comunidade de leveduras dependem da

composio dos nutrientes disponveis no substrato, da presena de compostos inibidores e de vetores que utilizam esses substratos. As plantas so habitats para vrias comunidades de leveduras que interagem ecologicamente e envolvem-se com outros organismos e substratos (ROSA et al., 2006).

3.2.1 Superfcie foliar

A superfcie da filosfera acomoda uma variada microbiota e as leveduras esto entre os componentes predominantes desse microhabitat. A maioria das espcies isoladas de plantas de ambientes tropicais de basidiomicetos (MIDDELHOVEN, 1997). No entanto, esse mesmo autor obteve resultados diferentes estudando as plantas das ilhas vulcnicas da costa espanhola (Canary Islands, Lanzarote e Fuerteventura). Ele verificou uma maior abundncia de ascomicetos em relao aos basidiomicetos, e concluiu que essa diferena de resultados era provavelmente devido alta umidade da ilha. O crescimento e a manuteno de uma comunidade de leveduras em determinado substrato influenciado pela disponibilidade de certos acares e outros nutrientes. O rompimento da cutcula das clulas vegetais, causado muitas vezes por enzimas produzidas pelas leveduras, liberam substncias que favorecem a distribuio e manuteno da comunidade de leveduras (MIDDELHOVEN, 1997). De modo contrrio, alguns compostos naturais das plantas podem exercer ao inibitria ao crescimento de algumas leveduras. Os insetos tambm podem produzir substncias que afetam o crescimento de leveduras a eles associadas. Porm, incipiente o conhecimento da atividade bioqumica das leveduras associadas s plantas (PHAFF & STARMER, 1980 citado por TRINDADE, 2001; MIDDELHOVEN, 1997). Muitas leveduras da filosfera conseguem ultrapassar a cutina pela presena da cutinase, enzima hidroltica que ataca a cutcula e tambm pela produo de esterases e lipases que acabam sendo fonte de carbono e energia. Aps a hidrlise da cutina, a completa

penetrao das clulas das leveduras e das enzimas extracelulares retardada pelo complexo de lignocelulose e por hemiceluloses. Alguns ascomicetos negros conseguem assimilar pectina; basidiomicetos como Cryptococcus e Rhodotorula tambm degradam a estrutura desses polissacardeos. Vrios compostos benznicos so assimilados por muitas espcies. Debaromyces hansenii assimila fenol, catecol e o cido 3-hidroxibenzico. Algumas linhagens, Rhodotorula sp, Pseudozyma sp.,C. cyanescens, toleram p-cumarato e ferulato, e estes so importantes constituintes das plantas. A osmotolerncia e outras propriedades fisiolgicas permitem a sobrevivncia das leveduras em condies climticas adversas. As leveduras no so consideradas uma ameaa s plantas, so saprfitos inofensivos que habitam a sua superfcie e as protegem quando competem por nutrientes com os fungos fitopatognicos (MIDDELHOVEN, 1997).

3.2.2 Frutos e Flores

Os frutos e as flores so as fontes prediletas de leveduras devido ao seu alto teor de acares disponveis. A colonizao e permanncia das leveduras nesses substratos ou microhabitats ocorrem principalmente pela disponibilidade de diversos tipos de acares, pelo baixo pH e pela visitao de insetos. As leveduras de flores e frutos so muito diversificadas filogeneticamente e os estudos das comunidades de leveduras associadas em diferentes plantas tm fornecido novas espcies de leveduras. H espcies isoladas de frutos que so capazes de crescer sob refrigerao e ainda causarem a deteriorao dos frutos. As espcies normalmente isoladas de sucos de frutas (ma, cenoura, morango, uva) so Rhodotorula rubra, Candida lambica, C. sake e Kloeckera apis. BEECH & DAVENPORT (1970) isolaram trs novas espcies de Candida (C.anglica, C. cidri e C. pomicola) de suco fermentado de ma. TOURNAS et al. (2006) coletaram amostras de saladas de frutas ctricas, de melo, abacaxi, morango e amostras pasteurizadas de suco de fruta (ma, cenoura com ma, uva e suco de laranja) de supermercados de Washington, USA e encontraram nessas amostras como espcies predominantes, os gneros: Rhodotorula, Pichia, Candida e Saccharomyces; foram tambm isolados alguns representantes de Debaryomyces, Zygosaccharomyces e Kloeckera. Os primeiros pesquisadores a isolar leveduras associadas a sucos de frutas foram BRANNON & POLLIT (1935) e RECCA & MRACK (1952) estes autores isolaram leveduras de sucos de frutas ctricas e algumas das espcies foram consideradas

contaminantes ou envolvidas nos processos de deteriorao dos frutos e dos sucos (TRINDADE, 2001). MORAIS et al. (1995) estudaram o fruto Amap e observaram que a populao de leveduras e a diversidade de espcies variavam de acordo com o estgio de deteriorao dos frutos. As leveduras da fase adiantada de amadurecimento do fruto possuam certas restries fisiolgicas e assimilavam rapidamente acares simples, como a sacarose e glicose. O aumento na competio por substratos assimilveis e a diminuio de acares simples, provavelmente causaram uma reduo acentuada de espcies e das populaes de leveduras ao longo dos dias da sucesso. Curiosamente, a comunidade de leveduras associadas ao fruto Amap mostrou-se restrita, pois de 36 fontes de carbono testadas, apenas cinco (glicerol, celobiose, D-lactato, salicina e L-sorbose) foram assimiladas. Mais de 80% delas foram classificadas como espcies fermentadoras, uma caracterstica de leveduras associadas deteriorao de frutas. SANTOS et al. (1996) identificaram leveduras associadas a flores e frutos tropicais e as espcies predominantes foram leveduras negras e anamorfos de basidiomicetos, principalmente a espcie Cryptococcus laurentii. Foi verificado que ocorria uma sucesso durante o processo de amadurecimento dos frutos, nos quais, quando maduros, predominaram as leveduras ascomicticas e seus anamorfos. A espcie Metschinikowia pulcherrima foi frequentemente isolada de flores de caju; Candida entomaea prevaleceu nos frutos de caj coletados no campo e as espcies fermentatoras, Issatchenkia orientalis e Kloeckera javanica, prevaleceram nos frutos maduros. Estudos realizados por LACHANCE et al. (1998) no Hava, Brasil e Austrlia, levaram descrio de cinco novas espcies de leveduras (Wickerhamiella australiensis, Wickerhamiella cacticola, Wickerhamiella occidentalis, Candida drosophilae e Candida lipophila) todas associadas a flores (Ipomoea spp e Hibiscus), cactos e insetos visitadores de flores (drosfilas, abelhas e besouros) e estas exibiram uma fisiologia muito especializada e ainda a produo de uma lipase extracelular de alta atividade. FREIRE et al. (2002) isolaram bactrias e leveduras associadas a amndoas de cajueiro, de castanha-do-Brasil e pimenta-do-reino preta e branca. As coletas das amostras foram no comrcio local da cidade de Belm (estado do Par), na regio da Amaznia brasileira e em fazendas do estado do Cear. Foram observadas altas contagens de leveduras associadas amndoa do cajueiro. As leveduras Pichia sp., Pichia guillermondii e Rhodotorula sp., isoladas somente a partir de amndoas de cajueiro, predominaram em altas concentraes de densidade quando comparadas a de bactrias. J a partir das pimentas 8

branca e preta no foram isoladas leveduras, provavelmente devido inibio de crescimento provocada pelos leos essenciais presentes nas pimentas. Tal observao foi corroborada por outros autores que tambm no encontraram leveduras associadas s especiarias ou as encontraram em nmero insignificante (KRISHNASWAMY et al., 1973 citado por FREIRE et al., 2002). Espcies do gnero Metschnikowia desenvolvem-se bem no ecossistema flor-inseto no qual proliferam devido alta concentrao de acares do nctar. A composio de acares do nctar das flores varia entre as espcies de plantas, mas predomina as hexoses (glicose e frutose) e os dissacardeos, principalmente a sacarose (JURADO et al., 2003). TRINDADE et al. (2004) descreveram uma nova espcie de levedura, Candida sergipensis, isolada de polpa de frutas tropicais brasileiras, umb (Spondias tuberosa Avr. Cam.) e mangaba (Hancornia speciosa Gom.), sendo a espcie predominante nessas frutas. A levedura C. sergipensis assimilava acares simples geralmente presente em frutas (glicose e sacarose) e algumas linhagens desta espcie fermentavam glicose e possivelmente atuavam como agentes de deteriorao dessas frutas tropicais. THANH et al. (2006) estudaram a fruta da lichieira e a comunidade de leveduras associadas fruta. As coletas foram realizadas em mercados populares da cidade de Hani, no Vietnam, durante o vero de 2001 e 2002. Foram analisadas frutas sem sinais de fermentao e os resultados obtidos mostraram uma comunidade de leveduras formadas por espcies que so carreadas para as frutas por vetores. A espcie dominante pertence ao gnero Kloeckera e outros ascomicetos como Candida, Pichia, Torulaspora, Issatchenkia e basidiomicetos tpicos de superfcie foliar. Entre eles, duas novas espcies foram identificadas: Cryptococcus bestiolae e Cryptococcus dejecticola, que apresentaram as caractersticas tpicas do gnero Cryptococcus: habilidade para assimilar inositol, reao positiva a urease e presena da coenzima ubiquinona, CoQ-10. A anlise da seqncia D1/D2 do RNA ribossomal confirmou que as duas novas espcies so pertencentes a este grupo polifiltico.

3.2.3 Polinizadores
As leveduras so organismos imveis e precisam ser carreados por vetores. H diversos estudos de isolamento de leveduras associadas com insetos. Devido estreita relao existente entre plantas e insetos polinizadores, estes podem dispersar as leveduras entre diferentes microhabitats, uma vez que utilizam destes stios para alimentao e para a

oviposio. Dentre os insetos dispersores de leveduras destacam-se vrios grupos de espcies de Drosophila (TRINDADE, 2001). A associao de leveduras com insetos, em particular drosfilas, tem sido relatada na literatura. As leveduras fazem parte da dieta dessas moscas, podendo inclusive interferir no seu desenvolvimento; geralmente, mais de uma espcie de levedura associada a cada inseto, e as comunidades de leveduras so significativamente influenciadas pelo habitat (GOMES et al., 2003). Muitas espcies da famlia Drosophilidae possuem comunidades de leveduras associadas (Metschinikowia hawaiiensis, Candida amapae, Kloeckera sp., Hanseniaspora sp., Candida guillermondii e Candida krusei, Candida ipomoea).Vrias outras espcies de leveduras tm sido isoladas de drosfilas de regies tropicais, espcies de Candida, como C. lipophila, C. drosophilae, C.restingae, C. sonorensis, C. deserticola e de outros insetos, como abelhas, foram isoladas espcies de Candida, Hanseniospora, Hansenula, Trichosporon, Rhodotorula, Cryptococcus e Aureobasidium. Tem sido proposto que as leveduras representam o controle energtico necessrio nas funes de reproduo e funes somticas em Drosophila melanogaster, elas atuariam tanto aumentando a fecundidade das moscas como diminuindo a resistncia e o seu ciclo de vida (GOMES et al., 2003). MORAIS et al. (1992) estudaram a distribuio e a diversidade de leveduras associadas a oito espcies de Drosophila (superfcie do corpo e intestino) em duas reas de Mata Atlntica e uma rea impactada no Rio de Janeiro, Brasil. As espcies de leveduras prevalentes foram Kloeckera apis, K. javanica, K. japonica, Geotrichum spp. e Candida citrea. Esses autores verificaram que havia similaridade entre as espcies isoladas da superfcie do corpo das moscas com as isoladas do aparelho digestivo, indicando que as leveduras eram suas principais fontes de alimento. MORAIS et al. (1995) estudaram a sucesso de leveduras no fruto Amap (Parahancornia amapa) e como essa sucesso interferia na comunidade de Drosophila spp. As espcies de Drosophila apresentaram preferncias de alimentao por leveduras diferentes e poderiam ser consideradas as responsveis pela distribuio das leveduras ao longo da sucesso temporal no fruto Amap. As interaes das espcies competidoras de leveduras, juntamente com a produo de toxinas, poderiam desempenhar um papel na estrutura da comunidade de leveduras do fruto Amap. Os resultados obtidos mostraram uma comunidade de leveduras flutuante ao longo do amadurecimento e apodrecimento do fruto. A diversidade de espcies decresceu ao longo da deteriorao do fruto, provavelmente devido reduo de acares e alterao do pH. As leveduras que foram frequentemente isoladas das moscas so 10

Kloeckera apiculata, Pichia membranaefaciens-like, e Candida citrea. A espcie Drosophila tropicalis estava freqentemente associada com C. norvegensis, C. fructus, C.sorboxylosalike. As leveduras que colonizaram o fruto nos primeiros dias da fruta cada apresentaram perfis fisiolgicos restritos, assimilando alguns acares simples e fermentando rapidamente glicose e sacarose. Com a intensa visitao de Drosophila spp e de outros insetos a partir do segundo e terceiro dia da fruta cada, provavelmente ocorreu inoculao de outras espcies de leveduras como, C. guillermondii, Geotrichum sp, Pichia kluyveri e P. pijperi. Algumas espcies que colonizaram o fruto nos primeiros dias foram substitudas por outras ao longo dos dias. A competio entre as espcies por fontes de energia provavelmente resultou no decrscimo da populao e da diversidade; as que possuam atividade killer apresentaram vantagens na competio pelo substrato efmero da fruta em estgio de deteriorao. Diferentes espcies apareceram na fase final de deteriorao, Candida blankii-like, C. diversa, C. karawaiewii. C.lipolytica-like, C. versatilis e C. quercitrusa, e estas no foram isoladas das moscas. Isso indica que Drosophila spp no so os nicos vetores das leveduras encontradas no fruto do Amap. E tambm, que as espcies de Drosophila visitam outros substratos na floresta. As espcies de leveduras isoladas em fmeas de Drosophila foram maiores que as transportadas por machos sugerindo que as fmeas visitavam uma maior variedade de substratos que os machos. LACHANCE et al. (1998) descreveram cinco novas espcies que ocorrem em flores que so visitadas por insetos, principalmente abelhas e algumas espcies de drosfilas da Austrlia, Brasil e Hava. Neste estudo, foram isoladas vrias leveduras de flores e insetos associados com aspectos fisiolgicos bem especializados. Foram identificadas as abelhas visitadoras de flores de cactos e de Ipomoea fistulosa. Uma das novas espcies descritas, Candida drosophilae, intimamente relacionada drosfilas que possuem como habitat flores de Ipomoea spp. e Candida lipophila foi a outra espcie frequentemente isolada das drosfilas . ROSA et al. (1999a) isolaram uma nova espcie de levedura, Candida batistae, que associada a uma abelha solitria desempenhava a funo de converso do plen a alimento para as larvas. E as contagens elevadas de leveduras em provises larvais das duas abelhas solitrias sugeriram que as leveduras so metabolicamente ativas. A produo do lipase e a habilidade de fermentar acares, duas caractersticas observados em C. batistae poderiam ser fundamentais na transformao bioqumica do plen dentro dos ninhos das abelhas e beneficiariam nutricionalmente as larvas. As leveduras so fontes de protenas e de vitaminas para outros insetos tais como a Drosophila. 11

