CARACTERIZACIN MOLECULAR CON MICROSATLITES ALEATORIOS RAMs DE LA COLECCIN DE MORA Rubus spp, DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA

Rubus glaucus Benth

ANA CRUZ MORILLO CORONADO YACENIA MORILLO CORONADO

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS INGENIERIA AGRONMICA PALMIRA 2003

CARACTERIZACIN MOLECULAR CON MICROSATELITES ALEATORIOS RAMs DE LA COLECCIN DE MORA Rubus spp, DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA

ANA CRUZ MORILLO CORONADO YACENIA MORILLO CORONADO

Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar por el ttulo de Ingeniero Agrnomo

Directores: Jaime Eduardo Muoz Florez Profesor asociado Universidad Nacional de Colombia Herney Daro Vsquez Ameriles Profesor asistente Universidad Nacional de Colombia

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS INGENIERIA AGRONMICA PALMIRA 2003

La facultad y los jurados de Tesis no sern responsables de las ideas emitidas por el los autores de la misma.

(Artculo 24, Resolucin 04 de 1974 del Consejo Directivo).

DEDICATORIA

Todo el esfuerzo y la dedicacin en este trabajo de investigacin se lo dedicamos: A Dios, por ser la luz que gua nuestros pensamientos, emociones y nuestra vida; la fortaleza que nos impulsa a alcanzar nuestros sueos e ideales; porque en El est representando el amor, la entrega y el sacrificio. A nuestros padres, por ser el regalo ms hermoso que Dios nos ha dado, por su ejemplo, dedicacin y perseverancia. A nuestros hermanos por compartir nuestras alegras y tristezas, por ser ejemplo de lucha y superacin y cmplices de nuestros anhelos. A nuestros familiares y amigos por su apoya incondicional y sus palabras de aliento que nos motivaron a seguir siempre adelante y no desfallecer ante las adversidades.

Nuestra mayor gloria no est en no haber cado nunca, sino en levantarnos cada vez que caemos. Goldsmith Oliver

AGRADECIMIENTOS
En el trabajo de investigacin que hoy culminamos son muchas las personas a quienes queremos expresar nuestros ms sinceros agradecimientos: Profesor Jaime Eduardo Muoz Florez, por ser nuestra gua y ejemplo de constancia y dedicacin, por sus enseanzas y compaa a lo largo del desarrollo de este trabajo de investigacin y sobre todo por haber depositado su confianza en nosotras y ser ms que un maestro nuestro amigo. Profesor Herney Daro Vsquez por su apoyo incondicional, sabios consejos y amistad. Profesores Juan Gonzalo Morales y Franco Alirio Vallejo, por sus valiosos aportes en el desarrollo de este trabajo de investigacin. Profesora Angela Alvarez, por su lucha y entrega para sacar adelante el Laboratorio Integrado de Investigaciones. Profesor Eugenio Escobar Manrique por su valiosa colaboracin y disposicin para ayudarnos a resolver nuestras dudas e inquietudes. Profesor Tulio Csar Lagos por su valiosa amistad y disposicin para ayudarnos. A la Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira, nuestra Alma Mater, por haber construido y propiciado ese espacio para crecer como seres humanos y enriquecernos cada da con nuevos conocimientos y experiencias. A nuestros profesores, quienes confan en nosotros y depositan da a da sus conocimientos y experiencias, porque admiramos su calidad humana, su vocacin, dedicacin y ejemplo. Al instituto Von Humbolt especialmente a Juan Diego Palacio por honrarnos con su amistad, por su sencillez, por compartir con nosotras sus conocimientos y experiencias, por querer siempre que las cosas nos salieran bien y porque siempre estuvo dispuesto ayudarnos en las cosas ms importantes y sencillas de nuestro trabajo.

A Carolina Villafae, Tania y Vctor Hugo Garca, por su generosidad y amistad, por su clida acogida, y por su eficiente gestin y ayuda permanente para solucionar nuestros problemas. Germn Franco, por su colaboracin y disposicin en el desarrollo de esta investigacin. Germn Llanos y a Juan Fernando Meja por su asesora, orientacin y por la disposicin de ayudarnos. Adriana Zamorano por tu colaboracin, apoyo incondicional y amistad, y por haber compartido juntas cada una de las experiencias que nos llevaron a culminar con xito el presente trabajo. Andrs Mauricio Posso, Lorena Cuervo y Helmuth Ceballos, por su inmensa colaboracin y disposicin para ayudarnos a lo largo de todo este proceso. Jaime Martnez Garcs por todos los gratos momentos compartidos. A todos nuestros compaeros que trabajan en el Laboratorio Integrado de Investigaciones, y en especial a Martha Bonilla y Katherine Espinosa, por todos los momentos que compartimos y por que siempre estuvieron ah, dispuestos a ayudarnos en el momento que ms lo necesitbamos A todas aquellas personas que de una u otra manera hicieron posible la realizacin de este trabajo, quienes depositaron su credibilidad y confianza en nuestro proyecto, y por permitirnos hoy cumplir una de nuestras grandes metas: Crecer como personas y ser excelentes profesionales, para as poder brindar un mejor servicio a nuestro pas.

TABLA DE CONTENIDO Pg 1 4 4 4 4 5 6 7 7 8 8 8 9 10 13 15 15 16 17 18 19 19 20 21 22 26 26 26 26 28 29 30 30 30 34 34

INTRODUCCIN 2. REVISIN DE LITERATURA 2.1 RESEA HISTORICA 2.2 GENERALIDADES 2.2.1 Caractersticas Botnicas y Taxonmicas 2.2.2 Biologa Floral 2.3 ESPECIES Y CLONES DEL GNERO Rubus. 2.4 HBRIDOS 2.5 CONDICIONES EDAFOCLIMATICAS PARA EL CULTIVO DE LA MORA 2.6 AGRONOMIA DEL CULTIVO 2.6.1 Desarrollo del fruto 2.6.2 Mtodos de Propagacin de mora 2.6.3 Plagas y Enfermedades 2.7 IMPORTANCIA SOCIOECONMICA DE LA MORA 2.8 RECURSOS GENETICOS 2.9 GENETICA DE POBLACIONES 2.9.1 Modelos de Dispersin 2.9.2 Accin de la Deriva Gentica y la Endogamia en Poblaciones Pequeas 2.9.3 Diversidad Gnica Promedio 2.10 MARCADORES MOLECULARES 2.10.1 Marcadores Proteicos 2.10.2 Marcadores de ADN 2.10.3 Marcadores Microsatlites 2.10.3.1 Microsatlites RAMs 2.11 DESCRIPCIN DE LA COLECCIN DE MORA Rubus spp. 3 MATERIALES Y METODOLOGAS 3.1 LOCALIZACIN 3.2 METODOLOGA 1: ESTANDARIZACIN DE UN PROTOCOLO PARA LA EXTRACCIN DE ADN 3.2.1 Obtencin de Muestras 3.2.2 Mtodos de Extraccin 3.2.3 CUANTIFICACIN DE ADN 3.2.4 ELECTROFORSIS 3.3 METODOLOGA 2: AMPLIFICACIN DEL ADN MEDIANTE PCR 3.3.1 Microsatlites RAMs 3.4 METODOLOGA 3: ANLISIS ESTADSTICO 3.4.1 Similaridad en trminos de Marcadores Moleculares: Coeficiente de Similaridad de Nei-Li

3.4.1.1 3.4.1.2 3.4.2 3.4.3 3.4.4 3.4.5 3.4.5.1 4 4.1 4.2 4.2.1 4.3 4.3.1 4.3.2 4.4 4.4.1 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 5. 6. 7.

Matriz de Variable Binaria Mtodo de Clasificacin Anlisis de Correspondencia Mltiple Anlisis Boot Strap Anlisis de Varianza Molecular (AMOVA) Diversidad Gentica Heterocigosidad esperada RESULTADOS Y DISCUSIN ESTANDARIZACIN DE UN PROTOCOLO PARA LA EXTRACCIN DE ADN CARACTERIZACIN DE LA ESTRUCTURA GENETICA Caractersticas de los Cebadores ANLISIS DE LA DIVERSIDAD GENETICA Dendrograma con el Indice de Nei-Li Estimacin de la heterocigosidad DIFERENCIACIN POBLACIONAL Estadstico Fst ANLISIS DE CORRESPONDENCIA MLTIPLE ANLISIS DE VARIANZA MOLECULAR (AMOVA) DISTANCIA E IDENTIDAD GENETICA ANLISIS DE DIVERSIDAD GENTICA PARA LOS GRUPOS DE Rubus glaucus ANLISIS DE LOS AGRUPAMIENTOS POR SITIO GEOGRFICO CONCLUSIONES RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFA ANEXOS

34 34 34 35 35 35 35 37 37 39 39 43 43 47 49 49 50 51 52 53 57 60 62 63

LISTADO DE TABLAS

Pg. Tabla 1 Materiales de mora Rubus spp utilizados para la caracterizacin molecular con Microsatlites RAMs. Tabla 2 Patrones del Bacterifago Lambda Tabla 3 Primers utilizados en la tcnica Microsatlites RAMs Tabla 4 Cctel para la Amplificacin por RAMS Tabla 5 Ccteles utilizados para la amplificacin por RAMs Tabla 6 Concentraciones de ADN (ng) de los materiales de mora Rubus spp. Tabla 7 Cebadores utilizados para la evaluacin de la diversidad gentica en Rubus Tabla 8 Valores de Heterocigosidad, Fst y Porcentaje de Loci polimorficos para los primers RAMs. Tabla 9 Patrones de Bandas nicos generados por la tcnica RAMs Tabla 10 Patrones de Bandas comunes generados por la tcnica RAMs. Tabla 11 Heterocigosidad Promedio estimada y Porcentaje de Loci polimorficos entre los grupos analizados. Tabla 12 Anlisis de Varianza Molecular (AMOVA) para los grupos formados. Tabla 13 Matriz de Distancia e Identidad gentica calculados con el Indice de Nei (1978) para los grupos formados. Tabla 14 Matriz de Distancia e Identidad gentica para los cuatro grupos de Rubus glaucus. Tabla 15 Heterocigosidad Promedio estimada y porcentaje de Loci polimorficos para los 4 grupos de Rubus glaucus. Tabla 16 Anlisis de Varianza Molecular (AMOVA) para los 4 grupos de Rubus glaucus. Tabla 17 Heterocigosidad Promedio estimada y Porcentaje de Loci polimorficos entre Regiones y Localidades analizadas. Tabla 18 Anlisis de Varianza Molecular (AMOVA) para Regiones y Localidades analizadas 27 29 30 31 31 39 39 40 42 42 48 51 52 53 55 56 57 59

LISTADO DE FIGURAS Pg. Figura Figura Figura Figura 1 2 3 4 Esquema de la flor de la mora de Castilla (Adaptada de McGregor) Principales pases productores de Mora. rea y Produccin Nacional de Mora. Participacin por departamentos en la Produccin Nacional de Mora2.000. Rendimiento en la Produccin Nacional de Mora (Ton/ha). Sitios de Colecta de los materiales de Rubus spp. Metodologa de los Microsatlites RAMs para Caracterizar la estructura gentica de Rubus spp. ADN total de las 36 accesiones de Rubus spp. Hibridacin del primer TG a la cadena de ADN complementaria. Patrones de bandas generadas por el primer Microsatlite RAMs (TG)n. Dendrograma de la estructura gentica de 36 individuos de Rubus spp, basado en el Coeficiente de Similaridad de Nei-Li, y calculado de los datos combinados de los siete primers Microsatlites RAMs, con el mtodo de clasificacin UPGMA, usando los programas SAHN y TREE de NTSYS-pc Versin 1.8 (Exeter Software, Setauket, NY, USA). 6 20 11 12 13 23 33 38 40 41 44

Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10 Figura 11

Figura 12 Representacin espacial de la estructura gentica de 36 individuos de Rubus spp usando los Microsatlites RAMs. Elaborado mediante el Anlisis de Correspondencia Mltiple. Figura 13 rbol de distancia gentica para los grupos formados. Figura 14 rbol de distancia gentica para los cuatro grupos analizados. Figura 15 Representacin espacial de la estructura gentica de 29 accesiones de Rubus glaucus usando los Microsatlites RAMs. Elaborado mediante el Anlisis de Correspondencia Mltiple.

51 53 54 56

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LISTA DE ANEXOS ANEXO 1 ANEXO 2 ANEXO 3 ANEXO 4 ANEXO 5 ANEXO 6 Formato de Colecta para las introducciones de mora Rubus spp. Mtodo de Dellaporta et al (1983) modificado por Henrquez (2000) Mtodo de Fulton et al (1995) modificado por Restrepo (2003) Mtodo de Dellaporta et al (1983) modificado por Palacio (2003) Buffer y Medios Principios qumicos de algunos reactivos

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SUMMARY
The Rubus Genus, from Rosaceae family is one of more diverse in the vegetable kingdom, it has around of 300 species highly heterocigotas, which find disseminated in almost all world, with exception in desertics zones. In Colombia is every time greater the interest to cultivate Castilla Blacberry due to internal thus fruit because 90 percent of this production will be destined to agroindustrial processing. (Franco & Giraldo, 2000). Despite to be a traditional fruit of high consumption in Colombia, we know few about the genetic composition of the cultivated field in our country. There is nowadays moleculars tools which let determine the species characteristies with accuracy and determine primers of great usefulness. (Marulanda and Mrquez, 2001). This study was done with 36 accesions of the collection of blacberry Rubus spp, from National University of Colombia, Palmira seat, with objective of establish a methodology to DNA extraction and characterization, and identify primers which let detect the genetic diversity existent in the genus. It was done with several methods to the DNA extraction, being the Dellaporta et al protocol (1983) changed by Palacio (2003), who let obtain DNA of good quality. To evaluate the genetic diversity of the genus, we used RAMs markers (Random Amplifity Microsatellites) and like this calculate similarity pointers

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and examine the variety specific. It was identified six primers which did 43 polymorphics bands with molecular weight between 260 and 1500 Kb. The Random analysis let differenciate the materials according to species belonging, Rubus glaucus, Rubus urticifolius and Rubus robustus, the place of proceeding of them, as identify materials very similar existents in the collection like UNAPM19 and UNAPM25. The analysis by means of coefficient of DICE and Nei-Li to a level of similarity of 0.55 make difference of population in six groups and this make difference too, in 27 haplotypes. The group done by Rubus robustus showed the lower value of similarity (0.25) it possibly due to his characteristics morphologys and /or moleculars. The heterocigocity average of the total population was 0.3125, oscillating between 0.01 for group F (Rubus robustus) and 0.25 for group B ( Rubus glaucus), with a value of Fst of 0.4980, showing a high genetic variety inside and between the groups done corresponding to 52 and 48 percent respectively, this possibly due to power as such as immigration, genes flow, type of production, polinization, between others. The introducction proceeding from Valle, Cauca and Nario departments were the greast contribution did to the total genetic variety, being the corregiment of Juntas ( Ginebra- Valle) the place what showed a large diversity of wild materials. This work confirm the usefulness practical of the RAMs method to characterize molecularly the population of vegetables species.

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RESUMEN
El gnero Rubus, de la familia Rosaceae es uno de los ms diversos dentro del reino vegetal, comprende cerca de 300 especies altamente heterocigotas, las cuales se encuentran diseminadas en casi todo el mundo, excepto en las zonas desrticas. En Colombia es cada vez mayor el inters por cultivar mora de castilla debido a la aceptacin interna y las posibilidades de exportacin de esta fruta ya que el 90% de su produccin se destina al procesamiento agroindustrial (Franco & Giraldo, 2000). A pesar de ser un frutal tradicional de alto consumo en Colombia, muy poco se conoce acerca de la composicin gentica de la poblacin de cultivares sembrados en nuestro pas. Existen hoy en da herramientas moleculares que permiten determinar la caracterizacin de las especies con alta precisin e identificar cebadores de gran utilidad. (Marulanda y Mrquez, 2001). El presente estudio se realiz con 36 accesiones de la coleccin de mora Rubus spp, de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Palmira con el objetivo de establecer una metodologa para la extraccin y caracterizacin de ADN, e identificar cebadores que permitan detectar la variabilidad gentica existente dentro del gnero. Se probaron diferentes metodologas para la extraccin de ADN, siendo el protocolo de Dellaporta et al., (1983) modificado por Palacio (2003), el que permiti obtener ADN de buena calidad.