HONG et al. (2003), isolaram uma espcie nova, a Candida kuwiensis, da superfcie corporal de cinco espcies diferentes de abelhas visitadoras de Ipomoea batatas, sugerindo uma associao com o plen e outras espcies como Candida bombi, que tambm frequentemente isolada de superfcies de abelhas e do plen. Neste mesmo estudo, verificouse que nas flores de Ipomoea spp., visitadas pelos zanges, o nctar e os proboscdeos desses zanges continham uma comunidade diferente de leveduras, composta predominantemente por Metschnikowia reukaufii, e em menores propores, M. gruessii e C. bombi. GOMES et al. (2003) estudaram as leveduras presentes em figos infestados pela mosca da fruta Zaprionus indianus (Dip.: Drosophilidade). A drosfila Z.indianus se tornou nos ltimos anos a maior praga da cultura de figos no Brasil. Neste estudo, os autores verificaram altas contagens de leveduras presentes em figos infectados com Zaprionus indianus e estas no foram isoladas das frutas no infectadas. As moscas obtidas das crislidas da superfcie esterilizadas abrigaram leveduras e todos os isolados foram identificados como Candida tropicalis. Este resultado sugeriu que a presena de uma nica espcie de levedura e a baixa variabilidade gentica determinada pela tcnica de polimorfismo de DNA amplificado aleatoriamente (RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA) dos isolados indicaram uma relao muito estreita entre Zaprionus indianus e Candida tropicalis. BRYSCH-HERZBERG et al. (2004) estudando o gnero Wickerhamiella, isolaram uma nova espcie de levedura, Candida bombiphila, da probscide de Bombus terrestris (abelha rainha) e dos favos de mel da abelha Bombus pascuorum. A nova espcie apresentou habilidade de fermentar a glicose, porm no crescia na presena de etanol, de 2cetogluconato e 10% NaCl, caractersticas fisiolgicas que juntamente com as diferenciaes moleculares, permitiram separar C. bombiphila de Wickerhamiella domercqiae, espcie frequentemente associada a flores e insetos. A espcie de borboleta Conopomorpha sinensis (Lepidoptera: Gracillariidae) a maior peste e o maior perfurador da fruta da lichieira (fruta tpica do Sudeste da sia e Sudeste da China). um inseto que coloca os ovos na fruta em qualquer momento aps a florao. As suas larvas permitem que uma variedade de microrganismos destrua a fruta e eventualmente toda a colheita. Foram identificadas duas novas espcies: Cryptococcus bestiolae e Cryptococcus dejecticola. Essas espcies so similares filogeneticamente a espcie associada a insetos, Bullera dendrophila, e esse fato sugeriu que o habitat dos novos isolados seria a superfcie da planta, j que B. dendrophila, inicialmente foi isolada de dejetos de besouros, assim, h possibilidade de que as espcies sejam associadas aos dejetos do inseto e no superfcie foliar (THANH et al., 2006). 12

3.2.4 gua
As leveduras tm sido isoladas de uma variedade de ecossistemas aquticos. Muitas pesquisas relatam diversas espcies em ambientes aquticos, como o sedimento, as plantas, os animais, rios, esturios, mangues costeiros, oceanos e no fundo do mar. Os estudos com leveduras nas regies ocenicas iniciaram-se nas ltimas duas dcadas e indicaram que as comunidades eram constitudas de espcies que so ubquas ou restritas geogrficas, hidrogrfica e biologicamente. Nos ecossistemas de pntanos e mangues salgados, as leveduras parecem desempenhar um importante papel na cadeia de alimentar podendo ser fonte de alimento para alguns invertebrados e zooplncton marinhos. Muitas espcies de leveduras encontradas em ambientes aquticos so alctones, com nmeros limitados de espcies e similares as terrestres. Somente algumas espcies isoladas de ambientes aquticos so restritas a esse ambiente, isso poderia indicar que a maioria das espcies marinhas so contaminantes terrestres. Geralmente, leveduras basidiomicticas so menos freqentes do que as leveduras ascomicticas nos ambientes aquticos poludos (NAGAHAMA, 2006). Vrias espcies so isoladas de guas, porm um limitado nmero de espcies prevalece ao longo do tempo. As espcies mais freqentes pertencem aos gneros Aureobasidium, Candida, Cryptococcus, Pichia, Rhodotorula, Saccharomyces e Trichosporum. E algumas espcies desses gneros so consideradas como bioindicadores de poluio: Aureobasidium pullulans, Cryptococcus albidus, Cr. laurentii, Debaryomyces hansenii e Rhodotorula mucilaginosa (Rh. rubra). A maioria das espcies desses gneros associada s plantas, solo e fontes orgnicas de poluio. Apesar do significado ecolgico das leveduras em ambientes aquticos ainda no ser totalmente claro, bvio o aumento das leveduras com a entrada de fontes orgnicas em ambientes aquticos, assim elas poderiam ser utilizadas como indicadores de poluio orgnica. Os estudos indicam que as leveduras so metabolicamente ativas em ecossistemas aquticos e contribuem no ciclo do carbono, demonstrando uma participao ativa desses microrganismos nestes ambientes (HAGLER & AHEARN, 1987 citado por ROSA, et al., 1995; NAGAHAMA, 2006). H um crescente interesse, principalmente na Europa e Amrica do Norte, pelo isolamento das leveduras presentes em esturios, lagos, mares, rios, crregos, e alguns estudos sendo desenvolvidos na Amrica do Sul (Brasil e Chile). Na Amrica do Norte, a maioria das espcies isoladas pertence aos grupos de Candida, Trichosporon, Torulopsis, 13

Rhodotorula, e Debaryomyces. No Brasil, os estudos ainda se limitam s cidades de Florianpolis, Recife, Rio de Janeiro e So Paulo, e nesta ltima, a presena de Candida tem sido utilizada como indicadora de poluio marinha (LOUREIRO et al., 2005). ROSA, et al. (1995) estudaram a populao de leveduras da Lagoa Olhos dgua, uma pequena lagoa na rea urbana da cidade de Lagoa Santa, Minas Gerais, Brasil. O objetivo do estudo era avaliar a influncia da variao trmica e das variaes sazonais do ambiente como fatores interferentes na comunidade de leveduras. Das 56 espcies isoladas, Aureobasidium pullulans, Candida famata, Cryptococcus albidus, Cryptococcus laurentii, Rhodotorula glutinis, Rhododotorula rubra e Trichosporon cutaneum, ocorreram em maior freqncia. A espcie Aureobasidium pullulans foi a mais freqente durante o perodo de seca (inverno) e as espcies, C. famata, Cr. albidus, Cr. laurentii e Rh. rubra durante o perodo chuvoso (vero). Trichosporon cutaneum foi isolada entre julho e novembro. A maior parte dessas espcies associada s plantas e solos, possuem habilidade de assimilar um grande nmero de compostos de carbono, e so importantes na decomposio de macrfitas aquticas da lagoa. Foi observada uma menor diversidade de leveduras na zona limntica quando comparada com a zona litornea. E a rea de menor diversidade situada mais distante da margem e em regio de intensa colonizao por macrfitas, sugerindo que estas constituem uma barreira natural para o estabelecimento das leveduras. As leveduras Aureobasidium pullulans e Candida famata foram isoladas durante todo o perodo de amostragem. A primeira uma levedura negra pouco isolada de guas e frequentemente associada s plantas e solo. A segunda uma espcie ubqua em guas e capaz de utilizar variedade de fontes de carbono. As espcies de Cryptococcus foram isoladas somente na estao chuvosa e so encontradas normalmente em guas limpas, solo e superfcie de plantas. Assim h possibilidade de que estas sejam carreadas pela chuva para ambientes aquticos. Ainda neste estudo, as espcies do gnero Rhododotorula ocorreram em baixa freqncia, o que difere da maioria dos estudos em ambientes aquticos, nos quais o gnero representa 50% dos isolados. Trichosporon cutaneum mostrou uma variao sazonal tpica sendo isolada somente entre julho e novembro, na regio limntica, e com um decrscimo de isolados com a profundidade. uma espcie principalmente associada aos humanos e animais, o que sugere que esta levedura pode ser utilizada como indicadora de poluio fecal de origem humana. Algumas espcies de Candida no foram identificadas, e estas provavelmente representam novos bitipos ou novas espcies. A maioria dos isolados so versteis nutricionalmente e colonizam ambientes aquticos com baixas concentraes de nutrientes; prevaleceram leveduras basidiomicticas anamorfas, e como as altas contagens 14

foram encontradas prximas superfcie, infere-se que a sobrevivncia destas leveduras influenciada por fosfatos e oxignio. A descrio da comunidade de leveduras dessa lagoa tropical demonstrou a flutuao da populao de leveduras em relao estao (seca e chuvosa) em contraste com a temperatura da lagoa. LOUREIRO et al. (2005) isolaram espcies de leveduras do solo e da gua do mar das praias de Bairro Novo e Casa Caiada, na cidade de Olinda, estado do Pernambuco, Brasil. Foram obtidas 292 amostras de leveduras, distribudas em quatro gneros e 31 espcies. A populao de leveduras encontrada pertencia aos mesmos grupos j isolados de outros ambientes aquticos, como Candida, Trichosporon, Rhodotorula e Brettanomyces. A espcie Brettanomyces bruxellensis apresentou a mais alta freqncia 43,75%, e Candida o maior nmero de espcies, Candida fennica, C. catenulata, C, melibiosa, C. parapsilosis, C. rhagri, C. rugopelliculosa e C.sake. O grupo com menor freqncia de espcies foi Trichosporon.

3.2.5 Solo
Os solos consistem em partculas minerais e orgnicas que do forma a agregados heterogneos de vrios tamanhos e uma rede complexa de poros. Esses podem ser preenchidos com gases atmosfricos, vapor de gua ou solues aquosas de sais. um habitat heterogneo e complexo, com inmeras propriedades fsico-qumicas, temperatura, gua, diversidade de microrganismos e processos biolgicos de decomposio desencadeados pelos microrganismos do solo. Apesar de conter vrios nutrientes, considerado oligotrfico, sendo que o carbono orgnico a principal fonte de nutriente para os decompositores, plantas, organismos da rizosfera e patgenos (YOUNG & CRAWFORD, 2004). Geralmente as leveduras ocorrem em vrios tipos de solo e em diversas reas geogrficas, desde as zonas rticas aos trpicos. Vrias espcies de basidiomicetos e ascomicetos foram isolados do solo, porm na maioria dos estudos, a quantidade e a diversidade de leveduras so irrisrias diante dos procariotos e fungos isolados. Normalmente, as leveduras ocorrem nos primeiros 10 cm do solo, em conseqncia da habilidade de crescer aerobicamente. E, nos solos midos, h maior diversidade de espcies em relao aos solos ridos e nutricionalmente pobres. Muitas leveduras so encontradas em solos com plantas frutferas e ricas em hidratos de carbono, pois estas servem como nutriente rico para as leveduras quando a fruta deteriorada depositada no solo. As leveduras do solo sobrevivem sob circunstncias oligotrficas, mas tambm so isoladas dos habitats relativamente ricos em nutrientes como a rizosfera e restos orgnicos que se deterioram no 15

solo. Entretanto, considerando a heterogeneidade do solo, as espcies de leveduras estariam distribudas desigualmente e apresentariam uma variao temporal de acordo com as variaes climticas (PHAFF et al. 1966; BOTHA, 2006). Os estudos sobre ecologia microbiana do solo pouco ou nada mencionam sobre as interaes ecolgicas de leveduras do solo in situ. Os estudos da interao das leveduras com outros microrganismos poderiam levar a compreenso do papel das comunidades de leveduras, da sua distribuio e exigncias nutricionais e habilidades intrnsecas de assimilar nutrientes do solo. Podem frequentemente coexistir intimamente com uma diversidade de algas, procariotos, protistas, bem como razes de plantas. Assim, o crescimento e a sobrevivncia de uma espcie em particular de levedura do solo podem ser determinados no unicamente pelas habilidades intrnsecas, mas tambm como resultado cumulativo de inmeras interaes dentro da comunidade microbiana deste habitat (BOTHA, 2006). Em 1927, os autores Starkey e Henry iniciaram os estudos das leveduras do solo. Desde ento, muitas espcies de leveduras tem sido isoladas deste habitat (STARKEY & HENRY, 1927). No ano de 1950 foram isolados os primeiros gneros de Saccharomyces e Schizosaccharomyces do solo. Algumas outras espcies dos gneros Cryptococcus, Debaryomyces, Lipomyces, Schizoblastoporion, tem sido isoladas repetidamente de vrios solos, indicando que os nichos ecolgicos destes fungos ocorrem no solo (CARMO-SOUZA, 1969; BOTHA, 2006). A habilidade de leveduras autctones do solo de sobreviver neste habitat foi atribuda a inmeros fatores. Por exemplo, a maioria destas leveduras possui um espectro largo de atividades metablicas o que permite assimilao de vrios produtos hidrolticos de materiais de planta, gerados por fungos e por procariotos. Algumas linhagens de Lipomyces, Cryptococcus e Rhodotorula produzem as cpsulas exopolimricas, o que sugere uma melhor sobrevivncia nos solos pobres nutricionalmente. Nos solos semi-ridos a maior parte da comunidade de leveduras formada por criptococos e por leveduras basidiomicticas (SPENCER & SPENCER 1997). Algumas linhagens de criptococos do solo podem produzir substncias polimricas extracelulares (EPS) e biofilmes. A formao do biofilme um dos mecanismos pelos quais os microrganismos podem seqestrar e concentrar nutrientes ao crescer em ambientes de baixas concentraes nutricionais (JOUBERT et al., 2003). A ocorrncia dessas leveduras autctones no solo indica que elas atuam na dissipao e transformao de energia no ecossistema (LACHANCE & STARMER, 1998). A maioria das espcies encontradas freqentemente no solo utiliza aerobicamente L-arabinose, D-xilose e celobiose. Estes hidratos de carbono so produtos da hidrlise enzimtica realizada por 16