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Para la evaluacin de la diversidad gentica de las introducciones se utilizaron marcadores RAMs (Microsatlites Aleatorios Amplificados al Azar), con el fin de calcular los ndices de similitud y analizar la variabilidad intraespecfica. Se identificaron seis cebadores que produjeron 43 bandas polimrficas con pesos moleculares entre 260 y 1500 Kb. El anlisis RAMs permiti diferenciar los materiales de acuerdo a la especie a la cual pertenecen, Rubus glaucus, Rubus urticifolius y Rubus robustus, el lugar de procedencia de los mismos, como tambin identificar materiales muy similares existentes en la coleccin como UNAPM19 y UNAPM25. El anlisis mediante los coeficientes de DICE y Nei-Li a un nivel de similaridad de 0.55 diferenci la poblacin en seis grupos y estos a su vez en 27 haplotipos. El grupo formado por Rubus robustus present el valor ms bajo de similitud (0.25) posiblemente se deba a sus caractersticas morfolgicas y/o moleculares. La heterocigosidad promedio de la poblacin total fue de 0.3125, oscilando entre 0.01 para el grupo F (Rubus robustus) y de 0.25 para el grupo B (Rubus glaucus), con un valor de Fst de 0.4980, evidenciando una alta variabilidad gentica dentro y entre los grupos formados correspondiente al 52 y 48% respectivamente, esto posiblemente se deba a fuerzas tales como la migracin, flujo de genes, tipo de reproduccin, polinizacin, entre otros. Las introducciones procedentes de los departamentos del Valle, Cauca y Nario fueron las que mayor aporte hicieron a la variabilidad gentica total, siendo el Corregimiento de Juntas (Ginebra-Valle) el lugar que exhibe una amplia diversidad en cuanto a materiales silvestres se refiere.

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Con este trabajo se confirma la utilidad prctica de la tcnica RAMs para caracterizar molecularmente las poblaciones de especies vegetales.

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CARACTERIZACIN MOLECULAR CON MICROSATLITES ALEATORIOS RAMs DE LA COLECCIN DE MORA Rubus spp, DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE PALMIRA
Ana Cruz Morillo Coronado1 Yacenia Morillo Coronado1

INTRODUCCIN El gnero Rubus es uno de los de mayor nmero de especies en el reino vegetal. Se encuentran diseminadas en casi todo el mundo, excepto en las zonas desrticas. Comprende cerca de 500 especies altamente heterocigotas, su nivel de plodia va desde diploide hasta dodecaploides y la mayora son apomcticas. (Jennings, 1998). Ha sido subdividido en doce subgneros y slo algunos de ellos han sido domesticados. Al subgnero Idaeobatus pertenecen los Raspberries que se distribuyen en Europa y Norteamrica (Graham y McNicol, 1995), y al subgnero Rubus pertenecen los Blackberries que se distribuyen en el Centro y Norte de Europa (Nybom y Kraft, 1995). La mora de Castilla, Rubus glaucus, descubierta por Hartw y descrita por Benth, es originaria de las zonas altas tropicales de Amrica principalmente de Colombia, Ecuador, Panam, Guatemala, Honduras, Mxico y Salvador (Franco, Giraldo, 2000); ha sido considerada un hbrido pues combina las caractersticas de los subgneros Idaeobatus y Rubus, y es adems un anfidiploide frtil (Jennings, 1998).

Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar el ttulo de Ingeniero Agrnomo, bajo la direccin de los profesores Jaime Eduardo Muoz Florez y Herney Daro Vsquez A.
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La mora se ha convertido en un cultivo de gran importancia en las regiones tropicales del mundo, porque adems de sus caractersticas organolpticas, medicinales es rica en vitaminas y minerales, por lo que su uso se extiende a la fabricacin de mermeladas, jugos, concentrados, jaleas, bocadillos, etc.(Franco & Giraldo, 2000). La produccin mundial de mora alcanz las 260.000 toneladas en 1999, donde Europa particip con el 67.4%, siendo Alemania el principal productor (con el 31,9% del volumen), en tanto que Estados Unidos contribuy con el 12%, Guatemala, Chile, Costa Rica y Colombia, participaron con el 20.6% del volumen total. Si se toma en cuenta la informacin del Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, la participacin de Colombia en la produccin mundial en el 2.000 sera del 15.4% (39.989 toneladas). (Corporacin Colombiana Internacional, 1999). En Colombia es cada vez mayor el inters por cultivar mora de castilla debido a la aceptacin interna y las posibilidades de exportacin de esta fruta, ya que normalmente alcanza muy buenos precios en el mercado extranjero, como el de la comunidad europea, el estadounidense y el japons. (Tamayo et al, 1999). Por otra parte el diagnstico ms reciente sobre el estado de biodiversidad en Colombia indica que varios de los ecosistemas de montaa se encuentran seriamente amenazados con alto riesgo de prdida de los recursos genticos (Hernndez & Rangel, 1992). A nivel internacional hay un gran inters en la conservacin de los Parientes silvestres de las plantas cultivadas (Hoyt, 1992), razn por la cual se hace necesario caracterizar mejoramiento. y evaluar los materiales colectados para su posterior utilizacin en programas de

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El desarrollo de la Biologa Molecular ha dado como resultado mayor entendimiento de las relaciones entre especies del gnero Rubus, acertada clasificacin taxonmica y mayor habilidad para identificar especies y cultivares. Estas tcnicas tambin permiten entender y utilizar mejor la diversidad gentica por parte de los mejoradores (Graham y McNicol, 1995). La clasificacin de especies y cultivares del gnero Rubus basada en caracteres morfolgicos, puede ser difcil debido a las caractersticas botnicas de la especie. Tcnicas como las isoenzimas no han sido una herramienta til (Cousineau y Donelly, 1989). Otros marcadores como las sondas de ADN de cloroplasto tampoco fueron eficientes en determinar la variacin en cultivares de Blackberries (Waught et al, 1990), y los minisatlites de ADN y los RFLPs, aunque son marcadores muy informativos, requieren el uso de radioistopos (Nybom y Kraft, 1995). Entre los diferentes marcadores moleculares conocidos, los RAMs (Random Amplified Microsatellite o Microsatlites Amplificados al Azar) son muy tiles para medir la diversidad gentica en plantas y animales, muestran la base misma de la variacin de los individuos, permiten seleccionar regiones concretas dentro de la molcula de ADN para estudio determinados, el nmero de polimorfismos detectables es tericamente ilimitado, permiten analizar tanto la informacin que se expresa como la que no. (Ferreira & Grattapaglia, 1998). En la Universidad Nacional de Colombia, Sede Palmira, se tienen proyectos de investigacin dirigidos al estudio de la diversidad gentica tanto en especies animales como Hartn del Valle, cerdos y gallinas criollas, tilapia entre otros, como tambin en vegetales entre los que se encuentran la de un uchuva, mora, guayaba, lulo, etc. El presente trabajo hace parte

proyecto de investigacin titulado Coleccin, Caracterizacin Fenotpica y

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Molecular de poblaciones de mora Rubus spp que abarca el Sur Occidente colombiano principalmente los departamentos del Valle, Cauca y Nario y cuyo objetivo principal es conocer y conservar la diversidad gentica existente en este gnero. Este trabajo tiene como objetivo general estudiar la diversidad gentica de la coleccin de mora Rubus spp de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Palmira utilizando una nueva tcnica basada en microsatlites, denomina RAMs, con el propsito de utilizar los resultados en el desarrollo de estrategias de mejoramiento as como tambin la identificacin de clones lite. Como objetivos especficos se plantearon los siguientes:

Estandarizar y optimizar un mtodo de extraccin de ADN.

Determinar la diversidad gentica de Rubus spp mediante el uso de marcadores moleculares RAMs, en los departamentos del Valle, Cauca y Nario.

Estimar los ndices de similitud y analizar la variabilidad intra e interespecfica en las especies Rubus glaucus y Rubus urticifolius.

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2. REVISIN DE LITERATURA

2.1 RESEA HISTRICA: El gnero Rubus se encuentra distribudo en la mayor parte del mundo, excepto en las zonas desrticas. Las especies ms conocidas que se cultivan en la zona templada son: La Rubus idaeus (frambuesa), Rubus occidentalia (mora cultivada) y la Rubus folius (zarzamora).(Graham et al, 1997). Existen ms de 300 especies de mora de Castilla, pero slo unas nueve tienen actualmente valor comercial. A escala mundial las variedades ms cultivadas provienen de las especies Rubus occidentalis o de hibridaciones con Rubus idaeus. En Colombia se cultiva comercialmente la especie Rubus glaucus o mora de Castilla. Entre las moras existen variedades e hbridos con o sin espinas. No obstante, el uso de hbridos es muy limitado ya que todava no han llenado las expectativas tcnicas y econmicas de los productores. (Jennings, 1998). La mora de Castilla tiene como centro de origen las zonas altas tropicales de Amrica principalmente en Colombia, Ecuador, Panam, Salvador, Honduras, Guatemala, Mxico e inclusive los Estados Unidos. (Franco & Giraldo, 2000). El nombre de Mora de Castilla se origin en la poca de la colonia, donde las familias nobles que se daban el lujo de consumir frutas, entre ellas la mora crean que procedan de Castilla, Espaa. Fue descubierta por Hartw y descrita por Benth, llamada Rubus del latn rojo y glaucus del latn blanquecina, debido al color del envs de sus hojas. ( CORPOICA, 1998 ).

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2.2 GENERALIDADES: 2.2.1 Caractersticas Botnicas y Taxonmicas: Es una planta perenne, arbustiva, semierecta y con tallos rastreros o semierguidos que forman macollas. Los tallos son de longitud variable y pueden ramificarse, tienen espinas y emiten brotes, constantes en la base. Las hojas son alternas y tienen 3 fololos, de bordes aserrados, verde por el haz y blanquecino por el envs. Las ramas florecen en racimos terminales. Sus flores son blancas, de 2 -2,5cm de dimetro y se disponen en racimos en las puntas de las ramas o a veces en toda la rama. (Escoto, 1994).

El fruto es formado por muchas drupas, dentro de cada drupa hay una semilla. Los frutos pueden ser de tamao grande, mediano o pequeo, maduran de manera dispareja porque la floracin no es homognea. Cuando maduran tienen color que va de rojo a prpura o de rojo a rojo oscuro. La produccin de frutos es continua aunque se presentan pocas de mayor produccin en intervalos de 5 a 6 meses.

Las races se distribuyen en los primeros 30 cm del suelo, tienen posicin horizontal, la longitud de vegetativas capaces de 1994). las races vara entre 0,5 y 1,2 m. Las races activarse produciendo nuevos brotes. (Escoto, sostienen la planta y permiten su propagacin al presentar yemas

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Taxonoma: Reino: Subreino: Divisin: Clase: Subclase: Orden: Suborden: Familia: Subfamilia: Gnero: Subgnero: Especie: Vegetal Embriofita Spermatophyta Angiosperma Dicotiledonae Rosales Rosineae Rosaceae Ruboideae Rubus Eubatos Rubus glaucus

2.2.2 Biologa Floral. La inflorescencia de la mora se da en racimos de entre 11 y 60 flores por lo general, aunque se tienen datos de 150. Tienen el cliz verde, con cinco spalos del mismo color y cinco ptalos blancos alrededor del androceo y gineceo. Van dispuestas de a tres por yema, alternas, comenzando por una flor solitaria terminal. El nmero de racimos florales por planta vara entre 5 y 20 segn la poda. (Botero, 1994). La flor posee de 50 a 100 estambres alrededor de un nmero semejante de pistilos; cada pistilo o carpelo tiene un ovario que da origen a un fruto pequeo y carnoso llamado drupa (Figura 1). Entre el androceo y el gineceo, el nctar es segregado en abundancia y su concentracin es de 28 a 31% (McGregor, 1976). En este tipo flor primero se libera el polen de los estambres ms externos que normalmente cae afuera de la flor, mientras los

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estambres ms internos son, por su ubicacin, los nicos que logran fertilizar algunos estigmas directamente adyacentes si no hay un agente transportador de polen (Free, 1968). Hedrick estudi en 1938 la esterilidad de la mora y not que su polen era frecuentemente deforme, arrugado y encogido (McGregor, 1976). El perodo de fructificacin va de los 54 a 65 das desde la dehiscencia de anteras hasta la madurez del fruto (Aviln et al., 1982). Seccin longitudinal de la flor de la Mora.

Figura 1. Esquema de la flor de la mora de Castilla (Adaptado de McGregor).

La flor comienza a secretar nctar tan pronto empiezan a abrirse los ptalos, alcanzando su mxima atraccin al ocurrir la dehiscencia de anteras, cuando los ptalos estn ms extendidos, mayor cantidad de nctar es secretado. Sobre el anillo nectarfero se van ubicando las abejas visitantes, recorriendo la flor circularmente, untndose de polen que queda adherido a sus cuerpos pilosos; en su visita a la prxima flor y al efectuar el mismo recorrido, este polen adherido caer sobre los estigmas y se dar la polinizacin (Free, 1960). Al ocurrir esto, los pistilos se ven oscuros, ennegrecidos (Connor, 1973) y se curvan hacia dentro sobre los carpelos (Free, 1968). El fruto es un

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agregado de drupas adheridas al receptculo floral y mide entre 1 y 3 cm de largo segn la variedad cultivada. 2.3 Especies y Clones del gnero Rubus: Debido a su crecimiento natural, se pueden identificar unas 300 especies dentro del gnero Rubus, en Colombia se han encontrado 44 especies, de stas, 9 son comestibles, siendo las ms cultivada comercialmente la mora de Castilla (Rubus glaucus Benth). (Oliveros, 2000). En algunas regiones de Colombia los campesinos clasifican la mora en: Mora Pajarita, de frutos pequeos y plantas muy ramificadas. Mora Ranchona, con la inflorescencia distribuida a lo largo de toda la rama. Mora Hartona, poco ramificada y con frutos grandes. Se reportan que desde el ao 1840 se iniciaron trabajos para obtener variedades de Rubus con mejores caractersticas, las cuales se establecieron principalmente en los Estados Unidos. La primera variedad reportada fue la de Dorchester y luego la Snyder en 1851. A nivel mundial, las variedades de mora cultivada provienen de las especies Rubus occidentalis o de hibridaciones con Rubus ideaus. (CORPOICA, 1998). Con base en el manual de postcosecha del Sena (1999), se citan algunas especies de mora que aparte de la especie Rubus glaucus Benth se cultivan en Colombia, stas son: Rubus bogotensis HBK : Se encuentra sembrada en Antioquia, Valle, Santander y Cundinamarca, dentro de los rangos de altitud de 1.700 a 3.200 m.s.n.m. Los frutos son racimos muy apretados y con poco jugo.

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Rubus giganteus o Macrocarpus Benth: Esta especie se encuentra principalmente en el departamento de Cundinamarca sembrada en altitudes entre los 2600 a 3400 m.s.n.m. Se caracteriza porque el receptculo interno del fruto es hueco y los frutos son grandes con aproximadamente 7 cm de largo. Rubus megalococus : Esta variedad se encuentra sembrada principalmente en Cundinamarca entre los 2300 y los 2700 m.s.n.m. Es una planta rstica con frutos pequeos. Rubus nubigenus : Esta especie se encuentra sembrada principalmente en los departamentos de Caldas, Cundinamarca y Cauca a alturas entre los 2600 y 3100 m.s.n.m. Se caracteriza por presentar los frutos grandes. 2.4 HBRIDOS: Existen muchos hbridos con espinas y sin espinas, sobre algunos se dice que tienen uso muy limitado, ya que no han llenado las expectativas productivas y econmicas de los productores. Algunos de estos hbridos de mora han sido obtenidos del cruce entre especies de mora y frambuesa, como: Youngberry, Boysenberry, Dewberry, Tayberry, Loganberrry y Olallieberry. Sin embargo otros hbridos como Marionberry, resultado del cruce entre los hbridos de mora Chechalem y Olallieberry, constituye de acuerdo con The Oregon Raspberry & Blackberry Commission (ORBC) la variedad de mora ms plantada en el mundo que crece exclusivamente en Oregon y que se distingue por su sabor dulce y mucho aroma. (http://www.oregonberries.com).

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2.5 CONDICIONES EDAFOCLIMTICAS PARA EL CULTIVO DE LA MORA: La mora tiene un rango de adaptacin amplio (1.600-3.000 m.s.n.m.) y manifiesta su mayor potencialidad productiva en zonas ubicadas entre los 1.800 y 2.400 m.s.n.m, con una temperatura de 11 a 18 C y rgimen de precipitacin de 1500 a 2500 mm ao. (Escoto, 1994). El cultivo requiere entre 1200 y 1600 horas luz/ao y una humedad relativa entre el 70 y el 80%, lo cual puede encontrarse en las alturas de nuestro medio, lo que obliga la escogencia cuidadosa de zonas de siembra. Los mejores suelos son los textura franca, ricos en materia orgnica y buen drenaje. La mora es un cultivo exigente en Nitrgeno, Fsforo, Calcio y Magnesio (Franco & Giraldo, 2000). 2.6 AGRONOMA DEL CULTIVO: 2.6.1 Desarrollo del fruto: Las etapas de desarrollo varan en el tiempo, segn la zona y las condiciones predominantes del clima. En general, los perodos para el desarrollo del fruto son:

ETAPAS DE DESARROLLO Yema, botn floral Inicio floracin-apertura flor Apertura floral-polinizacin Polinizacin-formacin de fruta Formacin de fruta-cosecha Total

DIAS 6 23 5 8 40 82

De siembra a produccin de yema son 5 meses para un total de 8 meses, incluidos los 82 das del desarrollo de las yemas y frutos.

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La planta de mora produce diferentes tipos de ramas como: - Rama ltigo: Son ramas muy delgadas, con hojas pequeas y escasas. Crecen horizontalmente buscar el suelo y tienen tendencia a enterrarse. Estas ramas deben cortarse desde su punto de origen porque son ramas que generalmente no florecen. - Ramas vegetativas o machos: Son ramas gruesas con muchas espinas, que se conocen porque su terminal o punta tienen las hojas cerradas, se deben cortar para estimular la emisin de ramas secundarias que pueden ser vegetativas o productivas. - Ramas productivas o hembras: Son ramas ms gruesas que las ramas ltigo, pero ms delgadas que los machos. Se conocen porque crecen verticalmente y su punta o terminacin siempre tienen hojas abiertas. 2.6.2 Mtodos de Propagacin de mora: Propagacin por estaca: Las estacas deben tener consistencia leosa o semileosa, provenir de ramas secundarias o terciarias que ya hayan fructificado, que tengan como mnimo, un centmetro de grosor, y que la estaca cortada quede con tres yemas en buen estado, como mnimo. Es el sistema ms recomendado por lo fcil de realizar, y porque brinda ventajas econmicas (Anta y Torres, 1998). Propagacin por acodo: El acodo es un mtodo de propagacin mediante el cual se provoca la formacin de races en un tallo que todava est pegado a la planta.

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Consiste en introducir la punta de una rama productiva, en la tierra o en una bolsa con tierra; antes de enterrar la rama se le deben quitar las hojas terminales, pero no el pice. Propagacin por semilla: Es un mtodo poco utilizado porque tiene desventajas como: lenta germinacin y lento desarrollo de las plantas. 2.6.3 Plagas y Enfermedades: Los principales problemas sanitarios que afectan la mora son causados por plagas y enfermedades. Las plagas ms importantes son: Perla de tierra (Margarodes sp): El dao principal es la destruccin de las races. Forma agallas y verrugas al chupar la savia, produce clorosis y poco desarrollo radicular facilitando el volcamiento; Por lo general su deteccin es tarda. Cuando la perla se ha enquistado en la raz ningn tratamiento qumico es eficiente, por eso son importantes otras medidas de manejo, como: Escoger muy bien bien los materiales de siembra, hacer revisiones peridicas de las races, fertilizar adecuadamente, etc. La mosca de la fruta (Anastrepha sp). Esta plaga prospera en la pulpa de la fruta y ataca cuando los frutos estn maduros, favoreciendo la entrada de enfermedades que causan pudricin. La aparicin de la mosca se previene recolectando la mora madura dos veces por semana y colocando trampas con feromonas. En cuanto a enfermedades se tienen: Antracnosis: Enfermedad causada por el hongo Colletotrichum sp. que ataca hojas y tallos. Se observan manchas oscuras en ramas y tallos que en

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su interior se tornan de color caf, ataca los botones florales, brotes tiernos, pednculos y frutos. Para su manejo se recomienda podar y quemar las partes afectadas, fertilizar oportunamente, desyerbar , platear. Agalla de la corona: La causa de esta enfermedad es una bacteria llamada Agrobacterium tumefaciens. Se presentan agallas o tumores en el tallo generalmente cerca al cuello de la raz, o un poco ms altos. Esta enfermedad se propaga principalmente en los materiales empleados para la siembra y por heridas realizadas a las plantas. Por eso se recomienda cortar, sacar y quemar las ramas con agallas, seleccionar bien los materiales que se van a propagar, desinfectar el suelo, no sembrar en suelos mal drenados, fertilizar oportunamente. Pudricin de fruto: Es una enfermedad causada por el hongo Botrytis cinerea, que ataca los frutos principalmente, en los que se observa el micelio del hongo de color grisceo. El ataque es ms fuerte en pocas lluviosas. Para controlarlo se debe proporcionar una buena ventilacin y luminosidad a la fruta, la cual se logra con poda antes de la floracin. A partir de la floracin se procede con la aplicacin de fungicidas como Captan, Mancozeb, etc, cada 15 o 22 das de acuerdo con el clima y la severidad del ataque. Mildeo Polvoso u Oidio: Producida por el hongo Oidium sp. Este hongo cambia el color de las hojas (mosaico) y las deforma, se localiza en hojas jvenes y se presentan un polvillo blancuzco por el envs, tambin en tallos, flores y frutos, las ramas afectadas toman apariencia de ltigo. Para el control se recomienda mantener limpio y aireado el cultivo, fertilizar oportunamente.

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2.7 IMPORTANCIA SOCIOECONMICA DE LA MORA : Situacin Mundial: La produccin mundial de mora en la ltima dcada prcticamente no present crecimiento, pues de 376.148 toneladas mtricas producidas en el ao 1992, en el 2001 la produccin apenas ascendi a 384.044, esto es, tan solo un 2.1% mayor que hace 10 aos. El 82% de la produccin mundial en el ao 2000 se realiz en los pases en desarrollo, en Asia el 78.4% y en Europa el 11%, Amrica produce el 8.7%. (Corporacin Colombiana Internacional, 2001). En trminos de pases, los asiticos ocupan los tres primeros lugares, sobresaliendo Vietnam con el 31% de la produccin del mundo de estas bayas, en segundo lugar Turqua con el 16.7% y en tercer lugar, China con el 7.3%. (Figura 2). En Amrica, Estados Unidos es el principal productor, con una participacin del 5.7%, seguido por Mxico con el 1.5% y Ecuador con el 1.1% (Figura 2). A pesar de que en las cifras de la FAO no aparece registrado Chile como productor mundial, hay que anotar que es proveedor importante de esta fruta en los mercados internacionales, abasteciendo a Estados Unidos en un 19% de sus importaciones y ubicndose entre los principales proveedores de la Unin Europea. (Corporacin Colombiana Internacional, 2001).

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PRINCIPALES PAISES PRODUCTORES DE MORA

1,10% 1,50% 5,70% 7,30% 31% Vietnam Turquia China USA Mexico Ecuador

16,70%

Fuente: Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural. Clculos: Corporacin Colombia Internacional, 2001. Figura 2. Principales pases productores de mora.

Comercio mundial Las exportaciones mundiales de mora, de acuerdo con cifras de la FAO, ascendieron en el ao 2000 a 57.028 toneladas mtricas, equivalentes al 16.2% de la produccin mundial de ese ao y siendo un 53.2% mayor que las 37.215 toneladas registradas en 1991. Los pases en desarrollo, siendo productores del 82% de estas frutas en el mundo, tan solo contribuyen con el 11.5% de las exportaciones mundiales de las bayas. (Corporacin Colombiana Internacional, 2001). Los principales pases exportadores fueron en su orden, Canad con un 47.1% de las ventas en el mundo, Estados Unidos el 13.7% y la Unin Europea el 13.4% con la participacin fundamental de Espaa en un 6.4%. En Amrica Central se destacan Mxico y Guatemala, con 7.5% y 2.8% de la

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participacin en las exportaciones mundiales, respectivamente. (Corporacin Colombiana Internacional, 2001). Situacin Nacional: El rea de mora sembrada en Colombia aument de 3,167 hectreas sembradas en 1992 a 7,613 hectreas en el ao 2000, con una tasa de crecimiento promedio anual del 11.0% durante este perodo, donde los departamentos de Cundinamarca, Santander, Valle, Antioquia y Tolima concentran el 76% del rea total de mora sembrada en el pas. Figura 3. El departamento con mayor rea cultivada de mora en el ao 2000 fue Cundinamarca con 2,205 hectreas. Entre 1992 y 2000 su crecimiento ha sido permanente a una tasa promedio anual de 14.9%. (Corporacin Colombiana Internacional, 2001). rea y Produccin Nacional de mora

Fuente: Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural. 2.000 Figura 3. rea y Produccin nacional de mora.

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Entre 1992 y 1995, Valle fue el primer departamento con mayor rea cultivada de mora a nivel nacional, sin embargo, entre 1992 y 2000 el rea se ha venido reduciendo a una tasa de decrecimiento anual del 2.0%. En el ao 2000 el departamento del Valle cultiv 925 hectreas de mora. (Corporacin Colombiana Internacional, 2001). Produccin: Durante los ltimos nueve aos, la produccin nacional de mora ha tenido un crecimiento constante a una tasa promedio anual del 12.0%. En el ao 2000 la produccin nacional fue de 61,170 toneladas. La mayor produccin en el ao 2000 se present en el departamento de Cundinamarca, el cual ha incrementado su produccin de manera acelerada con una tasa promedio anual de crecimiento del 19.2%, superando de manera importante a la tasa promedio de crecimiento anual nacional que corresponde al 12.0%. En el ao 2000, los departamentos de Antioquia, Santander, Huila y Valle registraron una produccin de 6,989, 6,848, 3,834 y 3,739 toneladas respectivamente, con una tasa de crecimiento promedio anual durante el perodo 1992 - 2000 de 6.4% para el departamento de Antioquia, 6.9% para Santander, 9.5% para Huila y 3.3% para el departamento del Valle. (Corporacin Colombiana Internacional, 2001). Durante el ao anterior, el mayor productor de mora fue el departamento de Cundinamarca que aport 26,263 toneladas, equivalentes al 44% de la produccin nacional, le siguen los departamentos de Valle y Santander con el 11% de participacin cada uno y Antioquia y Huila cada uno con el 6% del total de la produccin nacional. Figura 4.

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Participacin por departamentos en la produccin nacional de mora 2000.

Fuente: Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural. Clculos: Corporacin Colombia Internacional, 2001. Figura 4. Participacin por departamentos en la produccin nacional de mora 2000.

Rendimiento: El rendimiento en el cultivo de mora, entre los aos 1992 y 2000, registr un leve crecimiento a una tasa promedio de crecimiento anual de 1.0%, pasando de 7.1 ton/ha en 1992 a 8.0 ton/ha obtenidas en el ao 2000. Figura 5. Rendimiento en la produccin nacional de mora. (Ton/ha)

Fuente: Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, 2000. Figura 5. Rendimiento en la produccin nacional de mora. (Ton/ha).

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El mayor rendimiento del cultivo de mora durante el ao 2000 se obtuvo en el departamento de Cundinamarca con 11.9 ton/ha, el cual se ha mantenido por encima del promedio nacional durante los ltimos ocho aos, con una tasa de crecimiento de 4.3% entre 1992 y 2000. (Corporacin Colombiana Internacional, 2001). En el departamento del Valle, para el ltimo ao se registr un valor por debajo del promedio nacional, correspondiente a 4.0 ton/ha. Por su parte el departamento de Santander, a pesar de haber incrementado el rea sembrada en el perodo 19922000, su rendimiento ha venido descendiendo considerablemente, pasando de 10.3 ton/ha en 1995 a 6.6 ton/ha en el ao 2000. (Corporacin Colombiana Internacional, 2001). En Colombia, el consumo aparente de mora en fresco creci a una tasa promedio anual del 5.9% entre 2000 y 2001, pasando de 36.892,7 toneladas a 43.795,7 toneladas, mientras que el consumo per cpita present una tasa de crecimiento del 6,9%, al pasar de 0,9 Kg. a 1,1 Kg durante el mismo perodo. La fruta fresca se destina a la elaboracin domstica de jugos, dulces, y mermeladas caseras, ya que el sabor de la fruta no resulta agradable para el consumo; esta situacin puede cambiar con la introduccin de variedades e hbridos dulces o mediante investigaciones tendientes a incrementar el contenido de azcar de la mora de Castilla. (Corporacin Colombiana Internacional, 2001). 2.8 RECURSOS GENETICOS La biodiversidad puede definirse como la riqueza, la cantidad y gran variedad de seres vivos que viven en una determinada rea. Incluye el nmero total de especies y variedades que existen en un ecosistema terrestre, de aguas dulces o marinas, en el suelo, en los bosques y en las reas agrcolas. La

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biodiversidad tambin incluye las diferentes culturas y etnias que habitan en un territorio, contiene los recursos biolgicos como los animales, los vegetales y los seres humanos, los cuales estn asociados de forma inseparable al conocimiento para su uso y manejo. La diversidad se compone no slo de un elemento, sino de la variacin y la abundancia relativa de especies, de modo que las medidas de diversidad as consideran estos dos factores: riqueza de especies, que es el nmero de especies; y uniformidad, estos es, en qu medida son abundantes las poblaciones de cada especie. Los cambios que se presentan en las especies a travs del tiempo son debidos a factores tales como: Mutacin: nica fuente de todos los alelos nuevos y origen de la variabilidad gentica en su totalidad. Variacin o deriva gentica: Fluctuaciones aleatorias de las frecuencias de los alelos que ocurren en pequeas poblaciones (efecto fundador). Seleccin: Reproduccin diferencial originada en la mayor capacidad de supervivencia que confieren ciertos alelos (adaptacin). Enlace concordante: Eleccin no aleatoria de la pareja (basada en aspectos culturales, religiosos, geogrficos, etc). Flujo gnico: Aporte de nuevos genes por cambios de asentamientos de las poblaciones (migraciones). Por otra parte, la conservacin de los Recursos Filogenticos ha adquirido relevancia en las ltimas dcadas, atendiendo la magnitud y velocidad de prdida de germoplasma producida en la naturaleza.

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El germoplasma vegetal involucra a todo tejido vivo constituido por clulas germinales portadoras de la herencia, con capacidad de reproducir un nuevo individuo. Dicha definicin origina categoras de germoplasma tales como: especies silvestres emparentadas con los cultivos, variedades tradicionales y razas locales, producto de la seleccin emprica a travs de siglos en las reas de cultivo tradicional, variedades modernas actualmente en uso, as como materiales genticos especiales (lneas avanzadas, mutantes, aneuploides, stocks genticos producto de la actividad de mejoramiento gentico). La destruccin o modificacin de los centros de origen de los cultivos, y el continuo desplazamiento de variedades tradicionales y razas locales por variedades modernas, poseen caractersticas tales como uniformidad, como respuesta a una creciente presin de mercado para producir nuevas variedades con estndares muy exigentes. Dicha uniformidad y el empleo de bases genticas estrechas las condiciona a condiciones de vulnerabilidad frente a adversidades y cambios climticos o ataque de plagas o patgenos. Por tales motivos conservar germoplasma tiene como funcin, asegurar la disponibilidad de variabilidad gentica de especies de importancia socioeconmica actual y potencial para su uso en programas de mejoramiento gentico. 2.9 GENETICA DE POBLACIONES La gentica poblacional estudia los modelos matemticos que explican de manera aproximada, la inter-relacin entre la estructura gentica de una poblacin biolgica y los factores que regulan su proceso evolutivo.