bactrias e fungos do material lignocelultico da planta (BISARIA & GHOSE, 1981). Outras leveduras freqentes no solo assimilam produtos intermedirios da degradao da lignina, como os cidos ferlico e vanlico e o 4-cido hidroxibenzico (MIDDELHOVEN, 1993). Entretanto, apesar dessa habilidade de utilizar os produtos da degradao da madeira, alguns autores sugerem que as leveduras do solo no possuem um papel principal na decomposio da matria orgnica, devido aos nmeros relativamente baixos de espcies comparados com os dos fungos e dos procariotos que ocorrem no mesmo habitat. Entretanto, em alguns habitats, como zonas rticas, as leveduras podem ser a microbiota cultivvel dominante no solo e isto permitiria que contribussem significativamente na decomposio da matria orgnica do solo (PHAFF & STARMER, 1987). Aparentemente, algumas leveduras devido s suas potencialidades oligotrficas, no ocorrem dentro do solo, mas podem crescer nas superfcies das rochas acima da terra. Alguns gneros de ascomicetos e basidiomicetos, como Candida, Lipomyces, Rhodotorula e Trichoderma foram isolados das superfcies da rocha. Tais fungos epilticos e endolticos compreendem uma proporo significativa da comunidade microbiana que habitam as rochas (granito, calcrios, mrmore, silicatos e os aluminosilicatos). As leveduras e outros fungos que ocorrem nas rochas atuam na sua dissoluo e na liberao de nutrientes, assim, podem contribuir para a formao do solo e na disponibilidade de nutrientes solveis comunidade microbiana (GADD & SAYER, 2000; STERFLINGER & PRILLINGER, 2001; BURFORD et al., 2003; BOTHA, 2006). Devido competio acirrada entre bactrias e fungos no solo, as concentraes de compostos orgnicos assimilveis so baixas. Mas as leveduras presentes na matria orgnica em decomposio produzem uma variedade de compostos assimilveis de carbono (BOTHA, 2006). Apesar dos poucos estudos de leveduras dos solos, pode-se antecipar que quanto mais espcies de leveduras so descobertas e estudadas, mais tipos de interaes so descritas e melhor elucidado o papel destas nesse ecossistema. As anlises da seqncia do rDNA do DNA total da comunidade do solo, bem como a hibridizao in situ, tm permitido que os estudos das leveduras do solo diretamente em seu habitat natural avancem, o que aumenta a possibilidade de descrio de novas espcies, de se conhecer o potencial destas leveduras e da sua interferncia na colheita de alimentos (HUNT et al. 2004; CAIRNEY, 2005). VU NGUYEN et al. (2004) ao estudarem leveduras que hidroxilam monoterpenos, isolaram trs novas espcies do solo e de resduos de plantas de ambientes ricos nestes compostos. Monoterpenos e monoterpenides so compostos aromticos de grande importncia industrial. A sntese de monoterpenides via biotransformao microbiana 17

muito atrativa devido s regies de alta estereoseletividade. Muitas espcies de leveduras em condies de cultivo hidroxilam monoterpenos e algumas espcies assimilam monoterpenos como nica fonte de carbono. Os autores desse estudo descreveram as novas espcies: Rhodotorula cycloclastica, Rhodotorula retinophila, Rhodotorula terpenoidalis. As linhagens isoladas foram capazes de assimilar limoneno (em estado de vapor) como nica fonte de carbono e apresentaram propriedades fisiolgicas substancialmente distintas umas das outras e de outras espcies j descritas. A assimilao de limoneno no exclusiva dessas trs novas espcies, sendo que j foi demonstrado que Yarrowia lipolytica, Debaryomyces spp. e Candida spp. so tambm capazes de hidroxilar limoneno, embora no o utilizem como nica fonte de carbono. O gnero Nonomuraea formado atualmente por 18 espcies descritas que formam uma linha filtica distinta na famlia Streptosporangiaceae. As espcies de Nonomuraea so distinguidas pelas caractersticas fenotpicas. WAEL et al. (2007) isolaram uma espcie nova de levedura de dunas de areia, na cidade de Borg El-Arab, Egito. Os isolados formavam miclios ramificados no substrato, hifas areas brancas, e esporos em cadeia; cresceram bem em sais inorgnicos e alguns acares. A levedura foi distinguida dos outros representantes do gnero pelas propriedades fenotpicas e comparao da seqncia 16s rRNA, o que a classificou no gnero Nonomuraea sendo denominada Nonomuraea aegyptia. MIDDELHOVEN & KURTZMAN (2007) descreveram quatro novas espcies, Candida cretensis e Candida vadensis, isoladas de cogumelos deteriorados (Hericium erinaceus, Bull.: Fr.), Blastobotrys robertii e Candida scorzettiae, isoladas de madeira de pinheiro (Pinus sylvestris L.) em estado de decomposio. De acordo com as anlises filogenticas das seqncias de nucleotdeos da regio D1/D2 LSU do DNA ribossomal, as quatro novas espcies pertencem a clados distintos. Todas cresceram em n-hexadecano e somente C.scorzettiae assimilou alguns compostos fenlicos, cidos benzicos e cidos cinmicos. Apenas C. cretensis fermentou acares. Diferentemente de muitos basidiomicetos isolados de madeira em decomposio, as leveduras ascomicticas no apresentam atividade degradativa de compostos fenlicos e polissacardeos, porm C. cretensis e C. vadensis assimilaram xilano; e as espcies B. robertii e C. scorzettiae cresceram lentamente na presena do composto. Recentemente, 22 espcies novas do clado de C. vadensis foram descobertas, sendo que a maior parte dos isolados so de insetos associados com os cogumelos, isso demonstra que os membros deste clado podem ter distribuio extensa na natureza e so associadas fortemente aos cogumelos visitados por insetos.

18

3.3

Produo de enzimas extracelulares por leveduras

As leveduras tm distribuio mundial e metabolismo diversificado e especialidade

fisiolgica que proporciona a utilizao de uma variedade de nutrientes em distintas condies ambientais. Diversas espcies esto associadas a processos industriais e descritas como patgenos oportunistas. So microrganismos de relevncia por serem timas produtoras de biocompostos e constiturem fonte de protenas e vitaminas (KIRSOP & KURTZMAN, 1988). Para que uma comunidade de leveduras se estabelea em um ambiente no basta uma composio nutricional adequada, existe uma variedade de fatores interferentes no processo de estabelecimento em um microhabitat, e estes vo desde a competio pelo nicho produo ou a atividade de enzimas extracelulares. Algumas destas enzimas so capazes de degradar nutrientes insolveis como celulose, protenas, amidos e cidos graxos, permitindo o transporte dos mesmos para o interior da clula para o seu crescimento (BUZZINI et al., 2002; ANDRADE et al., 2002).As enzimas extracelulares so importantes para as leveduras e fungos para defesa nos processos patognicos e auxiliam na solubilidade de produtos que so absorvidos e usados como alimentos (MOREIRA et al., 2005). Entre as principais enzimas produzidas por leveduras esto as hidrolticas ou hidrolases, como as -glucanases, proteases e as quitinases. Vrias substncias tm sido obtidas das clulas de leveduras, com auxlio da lise enzimtica, como os peptdeos, cidos nuclicos, protenas recombinantes, polissacardeos, pigmentos, enzimas (amilases, proteases, lipases). A aplicao desses produtos passa pela produo de enzimas intercelulares, preparao dos polissacardeos, glucanas e mananas, extrao alcalina de protenas, produo de extrato de leveduras, aumento da digestabilidade animal, extrao de pigmentos, como o vermelho de astaxantina. Na alimentao, so utilizadas para preservao de alimentos, na obteno de protena para animais e humanos, aumento do valor alimentcio de cereais quando se utilizam grandes propores de polissacardeos sem amido, clarificao e filtrao de vinhos, reduo da viscosidade do produto final na fabricao da cerveja, na elucidao da estrutura, composio e mecanismo de sntese da parede celular de leveduras (FLEURI et al., 2005). Dentre os gneros de fungos que se destacam na produo de enzimas, as espcies de Mucor constituem o gnero responsvel pela produo de vrias enzimas como amilases, lipases, pectinases e proteases. As espcies M. hiemalis, M. racemosus, M. bacilliformis, M.

19

miehei, possuem atividade proteoltica de valor comercial e a espcie M. miehei produz lipase (ALVES et al., 2002). So diversos os gneros de leveduras produtores de enzimas extracelulares. E muitas espcies so peculiarmente apropriadas para variados propsitos industriais. So requeridas em muitas reas de pesquisa, na produo de compostos, em processos na indstria de alimentos ou medicamentos. Muitas so as vantagens de se utilizar as enzimas produzidas por leveduras, uma dessas o fato de ser uma clula eucariota, e, portanto com os processos de sntese de protenas ou de outras substncias similares aos dos animais; suas protenas possuem massa molecular maior quando comparada a outros sistemas, como o de fagos e bactrias. Para a produo de enzimas extracelulares por leveduras alguns fatores so relevantes, os diferentes tipos de cultivos, o nmero de clulas, a idade do inculo, o meio usado para fermentao e a temperatura usada para crescimento do microrganismo (SILVA NEVES et al., 2006; MICHIKO et al., 2007). Nos ltimos anos, vrios estudos tm revelado que os ambientes tropicais apresentam uma variedade de leveduras produtoras de enzimas extracelulares, de compostos bioativos, ambos com propriedades com possveis aplicaes teraputicas e com ilimitadas utilizaes biotecnolgicas.

3.3.1 Lipases
As lipases pertencem famlia das hidrolases, so encontradas na natureza e sua biossntese observada em animais, vegetais e microrganismos. Sua funo biolgica catalisar a hidrlise de triacilgliceris para formar mono e diacilgliceris, cidos graxos e glicerol. Possuem a caracterstica peculiar de agir nas fases aquosas e no-aquosas, e uma relativa especificidade por diferentes substratos as distingue das esterases. Os substratos naturais para lipases so leos e gorduras, contendo cidos graxos de cadeia longa (steres insolveis em gua), enquanto as esterases atuam apenas em steres simples de cidos graxos hidrossolveis. As esterases ainda no so to exploradas quanto lipases. No passado, a maioria dos estudos referentes s lipases e ao seu modo de ao foi direcionada para as enzimas de mamferos, como a lipase pancretica, lipoprotena e fosfolipase A2. BUZZINI et al. (2002) estudaram leveduras isoladas de ambientes tropicais e produtoras de enzimas extracelulares. Eles verificaram que a ocorrncia de esterases era tipicamente associada aos basidiomicetos, e que, a ocorrncia de lipases, essencialmente associada com ascomicetos. 20

Nos ltimos anos esto sendo desenvolvidos vrios estudos envolvendo lipases microbianas, de bactrias, fungos e leveduras, com o objetivo de selecionar microrganismos capazes de se tornarem fontes industriais destas enzimas (CARNEIRO, 2000). As enzimas lipolticas apresentam uma ampla utilizao na indstria de lacticnios, nas snteses orgnicas, na manufatura do papel, como aditivos em detergentes, principalmente nos usados em lavanderias industriais. So aplicadas para o desenvolvimento de sabor em produtos de laticnios e bebidas achocolatadas e alcolicas, e ainda, no tratamento de resduos em efluentes contaminados com gorduras slidas (JAEGER et al., 1998; LORTIE et al., 1997). Vrios autores descreveram a produo de lipases microbianas por bactrias, principalmente, espcies de Pseudomonas e Bacillus. Os fungos filamentosos e as leveduras so tambm capazes de produzir lipases extracelulares. Os principais gneros de fungos produtores so: Penicillium, Rhizopus, Rhizomucor, Mucor e Aspergillus. Em leveduras, as espcies do gnero Candida sp. e as espcies Geotrichum sp., G. candidum e Galatomyces geotrichum so frequentemente relatadas na literatura como produtoras de lipases (MACEDO et al., 1997; VEERARAGAVAN et al., 1990; PHILLIPS & PRETORIUS, 1991; BHUSHAN & HOONDAL, 1994). MUDERHWA et al. (1985) purificaram e caracterizaram a lipase produzida por Candida deformans. A enzima apresentou atividade enzimtica em temperatura de 40-50C, pH 7.0, sendo ativada por ons Ca+2, Mg+2, Co+2 e inibida por ons Cu+2, Zn+2 e EDTA. VEERARAGAVAN et al. (1990), caracterizaram duas lipases distintas de Geotrichum candidum, denominada lipase I e II. Ambas apresentaram massa molecular de 56kDa, foram estveis em uma faixa de pH entre 6.0 e 8.0, e, quando em pH abaixo ou acima de 5.0 e 9.0, tornaram-se completamente desnaturadas. ons monovalentes tiveram um pequeno efeito na atividade enzimtica, enquanto que ons divalentes, em concentraes superiores a 50mM, inibiram a enzima de maneira concentrao dependente. Utilizando a mesma levedura, BAILLARGEON et al. (1991) purificaram parcialmente e caracterizaram cinco diferentes lipases produzidas por Geotrichum candidum (NRRL- Y-553). Aps cultivo da levedura em meio de cultura adicionado de leo de soja como fonte de carbono, houve produo de uma mistura complexa de lipases e estas se diferenciaram quanto massa molecular (de 57 a 60 kDa). A maior atividade lipoltica foi observada em temperatura de 30C, pH 7,75. A atividade foi totalmente inativada em 35 minutos a 56C. E a 4C, em pH 5.0-8.0 durante semanas no ocorreu perda significativa da atividade enzimtica. RA et al. (1992) purificaram e caracterizaram duas lipases, denominadas A e B, produzidas por Candida cylindracea. As enzimas apresentaram contedo de aminocidos 21

similares, porm diferiram no de acares neutros e na estabilidade em diferentes temperaturas e valores de pH. As duas enzimas apresentaram atividade mxima entre pH 6.0 e 7.5, e o peso molecular semelhante e prximo a 60 kDa. RIAUBLANC et al. (1993) purificaram a lipase produzida por Candida rugosa, ela foi inibida por ons Cu+2, Zn+2 e por detergentes. Mas permaneceu ativa em ampla faixa de pH (3.0 a 8.0) e temperatura superior a 55C. A atividade mxima foi obtida em pH 7.0 e 40C. KUNO et al. (1996) descreveram a produo de lipases extracelulares por Yarrowia (Sacharomycopsis) lipolytica, em meio contendo leo de oliva e casena. Uma enzima - a lipase A - foi purificada e apresentou massa molecular de 39 kDa. Utilizando a mesma levedura, DESTAIN et al. (1997) aumentaram a produo de lipase atravs de procedimentos de mutao. A maior produtividade com a linhagem selvagem em meio lquido foi de 28 U/mL aps 72 horas de cultivo. Aps a primeira mutao, a produtividade registrada aumentou para 700 U/mL decorrido o mesmo tempo. J na segunda gerao de mutantes, o rendimento atingiu 1000 U/mL. Os autores consideraram a seleo de mutantes uma excelente estratgia para aumento da produtividade da enzima. KAMIMURA et al. (1999) descreveram a produo de lipase por Geotrichum sp. A produo da enzima foi maior em meio de cultivo complexo (5% de corn steep liquor, 0,5% de nitrato de amnio e 1% de leo de oliva) comparada ao meio de cultivo sinttico. Ocorreu um aumento em 13 vezes na produo alcanada em um trabalho anterior com a mesma levedura, em condies diferentes de cultivo. A produo de lipases pode ser induzida pelo acrscimo de leo de oliva ao meio de cultivo, como fonte de obteno de energia (MOREIRA et al., 2005). Os estudos relacionados produo, purificao e caracterizao de lipases extracelulares tm dado nfase a gneros restritos, principalmente Geotrichum e Candida. Diante disso, estudos de outros gneros so imprescindveis. Estudos e ensaios preliminares com os gneros, Kodamaea e Wickerhamiella, mostraram que leveduras pertencentes a estes gneros e isoladas de substratos naturais, demonstraram capacidade de produzir lipases extracelulares (LACHANCE et al., 1998). CARNEIRO (2000) estudou Wickerhamiella cacticola (UFMG-96-381), levedura isolada de flores de cactos, que foi previamente identificada como produtora de lipase extracelular. A produo da enzima foi avaliada perante diferentes meios de cultivo, pH, tempo e temperatura de incubao na produo da enzima. Os resultados demonstraram a influncia desses fatores na produo da enzima. A produo mxima da enzima foi atingida em meio de cultivo com tributirina, pH 5.0 e 9.0, aps 72 horas de incubao, a 37C. Quando 22

se utilizou azeite de oliva e no tributirina, a maior produo foi alcanada aps 24 horas a 37C. A massa molecular da enzima foi de 20 kDa, o pH timo de atividade foi 8.0 e a temperatura tima de 30C. Atualmente os genes de lipases tem sido clonados e caracterizados geneticamente. Alguns genomas de leveduras com atividade lipoltica foram seqenciados, como o de Yarrowia lipolytica. Existem dados de aproximadamente 21 genes de lipases/ carboxilesterases nos bancos de genoma. Essas lipases esto divididas em duas famlias; uma famlia contm cinco carboxilesterases/lipases do tipo B (descritas como Lip1 e Lip3) originrias de Candida rugosa e Geotrichum candidum; e a outra famlia contm 16 lipases triacilglicerol (Lip2), que so de Thermomyces lanuginosus e Rhizomucor miehei (PIGNEDE et al., 2000; MINGRUI et al., 2007). A levedura Yarrowia lipolytica utiliza triglicerdeos como fonte de carbono e produz muitas lipases, intracelulares e extracelulares. A lipase extracelular (YlLip2) responsvel pelo aumento da atividade extracelular de muitas lipases. Essa lipase originria de Y.lipolytica apresenta alta atividade em reaes de hidrlise, esterificaes e transesterificaes. Assim sendo, YlLip2 usada para catalisar a sntese de metil steres de triglicerdeos e cidos graxos livres, e em vrias outras reaes qumicas importantes para a indstria farmacutica. Para a expresso de lipases, a levedura metilotrfica Pichia pastoris, considerada um excelente hospedeiro de protenas e lipases. Algumas lipases microbianas tm sido expressas com sucesso em P. pastoris - Candida rugosa lipase I, Rhizopus oryzae lipase, Candida antarctica lipase B, C.parapsilosis lipase, Yarrowia lipolytica, lip7 e lip8 (PIGNEDE & NICAUD et al., 2000; MINGRUI et al., 2007). MINGRUI et al. (2007) estudaram a expresso heterloga do gene Lip2 em Pichia pastoris com o objetivo de produzir, purificar e caracterizar a lipase do recombinante YlLip2. A produo da lipase foi de 12,500 U/ml (ou 0.63 g/l-concentrao de lipase) no sobrenandante, a temperatura e o pH timos foram de 40C e 8.0, respectivamente. A lipase apresentou uma alta atividade para cidos graxos de cadeia longa ster metil. O recombinante YlLip2 apresentou uma caracterizao similar com a lipase selvagem de Y.lipolytica. A lipase B de Candida antarctica (CALB) uma das enzimas mais utilizadas em biocatlises devido sua versatilidade, apresenta uma elevada seletividade de substrato. Atua com sucesso em inmeras reaes - produo de biodiesel, solvente orgnico, resolues cinticas e reaes de esterificao. Curiosamente, no apresenta as seqncias homlogas significativas de aminocidos de outras lipases (seqncia consenso GXSXG), encontrada em todas lipases microbianas e de mamferos. disponibilizada comercialmente pelas indstrias 23

farmacuticas (Novozymes A/S e Roche Molecular Biochemicals) com um alto custo (MICHIKO et al., 2007; TAKANORI et al., 2007). MICHIKO et al. (2007) propuseram preparar CALB de forma adequada e a um menor custo. Para tanto, foi construdo o mutante (mCALB), e um sistema de exposio molecular para aumentar a atividade enzimtica na superfcie da clula da levedura. Aps a construo do recombinante, as propriedades de mCALB foram determinadas e comparadas com as de Rhizopus oryzae lipase (ROL). Os resultados obtidos mostraram que a atividade de mCALB permaneceu inalterada at 30C e diminuiu gradualmente com o aumento da temperatura. Entretanto, mCALB apresentou uma atividade residual de 35% na temperatura de 70C. As temperaturas para atividade residual de 50% foram de 60 e 44C, para mCALB e ROL, respectivamente. Esse resultado sugeriu que a superfcie da clula tem maior estabilidade trmica, devido possivelmente estrutura rgida de CALB que tambm deve contribuir para a especificidade de substratos - cidos graxos de cadeias pequenas - uma vez que os cidos graxos de cadeia longa no conseguem se ligar ao stio-substrato. O sistema preparado poderia ser utilizado com eficcia em meios aquosos e em solventes orgnicos. As diversas enzimas com atividade lipoltica conferem diferentes sabores aos queijos durante a sua produo. Muitas destas enzimas so produzidas pelas leveduras presentes no leite. Leveduras do gnero Trichosporon so frequentemente isoladas de leite e derivados e algumas espcies deste gnero tm sido usadas para isolamento e produo de lipases. SANTOS et al. (2007) isolaram de queijo coalho a levedura Trichosporum spp., produtora de lipase e realizaram a extrao enzimtica pelo sistema bifsico aquoso. A levedura produziu 7,3 U/mL (59,3 U/g) aps 72h de cultivo. A atividade tima da lipase foi a pH 7.0-8.0 e a temperatura tima entre 45-50C. A extrao pelo sistema bifsico aquoso (ATPS) e com o sistema polietileno glicol (PEG)-sais de fosfato apresentou 99,8% de recuperao da atividade enzimtica.

3.3.2 Proteinases
As enzimas proteolticas esto entre as mais importantes enzimas utilizadas pela indstria. A principal utilizao de proteases livres est na limpeza seca, no processamento e amaciamento de carne, couro e pele, na recuperao da prata de pelculas fotogrficas, em tratamentos mdicos digestivos e em determinados tratamentos de inflamao de feridas. So vastamente exploradas pelas indstrias de panificao, processos industriais e biotecnolgicos, incluindo o processamento de bebidas e frutas e ainda participam da

24

composio de detergentes nas indstrias de papel. Nos ltimos anos a produo de proteases tem sido amplamente estudada devido s suas implicaes em bebidas, principalmente na indstria de vinhos. O uso dessas enzimas corresponde a 40% do mercado mundial de biocatalizadores avaliado em um bilho de dlares (NORTH, 1982; OGRYZIAK, 1993; STEELE & STOWERS, 1991; TRINDADE, 2001; SILVA NEVES et al., 2006). A presena de proteinases nos substratos naturais pode disponibilizar o nitrognio de forma mais assimilvel para as leveduras de toda comunidade. Regularmente, as fontes mais conhecidas de proteinases naturais so os animais, vegetais, bactrias e as leveduras, e as ltimas esto sendo relatadas como uma significante fonte de proteinases, tanto para aplicao nos processos industriais tais como a estabilizao de cervejas e vinhos. As leveduras so bastante utilizadas na indstria porque a maioria das espcies no apresenta caractersticas patognicas (NORTH, 1982; BILISNSKI, 1982; ROSS, 1990; OGRYDZIAK, 1993 TRINDADE, 2001; SILVA NEVES et al., 2006). Os estudos sobre as atividades das proteinases iniciaram-se em 1972 por KAMADA et al., nesse estudo os autores comprovaram a importncia do pH de cultivo para a atividade enzimtica. Em 1979, FODA et al. (citado por TRINDADE, 2001) selecionaram leveduras em placas contendo casena ou gelatina em pH 4,5 e 8,0. Espcies como Endomycopsis fibuliger, Metschinikowia pulcherrima e Candida parapsilosis apresentaram as maiores atividades proteolticas (citado por TRINDADE, 2001). A produo de proteases uma caracterstica comum entre as leveduras basidiomicticas. No entanto, a atividade proteoltica tanto encontrada em leveduras ascomicticas quanto basidiomicticas. So considerados como os principais gneros produtores de proteases: Candida, Cryptococcus, Debaromyces, Endomycopsis, Pichia, Rhodotorula, Trichosporon e Yarrowia (AHEARN, 1968; OGRYDZIAK, 1993; ABRANCHES et al., 1997; citados por TRINDADE, 2001). ABRANCHES et al. (1997) estudaram a atividade proteoltica de leveduras isoladas de cactos, da gua de bromlias, flores de Ipomea e frutos Amap e associadas com Drosophila de floresta tropical. As espcies foram selecionadas pela capacidade de hidrolisar casena, gelatina e albumina. Os resultados obtidos mostraram uma freqncia de atividade proteoltica elevada em todos os substratos, e como anteriormente registrado na literatura, as mais altas atividades proteolticas foram observadas em leveduras basidiomicticas. BRAGA et al. (1998) analisaram leveduras isoladas do fruto Amap e associadas com Drosophila visitantes do substrato. A produo de proteinases abrangeu 30% das espcies, como Candida parapsilosis. C. krusei, C.sorbosa, C. valida e C. sorboxylosa. 25

BUZZINI et al. (2002) estudaram 196 leveduras isoladas (ascomicetos e basidiomicetos) de solo, gua, insetos, materiais associados s plantas, todos coletados em ambientes naturais de florestas tropicais do Brasil (Tijuca, Serra Capivari e Pau de Fome), quanto produo ou atividade de lipases, amilases, esterases, proteases, pectinases, quitinases e celulases. Aproximadamente um tero dos basidiomicetos apresentaram atividade proteoltica (casena), esta caracterstica foi expressa exclusivamente por Cryptococcus sp. e Pseudozyma sp. A espcie Pseudozyma antartica apresentou grande habilidade caseinoltica. E todas as espcies caseinolticas de basidiomicetos tambm foram capazes de hidrolisar a gelatina. Entre os basidiomicetos a produo de proteases uma caracterstica essencialmente expressa por espcies de Pseudozyma sp. TAKAKI et al. (2002) verificaram a produo de proteases extracelulares por Mucor circinelloides na presena de D-glicose como substrato. O interesse pela ordem Mucorales se deve ao fato de que algumas espcies tm sido reportadas como notveis produtoras de proteases. ALVES et al. (2002) observaram que 56 isolados do gnero Mucor obtidos de fezes de herbvoros, totalizando 11 txons, foram capazes de produzir enzimas, amilases, lipases, poligalacturonase e proteases. Dos isolados 82% foram capazes de produzir proteases. PERALTA et al. (2005) estudaram a produo de enzimas hidrolticas (principalmente proteases e lipases) pelo fungo fitopatognico Myrothecium verrucaria em diversos substratos. O fungo demonstrou habilidade de produzir diferentes depolimerases e glicosidases, sendo xilanases, pectinases e proteases as mais importantes. A atividade proteoltica foi detectada em todas as culturas e ativa em ampla faixa de pH, de 3,5 a 11,0, e otimamente ativas a 40C, estveis por vrias horas e em temperaturas superiores. A importncia dessas enzimas hidrolticas devido ao seu envolvimento na invaso tecidual do fungo nos vegetais. A protease identificada apresentou caracterstica alcalina, com atividade tima em meio alcalino e as outras enzimas mostram-se ativas em condies cidas. Provavelmente, em decorrncia dos altos nveis de produo de enzimas, os autores sugeriram que as vrias enzimas hidrolticas secretadas pelos fungos esto relacionadas ao sinergismo e a degradao de vrios componentes vegetais, assim as enzimas hidrolticas de M.verrucaria esto envolvidas nos mecanismos de fitopatogenicidade. SILVA NEVES et al. (2006) estudaram 50 leveduras isoladas a partir de diferentes substratos da Regio Amaznica e selecionaram uma espcie de maior atividade proteoltica. Foram analisadas amostras de leveduras pertencentes aos gneros: Saccharomyces, Rhodotorula, Trichosporum, Candida, Cryptococcus, Lipomyces, Dekkera, Pichia e Hansenula. Entre estes gneros, as espcies de maior freqncia foram Candida aquatica 26

(12%) e Candida tropicalis (10%). Nas anlises quantitativa e qualitativa, a maioria das leveduras produziu proteases, entre estas Candida intermedia foi a espcie que expressou maior atividade proteoltica, 356 U/mL. A levedura no apresentou patogenicidade, a temperatura tima para maior produo de protease foi de 30C, com inculo equivalente a 3% do volume do meio e foi obtido de cultura estoque com 24 horas de crescimento. Os resultados obtidos pelos autores corroboram com outros autores de que o rendimento enzimtico diretamente influenciado pela concentrao e idade do inculo, composio do meio, temperatura, o perodo de incubao e a capacidade de germinao dos esporos.

3.3.3 Pectinases
A pectina o maior constituinte da parede das clulas vegetais e composta de um complexo de heteropolissacardeos. As substncias pcticas so ubquas no Reino Vegetal e so isoladas de fungos filamentosos, bactrias e plantas. As enzimas que degradam essas substncias so as pectinases. Dependendo do seu modo de ao so classificadas em pectinesterases e depolimerases. Na ao das pectinesterases h remoo de resduos metxi e desesterificao da pectina, enquanto que na despolimerizao, enzimas como as poligalacturonases (hidrolases) e liases, clivam as ligaes glicosdicas por -eliminao. As pectinases disponveis comercialmente so produzidas por fungos micelianos, como o Aspergillus e Penicillium. Os estudos com leveduras produtoras de pectinases so recentes e estas so consideradas relevantes para vrias indstrias (MARGESIN et al., 2005). Vrias espcies de leveduras tm sido descritas como produtoras de pectinases: Candida tropicalis, C. novergensis, Saccharomyces chevalieri, Torulopsis candida, Candida macedoniensis, Cryptococcus albidus, Kluyveromyces marxianus, S. cerevisiae, Geotricum lactis, Aureobasidium pullulans, K. lactis, Rhodotorula rubra (TRINDADE, 2001). As pectinases so amplamente utilizadas na indstria e na biotecnologia. Na indstria txtil utilizada para diminuir a viscosidade das fibras; na de alimentos, para melhorar a extrao de substncias pcticas de frutas e vegetais processados, concentrar e clarificar sucos de frutas e mostos de uva. Tambm so utilizadas nos processos de fermentao das sementes de cacau para produo de chocolate e extrao de leos vegetais, para obteno de aromatizantes e pigmentos extrados de vegetais, preparao de fibras celulsicas, fermentaes de caf e chs. Recentemente, as pectinases (tanto as de origem bacteriana quanto as produzidas por leveduras) tm sido testadas para remover resduos de substncias pcticas presentes na gua residual das indstrias alimentcias, diminuindo a carga poluidora e 27