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Las especies presentan diversos arreglos de distribucin y abundancia espacial y temporal en la naturaleza. La existencia de poblaciones, metapoblaciones y subpoblaciones, es un indicativo de la dinmica espaciotemporal que es inherente a las especies. La dinmica que presentan las especies, agrupadas inicialmente en poblaciones, es fundamentalmente el resultado de fuerzas modificadoras como la seleccin, el flujo de genes, la deriva gentica y la migracin, entre otras. La interaccin que se presenta entre las fuerzas modificadoras y las caractersticas ecolgicas particulares de las especies, ha llevado a ensamblajes espaciales definidos, que originan una diversidad de modelos demogrficos y genticos. Tanto, la dispersin, como los sistemas de reproduccin, son considerados dos factores ecolgicos de vital relevancia en la formacin de estructuras genticas particulares. (Hedrick et al, 1976). 2.9.1 Modelos de Dispersin La dispersin debe ser entendida desde dos puntos de vista: como migracin y como colonizacin. La primera se refiere al movimiento de los individuos y a la incorporacin de sus genes en poblaciones establecidas. Por otra parte, la colonizacin, se refiere al movimiento y establecimiento de los individuos y sus genes en hbitat vacantes. Esta dualidad que presenta la dispersin tiene diferentes efectos en el flujo de genes dentro y entre poblaciones, originando a su vez predicciones diferenciales en cada caso. Dada la intrincada relacin existente entre los factores ecolgicos y fuerzas modificadoras, se pueden definir tres modelos de dispersin: modelos de flujo gentico, modelos de extincin/recolonizacin y modelos de seleccin interdrmica (Nason et al, 1997).Dentro de estos modelos de flujo gentico se encuentran a su vez tres modelos: el modelo de islas de Wright (1951) el

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modelo por pasos (stepping-stone model) y el modelo de aislamiento por distancia (Hedrick 1983). De estos modelos se puede inferir que existe una relacin estrecha entre las tasas de migracin y el proceso de diferenciacin gentica, medido a travs de la intensidad y persistencia que tenga el flujo gentico (dado por polen o por semilla) y el grado de subdivisin y distanciamiento geogrfico que presentan las poblaciones, los cuales en sumatoria estarn teniendo efectos en el grado de estructuracin que presenten las poblaciones. A nivel gentico, la dispersin cobra una relevante funcin, ya que determina en gran parte, la estructura gentica de las poblaciones a travs del flujo de genes, y con l, los cambios en las frecuencias allicas que determinan las diferencias y/o las similitudes. Habilidad de la dispersin y la distribucin de la diversidad gentica La relacin entre dispersin de genes y los niveles de diversidad gentica dentro de las especies de plantas o sus poblaciones puede ser ilustrado al examinar el efecto de los sistemas de reproduccin de las plantas y los mecanismos de dispersin de polen. Es muy probable encontrar altos niveles de variabilidad gentica entre poblaciones de plantas que se reproducen por alogamia, mientras que por el contrario, aquellas poblaciones que presentan un sistema de reproduccin endogmico amplio tienen los niveles ms bajos de variabilidad. Lo anterior est asociado igualmente con los diferentes mecanismos de dispersin de polen (polinizacin por el viento, por aves, entomfila, por murcilagos), los cuales operan a diferentes escalas espaciotemporales. Por ende, el movimiento de polen puede ser considerado en algunos casos un evento de flujo gentico que podra reducir la heterogeneidad entre poblaciones. (Hedrick 1983).

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De sta forma, los niveles de diversidad gentica (descritos por parmetros tales como el nmero de alelos por locus polimrfico, y el ndice de diversidad gentica o heterocigosidad) estn influenciados principalmente por el sistema de reproduccin de las especies y por su sistema de dispersin, tanto de polen como de semillas. Existen asimismo mltiples factores, como el predominio de un sistema de reproduccin exogmico, la morfologa floral, el tipo de reproduccin sexual y la duracin del ciclo de vida, que pueden estar influyendo de una forma mayor a la formacin de una estructura gentica particular. No obstante, la dispersin de semillas y polen evaluadas a diferentes escalas espaciotemporales ha sido el principal componente para confirmar tales planteamientos. (Hedrick 1983). 2.9.2 Accin de la deriva gentica y la endogamia en poblaciones pequeas El aislamiento geogrfico altera el flujo gentico entre poblaciones, originando en algunos casos poblaciones pequeas. Dos consecuencias genticas del tamao pequeo en las poblaciones son la deriva gentica y la endogamia. La deriva gentica al azar, o simplemente deriva gentica, se refiere al cambio aleatorio en las frecuencias allicas y genotpicas debido a errores de muestreo en la transmisin de los genes de una generacin a otra. La acumulacin de stos cambios lleva eventualmente a la fijacin de uno de los alelos en todos los individuos de la poblacin, a menos que el flujo de genes o las mutaciones eviten esto.

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La deriva gentica cambia la distribucin de la variacin gentica de dos formas: 1) el decrecimiento de la variacin dentro de las poblaciones (prdida de heterocigosidad y fijacin eventual de alelos), y 2) el incremento de la diferenciacin entre poblaciones. Cada poblacin finita experimenta deriva gentica, pero los efectos son ms pronunciados en poblaciones con tamao en decrecimiento, debido a que se aumenta la incidencia en las fluctuaciones de las frecuencias allicas en este tipo de poblaciones (Falconer 1989; Futuyma 1998). La evolucin de la estructura gentica y su mantenimiento en el tiempo y en el espacio estn sujetas a la accin de tres fuerzas evolutivas con efectos divergentes. Por un lado, la seleccin natural y la deriva gentica (fuerzas que favorecen la diferenciacin gentica de una poblacin), y por otro, el flujo gentico, el cual promueve la homogenizacin de la diversidad gentica entre poblaciones, minimizando el grado de diferenciacin gentica a grandes escalas (Nason 2002). 2.9.3 Diversidad gnica promedio

Cuando las frecuencias allicas son estudiadas en muchos loci la variacin gentica en una poblacin es medida por la diversidad gnica promedio, la cual a menudo es llamada heterocigosidad promedio. La heterocigosidad no es la frecuencia observada de heterocigotos en la poblacin, sino la heterocigosidad esperada bajo la restriccin de equilibrio Hardy-Weinberg.

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Razones por la que se usa la heterocigosidad esperada: 1- nicamente depende de las frecuencias allicas. 2- Puede ser usada sin considerar el sistema de apareamiento de la poblacin, el cual es transitorio o tpico de la especie. 3- No depende de la plodia del individuo estudiado. La diversidad gnica en un locus se calcula:
q H = 1- xi2 i=1

Donde: Xi = Frecuencia en la poblacin del alelo i q = Nmero de alelos Indice de fijacin: En poblaciones reales, no necesariamente cada subpoblacin sigue el equilibrio Hardy-Weinberg, por lo tanto, F en cada subpoblacin podra no ser cero. Los ndices de fijacin son tiles para entender la estructura de cruzamientos de las poblaciones, y el patrn de seleccin asociado con alelos polimorficos. S. Wrigth (1978) propuso que las desviaciones de las frecuencias genotpicas en una poblacin subdividida, seran medidas en trmino de tres parmetros; FIS, FIT y FST, llamados ndices de Fijacin. FIS es la correlacin entre dos gametos escogidos al azar respecto a la subpoblacin.

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FIT es la correlacin entre dos gametos escogidos al azar respecto a la poblacin total. FST es la correlacin entre dos gametos escogidos al azar de cada subpoblacin respecto a la poblacin total. Mide el grado de diferenciacin gentica de las subpoblaciones. Nei en 1973, redefini los ndices de fijacin sin considerar el concepto de correlacin entre gametos, pero s las relaciones filogenticas, patrones de migracin, del nmero de alelos y si estn o no en seleccin. En esta teora los ndices de fijacin FIS, FIT y FST, son definidos en trminos de tres heterocigosidades: La heterocigosidad Observada dentro de las subpoblaciones (H0), la heterocigosidad Esperada dentro de las subpoblaciones (HS) y la heterocigosidad total esperada (HT). Ahora los ndices de fijacin pueden ser definidos usando H0 , HS y HT en la siguiente forma (Nei 1987):
HS - H0 FIS = ------------HS HT - H0 FIT = ------------HT HT - HS FST = -----------HT

FIS y FIT pueden ser negativos cuando H0 es inusualmente alto. FST no puede ser negativo ya que siempre HT HS. Es equivalente al

ndice de fijacin de Wright, desarrollado para el caso de dos alelos. Por otra razn el FST definido para alelos mltiples es denominado GST el cual fue originalmente llamado coeficiente de diversidad Gnica de Nei (1973).

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2.10 MARCADORES MOLECULARES Los caracteres fenotpicos resultan de fcil observacin, pero estn muy influenciados por el ambiente y su control gentico es poco claro. Los marcadores moleculares permiten estudiar directamente el material gentico, pero normalmente se trata de rasgos sin reflejo en el fenotipo. Sin embargo, no es fcil estimar el verdadero grado de variacin gentica. En principio, las nicas diferencias observables entre individuos eran rasgos fenotpicos (coloracin, rasgos morfolgicos, tamao, diferencias de crecimiento o comportamiento); pero la variacin gentica correspondiente a estas diferencias no est bien determinada: rasgos controlados por varios genes, interaccin entre ellos, influencia del ambiente. A partir de los aos sesenta, el desarrollo de tcnicas para estudiar la variacin a nivel molecular abri la posibilidad de estudiar caracteres con un control gentico sencillo, tales como las diferencias de movilidad en protenas; posteriormente, se ha hecho posible estudiar directamente la variacin en la molcula de ADN. Con los marcadores moleculares se estima la diversidad gentica. Existen distintos tipos de tcnicas, que ofrecen distintos tipos de informacin segn las caractersticas de la molcula o fragmento de molcula analizado, lo ms comn es detectar diferencia de tamao; a partir de las frecuencias con que aparecen cada una de las variantes (alelos) se calculan diversos parmetros que dan la medida de la diversidad y permiten comparar entre las especies y/o estudios. (CIAT, 1999). A partir de estos datos tambin es posible establecer relaciones de paternidad y parentesco, relaciones filogenticas, o analizar que procesos estn ocurriendo en las poblaciones (migracin, deriva gentica, cuellos de

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botella, etc). De acuerdo a la tecnologa utilizada suelen distinguirse dos tipos de marcadores: Basados en el anlisis de protenas (anlisis isoenzimtico, polimorfismo posicional de pptidos). Basados en el anlisis de ADN. En esta categora encontramos dos grandes grupos de marcadores: Los revelados mediante hibridacin con sondas marcadas y los obtenidos mediante amplificacin por PCR (Polymerase Chain Reaction o Reaccin en Cadena de la Polimerasa). Esta tcnica usa ADN molde, dos oligonucletidos cebadores o iniciadores de 20-28 bases complementarias a secuencias especficas del ADN molde. La extensin a partir de los cebadores es catalizada por la Taq DNA polimerasa (enzima termoestable aislada de Thermus aquatics ) (Mullis, Faloona, 1987). La mezcla de cebadores, ADN, dNTPs y Taq se calienta para separar las cadenas del ADN que tienen la secuencia de inters y luego se enfra para que los cebadores encuentren la secuencia complementaria y se unan a ella. Luego la polimerasa los extiende a 72C y se genera una nueva cadena. Las series de calentamiento y enfriamiento multiplican el ADN en forma exponencial. En una hora aproximadamente 20 ciclos de PCR pueden amplificar el ADN situado entre los cebadores en un milln de veces (CIAT, 1999). Para aplicar esta tcnica es necesario optimizarla para cada uno de los estudios a realizar, pero el parmetro ms crtico para un PCR exitoso es la eleccin correcta de los cebadores. Adems de tener una secuencia nica dentro de la regin a amplificar, los cebadores deben poseer, en el extremo 3, residuos G/C para facilitar su alineamiento en el DNA molde ( Sharrocks, 1994 ).

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Adems de esta divisin segn el tipo de molcula utilizada los marcadores se caracterizan como haploides o diploides, dependiendo del tipo de genoma de que provengan, y como dominantes (cuando, en el caso de individuos heterocigotos, slo es posible observar el alelo dominante) o codominantes (cuando pueden distinguirse los dos alelos en heterocigosis). 2.10.1 Marcadores proteicos: Los marcadores proteicos son generalmente codominantes, y permiten el anlisis a la vez de varios loci. Los genotipos resultantes de dichos anlisis se pueden procesar como cualquier clase de datos mendelianos codominantes y los resultados obtenidos se pueden utilizar en anlisis de poblaciones, relaciones inter.- e intrapoblacionales, taxonoma, anlisis de parentesco, estudio de ligamientos e identificacin de hbridos. Las tcnicas ms utilizadas son el anlisis isoenzimtico y la electroforesis en dos dimensiones. 2.10.2 Marcadores de ADN: Los marcadores de ADN presentan una serie de ventajas frente a los proteicos: no se ven afectados por variaciones ambientales ni de desarrollo, muestran la base misma de la variacin de los individuos, permiten seleccionar regiones concretas dentro de la molcula de ADN para estudios determinados, el nmero de polimorfismos detectables es tericamente ilimitado, permiten analizar tanto la informacin que se expresa como la que no, y en la actualidad, se han desarrollado un gran nmero de tcnicas adecuadas a las diferentes situaciones. Los marcadores moleculares tienen diferentes caractersticas en cuanto a su tipo de herencia y dominancia; por lo tanto, la eleccin de los mismos debe hacerse pensando en la informacin que se quiere obtener. En este sentido, al elegir la tcnica a utilizar tendremos en cuenta si proporciona un marcador dominante o codominante, si maneja ADN nuclear (generalmente de origen biparental), o ADN mitocondrial de origen monoparental (materno) o ADN de

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cloroplasto, tambin de origen monoparental (dependiendo de las especies es paterno o materno). Tambin ser necesario tener en cuenta el costo y la dificultad de la tcnica, as como la necesidad de informacin previa de la secuencia de ADN, o el uso de radioactividad. 2.10.3 Marcadores Microsatlites En el inicio de los 80 se demostr que los genomas eucariontes estn densamente poblados por diferentes clases de secuencias repetidas, unas ms complejas y otras ms sencillas (Hamada, 1982). La secuencias sencillas repetidas (SSR Simple Secuence Repeats) ms tarde denominados Microsatlites (Litt & Luty 1989), consisten en pequeas secuencias de uno a cuatro nucletidos adyacentes repetidas lado a lado. Estos loci altamente polimorficos, amplificados va PCR constituyen la clase ms polimrfica de marcadores moleculares hoy disponible. Los microsatlites han sido observados en diversos organismos como en seres humanos (Litt & Luty 1989), ballenas, Drosophila (Tautz, 1989), ratones (Love et al., 1990), bovinos y caprinos (Moore et al., 1991), entre otros. En plantas se observ que oligonucletidos compuestos por elementos repetitivos del tipo TG y GATA /GACA, detectaban polimorfismo cuando se utilizaban como sondas RFLPs (Weising, 1995). Tambin en plantas una bsqueda en bancos de datos de ADN publicadas revel que los sitios de microsatlites estn ampliamente distribuidos con una frecuencia de 1 cada 50 mil pares de bases. Su presencia se constat en 34 especies vegetales, siendo el elemento repetido ms comn el dinucletido AT (Morgante & Olivieri, 1993). En la actualidad, los marcadores basados en microsatlites estn siendo desarrollados para elaborar mapas genticos para algunos cultivos anules como: Soya arroz y trigo (Akkaya et al., 1992) (Roder et al.,

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1995), as como para especies forestales, como Pinus spp (Smith & Devey, 1994) y frutales como Citrus spp (Ferreira et al., 1998). Los microsatlites son un tipo de marcador de ADN que est adquiriendo preponderancia en la definicin de genotipos individuales y en los estudios de flujo de genes en especies vegetales. Los microsatlites o repeticiones de simple secuencia (SSRs), consisten en segmentos de ADN que contienen numerosas repeticiones en tandem de una secuencia de Tema corto, normalmente de uno a cuatro bases. Se ensayan mediante la amplificacin por reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) (Mullis & Faloona, 1987), utilizando cebadores diseados para acoplar las secuencias nicas que flanquean la secuencia en tandem. El proceso PCR da lugar microsatlite. La utilidad de los microsatlites se debe a su gran variabilidad, junto con la capacidad de hacer en forma semiautomtica su anlisis y clasificacin. Los microsatlites son marcadores codominantes (los heterocigotos se pueden distinguir de los homocigotos) y por ello son ms informativos para definir genotipos individuales y poder realizar mapas de ligamiento, que los marcadores dominantes, como los RAPDs y los AFLPs. Los microsatlites tienen entre otras ventajas, que por aportar un alto contenido de informacin desde el punto de vista de polimorfismo, toda y cualquier poblacin segregante puede ser utilizada como poblacin de referencia para estudio de ligamiento y mapeo gentico, con el objeto de seleccionar la poblacin ms informativa desde el punto de vista de caractersticas biolgicas o econmicas de inters. Permiten una completa cobertura del genoma eucarionte por su alta frecuencia y distribucin al azar. Todas estas caractersticas sumado a que los fragmentos polimorficos a un gran nmero de copias del segmento elegido de ADN que contiene la secuencia