apresentando-se como um tratamento ambiental alternativo e de baixo custo (MURAD & FODA, 1992 citados por TRINDADE, 2001; MARGESIN et al., 2005; CHADHA et al., 2005; LALUCE, et al., 2006). As leveduras e os fungos filamentosos so os principais responsveis pela deteriorao de produtos ctricos. Entretanto, algumas poucas linhagens de Saccharomyces sensu stricto demonstram habilidade de catalisar a despolimerizao de pectinas bem como clarificar sucos de frutas. Porm, Saccharomyces cerevisiae e Pichia membranifaciens so as leveduras responsveis e predominantes durante a fermentao da semente do cacau, rica em pectinas (LALUCE, et al., 2006). A produo de pectinases por S. cerevisiae no induzida por pectina, cido poligalacturnico ou cido galacturnico, mas regulada por monossacardeos e por oxignio disponvel no meio. E a secreo de poligalacturonase induzida por galactose e reprimida por glicose. Leveduras como Kluyveromyces, Saccharomycopsis e Saccharomyces, so descritas como produtoras de pectinases, principalmente poligalacturonase, com o crescimento da linhagem na ausncia de agitao. Isto sugere que os nveis do oxignio dissolvido no meio regulam a secreo da atividade de poligalacturonase (BLANCO et al., 1999, citados por LALUCE et al., 2006). Substncias como o (NH4)2SO4 (sulfato de amnio), o extrato de leveduras e a temperatura tima de 50C, foram relatados como indutores da sntese de pectinases (SAPUNOVA, et al., 2005, citados por CHADHA et al., 2005). Algumas espcies de leveduras no crescem em temperaturas entre 25 e 45C: Bullera huianensis, B. hannae, Candida psychrophila, Cryptococcus aquaticus, Cryptococcus consortionis, Cryptococcus friedmanii, Fellomyces horovitziae, Leucosporidium antarcticum, Makria frigida, Sporobolomyces coprosmicota, S. dracophylli, S. ruber, Tausomia pamirica e Udeniomyces puniceus (ROSA et al., 2006). H uma variedade de bactrias descritas como produtoras de enzimas frio-ativas, porm existem poucas informaes sobre as leveduras adaptadas ao frio e produtoras de enzimas frio-ativas As enzimas frio-ativas so caracterizadas pela elevada eficincia cataltica em baixas e moderadas temperaturas, e as enzimas mesfilas homlogas so menos ou no ativos em baixas temperaturas, alm de serem termolbeis. As enzimas ativas em baixa temperatura so promissoras para a pesquisa bsica, para os processos de biodegradao e produo de enzimas (MAGESIN et al., 2005). Recentemente, as pectinases frio-ativas produzidas pela levedura Mrakia frigida e por outras psicrfilas tem sido caracterizadas. SCORZETTI et al. (2000) identificaram uma espcie nova de levedura, Cryptococcus adeliensis sp isolada em Terr Adlie, na Antarctica, produtora de uma enzima frio-ativa, a xilanase. NAKAGAWA et al. (2004) isolaram de 28

solos algumas linhagens de leveduras psicrfilas, Cryptococcus cylindricus e Mrakia frigida. Essas linhagens cresceram com pectina como nica fonte de carbono, em temperaturas inferiores a 5C e apresentaram excelente atividade pectinoltica. H poucas espcies conhecidas do gnero Mrakia (M. frigida M. gelida M. nivalis M. stokesii M. curviuscula) e todas so classificadas como psicotrficas ou psicrfilas, e isoladas de ambientes de baixas temperaturas. XIN et al. (2007) classificaram a espcie nova, Mrakia psychrophila, que foi isolada de amostras de solos na Pennsula de Fildes, Antarctica, e apresentou limites de crescimento entre 10-18C (SCORZETTI et al., 2000; NAKAGAWA et al., 2004 citados por XIN et al., 2007). A levedura Mrakia frigida, primeiramente foi isolada de solos ou sedimentos, alimentos congelados e excrementos de insetos. A atividade de pectato-liases ainda no tinha sido observada, at o estudo de MAGESIN et al. (2005), no qual foram descritas a produo de pectinases alcalinas por esta levedura. Estes autores estudaram duas linhagens da levedura psicrfila Mrakia frigida, isoladas de regies remotas e geladas (Alpes e norte da Sibria) ambas so produtoras de pectato-liases. O estudo comparou as condies timas exigidas para produo de pectato liase pelas duas linhagens da levedura psicrfila, em relao a leveduras mesfilas, produtoras da mesma enzima. A enzima pectato-liase aparentemente possui como temperatura tima 30C e pH 8,5-9,0. Mesmo sendo considerada termolbil, apresentou resistncia a repetidos congelamentos e descongelamentos. A levedura Mrakia frigida apresentou produo mxima da enzima entre 1-5C e em pH neutro, condio raramente descrita, o que reflete como permanente e natural o habitat dessa espcie. CHADHA et al. (2005) atravs da triagem de 120 cepas de fungos isolaram uma cepa capaz de produzir tanto pectinase quanto poligalacturonase. A cepa foi identificada como Aspergillus fumigatus Fres. MTCC 4163. Os autores obtiveram, empregando o cultivo em meio slido, os nveis timos das variveis para a produo de pectinase e de poligalacturonase. Os nveis mximos de atividade enzimtica foram obtidos quando a cultura era realizada em meio contendo farelo de trigo, sacarose, extrato de levedura, e sulfato de amnio por 2-3 dias a uma temperatura de 50C. Os melhores resultados, ou seja, com a atividade mxima de pectinase (1116 Ug-1) e de poligalacturonase (1270 Ug-1) foram obtidas em pH 4,0 e 5,0, respectivamente. LALUCE et al. (2006) estudaram leveduras pectinolticas isoladas de seis reatores de lcool no estado de So Paulo-SP, Brasil. O objetivo era a insero destes isolados nos processos industriais de produo de lcool, para converso de citro-molases em etanol. Os resultados obtidos demonstraram que os isolados apresentaram maior atividade pectinoltica 29

no final do processo fermentativo de citro-molases e que a liquefao de cido poligalacturnico era regulada por glicose, mas no por galactose.A vantagem de enzimas pectinolticas produzidas por leveduras em relao aos fungos micelianos, que estas no apresentariam caractersticas indesejveis para a indstria de sucos, como a turvao, apresentadas pelas enzimas produzidas pelos fungos micelianos.

3.3.4 -glicosidase
Os terpenos so os compostos responsveis pela variedade de aromas de muitas frutas e dos produtos da sua fermentao (sucos e vinho). Entre os terpenos, os monoterpenis (linalol, nerol, geraniol, -terpinol e citronelol) so capazes de liberar substncias que so precursoras do aroma. Esses compostos aromticos, presentes na maioria das frutas, so liberados durante a maturao do fruto pela ao de enzimas endgenas designadas glicosidases. uma das enzimas do complexo celuloltico, produzida por fungos micelianos e leveduras, ligada aos glicosdios, dos quais so liberados pela ao das -glicosidases. Muitas bactrias, fungos e leveduras produzem a enzima -glicosidase. Bactrias como Brettanomyces bruxellensis, Oenococcus oeni e Clostridium thermocellum, os fungos Aspergillus oryzae, Fusarium oxysporum, Trichoderma reesei e as leveduras, Candida peltata C.curvata, C.molichiana, C.pelliculosa, C.wickerhamii, C.cacaoi, Debaromyces hansenii, D. plymorphus, Kluyveromyces fragilis, Kloeckera apiculata, Hansenula anomala e Saccharomyces cerevisiae (PATIL et al., 2005). As -glicosidases originadas de plantas e de fungos no so ativas em pH 3-4 e so inibidas por concentrao de glicose acima de 1%. Entretanto algumas leveduras (Candida molischiana, C. wickeramii e Saccharomyces cerevisiae) so menos sensveis glicose, apresentam maior estabilidade em meio com altas concentraes e em pH entre 3-4, caractersticas no apresentadas pelas enzimas produzidas pelas plantas (RICCIO et al., 1999). A aplicao das -glicosidases ocorre principalmente na indstria de vinhos, sucos, bebidas alcolicas, promovendo o melhoramento das caractersticas organolpticas do produto. Tambm so teis para melhorar as condies de armazenamento dos vinhos e sucos, pois impedem a formao de depsitos nos garrafes. Na indstria txtil e de papel so utilizadas para amaciar e clarificar as fibras. As -glicosidases possuem a habilidade de hidrolisar a celobiose (subproduto da quebra da glicose) em duas molculas de glicose (RICCIO et al., 1999). 30

GUNATA et al. (1990) avaliaram as -glicosidases produzidas por Candida molichiana e C. wickerhamii e compararam seu desempenho durante a hidrlise de monoterpenos glicosdicos de uva com a das enzimas usadas na indstria de vinhos. Estes autores concluram que tanto as enzimas produzidas por C. molichiana e por C. wickerhamii poderiam ser utilizadas na indstria devido ao pH timo e alta estabilidade. Estudos com Debaromyces hansenii demonstraram que a levedura produz a enzima extracelularmente, de forma constitutiva e no reprimida pela glicose. A atividade enzimtica no inibida pela concentrao de etanol e glicose e nem influenciada pelo pH cido e por baixas temperaturas. RICCIO et al. (1999) extraram e imobilizaram duas glicosidases liberadas por D. hansenii. Na caracterizao das duas isoformas da enzima, foram obtidas atividades similares, porm apresentaram diferentes massas moleculares. As isoformas no foram separadas durante o processo de purificao, os autores sugerem que poderiam ser utilizadas para realarem o aroma de sucos de fruta e do vinho.

3.3.5 -galactosidase
A -galactosidase ou -D-galactosdeo-galactohidrolase ou ainda lactase uma enzima que hidrolisa a lactose do leite e do soro do leite. Ela catalisa a reao da lactose para formar glicose e galactose alm de enriquecer o produto hidrolisado com galactoligossacardeos. A lactase encontrada em animais, plantas, bactrias, fungos e leveduras. Porm as mais utilizadas so as originrias de leveduras e fungos, as espcies produtoras mais importantes so: Kluyveromyces fragilis, Aspergillus niger e Aspergillus oryzae. muito utilizada na tecnologia de laticnios e nos produtos industrializados que contem lactose. Possuem diversas aplicaes, como na remoo de cristais de lactose na indstria de lacticnio (os monossacardeos derivados da hidrlise da lactose so solveis e previnem a cristalizao de resduos), na produo de creme, suprimentos alimentcios para animais, produtos fermentados e na obteno de um produto ao qual foi eliminada a lactose, caracterstica desejvel para os consumidores que apresentam intolerncia lactose. Nos ltimos anos, sua importncia foi realada por sua atividade de galactosiltransferase, responsvel pela sntese de oligossacardeos transgalactosilados (TOS), que atuam como alimentos funcionais (CRUZ, 1999). As solues com altas concentraes de glicose, quando evaporadas e submetidas a galactosidases de microrganismos, sofrem a reao de transgalactosilao, produzindo uma

31

mistura de oligossacardeos transglicosilados (TOS). As dietas ricas em TOS favorecem o crescimento de Bifidobacterium, Lactobacillus e algumas espcies de Streptococcus, com conseqente decrscimo da concentrao de bactrias putrefativas do intestino de humanos e de outros animais, portanto possuem propriedades probiticas. Aumentam a absoro de Ca2+ e diminuem o colesterol no sangue. Tambm so utilizados na substituio por acares, sendo amplamente usadas em aditivos e alimentos infantis. So aplicados na produo de doces, tortas, pes, devido a sua estabilidade em alta temperatura (CRUZ et al.,1999; FRANCO et al., 1999). A enzima formada intracelularmente por leveduras e bactrias, e secretadas por fungos. Alguns microrganismos importantes, sob o ponto de vista clnico-mdico, como Aspergillus oryzae, Kluyveromyces fragilis, K.lactis, Neurospora, E.coli, Saccharomyces lactis, Bacillus circulans, Scopulariopsis sp. e Erwinia aroidea tem sido relatados como produtores de -galactosidases (FRANCO et al., 1999). CRUZ et al. (1999) descreveram a atividade hidroltica e de transgalactosilase, a purificao parcial e as propriedades de uma -galactosidase liberada por Penicillium simplicissimum. A linhagem isolada de solo apresentou grande produtividade da galactosidase com atividade galactosiltransferase, quando crescida em meio slido. O pH timo para hidrlise foi observado entre 4-6 e para atividade de galactosiltransferase, o pH ideal foi entre 6.0-7.0; as temperaturas timas para hidrlise e transferase foram de 55-60C e 50C, respectivamente. Os autores sugeriram que a enzima apresenta potencialidade para diversas aplicaes industriais como, remoo da lactose do leite e da lactose do soro de leite, converso da lactose em seus monossacardeos componentes.

3.4

Toxinas killer ou Leveduras micocinognicas

As micocinas ou toxinas killer so protenas ou glicoprotenas extracelulares

produzidas por leveduras e letais para linhagens da mesma levedura e para outras espcies. Normalmente, as micocinas contm um componente protico, apresentam atividade tima em pH cido (entre 3-6, com o timo entre 4-5) e so inativas em temperaturas superiores a 35C. So mais estveis em meios de cultura slidos e a agitao provoca sua inativao. A sua produo ocorre principalmente na fase exponencial das clulas e com condies satisfatrias de nutrientes e pH adequado. Possuem atividade antifngica e so inativas ou pouco ativas diante de bactrias e protozorios (VITAL et al., 2002).

32

O fenmeno killer foi primeiramente descrito em Saccharomyces cerevisiae por BEVAN e MAKOVER em 1963. Em 1978, YOUNG e YAGIU descreveram 11 sistemas distintos de leveduras micocinognicas, K1 a K11, sendo que os sistemas K1 a K3 so especficos de S. cerevisiae e K4 a K11 esto presentes em outros gneros. Desde ento, as pesquisas relacionadas ao tema crescem e se diversificam. Estudos abrangem desde o detalhamento das caractersticas moleculares das vrias toxinas killer ou micocinas (designao atual) j descritas, sua fisiologia, modo de ao, determinantes genticos responsveis pela produo, construo de hbridos, perspectiva de desenvolvimento de vacinas, antifngicos, etc. So utilizadas como modelo eucarioto para elucidao do processamento e secreo de protenas extracelulares, como ferramentas moleculares, principalmente para engenharia gentica, na construo de plasmdios e na expresso de protenas (MAGLIANI et al., 1997; SOARES et al., 1999; LOWERS et al., 2000; VITAL et al., 2002). Inicialmente, os primeiros estudos relatavam a produo de toxinas killer por Saccharomyces cerevisiae, e posteriormente vrios gneros e espcies foram identificadas com o fenmeno killer. A atividade micocinognica tem sido detectada em aproximadamente 80 espcies distribudas em 20 gneros de ascomicetos e basidiomicetos. Muitas leveduras micocinognicas pertencem aos gneros Candida, Cryptococcus, Cystofilobasidium, Debaryomyces, Filobasidium, Hansenula, Hanseniaspora, Kloeckera, Kluyveromyces, Metschinikowia, Pichia, Rhodotorula, Saccharomyces, Sporodiolobus, Torulopsis, Williopsis e Zygosaccharomyces. A atividade micocinognica tem sido detectada em vrias leveduras isoladas do ambiente - frutos, exsudatos e estruturas de plantas, mas raramente de solos (VITAL et al., 2002). As micocinas diferem entre as espcies ou linhagens produtoras, demonstrando uma diversidade de caractersticas quanto estrutura dos genes, tamanho da molcula e imunidade. Os mecanismos de reconhecimento e a sensibilidade das clulas s toxinas diferem para cada tipo de toxina. Vrios estudos demonstraram a atividade diante de outras leveduras e muitos estudos revelaram que as aes no se restringem s espcies de leveduras, mas a uma variedade de eucariotos e procariotos. Acredita-se que esse fenmeno natural seja um mecanismo de competio por interferncia ou amensalismo, com produo de compostos txicos, que diminuiriam o tamanho da populao competidora por nutrientes em um dado nicho. E o mais relevante foi a descoberta de que microrganismos de interesse clnico, como Candida albicans, C.glabrata, Pneumocystis carinii e Mycobacterium tuberculosis so susceptveis s toxinas killer (MAGLIANI et al., 1997; LOWERS et al., 2000). 33