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generados son lo suficientemente pequeos para ser detectados va PCR, es lo que hace que estos marcadores sean ideales para el mapeamiento gentico y fsico, para la identificacin y discriminacin de genotipos y en estudio de gentica de poblaciones. Sin embargo, el nmero de secuencias microsatlites en el genoma es limitado, lo que restringe su empleo para la elaboracin de mapas genticos, cuando se compara con el nmero potencialmente ilimitado de loci correspondientes a los RFLPs, RAPDs y AFLPs. Otras limitaciones para su empleo son en primer lugar, el esfuerzo y el gasto necesario y en segundo trmino, la evidencia de que sus secuencias de flanqueo pueden no conservarse mucho a travs de las especies de algunos gneros, por lo que los marcadores no son transferibles a especies no relacionadas directamente (Karhu et al., 1997). En estudio de poblaciones la fuerte variabilidad detectada dentro de las mismas utilizando microsatlites, puede reducir de hecho su poder para detectar diferencias entre poblaciones (Hedrick 1983). 2.10.3.1 Microsatlites RAMs: Los microsatlites son regiones de Dado que

secuencias de ADN pequeas y repetidas, generalmente de dos a tres nucletidos, los cuales pueden o no estar asociados con genes. la repeticin por s misma no codifica para formar ninguna protena, y debido a que las secuencias de ADN repetitivo pueden recombinarse y expandirse ms frecuentemente que otros tipos de secuencia, estas regiones son a menudo altamente variables y muy tiles para medir similitudes entre especies o variedades relacionadas. Los polimorfismos observados corresponden a diferencias de longitud provocadas por un nmero distinto de repeticiones. Dependiendo del ADN

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utilizado como molde en la amplificacin, los microsatlites son nucleares (genoma nuclear) o de cloroplasto (genoma de esta organela). La amplificacin de estos elementos exige un conocimiento previo de la secuencia que flanquea a los microsatlites para poderlos utilizar como cebador en la amplificacin. Los microsatlites se corresponden con regiones hipervariables, por lo que presentan un alto grado de polimorfismo. Estos marcadores permiten realizar estudios individuales entre poblaciones, mapas genticos y estudios filogenticos. Los de cloroplasto son especialmente interesantes en el estudio de historia de las poblaciones, flujo gentico, hibridacin e identificacin de reas que guardan una alta diversidad gentica. Este mtodo es muy eficiente y proporciona tantos datos para estudios entre especies, como microsatlites resulten del alto grado de mutaciones. Sin embargo, la necesidad de clonacin, secuenciacin y sntesis de los primers especficos de la especie, reduce su universalidad. Recientemente Zietkiewicz et al (1994) demostraron un nuevo mtodo para medir la diversidad gentica en plantas y animales usando primers basados en microsatlites. Hantula, J. et al, (1996) propusieron el nombre de RAMs, a la tcnica de Zietkiewicz et al (1994). Seleccionaron cuatro primers (GT, ACA, CCA, CGA) que fueron diseados teniendo una longitud de 18 bases incluyendo un extremo 5 degenerado, el cual sirve de anclaje para asegurar la unin del primer al inicio del microsatlite. La tcnica se ha utilizado para generar marcadores de ADN de los hongos Armillaria cepistipes, Gremmeniella abietina, Heterobasidion annosum, Phytophthora cactorum, Phlebipsis gigantea, y Stereum sanguinolentum, la tcnica es reproducible y aplicable a todos los hongos, incluyendo miembros de los Phycomycetes, Ascomycetes

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y Basidiomycetes; lo que permite detectar poliformismos de ADN interespecficos e intraespecficos. El mtodo molecular RAMs se ha utilizado recientemente para el estudio de cuatro especies de Myrothecium y cuatro de Myrothecium verrucaria en donde se muestra su fcil implementacin (Douglas, et al., 1999). Tambin ha sido utilizado para el estudio de la variacin gentica y especificidad del hospedero de Phytophthora cactorum (Hantula, et al, 1997) la diversidad de Tiarosporella en Finlandia, Noruega y Suiza (Muller y Hantula, 1998). Al igual que con aislamientos de Phaeoisariopsis griseola y Colletotrichum sp. (Mahuku, G, 1999; Mahuku, G. y Henriquez, M.A., 1999, Mahuku, G.; Henriquez, M.A. y Buruchara, R. 1999).

2.11 DESCRIPCIN DE LA COLECCIN DE MORA Rubus spp La coleccin de mora Rubus spp de la Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira est localizada en la finca Proyecto Vida en la Vereda la Cecilia, corregimiento de Juntas Municipio de Ginebra Valle, ubicada a una altura de 2.100 m.s.n.m. (foto de la coleccin). Cuenta con 72 materiales, los cuales fueron colectados en los departamentos del Valle, Cauca y Nario, y algunos de ellos donados por la Universidad del Quindo. Figura 6.

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N W S E

ESCALA 1: 80.000 Sitios de colecta

Figura 6. Sitios de colecta de los materiales de Rubus spp.

De acuerdo a la clasificacin taxonmica realizada por el Ingeniero Forestal Eugenio Escobar Manrique, los materiales de la coleccin pertenecen a tres especies: Rubus glaucus, Rubus urticifolius y Rubus robustus. Rubus glaucus Benth: Arbustos hasta 1.5 m de alto; tallos teretes; ejes glaucos y glabros; con agujiones amarillos grandes. Hojas compuestas, trifoliadas; estipulas basipecionlares, largo-lanceoladas, glabras; pecolos 3.8-8 cm largo; fololos ovado-lanceolados, largo-acuminados, 6-9 cm largo, 2,5-3,5 cm ancho, mrgenes serruladas, glabras por el haz, blancotomentosas por el envs. Inflorescencias terminales, racemoso-paniculadas; pedicelos largos, ms o menos aculeados, con pelos glandulosos rojos, espaciados, brcteas ovado-lanceolads, enteras o lobadas en el pice, con pelos glandulosos rojos; cliz densamente tomentoso con pelos blancos, lbulos ovado-triangulados, abruptamente acuminados, terminados en una sbula, con pelos glandulosos rojos por el envs; ptalos blancos; filamentos

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blancos, hasta 3 mm largo; pistilos hasta 4 mm largo, blancos, ovarios densamente tomentosos. Frutos hasta 2.6 cm. Ver foto 1. (Zamorano, 2003).

Foto 1. Rubus glaucus Benth

Rubus urticifolius Poir: Arbustos hasta 2 m de alto ; tallos 5-7 angulosos ; ejes con pelos glandulosos largos abundantes (superficie vilosa); agujones grandes anaranjados con pelos canescentes, en ocasiones con pelos glandulosos rojos. Hojas compuestas, 3-5 foliolos; estipulas basipeciolares, largo-lanceoladas13 mm largo, 1.5 mm ancho, angusti-lanceoladas hasta estrechamente ovado-lanceoladas, dioscreas o no, vilosas, con o sin pelos glandulares rojos por el envs; pecolos 3-12 cm largo; foliolos dioscreos, ovados hasta ovado-lanceolados, corto hasta largo-acuminados, 2,3-11.9 cm largo, 2,0-7,2 cm ancho, vilosos por el haz, densamente tomentosos por el envs. Inflorescencias: pednculos tomentosos, con pelos glandulosos rojos, brcteas tomentosas, con pelos canescentes y con pelos glandulares rojos, lbulos ovado-lanceolados, abruptamente acuminados, arista roja; ptalos blancos, teidos de rosado; filamentos de los estambres 0.2-0.3 cm largo,

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blancos; pistilos 0.2-0.3 cm largo, blancos; frutos hasta 1 cm. Ver foto 2. (Zamorano, 2003).

Foto 2. Rubus urticifolius

Rubus robustus: Arbusto escandente. Tallos angulosos, tomentoso a glabrescente, frecuentemente con sacos ssiles y glndulas subssiles, densamente espinosa, espinas angostas y gradualmente anchas hacia la base, 5-3 mm de longitud, curvadas. Estpulas sublobuladas-lanceoladas, de 7-8 mm. Pecolos de 25-100 mm de longitud, tomentoso o glabrescente, espinosos. Hojas con cinco foliolos, hojas ovado-elpticas de 7-11 x 3-7 cm, con 10-14 pares de venas secundarias, base redondeada. pice acuminado, margen serrulado, la superficie del envs con escasos pelos o vellos, tomento en las venas. Florece en racimo, algunas veces con 3 hojas o foliolos pequeos. Inflorescencia con panculas ms o menos laxas de 12-30 cm de longitud. Flores de 18-20 mm de dimetro, spalos ovalados, ptalos suborbiculares o ancho / ovado, rosados o blancos. Frutos globosos-ovados, con spalos ms o menos extendidos, drupas de 2.5-4 x 2-3 mm, 40-50 por

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receptculo, glabras o glabrescentes, morados. Ver foto 3. (Zamorano, 2003).

Foto 3. Rubus robustus

El registro de colecta (Anexo 1) de los diferentes materiales de la coleccin, se encuentra disponible en una base de datos computarizada obtenida mediante el programa Arcview, que ubica espacialmente las introducciones, permitiendo a los usuarios tener acceso a la informacin de cada una de ellas. (Zamorano, 2003).

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3. MATERIALES Y METODOLOGAS 3.1 LOCALIZACIN La caracterizacin molecular se llev a cabo en el Laboratorio Integrado de Investigaciones de la Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira, localizado en el Valle del Cauca, a una altura de 1.000 m.s.n.m y temperatura promedio de 24C. Para la caracterizacin molecular se utilizaron 36 materiales provenientes de los departamentos del Valle, Cauca y Nario, en los cuales estn incluidos 5 materiales donados por la Universidad del Quindo. (Tabla 1). 3.2 METODOLOGA 1: ESTANDARIZACIN DE UN PROTOCOLO DE EXTRACCIN DE ADN 3.2.1 Obtencin de Muestras Se tomaron de diferentes ramas de la planta hojas jvenes y maduras, las cuales fueron enrolladas en papel aluminio y guardadas en un termo que contena nitrgeno liquido. Las muestras maceradas fueron almacenadas a 80C, hasta su utilizacin. (Foto 4).

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Material vegetal e implementos utilizados en la extraccin de ADN.

Las hojas de algunos materiales fueron envueltas en papel peridico, se maceraron y se guardaron a 80 C para luego ser utilizadas en el proceso de extraccin de ADN.

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Tabla 1. Materiales de mora Rubus spp utilizados para la caracterizacin molecular con Microsatlites RAMs.

ACCESIONES UNAPM 1 UNAPM 2 UNAPM 3 UNAPM 4 UNAPM 5 UNAPM 6 UNAPM 7 UNAPM 8 UNAPM 9 UNAPM 10 UNAPM 12 UNAPM 13 UNAPM 14 UNAPM 15 UNAPM 16 UNAPM 17 UNAPM 18 UNAPM 19 UNAPM 20 UNAPM 21 UNAPM 22 UNAPM 23 UNAPM 24 UNAPM 25 UNAPM 26 UNAPM 28 UNAPM 29 UNAPM 30 UNAPM 31 UNAPM 32 UNAPM 33 UNAPM M1 UNAPM M2 UNAPM M3 UNAPM M4 UNAPM M5

ESPECIE R. glaucus R. glaucus R. glaucus R. glaucus R. glaucus R. glaucus R. urticifolius R. glaucus R. glaucus R. glaucus R. urticifolius R. glaucus R. glaucus R. glaucus R. glaucus R. glaucus R. glaucus R. robustus R. glaucus R. glaucus R. glaucus R. glaucus R. glaucus R. robustus R. urticifolius R. glaucus R. glaucus R. glaucus R. glaucus R. glaucus R. glaucus R. glaucus R. glaucus R. glaucus R. glaucus R. glaucus

PROCEDENCIA Juntas (Valle del Cauca) Palmira (Valle del Cauca) Cabrera (Nario) La Mina (Valle del Cauca) Juntas (Valle del Cauca) La Mina (Valle del Cauca) Juntas (Valle del Cauca) Cabrera (Nario) Ipiales (Nario) Miranda (Cauca) Cabrera (Nario) Juntas (Valle del Cauca) Juntas (Valle del Cauca) Ipiales (Nario) Tierradentro (Cauca) Tierradentro (Cauca) Tierradentro (Cauca) Trujillo (Valle del Cauca) Cabrera (Nario) Cabrera (Nario) Tierradentro (Cauca) Trujillo (Valle del Cauca) Juntas (Valle del Cauca) Ipiales (Nario) Juntas (Valle del Cauca) Hermosas (Valle del Cauca) Hermosas (Valle del Cauca) Hermosas (Valle del Cauca) Hermosas (Valle del Cauca) Calima (Valle del Cauca) Tula (Valle del Cauca) Caldas (Manizales) Caldas (Manizales) Caldas (Manizales) Caldas (Manizales) Caldas (Manizales)

59

3.2.2 Mtodos de Extraccin La aplicacin de las diferentes tcnicas empleadas en Biologa Molecular (construccin de libreras genmicas, RFLPs, PCR, AFLPs) para el anlisis del genoma, depende de la habilidad para obtener ADN puro, con alto rendimiento y de muy buena calidad, razn por la cual se utilizaron diversos mtodos de extraccin de ADN a fin de determinar cual de ellos es el ms eficiente y eficaz. Mtodo de Dellaporta et al (1983) modificado por Henrquez (2000) Se tomaron de 50-100 mg de tejido foliar, se maceraron con nitrgeno lquido y se colocaron en un tubo eppendorf. Se adicionaron 600 l del Buffer de Extraccin (Anexo 2), se mezcl y se incub por una hora a 65 C, agitando las muestras peridicamente cada 10 minutos. Despus se agreg la mitad del volumen (300 l) de Acetato de Amonio 7.5 M, se mezcl bien con la mano y se dej a temperatura ambiente por 10 minutos. Luego se centrifug a 12.000 rpm durante 10 minutos, y el sobrenadante se transfiri a otro tubo, donde se le adicion 600 l de isopropanol fro. Posteriormente se incub a 20 C por un mnimo de 2 horas o toda la noche. Transcurrido este tiempo se centrifugaron las muestras a 12.000 rpm por 15 minutos. Se removi el isopropanol y se dej el pellet, se aadieron 800 l de etanol 70% (fro) y se centrfugo por 5 minutos a 12.000 rpm, se boto el liquido y se sec el pellet por inmersin del tubo a temperatura ambiente por 15 minutos. Luego se agregan 100 l de Buffer 1X TE. Posteriormente se guardaron las muestras a 4 C toda la noche. Al da siguiente se mezcl el pellet con el TE utilizando una punta ancha para no fracturar el ADN.

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Mtodo de Fulton et al (1995) modificado por Restrepo (2003) Se tomaron de 50-100 mg de tejido foliar joven, se maceraron con nitrgeno liquido y se colocaron en un tubo eppendorf. Se adicionaron 750l del Microper Buffer (Anexo 3), se mezcl y se incub a 65 C durante 20-30 minutos. Posteriormente se adicion cloroformo-Isoamil (1:1) y se agit con el vortex, luego se centrifug a 10.000 rpm por 5 minutos y se transfiri a un tubo eppendorf nuevo 600 l del sobrenadante; al cual se le adicionaron 2/3 del volumen de isopropanol fro y se mezcl. Nuevamente las muestras se centrifugaron a 10.000 rpm por 5 minutos, al cabo de este tiempo se removi el isopropanol y se lav el precipitado con 1 ml de etanol al 70%. Se retir el etanol y se sec el precipitado colocando los tubos boca abajo sobre una toalla de papel por aproximadamente una hora. Se resuspendi el ADN en 50 l de TE a 65 C por 15 minutos y se centrifug a 10.000 rpm por 10 minutos. Finalmente el ADN se guard a 4 C hasta por una semana o a 20 C para perodos largos. Mtodo de Dellaporta et al (1983) modificado por Palacio (2003) Se tomaron de 200-300 mg de tejido foliar joven o maduro y se maceraron en nitrgeno liquido, se transfiri el tejido a un tubo eppendorf y se adicionaron 800 l del Buffer de Extraccin (Anexo 4), el cual haba sido previamente calentado a 65 C, y 50 l de SDS al 20%, se mezcl bien el tejido con el Buffer usando vortex o una punta y se incub a 65 C por 20 minutos, invirtiendo peridicamente. Posteriormente se adicionaron 250 l de Acetato de Potasio 5M fro, se mezcl y se incub en hielo durante 20 minutos en agitacin, despus se centrifug a 12.00 rpm por 10 minutos. Se transfirieron 800 l del sobrenadante a un tubo nuevo y se adicionaron 640 l de isopropanol fro (mezclando de 8-10 veces).

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Las muestras se incubaron a 20 C por dos horas. Al cabo de este tiempo se centrifugaron las muestras a 12.000 rpm durante 10 minutos y se les removi el isopropanol adicionndoles 500 l de T10E1 (Anexo 5) y se incubaron a 65 C por 15 minutos. Despus se adicionaron 400 l de isopropanol mezclando de 8 a 10 veces y se incub nuevamente a 20C durante 2 horas. Terminadas las dos horas se centrifug a 12.000 rpm por 10 minutos, se removi el isopropanol y se sec el precipitado colocando los tubos boca abajo sobre una toalla de papel por aproximadamente una hora. El ADN se resuspendi en 80 l de TE 10:1 y se adicion 1l de RNAsa (10 mg/ml) haciendo un corto spin. Finalmente el ADN se almacen a 4 C para usar a los pocos das y a 20C para tiempos mayores. 3.2.3 CUANTIFICACIN DE ADN Para determinar la concentracin del ADN de cada material de mora se hizo una curva de dilucin con ADN del bacterifago Lambda, de concentracin inicial (539 ng/ l) y concentracin final de 20 ng/l. En la tabla 2 se muestran los patrones utilizados para la cuantificacin.
Tabla 2. Patrones del Bacterifago Lambda. ADN LAMBDA (20 ng/ l) 1 2 3 4 5 BLUE JUICE 1X (l) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 TE 1X 4 3 2 1 0 VOLUMEN FINAL (l) 5.5 5.5 5.5 5.5 5.5 FINAL (ng/l) 20 40 60 80 100

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En un gel de agarosa al 0.8% preparado con TBE 0.5X (Anexo 5), con bromuro de etidio a una concentracin final de 0.5 ng/ml, se sirvieron tanto los patrones del bacterifago Lambda como las muestras a cuantificar (2 l de ADN). Se compar la intensidad de la banda de cada una de las muestras con los patrones de Lambda para finalmente determinar la concentracin en ng/ l. El ADN cuantificado se diluy en agua HPLC hasta una concentracin de 5 ng/ l. Se almacen a 20 C. 3.2.4 ELECTROFORESIS El ADN total se visualiz por electroforesis en un gel de agarosa al 0.8% preparado con TBE 0.5 X (Trisma-Borato-EDTA) y con Bromuro de Etidio (10 mg/ ml). Se tomaron 5 l de cada una de las muestras de ADN y se tieron con 2 l de Blue Juice 10X (1/10 V/V) para luego ser servidas en los pozos del gel. La electroforesis se corri a 70 voltios durante una hora. El gel se observ en el transiluminador y fue fotografiado. 3.3 METODOLOGIA 2: AMPLIFICACIN DEL ADN MEDIANTE PCR 3.3.1 Microsatlites RAMs En la tabla 1 se presentan las 36 accesiones de Rubus spp que fueron utilizadas para la caracterizacin molecular con Microsatlites RAMs. Para el anlisis se utilizaron siete primers (7) sintetizados por Technologies, Inc, reportados en trabajos anteriores como polimorficos en evaluaciones de la diversidad gentica del gnero Physalis (Bonilla & Espinosa, 2003), Phaeoisariopsis griseola, agente causal de la mancha angular en frjol

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(Henrquez,

2000),

Sphaceloma

manihoticola,

agente

causal

del

superalargamiento en yuca (Meja, 2002) y en especies animales como Hartn del Valle (Piedrahita, 2003), Cerdo criollo (Oslinger, 2003). (Tabla 3).
Tabla 3. Primers utilizados en la tcnica Microsatlites RAMS. PRIMER CCA CGA GT AG CT TG CA SECUENCIA (5 a 3) DDB(CCA)5 DHB(CGA)5 VHV(GT)5G HBH(AG)7A DYD(CT)7C HVH(TG)7T DBDA(CA)7

Las siguientes designaciones son usadas para los sitios degenerados: H (A T C); B (G T C); V (G A C) y D (G A T). Para la reaccin de Microsatlites RAMs se prepar el cctel de amplificacin en un tubo estril de microcentrfuga (1,5 ml) para un volumen final de 25 l (Tabla 4).
Tabla 4. Cctel para la amplificacin por RAMs. VOLUMEN (l) 2.5 2.5 1.2 2.5 4 12 0.3 [ ] INICIAL 10X 2mM 10m 25mM [ ] FINAL 1X 0.2mM 2M 1.5mM

REACTIVOS Buffer TAQ (Promega Stock) dNTPs (2mM cada dNTPs Stock)) Primer 0.5 M Stock (tabla 3) MgCl2 (25mM Promega Stock) ADN 5 ng /l Agua bidestilada, estril y filtrada (0.2 m) Taq polimerasa (5 Units/l; Promega Stock)

5 U/l

0.625 U

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Los siete primers utilizados se probaron

con 8 ccteles de diferentes

cantidades de Buffer PCR 1X y MgCl2 con todos los individuos (Tabla 5), el producto amplificado fue observado mediante electroforesis en geles de agarosa al 1.5% y visualizado con luz ultravioleta en el transiluminador.
Tabla 5. Ccteles utilizados para la amplificacin con RAMs. REACTIVO Buffer DNTPs Primer MgCl2 ADN Taq H20 TOTAL 1 2.5 4 2 1.5 2 0.2 12.8 25 2 2.5 4 2 2 2 0.2 12.3 25 COCTELES (Volumen / l) 3 4 5 6 2.5 2.5 1.6 2 4 4 4 4 2 2 2 2 2.5 3 1.5 1.5 2 2 2 2 0.2 0.2 0.2 0.2 11.8 11.3 13.7 13.3 25 25 25 25 7 2 4 2 2.5 2 0.2 12.3 25 8 3 4 2 1.5 2 0.2 12.3 25

En cada grupo de muestras para amplificacin se incluy un control negativo que contena la mezcla de reactivos y se reemplaz el ADN por agua bidestilada, filtrada, para detectar posible contaminacin (Hantula et al., 1997). La amplificacin se llev a cabo en un termociclador PTC-100 Programmable Termal Controller de MJ Research, Inc. La desnaturalizacin inicial fue de 95 C durante 5 minutos; 37 ciclos de desnaturalizacin a 95 C por 30 segundos, Hibridacin: 58 C (Primer GT), 61 C (Primer CGA), 50 C (Primer AG), 55 C (Primer TG), 41 C (Primer CA, Primer CT) durante 45 segundos y 55 C (Primer CCA) durante 50 segundos. Con una extensin de 72 C por 2 minutos y la extensin final a 72 C durante 7 minutos.

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Los productos de amplificacin se separaron por electrofresis en geles de agarosa al 1.2% a 90 voltios durante 3 horas visualizndose en un transiluminador.

En la figura 7 se observa la metodologa de los microsatlites RAMs para caracterizar la estructura gentica de Rubus spp.

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ADN TOTAL MATERIAL VEGETAL E IMPLEMENTOS DE EXTRACCIN EXTRACCIN DE ADN PROCESO DE AMPLIFICACIN

PRODUCTO PCR DE LA AMPLIFICACIN CON PRIMER RAMs DENDROGRAMA

Figura 7. Metodologa RAMs para caracterizar la estructura gentica de Rubus spp. 67

3.4 METODOLOGIA 3: ANALISIS ESTADISTICO 3.4.1 Similaridad en trmino de marcadores moleculares: Coeficiente de Similaridad de Nei-Li. Para estudiar el grado de similitud entre los individuos se parti de la definicin de similaridad de Nei-Li (1979) (Leung et al., 1993), tambin conocida como similaridad de DICE (Sneath & Sokal, 1973) o de Sorensen (1948), cuya frmula es:
Sij= 2a _ 2a + b+c

Donde: Sij = Similaridad entre el individuo i y el j. a = Nmero de bandas presentes simultneamente en los individuos i y j. b = Nmero de bandas presentes en i y ausentes en j. c = Nmero de bandas presentes en j y ausentes en i. El coeficiente de DICE omite la consideracin de pares negativos (0-0) y da doble peso a los pares positivos (1-1) (Sneath & Sokal, 1973) lo que hace til en trminos de similaridad del ADN, en el que la ausencia compartida de una banda no es necesariamente una indicacin de similaridad entre dos individuos. 3.4.1.1 Matriz de variable Binaria Se construy una matriz de variables binarias, ceros (ausencia de bandas) y unos (presencia de bandas) en la cual las accesiones forman las filas y las columnas las bandas evaluadas en cada uno de ellos.

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3.4.1.2 Mtodo de clasificacin: La matriz de similaridad se construy con el programa SIMQUAL del paquete Numerical Taxonomy System for Personal Computer ( NTSYS- pc versin 1.8 ). El mtodo utilizado fue el de distancia (o similitud) media UPGMA (del ingls UnWeighgted pair-Grupp Arithmetic mean) que es el ms usado y el que produce menor distorsin al ser comparada con la matriz original de similaridad. Apartir de esta matriz, se construy un dendrograma con el Programa TREE de NTSYS- pc (NTSYS-pc versin 2.02). 3.4.2 Anlisis de Correspondencia Mltiple Es un tipo de anlisis multivariado, que se realiz utilizando el SAS, permiti visualizar de manera ms detallada los resultados obtenidos. Facilita la representacin multidimensional de un grupo de individuos con caractersticas descriptivas de ellos en un plano. La representacin se obtiene con base en la dependencia que existe entre categoras que corresponden a las filas y columnas de una tabla de datos. De este modo, la asociacin se basa en variables especficas. El anlisis asocia todos los individuos con todas las caractersticas con que fueran calificados es decir, asocia todas las filas con todas las columnas y determina el nivel de proximidad (asociacin) (Joseph, et al., 1992). Desde el punto de vista operacional el anlisis asocia todos los individuos con todas las caractersticas con que ellos fueron calificados; es decir, asocia todas las filas con todas las columnas determinando el nivel de proximidad (asociacin) (Joseph,H. et al., 1992)

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3.4.3 Anlisis Boot Strap Los dendrogramas se construidos con base en los grados de similaridad entre individuos. Sin embargo, la confianza de los agrupamientos que se producen, no son generalmente sensibles a los procedimientos estadsticos usuales de computacin. Por lo tanto, Felsenstein (1985) propuso usar Bootstrapping (Efron, 1979) como camino para obtener una apreciacin no paramtrica de los lmites de confianza (Henrquez, 2000). Para establecer los ndices de similitud de Nei-Li para los grupos seleccionados del dendrograma se establecieron intervalos de confianza del 95%, utilizando el programa WINBOOT (Yap y Nelson, 1996) para ejecutar el anlisis Bootstrap a partir de una matriz binaria, donde 1 es para carcter de banda presente y 0 para carcter de banda ausente. 3.4.4 Anlisis de Varianza Molecular (AMOVA) Este mtodo fue usado para probar si existen diferencias entre los distintos sitios geogrficos donde fueron colectados los materiales, y tambin, para determinar cual de ellos aporta mayores diferencias. Las accesiones fueron distribuidas en 6 grupos con base en el anlisis del dendograma obtenido por el programa NTSYS- pc versin 2.02 y con un nivel de similaridad del 62%; para efectuar el AMOVA se asumi que cada grupo formado es una poblacin separada. Se utiliz el programa AMOVA-PREP (Excoffier et al.,1992), para generar matrices de distancia con base en el coeficiente de DICE y para crear archivos de distancia entre los grupos analizados. Este programa fue diseado para automatizar los procesos de preparacin de archivos que van a ser usados por AMOVA (Anlisis de Varianza Molecular) (M.P Miller,1998).

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3.4.5 Diversidad gentica Para estimar los parmetros de Heterocigocidad promedio (H) y el porcentaje de loci polimorficos se utiliz la frmula no sesgada de Nei (1978). 3.4.5.1 Heterocigocidad Esperada : Es la medida ms generalizada de diversidad gentica, consiste en la probabilidad de muestrear dos genes que sean diferentes dentro de una o ms poblaciones, usualmente se denomina He, o simplemente H. Se calcula mediante la frmula:
q

H=1

Xi2

I=1

Donde: Xi = Frecuencia en la poblacin del alelo i y q es el nmero de alelos H = Probabilidad de que dos individuos tomados al azar tengan diferente patrn; es el valor o dato con que se presenta la diversidad de la poblacin. La diversidad para subgrupos de cualquier naturaleza se calculan mediante la siguiente frmula, con la cual se pondera la HS individuos:
HT = HS + HST (n1H1 + n2H2 +... nJHJ ) HST = --------------------------------(n1 + n2 + nJ )

por el nmero de

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Donde : n = Nmero de individuos totales HT = Diversidad Total HS = Diversidad dentro de cada subgrupo o subpoblacin HST = Diversidad entre subgrupos o subpoblaciones Luego, se calcula el FST coeficiente de diferenciacin gentica, para estimar la mayor diversidad posible en cada subgrupo: FST = HST / HT Wright (1978), clasifica la diferenciacin gentica de acuerdo al FST: a) 0-0.05 = Poca diferenciacin gentica b) 0.05-0.15 = Moderada diferenciacin gentica c) Mayor 0.25 = Gran diferenciacin gentica La variacin en la frecuencia allica de las accesiones analizadas se obtuvo utilizando el paquete estadstico TFPGA (Tools For Population Genetic Analices, versin 1.3, 2000) adems se determin el f estadstico insesgado con un intervalo de confianza del 95%.

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4. RESULTADOS Y DISCUSION

4.1 ESTANDARIZACION DE UN PROTOCOLO PARA LA EXTRACCIN DE ADN Rogers and Bendich (1988), afirman que uno de los problemas en la extraccin del ADN de plantas es la composicin de la pared celular, la cual dificulta el acceso al interior para extraer su contenido, por ello, dicha pared celular debe romperse para liberar los constituyentes celulares, lo cual se hace generalmente por accin mecnica, pulverizando el tejido con hielo seco o con nitrgeno liquido, permitiendo que el ADN sea liberado dentro del Buffer de Extraccin; el cual presenta detergentes y soluciones que aseguran que una cantidad significativa de ADN no sea atrapada en los desechos o restos celulares, y/o que el ADN est completamente disociado de protenas y otros contaminantes que pudiesen interferir con el subsecuente anlisis. (Howell, 1973) De lo anterior se desprende la importancia que tiene la buena eleccin de cada una de las soluciones que intervienen en el proceso encaminado a la obtencin de un ADN de alto rendimiento, puesto que cada una cumple con una funcin especfica (Anexo 6), pero actan de manera interrelacionada para llevar a cabo un conjunto de reacciones las cuales terminan con el aislamiento del ADN total. El mtodo de Fulton et al., (1995) modificado por Restrepo (2003), as como el de Dellaporta et al (1983) modificado por Henrquez (2000) no fueron tan efectivos, ambos permitieron obtener ADN de algunos de los materiales de

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Rubus glaucus y Rubus robustus, pero no de Rubus urticifolius. Sin embargo el ADN que se obtuvo no fue de buena calidad, lo cual pudo deberse a la contaminacin de la muestra con polisacridos, protenas, membranas celulares, entre otros, que no fueron removidos durante el proceso de extraccin que afectaron finalmente la pureza del ADN. Estos residuos pueden inhibir la actividad de algunas enzimas como polimerasas, ligasas y endonucleasas de restriccin, digiriendo parcialmente el ADN e interfiriendo con su concentracin (Taylor et al., 1993). Sin embargo, estos mtodos han permitido obtener ADN de buena calidad y de alto rendimiento en especies vegetales como Physalis peruviana (Bonilla & Espinosa, 2003), Lycopersicum sculentum (Restrepo, 2003), Phaseolus vulgaris (Henriquez, 2000), Manihot sculenta, (Meja, 2002), entre otras. El protocolo de Dellaporta et al (1983) modificado por Palacio (2003) en el cual se utilizaron hojas maduras fue el que permiti obtener ADN de alto rendimiento y de muy buena calidad tanto de los materiales silvestres como cultivados (Figura 8). El buffer de extraccin contiene diferentes soluciones (Tris HCl, T10E1, Acetato de Potasio, etc ), detergentes (SDS 1%), antioxidantes (PVP, mercaptoetanol), etc, que ayudaron a remover polisacridos, protenas, restos de membranas, as como a inhibir la actividad de algunas enzimas como polimerasas, ligasas, endonucleasas de restriccin y polifenoloxidasas que permitieron un buen aislamiento de ADN total. (Anexo 6).

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Figura 8. ADN total de las 36 accesiones de Rubus spp.

Para prevenir la contaminacin de las muestras con polisacridos, debe tenerse en cuenta, que la base para la separacin de los polisacridos de los cidos nucleicos, es su solubilidad diferencial (Rogers and Bendich, 1988), por lo que el utilizar detergentes como el SDS (1%) as como un tampn con altas concentraciones de NaCl (0.5 M), o combinar la accin de este detergente con solventes orgnicos como el PVP (1%) y el mercaptoetanol (2%) pudo ser efectivo para eliminar complejos de carbohidratos. Para proteger el ADN de la accin de enzimas (nucleasas), se utiliz el EDTA (Acido-Etilendiamino-Tetra-acetico) en una concentracin de 50mM. Este es agente quelante que une iones de Magnesio, el cual es considerado un cofactor necesario para la mayora de las nucleasas, las cuales degradan el ADN. Compuestos como el - mercaptoetanol , evita el color pardo y escinde los puentes disulfuro y el PVP al inhibir la actividad de las polifenoloxidadas , elimina compuestos fenlicos que pueden causar la oxidacin de los tejidos (Roger and Bendich, 1988); evitando as la presencia de coloraciones pardas o grises, adems de que ayudan a aislar el ADN de residuos de polisacridos, protenas, restos celulares, por lo que permiten obtener ADN, de excelente calidad .