As aplicaes das micocinas so variadas. Na indstria de fermentaes, esto sendo aplicadas no incio dos processos de fermentao alcolica (transformao de acares a etanol), na fermentao maloltica e na produo de compostos que influenciam as condies e caractersticas organolpticas dos vinhos, no controle do crescimento de leveduras deteriorantes em alimentos na indstria de fermentao. A ocorrncia de leveduras killer em fermentaes espontneas de vinho tem sido estudada e encontrada em 88% dos processos de fermentao. Atuam inibindo leveduras indesejveis, impedem a refermentao no estgio final, inibem a microbiota indgena, influencia nos parmetros ambientais - temperatura, oxigenao, pH, e particularmente o antagonismo microbiano (MAGLIANI et al., 1997; SOARES et al., 1999; LOWERS et al., 2000; TRINDADE, 2001; VITAL et al., 2002). Hbridos de leveduras foram construdos com a funo de maximizar a atividade killer diante de leveduras indesejveis no processo fermentativo da uva (COMITINI et al., 2004). Anticorpos derivados da toxina killer de Pichia anomala tm sido exaustivamente estudados e h perspectivas de desenvolvimento de vacinas e antifngicos. Pichia anomala, Pichia guilliermondii, e S. cerevisiae tem sido usadas no biocontrole de crescimento de fungos, e na rea mdica, na biotipagem de leveduras patognicas para diagnsticos, e ainda existem perspectivas de que as micocinas possam ser utilizadas na profilaxia de doenas fngicas (COMITINI et al., 2004; MANFRED et al., 2006). GANTER et al. (1992) demonstraram o espectro de ao de leveduras micocinognicas em um ambiente. Os estudos de reatividade cruzada entre leveduras micocinognicas e sensveis de vrias comunidades demonstraram que uma nica linhagem pode ser capaz de eliminar mais leveduras de outras comunidades, do que as linhagens isoladas da prpria comunidade. O espectro de ao de uma levedura micocinognica em particular pode ser maior do que a freqncia do fenmeno killer dentro da comunidade. Esses dados sugerem que algum tipo de adaptao dentro da comunidade pode interferir na distribuio das linhagens micocinognicas nos substratos naturais e sustentam a possibilidade das comunidades possurem mecanismos de defesa e equilbrio. SOARES et al. (1999) caracterizaram o espectro da atividade killer de Saccharomyces cerevisiae Y500-4L. A levedura de alta capacidade fermentativa selecionada de mosto de fermentao de usina de lcool mostrou alta atividade killer contra leveduras comerciais Fleischmann e Itaiquara e tambm contra linhagens padres K2, K4 e K11 (S.diasticus NCYC 713, Candida glabrata NCYC 388, Torulopsis glabrata ATCC 15126, respectivamente). A levedura foi sensvel s toxinas produzidas por leveduras padres killer K8, K9, K10 e K11(Hansenula anomala NCYC 435, H.mrakii NCYC 500, Kluyveromyces drosophilarum 34

NCYC 575, Torulopsis glabrata, ATCC 15126, respectivamente). A linhagem S.cerevisiae Y500-4L no apresentou plasmdio e provavelmente o fentipo killer codificado por genes cromossomais. LOWERS et al. (2000) descreveram a construo de um gene da micocina HMK, produzido por Williopsis mrakii, e examinaram a expresso desse gene em um hospedeiro heterlogo, Aspergillus niger. A partir do desenvolvimento e purificao parcial da toxina HMK, a toxinas foram testadas. Foram comparados os efeitos da micocina nativa e da heterloga e em leveduras deteriorantes de silagem e iogurtes. A toxina exibe uma alta estabilidade trmica, alta estabilidade de pH, e amplo espectro de atividade diante de outras leveduras. A micocina heterloga foi ativa em vrias temperaturas, no sendo detectada resistncia de leveduras. Assim, a micocina HMK poderia ser usada para controle de leveduras que causam a deteriorao da silagem e de iogurtes. VITAL et al. (2002) investigaram a capacidade micocinognica de leveduras isoladas de solos da Estao Ecolgica de Marac, na regio Amaznica, Roraima-Brasil, de produzirem e excretarem toxinas letais a cepas sensveis de leveduras. Foram isoladas 240 linhagens de amostras de solos, entre as quais 82% de leveduras ascomicticas e 18% de basidiomicticas. Foram dominantes, Candida etchellsii, C. famata, C. robusta, C.rugosa, C.valida, Debaromyces hansenii, Cryptococcus albidus, C. laurentii, Rhodotorula glutinis, Rhodotorula minuta e Rhodotorula mucilaginosa. Seis linhagens foram capazes de produzir micocinas: Issatchenkia sp, Saccharomyces exiguus, Williopsis saturnus var. subsufficiens e trs linhagens de W. saturnus foram produtoras de micocinas diferentes. H poucos estudos de leveduras micocinognicas em solos, porm os autores sugerem que diante da pequena poro da amostragem e da relativa diversidade de leveduras encontrada, h grande possibilidade de que outros estudos revelem novas espcies de leveduras e leveduras micocinognicas. COMITINI et al. (2004) demonstraram que Kluyveromyces phaffii produz uma toxina killer (KpKt) que ativa contra leveduras que deterioram vinhos. A micocina KpKt ativa contra Hansenispora e Kloeckera, contaminantes do processo de produo do vinho, e inibe a deteriorao por leveduras no estgio pr-fermentativo. Permite a substituio de SO2 como antimicrobiano no mosto, portanto, atua como agente antisptico, no possui ao txica para humanos, podendo tambm ser adicionado ao final do processo como agente antioxidante. A micocina KpKt ativa contra Saccharomycodes ludwigii, Zygosaccharomyces bailii e Zygosaccharomyces rouxii. A protena foi purificada e o seu mecanismo est sendo

35

investigado. A micocina KpKt poderia ser utilizada tanto na indstria de vinhos quanto em outras indstrias de bebidas. MANFRED et al. (2006) revisaram a biologia bsica de leveduras killer e da associao destas com os vrus para codificar as toxinas. Os estudos recentes concentram-se no processamento, na maturao e na toxicicidade intracelular das micocinas. Tambm tem sido explorada, a estratgia de S. cerevisiae de se associar com vrus dsRNA e produzir as toxinas virais para penetrar eficazmente e inibir outros microrganismos. Em S. cerevisiae o fentipo ocorre a partir de uma infeco com os vrus citoplasmtico dsRNA da famlia Totiviridae. A freqncia das linhagens micocinognicas isoladas dos ambientes naturais varia entre os microhabitats, porm maior do que aquela encontrada entre os isolados de colees de culturas. Tm uma ampla distribuio geogrfica em diversos microhabitats, embora representem uma parcela relativamente pequena das comunidades de leveduras. Os estudos de leveduras tropicais poderiam levar alm da descoberta de novas espcies, tambm de novas leveduras micocinognicas (VITAL et al., 2002).

3.5

Perspectivas de descobertas de novas substncias bioativas de fungos

endofticos e leveduras isoladas de plantas do Cerrado

muito difcil estimar o nmero total de produtos teraputicos que utilizam formulaes originrias de produtos naturais de diversas fontes. Entretanto, acredita-se que entre 25 a 30% das prescries de medicamentos do mundo ocidental contm drogas de origem natural (STROBEL et al., 2004). H um enorme potencial e diversidade de substratos naturais nos ecossistemas tropicais que poderiam ser fonte de compostos bioativos, e vrias pesquisas para descoberta desses compostos tem sido realizadas em fontes naturais de algumas regies do Brasil. A indstria farmacutica utiliza toxinas naturais, como modelos de drogas para o desenvolvimento de seus produtos, com potencialidades farmacolgicas comparveis aos alcalides de plantas ou metablitos secundrios de microrganismos. A ampliao das perspectivas quanto ao desenvolvimento de novos agentes teraputicos e a biodiversidade brasileira fornecem os subsdios para a busca desses antibiticos em outras fontes alm de microrganismos. Com ampliao de pesquisas de biofrmacos, surgiu o termo bioprospeco, que o estudo que visa identificar plantas e endofticos (microrganismos que vivem no inteiro

36

de plantas, sistemicamente, sem causar danos) que possam fornecer substncias bioativas teis para o desenvolvimento de quimioterpicos e outras substncias ativas e igualmente teis em outras reas. Os primeiros estudos do potencial de basidiomicetos como produtores de substncias bioativas iniciaram em 1941 com Anchel, Hervey, Wilkins que avaliaram os extratos de cultura de miclios de mais de 2000 espcies. Esses pesquisadores obtiveram o isolamento e identificao da pleuromutilina, um diterpeno utilizado no tratamento de infeces causadas por micoplasmas em animais, esse estudo foi base para o desenvolvimento do primeiro antibitico comercializado e originado de basidiomicetos (ROSA, 2003). Muitos produtos bioativos originados de fungos endofticos j foram descritos como a criptocina e a criptocandina (substncias ativas contra Candida albicans e Trichophyton spp.), agentes anticancergenos, antidiabticos, compostos imunosupressores (ROSA et al., 2003; STROBEL et al., 2004). Foram realizadas muitas pesquisas relacionadas ao potencial e enorme diversidade dos ambientes tropicais do Brasil, sendo que a maioria dos estudos visa descoberta de compostos bioativos de basidiomicetos. Porm, com a destruio regular de ecossistemas, principalmente das florestas tropicais e do Cerrado brasileiro, muitas espcies endmicas desses biomas desaparecero e concomitantemente uma variedade de microrganismos, entre eles, fungos endofticos e leveduras, que poderiam ser fonte de novos compostos bioativos. O Cerrado brasileiro uma regio vasta e heterognea, com vrios tipos de solos, clima, relevo e altitude, com uma peculiar combinao de condies que possivelmente originaram a vegetao que o caracteriza. A flora do Cerrado considerada a mais rica em diversidade e estima-se que existam 1000 espcies arbreo-arbustivas, com 42% de espcies nativas, 58% oriundas de outras formaes e 11% de espcies que aparecerem em outras formaes vegetais. A biodiversidade do cerrado est estimada em cerca de 1/3 da biota brasileira e 5% da fauna e flora mundiais (POZO et al., 2001). A explorao desse e de outros ecossistemas praticamente inexplorados quanto presena de endofticos, sua biologia e potencial de produo de compostos bioativos teis, poderia levar a descoberta de produtos naturais derivados de metablitos secundrios e ou produzidos por microrganismos, plantas ou animais. Muitos exemplos ilustram o valor e a importncia de produtos naturais derivados de plantas e microrganismos - o taxol, um diterpenide produzido pela planta Taxus brevifolia utilizado no tratamento de cncer mamrio e de tero, produzido pelo fungo endoftico, Taxomyces andreamae, encontrado

37

dentro de Taxus brevifolia) mesmo sendo um composto relativamente recente tem conseguido impactar a medicina (STROBEL et al., 2004). FISHER et al. (1992) pesquisaram 25 fungos isolados dos arbustos Ulex europeus L., (Leguminosae, Faboideae) e U. gallii, popularmente conhecido como tojo e considerado uma planta invasora, e encontraram atividade antibitica em quatro desses isolados. Os isolados de Coniothyrium spp., produziram uma ampla faixa de atividade antibitica em ambos os ensaios. Em nenhum dos ensaios descritos, houve preocupao de se verificar de forma exaustiva a produo de antibiticos pelos isolados endofticos, mas ambos confirmam a hiptese de que os endofticos estariam aptos a competirem com os antagonistas. STROBEL et al. (2004) relataram a importncia dos endofticos como potenciais fontes de novos produtos naturais para explorao da medicina, agricultura e indstria. Para cada representante de planta (aproximadamente 300 000 espcies de plantas de superiores) que existe na Terra, devem existir um ou mais endofticos, sendo que pouqussimas dessas espcies de plantas foi estudada completamente no tocante aos seus endofticos. Consequentemente, a oportunidade de encontrar novos e interessantes microrganismos endofticos nas plantas e em diferentes ecossistemas grande. Segundo STROBEL et al. (2004) so considerados alguns critrios para se tentar isolar novos microrganismos endofticos, j que grande o nmero de espcies de plantas, entre eles: (1) Plantas encontradas um nico ambiente, especialmente aquelas que possuem estratgias novas ou incomuns para sobrevivncia. (2) Plantas que possuem uma histria etnobotnica, que relatada para usos especficos ou para aplicaes de interesse para estudos. (3) Plantas que so endmicas e que apresentam uma peculiar longevidade, e que cresam em reas de grande biodiversidade provavelmente possuem grande nmero de endofticos. Diante disso, plantas distintas ambientalmente devem ser consideradas como fonte de novas espcies de endofticos e de seus compostos, e plantas endmicas devem possuir endofticos especficos que podem ter evoludo com a espcie hospedeira. Ambientes de grande biodiversidade biolgica implica que produtos qumicos so requeridos para sobrevivncia nesses ecossistemas, uma vez que a competio grande, os recursos so limitados e a presso da seleo alta. Assim, existe uma elevada probabilidade que as florestas tropicais e ambientes de grande biodiversidade so fontes de novas estruturas moleculares, de compostos bioativos e de novas espcies de organismos. Alguns fungos endofticos produzem antibiticos e outros compostos bioativos que inibem uma variedade de fitopatgenos, bactrias, fungos, vrus e protozorios que afetam plantas e animais. Esses 38

microrganismos endofticos, em relao s suas aplicaes biotecnolgicas, poderiam ser encontrados no entre os endofticos mais freqentes, mas entre os mais especializados, raros e restritos a certos hospedeiros. A sinalizao quimiotxica aparentemente existente na interao ecolgica entre os endofticos e os hospedeiros sugere que estes endofticos no so meros oportunistas em seus hospedeiros e que houve uma adaptao evolutiva entre eles (STROBEL et al., 2004). Os metablitos secundrios produzidos pelos fungos endofticos pertencem a grupos estruturais diversos, incluindo esterides, xantonas fenis, isocumarinas, quinonas, furanos, terpenides, peptdeos e outros. Alguns metablitos so novos grupos estruturais, como a palmarumicina e o benzopiroano. Atualmente, a proporo de novas estruturas produzidas por endofticos consideravelmente mais alta (51%) do que a produzida pelos isolados do solo (38%), maior fonte de microrganismos produtores de compostos bioativos. Isso demonstra que os endofticos podem ser fontes de novos compostos secundrios, e ainda sugere que possuem um papel na estratgia de sobrevivncia desses endofticos. Os estudos para uso biotecnolgico destes metablitos pela indstria farmacutica, medicina, agroqumica e outras, esto se desenvolvendo, por exemplo, a substncia regulosina, produzida por um endoftico no esporulado, ativa contra uma mariposa (Choristoneura hebenstreitella) considerada uma peste para conferas. Devido proporo elevada de metablitos secundrios bioativos produzidos por fungos endofticos e a produo, in vitro, de metablitos secundrios herbicidas no-especficos pela maioria dos fungos endofticos, eles so considerados uma fonte para a seleo de novos produtos farmacuticos. (SCHULZ et al., 2005).

4-

CONCLUSES

-As leveduras so distribudas nos ambientes ou substratos naturais (solo, plantas, animais, gua e atmosfera). Nas plantas, podem ser encontradas: na superfcie foliar, na seiva, nctar das flores e frutos. Em plantas tropicais predominam basidiomicetos. Os frutos e as flores so as fontes prediletas de leveduras devido ao seu alto teor de acares. As leveduras de flores e frutos so muito diversificadas filogeneticamente e os estudos das comunidades de leveduras associadas em diferentes plantas tm fornecido novas espcies de leveduras. Essas espcies possuem aspectos fisiolgicos bem especializados. A distribuio de leveduras e sua

39

especificidade dependem da composio dos nutrientes disponveis no substrato, da presena de compostos inibidores e de vetores que utilizam esses substratos. -As leveduras tm sido isoladas de uma variedade de ecossistemas aquticos. So relatadas diversas espcies em sedimento, rios, esturios, mangues costeiros, oceanos e no fundo do mar. As basidiomicticas so menos freqentes do que as leveduras ascomicticas nos ambientes aquticos poludos. Predominam as espcies dos gneros Aureobasidium, Candida, Cryptococcus, Pichia, Rhodotorula, Saccharomyces e Trichosporum. Algumas so consideradas como bioindicadores de poluio: Aureobasidium pullulans, Cryptococcus albidus, Cr. laurentii, Debaryomyces hansenii e Rhodotorula mucilaginosa a maioria associada s plantas, solo e fontes orgnicas de poluio. -As leveduras ocorrem em vrios tipos de solo e em diversas reas geogrficas, desde as zonas rticas aos trpicos. Nos solos midos, h maior diversidade de espcies em relao aos solos ridos e nutricionalmente pobres. -A produo de enzimas extracelulares pode influenciar no estabelecimento e manuteno de uma comunidade natural de leveduras. As principais enzimas produzidas por leveduras so lipases, -glucanases, proteases, quitinases e as pectinases; vrias substncias tm sido obtidas das clulas de leveduras, peptdeos, cidos nuclicos, protenas recombinantes, polissacardeos, pigmentos, enzimas, lipdeos, etc. Os principais gneros produtores de enzimas proteolticas: Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Endomycopsis, Pichia, Rhodotorula, Trichosporum e Yarrowia. As principais espcies produtoras de pectinases so: Candida tropicalis, C. novergensis, Saccharomyces chevalieri, Torulopsis candida, Candida macedoniensis, Cryptococcus albidus, Kluyveromyces marxianus, S. cerevisiae, Geotrichum lactis, Aureobasidium pullulans, K. lactis, Rhodotorula rubra. Recentemente, as pectinases frio-ativas produzidas pela levedura Mrakia frigida e por outras psicrfilas tem sido caracterizadas. As leveduras Candida peltata C.curvata, C.molichiana, C.pelliculosa, C.wickerhamii, C.cacaoi, Debaryomyces hansenii, D. plymorphus, Kluyveromyces fragilis, Kloeckera apiculata, Hansenula anomala e Saccharomyces cerevisiae produzem a enzima glicosidase. As principais espcies produtoras de -galactosidases so: Kluyveromyces fragilis, Aspergillus niger e Aspergillus oryzae. Leveduras importantes sob o ponto de vista clnico-mdico, como Aspergillus oryzae, Kluyveromyces fragilis, K.lactis, Neurospora, E.coli, Saccharomyces lactis, Bacillus circulans, Scopulariopsis sp e Erwinia aroidea.

40

-As micocinas produzidas por leveduras sido detectada em aproximadamente 80 espcies distribudas em 20 gneros de ascomicetos e basidiomicetos. Os principais gneros produtores de micocinas: Candida, Cryptococcus, Cystofilobasidium, Debaryomyces, Filobasidium, Hansenula, Hanseniaspora, Kloeckera, Kluyveromyces, Metschinikowia, Pichia, Rhodotorula, Saccharomyces, Sporodiolobus, Torulopsis, Williopsis e Zygosaccharomyces. A atividade micocinognica tem sido detectada em vrias leveduras isoladas do ambiente, frutos, exsudatos e estruturas de plantas, mas raramente de solos. - So muitas as perspectivas de novas substncias bioativas de fungos endofticos e leveduras isoladas de plantas do Cerrado. A flora desse bioma considerada a mais rica em diversidade e estima-se que existam 1000 espcies arbreo-arbustivas, com 42% de espcies nativas, 58% oriundas de outras formaes e 11% de espcies que aparecerem em outras formaes vegetais. Possui inmeras plantas e frutos nativos com altos valores nutricionais e sociais, com vasto potencial de pesquisa cientfica, novos frmacos, descrio de novas espcies de leveduras associadas sua flora endmica pouco preservada. -Muitos produtos bioativos originados de fungos endofticos j foram descritos, a criptocina e a criptocandina (substncias ativas contra Candida albicans e Trichophyton spp.), agentes anticancergenos, antidiabticos, compostos imunosupressores. Os metablitos secundrios produzidos pelos fungos endofticos pertencem a grupos estruturais diversos, incluindo esterides, xantonas, fenis, isocumarinas, quinonas, furanos, terpenides, peptdeos e outros. -Devido o grande potencial dos biomas brasileiros e a crescente aplicabilidade de enzimas extracelulares de origens naturais, substncias bioativas e outros tipos de compostos que podem ser produzidos por leveduras e microrganismos endofticos, torna-se imprescindvel a identificao, caracterizao dos microrganismos isolados desses substratos naturais.

41

5-

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

ABRANCHES, J. MORAIS, P.B.; ROSA,C.A; MENDONA-HAGLER,L.C.;HAGLER, A.N. The incidence of killer activity and extracellular proteases in tropical communities. Can. J. Microbiol., v.43, p.328-336, 1997. ALEXOPOULOS, C. J.; MIMS, C. W.; BLACKWELL, M. Introductory mycology. 4.ed. New York: John Wiley, 869 p., 1996. ALMEIDA, S. P. & AGOSTINI-COSTA, T.S. Frutas Nativas do cerrado: caracterizao fsico-qumica e fonte potencial de nutrientes. In: Cerrado: ambiente e flora. Braslia: Embrapa Cerrados, segunda edio revisada e ampliada. 1994. ALVES, M.H.;TAKAKI-CAMPOS,G.M.;PORTO.A.L.F.;MILANEZ, A.I. Screening of Mucor spp. for the production of amylase, lipase, polygalacturonase and protease. Brazilian Journal of Microbiol. v.33, p.325-330, 2002. BAILLARGEON, M.W., MCCARTHY, S.G. Geotrichum candidum (NRRL Y-553) lipase: purification, characterization and fatty acid specificity. Lipids.v.26, p.831-836, 1991. BARNETT, J.A. Beginnings of microbiology and biochemistry: the contribution of yeast research. Microbiology, v.149 (Pt 3) p.557-567. 2003. BEECH, F.W.; DAVENPORT, R.R. The role of yeasts in cider making. In: Rose, A.H.,Harrison,J.S. (eds), The Yeasts. Academic Press, London, p.73-146, 1970. BISARIA, V.S; GHOSE, T.K. Biodegradation of cellulosic materials: substrates, microorganisms, enzymes and products. Enzyme Micro Technol.v.3, p.90-104, 1981. BHUSHAN, B.; HOONDAL, G.S. Characterization of lipase from an alkalophilic yeast sp. Biotechonol. Lett., v.16, p.837-840,1994. BOTHA, A. Yeast in soil. In: ROSA, C.A. PTER, G.(eds) The Yeast handbook. Biodiversity and Ecophysiology of Yeasts. Sprinter.vol. 1, 1 ed., p.222-240, 2006. BRAGA, A.A.; MORAIS, P.B. Screening of yeasts from Brazilian amazon rain forest for extracellular proteinases production. System.Appl.Microbiol., v.21,p.353-359,1998. 42

BURFORD, E.P. KIERANS, M.; GADD, G.M. Geomycology: fungi in mineral substrata. Mycologist. v.17, p.98-107, 2003. BUZZINI, P.; A.MARTINI. Extracellular enzymatic activity profiles in yeast and yeast-like strains isolated from tropical environments. Journal of Applied Microbiol., v. 93, p.10201025. 2002. CARLILE, M. J.; WATKINSON, S. C. The Fungi. London: Academic Press, 1994. 482 p. CARLOS A. ROSA; MARIA A. RESENDE; FRANCISCO A. R. BARBOSA; PAULA B. MORAIS; SARAH P. FRANZOT. Yeast diversity in a mesotrophic lake n the karstic plateau of Lagoa Santa, MG-Brasil. Hydrobiologia v.308, p.103-108, 1995. CARMO-SOUZA, L.D.O. Distribution of yeast in nature. In: ROSE, A.H.; HARRISON,J.S. (Eds) The Yeasts, biology of yeasts. London: Academic Press London. v.1, p. 79-106, 1969. CARNEIRO, C.D. Seleo de leveduras produtoras de lipase extracelular, produo enzimtica e caracterizao da atividade lipoltica de Wickerhamiella cacticola UFMG-96381 Belo Horizonte: UFMG/ICB, Dissertao Mestrado. 110 p.,2000. CAIRNEY, J.W.G. Basidiomycete mycelia in forest soils: dimensions, dynamics and roles in nutrient distribution. Mycol. Res. Rewiew.v.109 (1), p.7-20, 2005. CHADHA, B.S.; URMILA PHUTELA; VIKRAM DHUNA; SHOBHNA SANDHU. Pectinase and polygalacturonase production by a thermophilic Aspergillus fumigatus isolated from decomposting orange peels. Brazilian Journal of Microbiol. v. 36, p. 63-69, 2005. COMITINI, F.; PIETRO, N.DI.; ZACCHI, L.; MANNAZZU, I.; CIANI, M. Kluyveromyces phaffii killer toxin active against wine spoilage yeasts: purification and characterization. Microbiology, v. 150, p.2535-2541, 2004. CRUZ, R.; DRCDIA-CRUZ,V.; BELOTE, J.G.; KH,; KENAYFES, M.O. Properties of a new fungal -galactosidase with potential application in the dairy industry. Rev. Microbiol, v. 30, p.265-271, 1999. DESTAIN, J.; ROBLAIN, D.; THONART, P. Improvement of lipase production from Yarrowia lipolytica. Biotechnol. Lett., v.19, p.105-107,1997. 43

FISHER, P.J.; PETRINI, O.; LAPPIN SCOTT, H.M. The distribution of some fungal and bacterial endophytes in maize (Zea mays L.). New Phytologist, v.122, p.299-305, 1992. FRANCO,T.T.; SILVA, M.E. Purification of microbial -galactosidase from Kluyveromyces fragilis by bioaffinity partitioning. Rev. Microbiol. v.30, p.324-331, 1999. FREIRE, F.C.O.; OFFORD, L. Bacterial and yeast counts in Brazilian commodities and species. Brazilian Journal of Microbiol. v. 33, p. 145-148, 2002. GADD, G.M.; SAYER, G.M. Fungal transformation of metals and metalloids. In: Lovley, D.R. (ed) Environmental microbe-metal interactions.ASM, Washington, DC.p.237-256, 2000. GOMES, L.H.; ECHEVERRIGARAY, S.; CONTI, J.H. et al. Presence of the yeast Candida tropicalis in figs infected by the fruit fly Zaprionus indianus (Dip.:Drosophilidae). Brazilian Journal of Microbiol. v. 34, p.5-7, 2002. GUNATA, Y.Z.; BAYONOVE, C.L.; ARNAUD, A.; GALZY, P. Hydrolysis of grape monoterpenyl glycosides by Candida molschiana and Candida wickerhamii -glucosidases. J.Sci Food Agric. v.50, P.499-506, 1990. HAGLER, A.N.; MENDONA-HAGLER, L.C.; ROSA, C.A.; MORAIS, P.B.Yeasts an example of microbial diversity. In: ESTEVES, F.S. (Ed.), Brazilian ecossistems. Oecologia Brasiliensis, vol.1: Estrutura, Funcionamento e Manejo de Ecossistemas Brasileiros, p.225244, 1995. HASIMOTO & SOUZA, L.K.; OLIVEIRA, C.M.A.; FERRI, P.H.; SANTOS, S.C.; et al. Antifungal properties of Brazilian Cerrado Plants. Brazilian Journal Microbiol. v.33, p.247249, 2002. HAWKSWORTH, D.L. Fungal diversity and its implications for genetic resource collections. Studies in Mycology.v.50, p.9-18, 2004. HERZBERG, M. B.; LACHANCE, M.A. Candida bombiphila sp nov., a new asexual yeast species in the Wickerhamiella clade. Inter. J. Syst. Evol. Microbiol. v.54, p.1857-1859, 2004. HONG, S.G.; BAE, K.S.; HERZBERG, M. TITZE; LACHANCE, M.A. Candida kunwiensis sp nov., a yeast associated with flowers and bumblebees. Inter. J. Syst. Evol. Microbiol. v.53, p.367-372, 2003 44

HUNT, J.; BODDY, L.; RANDERSON, P.F.; ROGERS, H, J. An evaluation of 18S rDNA approaches for the study of fungal diversity in grassland soils. Microb. Ecol. v.47, p.385-395, 2004. JAEGER, K.-E.; REETZ, M.T. Microbial lipases from versatile tools for biotechonology. Trends Biotechnol., v.16, p.396-403, 1998. JOUBERT, L.M.; BOTHA, A.WOLFAARDT, G.M. Feeding relationships in yeast-ciliate biofilms. In: McBain A, Allison D,Brading. et al.,(eds) BBC 6. Biofilm communities: order from chaos? Bioline, Cardiff.p.409-415,2003. JURADO, G.G., KURTZMAN C.P., STARMER, W.T., MARTINS-SPENCER,I., Metschinikowia vanudenii sp.nov. and Metschinikowia lachancei sp.nov., from flowers and associated insects in North America. Inter. J. Syst. Evol. Microbiol. v.53, p.1665-1670, 2003. KAMIMURA,E.S.;MENDIETA,O.;SATO,H.H;PASTORE,G. Production of lipase from Geotrichum sp and adsorption studies on affinity resin.Braz.J.Chem.Eng, v.16, p.103112,1999. KIRSOP, B.E.; KURTZMAN, C.P. Yeast. Cambridge University Press, Cambridge. 233p.,1988. KUNO, H.; OTTA, Y. The new method for the purification of extracellular lipases from Yarrowia (Saccharomycopsis) lipolytica and some properties of lipase A. J.Fac.Appl.Biol.Sci., v.35, p.191-197,1996. LALUCE, C.; OLIVEIRA, K.F.; MALAVOLTA, L. Pectinolytic activity secreted by yeasts isolated from fermented citrus molasses.J. App Microbiol. v.100, p. 633-640, 2006. LACHANCE, M. A.; STARMER, W.T., ROSA, C.A.,EDLER,S.B. et al. Wickerhamiella australiensis, Wickerhamiella cacticola, Wickerhamiella occidentalis, Candida drosophilae and Candida lipophila, five new related yeast species from flowers and associated insects. Int. Journal of Systematic Bacteriology. v. 48, p.1431-1443, 1998. LACHANCE, M.A.; STARMER, W.T. Ecology of yeasts. In: Kurtzman,C.P;Fell, J.W. (eds) The yeasts a taxonomic study. 4ed. Eslsevier, Amsterdam, p.23-30, 1998.