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El ADN fue precipitado con isopropanol, el cual es ms selectivo en la precipitacin del ADN que otros alcoholes como el Etanol. Segn Howell (1973) el isopropanol requiere alta concentracin de ADN para dar mejor rendimiento; sin embargo, las concentraciones de los diferentes materiales de mora Rubus spp no fueron altas fluctuando entre 10 y 125 ng/ l (Tabla 6), pese a lo anterior el isopropanol permiti precipitar el ADN. Se adicion la enzima RNAsa para eliminar el ARN presente en la solucin.
Tabla 6. Concentraciones de ADN (ng) de los materiales de mora Rubus spp. CANTIDAD (ng) 10-20 21-30 31-50 > 50 N INDIVIDUOS 16 8 8 4 % 45 22 22 11

Este protocolo ha demostrado ser eficiente tanto para la obtencin de ADN de mora Rubus spp como para la extraccin de ADN del Roble negro Colombobalanus excelsa (Fernndez, 1999 y Gonzlez 2001). Las cantidades de ADN obtenidas fueron suficientes para evaluar los materiales con la tcnica RAMS, sugiriendo que con bajas concentraciones se pueden evaluar hasta 40 primers RAMs. 4.2 CARACTERIZACION DE LA ESTRUCTURA GENETICA 4.2.1 Caractersticas de los Cebadores Para la evaluacin de la diversidad gentica del gnero Rubus, se seleccionaron seis de los siete cebadores utilizados; el primer GT no amplific y fue descartado. De los 8 ccteles utilizados se escogieron el 3, 4,

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y 7 por mostrar mayor polimorfismo y buena resolucin de las bandas en los primers utilizados. (Tabla 5). Los seis primers utilizados generaron una matriz de 2088 entradas de las cuales 882 fueron bandas presentes y 1206 bandas ausentes. Se obtuvieron 58 bandas, de las cuales se seleccionaron 43 por ser las que contribuyeron en ms de un 70% a la discriminacin de los materiales. El nmero de bandas por iniciador vari de 8 para primer CT y 11 para el primer TG, con pesos moleculares entre 260 y 1500 Kb. (Tabla 7). Tabla 7. Cebadores utilizados para la evaluacin de la diversidad gentica en
Rubus. CEBADOR CGA TG AG CCA CT CA N BANDAS TOTALES 10 11 10 10 8 9 N BANDAS POLIMRFICAS 5 9 7 8 7 7

Al comparar el nmero de loci RAMs generados por los seis cebadores de este estudio (58 en total), con otros trabajos sobre diversidad gentica del gnero Rubus, como los realizados por Marulanda y Mrquez, (2001) quienes seleccionaron 12 de los 71 cebadores RAPDs utilizados, obtuvieron 45 bandas totales de las cuales 38 fueron polimrficas con pesos moleculares entre 0.805 y 1.501 Kb. Graham et al.,(1997) en estudios con especies silvestres de fresa (Rubus idaeus ) obtuvieron mediante la tcnica RAPDs un total de 62 bandas, de las cuales 47 fueron polimrficas; por lo anterior el total de bandas encontrado en el presente trabajo es un nmero

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adecuado para estimar parmetros genticos que permitan solucionar algunos interrogantes planteados entorno a esta especie. Los valores de heterocigosidad encontrados mediante el programa TFPGA muestran que los promedios mas altos corresponden a los cebadores CT (0.29), CGA (0.31) y TG (0.41). El cebador TG fue el que mayor aporte hizo a la variacin encontrada con un valor de Fst de 0.6086, lo que significa que puede ser til para lograr una mayor diferenciacin entre los materiales de mora Rubus spp. (Tabla 8).

Tabla 8. Valores de Heterocigosidad, Fst, y porcentaje de loci polimorficos para los primers RAMs. CEBADOR CGA TG CCA CA AG CT HETEROCIGOSIDAD 0.31 0.41 0.28 0.27 Fst 0.4748 0.6086 0.5392 0.4230 0.5668 0.4050 SD 0.05 0.09 0.07 0.08 0.09 0.09 % LOCI 76 89 82 70 60 75

0.26
0.29

Posiblemente el polimorfismo encontrado con este cebador se deba a una mayor frecuencia entre los sitios de hibridacin y las cadenas de ADN complementarias evidenciando la presencia de dos microsatlites TG y CA. (Figura 9).

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Cadena molde 3 AGTACACACACACACAC 5TCATGTGTGT GTGTGTG GTGTGTGTGTGTGTACT5 CACACACACACACATGA3' Hibridacin del primer a la cadena molde Cadena molde 3 AGTACACACACACACAC 5 TCATGTGTGTGTGTGTG Primer GTGTGTGTGTGTGTACT 5 Hibridacin del primer a la Cadena molde complementaria

5 TCATGTGTGTGTGTGTGT Microsatlite TG

GTGTGTGTGTGTGTACT 5 CACACACACACACATGA 3' Microsatlite CA

Figura 9. Hibridacin del primer TG a la cadena de ADN complementaria.

En la figura 10 se muestra el patrn de amplificacin generado por el cebador TG.

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CAUCA

VALLE

NARIO

CALDAS

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29

500pb

Figura 10. Patrones de bandas generados por el primer Microsatlite RAMs (TG)n.

M = Marcador molecular de 100 pb. Rubus urticifolius Rubus robustus

Rubus glaucus

Se puede observar que las introducciones UNAPM19 (lnea 18) y UNAPM25 (lnea 19) pertenecientes a la especie Rubus robustus y que fueron colectadas en los departamentos del Valle y Nario respectivamente presentan patrones de bandas comunes, debido que se trata del mismo material, molecular. En cuanto a los materiales silvestres (Rubus urticifolius) identificados como UNAPM7, UNAPM12, UNAPM20, UNAPM21 y UNAPM26, lneas 12,13, 14, 26 y 27 respectivamente, presentan bandas diferentes a las otras introducciones, lo que permite detectar una amplia variabilidad dentro de la coleccin, la cual se ve reflejada por caractersticas morfolgicas como tamao del fruto, pegajosidad del tallo, color de la flor (de blanco a rosado), color del envs, entre otros (Zamorano, 2003). y no presentan diferencias tanto a nivel morfolgico como

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Los materiales de Rubus glaucus a pesar de no exhibir mucha variabilidad a nivel morfolgico, muestran patrones de bandas comunes entre ellos y a la vez diferentes a las dems introducciones, aportando as a la variacin gentica total encontrada. Los seis cebadores utilizados permitieron identificar entre los materiales patrones de bandas nicos, sugiriendo una diferenciacin gentica entre ellos. (Tabla 9).
Tabla 9. Patrones de bandas nicas generadas por la tcnica RAMs. ESPECIES Rubus urticifolius Rubus glaucus Rubus robustus BANDAS UNICAS 3 2 4

La informacin de la distribucin de las bandas entre y dentro de los individuos tiene implicaciones para la gentica de conservacin, siendo la base para futuros trabajos de mejoramiento, clonacin, identificacin de especies o taxones. En la tabla 10 se puede observar que las especies Rubus glaucus y Rubus urticifolius comparten un mayor nmero de bandas comunes (28), a pesar de presentar ciertas diferencias a nivel morfolgico como nmero de espinas, tamao de fruto, color de la flor, vellosidades en el tallo entre otros.
Tabla 10. Patrones de bandas comunes generadas por la tcnica RAMs.

ESPECIES Rubus glaucus -Rubus robustus Rubus glaucus -Rubus urticifolius Rubus robustus- Rubus urticifolius

BANDAS COMUNES 16 28 14

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La presencia de bandas comunes entre los materiales silvestres de la especie Rubus urticifolius y Rubus glaucus, sugiere que ambas son potencialmente capaces de interactuar de diversas maneras. Las cultivadas podran influenciar la diversidad gentica de poblaciones silvestres, a travs del escape y transferencia de genes por el polen; adems las poblaciones silvestres hospederos de plagas hortcolas y sus predadores naturales, tambin son una fuente potencial para el mejoramiento de nuevos materiales. (Graham et al, 1997). Sin embargo la interaccin de las especies Rubus urticifolius y Rubus glaucus debe ser evaluarse en investigaciones futuras. Free (1960) y Smith (1972) afirman que variedades que slo son parcialmente autofrtiles producen ms y mejores frutos al darse la polinizacin cruzada. Este es el caso de las Rosceas donde se incluyen el Albaricoque (Prunus armeniaca) y el durazno (Prunus persica); especies autofrtiles y la manzana (Pyrus malus) y la pera (Pyrus comunis), todas autoestriles. Todas stas y la mora de castilla (Rubus glaucus Benth) figuran en la lista de McGregor (1976) y el USDA (1975) de aquellas plantas cultivadas que se benefician o necesitan de la polinizacin cruzada. Mas especficamente, la lista se refiere a las plantas polinizadas por Apis mellfera L., que realiza aproximadamente el 80% de la polinizacin por insectos en Estados Unidos (Wesbrook et al., 1975). McGregor (1976) afirma que las variedades autofrtiles se pueden beneficiar al tener abejas para transportar el polen a cada estigma receptivo de la flor en el momento ms temprano posible y que una provisin adecuada de insectos polinizadores debe ser altamente remunerativa tanto en el volumen como en la cantidad de frutos producidos. Para estimar la incidencia de los insectos polinizadores de los materiales de la coleccin de mora Rubus spp, Zamorano (2003) realiz una evaluacin

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sobre el efecto del cubrimiento de las flores sobre el nmero de bayas formadas, cuyos resultados demuestran que en la formacin de semillas, la presencia de insectos no es tan indispensable; sin embargo estos influyen en el tamao, forma y peso del fruto; sugiriendo as que no todas las especies son autoestriles. (Foto 5).

Foto 5. Cubrimiento de las flores en Rubus spp.( Zamorano, 2003).

Hay, sin embargo, muy poca informacin de la naturaleza y el grado de las interacciones y relaciones entre las poblaciones cultivadas y silvestres de algunas especies de Rubus; en sitios donde las especies de Rubus son cultivadas, las formas silvestres de las mismas especies frecuentemente se presentan en reas circundantes, particularmente en claros de bosque, cercos y bordes de caminos o carreteras (Graham et al, 1997). La informacin fenotpica reunida por varios autores proporciona una evidencia definitiva de la diferenciacin ecotpica en poblaciones silvestres. Mas recientemente la variabilidad del ADN revelada por sistemas tales como RAPDs, RFLPs y Microsatlites, han sido usados para detectar diferencias

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genticas en Rubus ( Antonius & Nybom, 1994), en la presente investigacin, la tcnica RAMs que combina RAPDs y Microsatlites permiti detectar esas diferencias. 4.3 ANLISIS DE LA DIVERSIDAD GENTICA 4.3.1 Dendrograma con el ndice de Nei-L i El anlisis mediante el coeficiente de Nei-Li, a un nivel de Similaridad de 0.55, diferenci la poblacin en 6 grupos (A,B,C,D,E,F)y stos a su vez en 27 haplotipos (es decir, individuos o grupos de individuos con estructura gentica idntica y que se diferencia de otro por lo menos en la presencia o ausencia de una banda al utilizar tcnicas moleculares) (Figura 11).

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VALLE CAUCA NARIO DONACIONES

Figura 11. Dendrograma de la estructura gentica de 36 individuos de Rubus spp, basado en el Coeficiente de Similaridad de Nei-Li, y calculado de los datos combinados de los siete primers Microsatlites RAMs, con el mtodo de clasificacin UPGMA, usando los programas SAHN y TREE de NTSYS-pc Versin 1.8 (Exeter Software, Setauket, NY, USA).

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El grupo F que incluye a las accesiones UNAPM25 y UNAPM19 de la especie Rubus robustus es el que presenta el menor valor de Similaridad (0.25) con respecto a los otros grupos formados, debido a las caractersticas propias de esta especie tales como forma, color, y borde de la hoja, distribucin de las espinas en el tallo, modo de propagacin (estolones) y adems de que se trata de materiales que han sido introducidos a nuestro pas. (Foto 6).

Foto 6. En la parte superior se observa las flores y frutos de la especie Rubus robustus, en la parte inferior, lado izquierdo, se muestran la distribucin de las espinas en el tallo, as como los bordes aserrados de las hojas, y a la derecha el mtodo de propagacin por estolones.

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Los materiales silvestres pertenecientes a Rubus urticifolius (Grupo E) con base en el anlisis RAMs, muestran 0.40 de similaridad con la especie Rubus glaucus aunque existen marcadas diferencias morfolgicas entre ellos, se encontraron 28 bandas comunes entre las dos especies. (Foto 7).

Foto 7. Diferencias morfolgicas en cuanto a hojas, tallos, flores y frutos entre las especies Rubus urticifolius (lado izquierdo) y Rubus glaucus (lado derecho).

El anlisis molecular confirm que las poblaciones silvestres son ms diversas que las cultivadas y sugiere un pequeo flujo de genes de cultivadas a silvestres como resultado quizs de su mecanismo de reproduccin, as como de la baja probabilidad de entrecruzamiento en poblaciones establecidas, adems no han sido seleccionadas y multiplicadas por el hombre, sino que su dispersin se debe en parte a las aves que las consumen. Las accesiones pertenecientes a Rubus glaucus se encuentran a un nivel de similitud 0.60, lo que evidencia una alta variacin entre individuos dentro de las procedencias. Los anteriores resultados contrastan con los obtenidos por Marulanda y Mrquez (2001) quienes al evaluar materiales cultivados de mora (Rubus glaucus ) encontraron valores de similitud del 85 y el 100%

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para los doce cebadores RAPDs utilizados, sugiriendo as poca variacin entre los materiales analizados. La variacin encontrada dentro de los materiales de Rubus glaucus puede deberse a la diseminacin de la semilla por los pjaros como la mirla la cual visita frecuentemente los cultivos, el nivel de alogamia de la especie, los mismos agricultores quienes seleccionan materiales silvestres por caractersticas como sanidad, tamao y nmero de frutos, sabor, etc, y al encontrarlos en el campo los introducen a sus cultivos contribuyendo a la variacin gentica total. La tcnica RAMs permiti discriminar los materiales segn la especie a la cual pertenecen, Rubus glaucus (Grupo A, B, C, D), Rubus robustus (Grupo F) y Rubus urticifolius (Grupo E), como tambin separar los materiales cultivados de los silvestres (urticifolius). El anlisis intraespecfico diferenci las procedencias de mora (Rubus spp) y las agrup por regiones geogrficas, indicando que hay diferencias entre las accesiones de acuerdo con la ubicacin geogrfica donde fueron colectadas. Como puede observarse el grupo A contiene la mayora de los materiales comerciales que fueron donados por la Universidad del Quindo, dichos materiales fueron obtenidos mediante cultivo in vitro y que sus diferencias tanto morfolgicas como moleculares no fueron significativas. Algunas de las accesiones se incluyeron dentro de grupos diferentes al sitio geogrfico donde fueron colectados, esto puede deberse a la transferencia de material comercial entre regiones productoras, lo cual es frecuente en este cultivo.

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El anlisis molecular permiti detectar posibles accesiones muy similares en la coleccin, como los individuos UNAPM19 y UNAPM25 de la especie Rubus robustus, procedentes de los departamentos del Valle y Nario, los cuales al exhibir patrones de bandas comunes se agruparon dentro de un mismo grupo. (Foto 8).

Foto 8. Lado izquierdo accesin UNAPM19, procedente del Municipio de Trujillo (Valle del Cauca) y a su derecha accesin UNAPM25, del Municipio de Ipiales (Nario).

Estudios realizados por Prez de La Vega (1993) en poblaciones naturales demuestran que los marcadores moleculares pueden usarse con varios fines: 1) La estimacin de la variabilidad gentica en y entre poblaciones, muestras o accesiones de especies cultivadas o silvestres relacionadas, o de la uniformidad varietal,; 2) la duplicacin de los materiales en las colecciones; 3) La delimitacin de los centros de origen; 4) el estudio de las relaciones filogenticas entre especies y taxones superiores, y como consecuencia de estos puntos; 5) La determinacin de mejores estrategias de conservacin de recursos genticos y la formacin de colecciones nucleares.