45

LORTIE, R. Enzyme catalyzed esterification. Biotechnol. Adv.v.15, p.1-15, 1997. LOUREIRO. S. T.A; CAVALCANTI, M.A.Q.;NEVES, R,J.; PASSAVANTE, J.Z.O. Yeast isolated from sand and sea water in beaches of Olinda, Pernambuco State, Brazil. Brazilian Journal of Microbiol. v. 36, p. 333-337, 2005. LOWES, K. F.; SHEARMAN, C. A.; PAYNE, J.; MACKENZIE, D.; ARCHER, D. B. Prevention of Yeast Spoilage in Feed and Food by the Yeast Mycocin HMK Appl. Environ. Microbiol. v. 66, p.1066-1076, 2000. MACEDO, G.A.;PARK,Y.K.;PASTORE,G.M. Partial purification and characterization of an extracellular lipase from a newly isolated strain of Geotrichum sp. Rev. Microbiol.v.28, p.90-95,1997. MAGLIANI, W.; CONTI, S.; GERLONI, M.; BERTOLOTTI, D.; POLONELLI, L.Yeast killer systems. Clin.Microbiol.Rev. v. 10 p.369-400, 1997. MANFRED J. S.; BREINIG, F. Yeast viral killer toxins: lethality and self-protection. Nature Reviews. Microbiol v.4, p.212-222, 2006. MARGESIN, R.; FAUSTER. V.; FONTEYNE P.A. Characterization of cold-active pectate lyases from psychrophilic Mrakia frigida. Lett App Microbiol. v. 40, p. 453-459, 2005. MARQUES, M.C.S., CARDOSO, M.G., SOUZA, P.E et al. Efeito fungitxico dos extratos de Caryocar brasiliensis Camb. Sobre os fungos Botrytis cineria, Colletotricum truncatum e Fusarium oxysporum. Cienc. Agrotec, Lavras. Edio especial, p.1410-1419, 2002. MENEZES, F.S.; SILVA, C.G.; HERDEIRO, R.S.; MATHIAS, S.J. Evaluation of antioxidant activity of Brazilian plants.Pharmacological Research.v.52, p. 229-233, 2005. MICHIKO KATO; JUN FUCHIMOTO; TAKANORI TANINO; MITSUYOSHI UEDA; AKIHIKO KONDO; HIDEKI FUKUDA. Preparation of a whole-cell biocatalyst of mutated Candida antarctica lipase B (mCALB) by a yeast molecular display system and its practical properties. Appl. Microbiol Biotechnol. v. 75, p. 549-555, 2007.

46

MIDDELHOVEN, W.J. Catabolism of benzene compounds by ascomycetous and basidimycetous yeasts and yeastlike fungi. Antonie van Leeuwenhoek v.63 p.125-144, 1993. MIDDELHOVEN, W.J. Identity and biodegradative abilities of yeasts isolated from plants growing in an arid climate. Antonie van Leeuwenhoek v.72, p.81-89, 1997. MIDDELHOVEN, W.J. & KURTZMAN, C.P. Four novel yeast from decaying organic matter: Blastobotrys robertii sp. nov., Candida cretensis sp. nov.,Candida scorzettiae sp.nov. and Candida vadensis sp. nov. Antonie van Leewenhock. v.92, p.233-244, 2007. MINGRUI YU; STEFAN LANGE; SVEN RICHTER; TIANWEI TAN. High-level expression of extracellular lipase Lip2 from Yarrowia lipolytica in Pichia pastoris and its purification and characterization. Protein Expression and Purification. v.53, p.255-263, 2007. MORAIS, P.B.; ROSA, C. A.; MENDONA-HAGLER, LC. ; HAGLER, A.N. High growth temperatures for apiculates yeasts isolated from Drosophila in Rio de Janeiro. Rev.Microbiol., v.23, p.163-166, 1992. MORAIS, P.B.; ROSA, C. A.; MEYER, S. A; MENDONA-HAGLER, LC. ; HAGLER, A.N. Candida amapae, a new amino acid-requering yeast from Amazonian fruit Parahancornia amapa. Journal of Microbiol., v. 14, p. 531-535,1995. MOREIRA, F.G.; REIS, S.; COSTA, M.A.F. et al. Production of hydrolytic enzymes by the plant pathogenic fungus Myrothecium verrucaria in submerged cultures. Brazilian Journal of Microbiol. v. 36, p. 7-11, 2005. MOTTER, M.D. S, SILVA, L.D. OLIVEIRA, R. B., YAMADA, A.T. et al. Mitotic index f epithelia cells in gills of Guppy (Poecilia vivipara) exposed to fractions of the leaf and abark of pequi (Caryocar brasiliensis). Braz. J. Vet. Res Anim Sci. 41 (4), 2004. MUDERHWA, J.M., RATOMAHENINA, R.; PINA, M., GRAILLE, J. Purification and properties of the lipase from Candida deformans (Zach) Langeron and Guerra. J.Am.Oil Chem.Soc.v.62, p.1031-1036, 1985.

47

NAGAHAMA, T. Yeast biodiversity in freshwater, marine and deep-sea environments . In: ROSA, C.A. PTER, G.(eds) The Yeast handbook. Biodiversity and Ecophysiology of Yeasts. Sprinter.vol. 1, 1 ed., p.242-262, 2006. OLIVEIRA, P.S.et al. Fenologia e Biologia reprodutiva das espcies do Cerrado. In: Sano, S.M.; Almeida,S.P., (eds.). Cerrado-Ambiente e Flora. Planaltina: Embrapa/CPAC, p.169192, 1998. PAULA B. MORAIS, MARLCIA B.MARTINS, L. B. KLACZKO, LEDA.C. MENDONA-HAGLER, ALLEN N. HAGLER. Yeast succession in the Amazon Fruit Parahancornia amapa as resource partitioning among Drosophila spp. App.Environ.Microbiol., v. 61,n12, p.4251-4257,1995. PATIL, M.B.; DHAKE, A.B. Production of -glucosidase by Penicillium purpurogenum. Brazilian Journal of Microbiol. v. 36, p.170-176, 2005. PERALTA, R.M.; MOREIRA,F.G.;REIS, S.;COSTA, M.A.F.; SOUZA, C.G.M. Production of hydrolytic enzymes by the plant pathogenic fungus Myrothecium verrucaria in submerged cultures. Brazilian Journal of Microbiol. v. 36, p.7-11, 2005. PIGNEDE,G.;H.WANG;F.FUDALEJ;C.GAILLARDIN; J.M.NICAUD. Characterization of an extracellular lipase encoded by LIP2 in Yarrowia lipolytica. J. Bacteriol. v. 182, p.28022810, 2000. PHAFF, H.J.; STARMER, W.T. Specificity of natural habitats for yeasts and yeasts-like organisms. In: SKINNER, F.A; PASSMORE, S.M. DAVENPORT,R. R.(Eds). Biology and activity yeasts. London: Academic Press., p. 79-102, 1980. PHAFF, H.J.;STARMER,W.T. Yeasts associated with plants, insects and soil. In: Rose A.I. Harrison, J.S. (eds). The Yeasts Biology. 2 ed. v.1. Academic, London, p.123-180, 1987. PHAFF, H.J.; MILLER.M.W; MRAK, E.M. Ecology, chap.VIII. In: Phaff,H.J.; Mrak,E.M. (eds) The life of yeasts. Harvard University Press. Cambridge, p.93-123,1966. PHILLIPS, A., PRETORIUS, G.H.J. Purification and characterization of an extracellular lipase of Galactomyces geotrichum. Biotechol. Lett., v.13,p.833-838, 1991.

48

POZO,O.V.C.; MAY, P. H: Compilacin y anlisis sobre los productos forestales no madereros (PFNM) en el Brasil. Proyecto Informacin para el manejo forestal sostenible: integrado esfuerzos nacionales e internacionales en 13 pases tropicales en Amrica Latina Santiago, CHILE, FAO. Tese Doutorado, p.27-28, 2001. RICCIO,P., ROSSANO, R.;VINELLA ,M.,DOMIZIO,P.,ZITO,F.,ROSI, I. et al. Extraction and immobilization in one step of two -glucosidases released from a yeast strain of Debaromyces hansenii. Enzyme Microb. Technol., v.24, p.123-129, 1999. ROSA, C.A. VIANA, E.M., MARTINS, R.P., ANTONINI, Y., LACHANCE, M.A Candida batistae, a new species associated with solitary digger nesting bees in Brazil. Mycologia. v. 91, n. 3, p. 428-433, 1999a. ROSA, C.A., LACHANCE, M.-A., STARMER,W.T.,BARKER, J.S.F.,BOWLES, J.M. Kodamaea nitidulidarum, Candida restingae and Kodamaea anthophila, three new related yeast species from ephemeral flowers.Int. J. Syst. Bacteriol., v.49, 1999b. ROSA, C.A. PTER, G. The Yeast handbook. Biodiversity and Ecophysiology of Yeasts. Vol. 1, 1 ed. Ed.Sprinter, 2006. ROSA, L.H., MACHADO, K.M.G., ZANI, C.L., et al. Screening of Brazilian Basidiomycetes for Antimicrobial Activity. Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v.98 (7) p.967-974, 2003. RA,M.L., DAZ-MAURIO,T., FERANDEZ ,V.M., OTERO, C., BALLLESTEROS, A. Purification and characterization of two distinct lipases from Candida cylindracea. Biochim. Biophys. Acta, v.1156, p.181-189, 1992. RIAUBLANC, A., RATOMAHENINA,R.,GALZY,P. Study of a lipase from Candida rugosa Diddens & Lodder. Fett Wissenschaft Techonologie, v. 95, p. 134-137, 1993. SANTOS, J.A.; AMARAL, M.C.O.; ARAJO, T.A.S.; MORAIS, M.M.C. Isolation of a lipase-producing Trichosporon spp. and enzyme extraction by two-phase aqueous system. Braz.Jour. Microbiol.v.38, p.62-64, 2007. SCHULZ, B.; BOYLE, C. The endophytic continuum. Mycol. Res. Review.v.109 (6).p.661686, 2005. 49

SILVA NEVES, K.C.; PORTO, A.L.F.; TEIXEIRA, M.F.S. Screening of yeast from Amazon Region for extracellular protease production. Acta Amazonica.v.36 n 3, p.299306,2006. SOARES, G.A.M.; SATO, H.H.; Killer toxin of Saccharomyces cerevisiae Y500-4L active against Fleischmann and Itaiquara commercial brands of yeast. Rev Microbiol. v.30, p.253257, 1999. SPENCER, J.F.T.; SPENCER, D.M. Ecology: where yeasts live. In:

Spencer,J.F.T.;Spencer,D.M. (eds) Yeasts in natural and artificial habitats. Springer. Berlin Heidelberg, New York. p.33-58, 1997. STARKEY, R.L.; HENRY,A.T. The occurrence of yeasts in soil. Soil Sci. v. 23, p.33-34, 1927. STERFLINGER, K.; PRILINGER, H. Molecular taxonomy and biodiversity of rock fungal communities in an urban environmental (Vienna, Austria). Antonie van Leeuwenhoek. v.80, p.275-286, 2001. STROBEL,G.; DAISY, B., CASTILLO, U., HARPER. Reviews. J.Nat. Prod., vol. 67, n 2, p.257-258, 2004. TAKAKI, G.M.C; ANDRADE, V.S.; SARUBBO, L.A.; et al. Production of extracellular proteases by Mucor circinelloides using D-glucose as carbon source/substrate. Brazilian Journal of Microbiol. v. 33 , p. 106-110, 2002. TAKANORI TANINO; TAKUMI OHNO; TOHRU AOKI; HIDEKI FUKUDA; AKIHIKO KONDO. Development of yeast cells displaying Candida antarctica lipase B and their application to ester synthesis reaction. Appl. Microbiol Biotechnol. v. 75, p. 1319-1325, 2007. THANH. V.N., HAI, A.D., LACHANCE, M.A. Cryptococcus bestiolae and Cryptococcus dejecticola, two new yeast species isolated from frass of the litchi fruit borer Conopomorpha sinensis Bradley. FEMS Yeast Res. v. 6, p 298-304, 2006. TOURNAS, V.H., HEERES, J., BURGESS, L. Moulds and yeast in fruit salads and fruit juices. Food Microbiology. v.23, p 684-688, 2006.

50

TORRES, F.A. G; MORAES, L.M.P. Protenas recombinantes produzidas por leveduras. Bieotecnologia, Cincia e Desenvolvimento. v.12, p. 20-22, 2000. TRINDADE, R.C. Biodiversidade de leveduras associadas a polpas de frutas da regio nordeste do Brasil. Belo Horizonte: UFMG/ICB, Tese Doutorado. 87 p.2001. TRINDADE, R.C., RESENDE, M.A, PIMENTA, R.S., LACHANCE, M.A., ROSA, C.A., Candida sergipensis, a new assexual yeast species isolated from frozen pulps of tropical fruits. Antonie van Leeuwenhoek v.86, p.27-32,2004. VEERARAGAVAN, K., COLPITTS, T., GIBBS, B.F. Purification and characterization of two distinct lipases from Geotrichum candidum. Biochim. biophys Acta,v.1044,p.26-33,1990. VITAL, M.J.S. et al., Mycocinogenic yeasts isolated from Amazon soils of the Marac Ecological Station. Braz. J. Microbiol, v.33, n. 3, p. 230-235, 2002. VU NGUYEN THANH; MARTHA S. SMITH; NTSANE MOLELEKI; JACK W. FELL. Rhodotorula cycloclastica sp. nov., Rhodotorula retinophila sp nov., and Rhodotorula terpenoidalis sp. nov., three limonne-utilizing yeasts isolated from soil. FEMS Yeast Research.v.4, p.857-863, 2004. WAEL N. HOZZEIN; MICHAEL GOODFELOW. Nonomuraea aegyptia sp.nov., a novel actinomycete isolated from a sand dune. Antonie van Leewenhock. v.92, p.165-171, 2007. WASKMAN, S.A; HENRICI, A.T. The nomenclature and classification of the actinomycetes. J.Bacteriol. v. 46, p.337-341, 1943. XIN MING-XIU; ZHOU PEI-JIN. Mrakia psychrophila sp. nov., a new species isolated from Antarctic soil. Journal of Zhejiang University Science B. v. 8 (4), p.260-265, 2007. XISTO, P.et al. Antifungal activity of Caryocar brasiliensis (Caryocaraceae) against Cryptococcus neoformans. Rev. Soc. Bras. Med. Trop. Uberaba, v.35, n. 6. 2002. YOUNG, I. M.; CRAWFORD, J.W. Interactions and self-organization in the soil-microbe complex. Science. v.304, p.1634-16347, 2004.

51