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Segn lo anterior, la tcnica RAMs permiti detectar la variabilidad dentro y entre los grupos formados al identificar patrones de bandas nicos y comunes entre las 36 accesiones analizadas, discriminar los materiales no slo por la especie a la cual pertenecen, R. glaucus, R.urticifolius y R. robustus (Foto 9), sino tambin el lugar de procedencia de los mismos, adems identificar materiales muy similares en la coleccin como UNAPM19 y UNAPM25. Haciendo que esta tcnica pueda ser considerada como una herramienta til a la hora de evaluar la diversidad gentica en poblaciones naturales, por lo que ha sido utilizada para la caracterizacin morfolgica y molecular de especies vegetales como soya, arroz, trigo (Akkaya, et al., 1992) y frutales como Citrus spp (Ferreira et al., 1998), y uchuva, Physalis peruviana (Bonilla & Espinosa, 2003).

Foto 9. Caractersticas morfolgicas que diferencian a cada una de las especies presentes en la coleccin de mora Rubus spp. Lado izquierdo flores, parte central hojas y lado izquierdo tallos.

4.3.2 Estimacin de la heterocigosidad En la tabla 11 se presentan los resultados obtenidos para la heterocigosidad promedio estimada y el porcentaje de polimorfismo para los seis grupos formados asumiendo equilibrio Hardy-Weinberg. Se estudi la

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heterocigosidad insesgada, pues est corregida por el nmero de muestras el cual en este estudio es bajo ( de 2 a 10 individuos por grupo).

Tabla 11. Heterocigosidad promedio estimada y porcentaje de loci polimorficos para los grupos formados.

GRUPOS A B C D E F POBLACIN TOTAL

HETEROCIGOCIDAD (H) 0.24 0.25 0.19 0.14 0.03 0.01 0.3125

% LOCI POLIMORFICOS (95%) 64 66 52 28 7 4 100

La heterocigosidad promedio (H) para la poblacin total fue de 0.3125, lo que revela un gran polimorfismo gentico en los grupos analizados, lo cual puede estar asociado a la probable naturaleza alogama de la especie, la cual tiende a favorecer la conservacin del alto porcentaje de heterocigotos, as como a la presencia de algunas accesiones colectadas en estado silvestre (Rubus urticifolius). En comparacin con estudios realizados en el gnero Rubus por Marulanda y Mrquez (2001), Graham et al, (1997), Graham & McNicol (1995), Antonius & Nybom (1994) en los cuales se obtuvieron valores de heterocigosidad de 0.1223, 0.1801, 0.1517, 0.1654 respectivamente, por lo que el valor encontrado en este estudio es alto, sugiriendo una mayor diferenciacin gentica entre las introducciones.

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Los valores de heterocigosidad fluctuaron entre 0.01 para el grupo F y 0.25 para el grupo B (Tabla 11). El grupo B exhibe el valor ms alto tanto de heterocigosidad, 0.25, como de loci polimorficos, 66%; con un nivel de significancia del 95%; en este se encuentran las accesiones UNAPM2, UNAPM3, UNAPM4, UNAPM5, UNAPM6, UNAPM7, UNAPM8 y UNAPM10, procedentes de los departamentos del Valle, Cauca y Nario. La alta variabilidad encontrada pudo deberse al estado del material (silvestre o cultivada) en el momento de la colecta, ya que la mayora de ellos se encontraron en borde de carretera, quebradas, bosques, etc y donde la accin antrpica es mnima (Zamorano, 2003). El grupo E al que pertenecen especies silvestres (Rubus urticifolius) presenta un valor bajo de heterocigosidad (0.03) debido a la poca variacin existente entre ellos, diferencindose principalmente por caractersticas morfolgicas como color de la flor (blanco o rosado), presencia o ausencia de vellosidades en el tallo. El valor ms bajo de heterocigosidad (0.01) corresponde al grupo F (Tabla 11), formado por las accesiones UNAPM19 y UNAPM25 que fueron colectadas en Trujillo e Ipiales, ya que no presentan diferencias significativas tanto a nivel morfolgico como molecular debido a que se trata del mismo material. La heterocigosidad de la poblacin total es relativamente mayor que la estimada para cada uno de los grupos, esto puede indicar que hay un grado de diferenciacin gentica significativo entre ellos.

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4.4 DIFERENCIACIN POBLACIONAL 4.4.1 Estadstico Fst El valor de Fst obtenido mediante el programa TFPGA con una desviacin estndar de 0.05. Segn para las 36

accesiones estudiadas asumiendo equilibrio Hardy-Weinberg fue de 0.4980, Wright (1978), valores por encima de 0.25 muestran una gran diferenciacin gentica, por lo que el resultado obtenido evidencia una alta variacin entre las especies de Rubus analizadas corroborando los resultados hasta el momento obtenidos. El Fst encontrado en este estudio es un parmetro importante puesto que ayuda a entender la dinmica espacio-temporal de las especies de mora (Rubus spp) as como la estructura de cruzamientos entre ellas.

Hay varios estudios que sustentan la existencia de una correlacin entre el sistema de reproduccin exogmico y la tendencia a una estructura gentica poblacional. En un anlisis comparativo de 84 estudios realizados en plantas para evaluar diversidad gentica y diferenciacin poblacional en relacin a caractersticas de historia de vida, Nybom & Bartish (2000) encontraron mediante anlisis de regresin que los sistemas de reproduccin tienen peso muy fuerte sobre los valores estimados de diversidad gentica y diferenciacin poblacional.

Estudios como los de Ellstrand & Elam (1993) Hamrick & Godt (1996), Nason et al (1997) y Aldrich et al (1998) entre otros, tambin hacen mencin al peso y a la importancia que tienen los sistemas de reproduccin, especialmente la exogamia, para plantas tropicales en la evaluacin de la variabilidad

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gentica. Nybom & Bartish (2000) encontraron que los valores ms altos de heterocigosidad poblacional estaban asociados a taxones con sistemas exogmicos, lo que llevaba a su vez a presentar bajo valores de diferenciacin poblacional. Estos resultados fueron congruentes con la prediccin hecha al respecto por Hamrick & Godt (1989) con relacin a la posible asociacin entre la exogamia y los bajos niveles de diferenciacin poblacional. McGregor (1976) y el USDA (1975) incluyen a la mora Rubus spp dentro de aquellas plantas que se benefician o necesitan de la polinizacin cruzada para producir ms y mejores frutos, lo que sugiere un nivel de alogamia importante. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que el sistema reproductivo es uno de los factores de vida de una planta que influye en la estructura gentica espacial de sus genotipos. El mismo trabajo de Nybom & Bartish (2000), plantea que existen otros factores como el estado sucesional tardo de la especie y el ciclo de vida largo que influyen en la alta diversidad gentica (heterocigosidad) dentro de las poblaciones y la baja diferenciacin entre las mismas. Los cultivos de mora pueden durar varios aos lo que explica su valor de heterocigosidad (0.3125), adems en ciertas regiones productoras como La Cecilia, Juntas, La Magdalena, se utilizan plantas provenientes de semillas, lo que contribuye al mantenimiento de la variabilidad gentica de la especie. Para efectos comparativos, Nason (2002) plantea que en concordancia con la alta tasa de exogamia y la dispersin de polen a largas distancias que parecen caracterizar las poblaciones de rboles neotropicales, dichas poblaciones presentan una diversidad relativamente alta y un grado de

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diferenciacin gentica relativamente bajo, an en poblaciones que se encuentran a kilmetros de distancia. La alta diversidad gentica y la carencia de subdivisin poblacional, evidencian un sistema de reproduccin exogmico al igual que el flujo gentico que ocurre en forma efectiva sobre una escala espacial, igualmente se considera el proceso de colonizacin de habitas libres como un factor, que desde el punto de vista ecolgico e histrico, puede estar aportando elementos para la distribucin espacial de genotipos encontrada en la escala espacial investigada. El mayor grado de polimorfismo e informacin aportados por la tcnica RAMs al ser comparado con la evaluacin morfolgica , permiti dilucidar en forma ms clara las intrincadas relaciones e interacciones que se presentan en la mayora de las especies y evaluar la diversidad intraespecfica de la coleccin. 4.5 ANLISIS DE CORRESPONDENCIA MLTIPLE El Anlisis de Correspondencia Mltiple separ las introducciones en tres grupos, con coeficientes de similitud dentro de grupos y entre grupos de 54 y 37 % respectivamente. En la figura 12, se puede observar la distribucin tridimensional de los 36 materiales de Rubus spp que fueron analizados mediante la tcnica RAMs. Se observa que los individuos pertenecientes a las especies Rubus glaucus y Rubus urticifolius se distribuyen de una manera mas laxa reflejando una alta variabilidad intraespecfica entre ellas y a la vez se alejan de la especie Rubus robustus debido a las caractersticas propias de esta especie ya mencionadas. Lo que la constituye en una fuente potencial de variabilidad que debe ser estudiada con ms detalle.

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Figura 12. Representacin espacial de la estructura gentica de 36 individuos de Rubus spp usando los Microsatlites RAMs. Elaborado mediante el Anlisis de Correspondencia Mltiple.

Rubus glaucus Rubus urticifolius Rubus robustus

4.6 Anlisis de Varianza Molecular (AMOVA) El anlisis de varianza molecular AMOVA para los seis grupos (Tabla 12) muestra que la variacin existente en el gnero Rubus obedece a diferencias propias de los individuos dentro de cada uno de los grupos, que corresponde a una varianza de 52% y un coeficiente de diferenciacin gentica de 0.484.

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Tabla 12. Anlisis de Varianza Molecular (AMOVA) para los grupos formados. FUENTE VARIACION ENTRE GRUPOS DENTRO GRUPOS TOTAL GL 5 30 35 SUMA CUADRADOS 190 182 372 VALOR 5.7 6.0 (%) 48 52

En la tabla 12 se observa que de la variacin gentica total, el 52% se debe al componente dentro de los grupos. Esta alta variacin podra indicar la existencia de niveles de subdivisin y jerarquizacin mayores a los evaluados en este estudio. El 48% restante se debe al componente de varianza gentica entre grupos, esta fue significativa (P 0.001), indicando que existe una diferenciacin gentica molecular entre los 6 grupos evaluados para las especies de Rubus.

4.7 DISTANCIA E IDENTIDAD GENTICA Los valores de distancia gentica calculados con el ndice de Nei (1978) fluctuaron entre 0.112 para la pareja AB y 0.4709 para la pareja EF; en tanto que los valores de identidad estuvieron comprendidos en un rango entre 0.6244 para la pareja EF y 0.8948 para la pareja AB (Tabla 13). En general los altos valores de distancia gentica obtenidos corresponden a los valores ms bajos de identidad gentica, lo cual se puede observar en los grupos E (Rubus urticifolius) y F (Rubus robustus) al encontrarse ms alejados de los dems grupos. Por el contrario los grupos AB presentan una menor distancia y por ende una mayor identidad gentica posiblemente por tratarse de materiales cultivados, los cuales han sido propagados

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clonalmente por los agricultores de las regiones productoras lo que puede estar causando una disminucin de la variabilidad gentica en el material utilizado para cultivo, as como la transferencia de los mismos de una regin a otra, entre otros factores. Tanto los valores de distancia como de identidad gentica, concuerdan con los resultados presentados hasta el momento, indicando que los seis grupos constituyen una unidad discontinua.
Tabla 13. Matriz de distancia e identidad Gentica calculada con el ndice de Nei (1978) para los grupos formados. GRUPOS A B C D E F A **** 0.1112 0.1797 0.2079 0.3387 0.4000 B 0.8948 **** 0.1295 0.1378 0.4500 0.3583 C 0.8355 0.8785 **** 0.1854 0.4112 0.4109 D 0.8123 0.8713 0.8308 **** 0.3447 0.4599 E 0.7127 0.6376 0.6628 0.7084 **** 0.4709 F 0.6703 0.6989 0.6631 0.6314 0.6244 ****

Distancia gentica (Parte inferior de la diagonal) e identidad gentica (Parte superior de la diagonal) para las combinaciones por parejas de los seis grupos de Rubus spp.

Por otra parte el rbol de distancia muestra tres agrupaciones, donde los grupos A, B, C,D que incluyen individuos de Rubus glaucus se unen a una distancia del 20% en tanto que los grupos E (Rubus urticifolius) y F (Rubus robustus) se encuentran al 40 y 50% respectivamente, lo cual sugiere una amplia diversidad gentica. (Figura 13).

98

Figura 13. rbol de distancia gentica para los grupos formados.

4.8 ANLISIS

DE LA DIVERSIDAD GENETICA PARA LOS CUATRO

GRUPOS DE Rubus glaucus Con el fin de determinar cual es el aporte de los agrupamientos de Rubus glaucus (grupos A, B, C, D) a la variabilidad gentica total, se hizo necesario estudiar cada uno de ellos y as identificar cual de los grupos analizados posee la mayor variabilidad. Los valores de distancia gentica calculados con el ndice de Nei-Li (1978) fluctuaron entre 0.1201 para la pareja AB y 0.2216 para la pareja AD. Por su parte las identidades genticas fluctuaron entre 0.8012 para la pareja AD y 0.8868 para la pareja AB (Tabla 14). Los anteriores resultados demuestran que entre los materiales analizados existe una alta homogeneidad, debido al posible flujo de genes, migraciones, transferencia de materiales entre regiones etc.

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Tabla 14. Matriz de distancia e identidad gentica para los 4 grupos de Rubus glaucus. GRUPOS A B C D A *** 0.1201 0.1860 0.2216 B 0.8868 *** 0.1408 0.1555 C 0.8303 0.8687 *** 0.1988 D 0.8012 0.8560 0.8197 ***

Distancia gentica (parte inferior de la diagonal) e Identidad Gentica (parte superior de la diagonal).

Los resultados obtenidos mediante el anlisis del coeficiente de Nei-Li (Figura 14) muestran que los grupos A y B se unen con un ndice de similitud del 12% en tanto que los grupos C y D no se encuentran muy alejados de stos con valores de similitud del 16 y 19% respectivamente. A su vez estos 4 grupos corresponden a 19 haplotipos, de los 27 encontrados en las 36 introducciones estudiadas.

Figura 14. rbol de distancia gentica para los cuatro grupos analizados.

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La similaridad entre estos grupos de Rubus glaucus es debida posiblemente a la falta de movimientos de genotipos, reproduccin asexual (estacas, acodos), flujo de genes o migracin, as como la diseminacin de los materiales entre las diversas regiones productoras del pas, entre otros factores.

En la tabla 15 se presentan los valores de heterocigosidad estimada calculada para los cuatro grupos analizados, en la cual se observa que el grupo B que comprende accesiones de los departamentos del Valle, Cauca y Nario es el ms diverso, con un valor correspondiente a 0.25, esto posiblemente se deba a las caractersticas propias de los diferentes sitios donde fueron colectados los materiales, tales como la topografa, condiciones edafoclimticas, mtodos de propagacin, ya que en algunos sitios como La Cecilia, Juntas, La Magdalena, se utilizan adems de las propagadas vegetativamente, plantas provenientes inicialmente de semillas, despus se propagan vegetativamente las plantas con las mejores caractersticas, que son las que utiliza el agricultor para nuevas siembras, entre otros factores que favorecen la diversidad, adems esto se refleja en el mayor nmero de loci polimrficos encontrados dentro de las accesiones equivalente al 65% con un intervalo de confianza del 95%.

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Tabla 15. Heterocigosidad promedio estimada y porcentaje de loci polimorficos para los cuatro grupos de Rubus glaucus.

GRUPO A B C D POBLACIN TOTAL

HETEROCIGOSIDAD INSESGADA 0.24 0.25 0.19 0.14 0.2862

%LOCI POLIMORFICOS (95%) 64 66 52 28 79.3103

El grupo A al que pertenecen accesiones donadas por la universidad del Quindo, presenta un 64% de loci polimrficos, con un valor de heterocigosidad de 0.24, lo que significa que tambin alberga una amplia diversidad. El grupo D a diferencia de los otros tres, fue el que registr el menor valor de heterocigosidad (0.14), al igual que el nmero de loci polimrficos equivalente al 28%, ya que incluye solamente dos individuos lo cual puede no ser una muestra representativa de la variabilidad de la zona.

El grfico en tercera dimensin generado por el Anlisis de Correspondencia Mltiple, muestra la distribucin de los individuos de Rubus glaucus, se observa diversidad gentica entre las accesiones del Valle principalmente; y una distribucin ms amplia entre los individuos colectados en los Departamentos de Cauca, Nario y Valle, aportando por ende una mayor diversidad gentica. Se puede observar que un material silvestre del Cauca (UNAPM 16) se aleja de las dems procedencias, constituyendo de esta manera una fuente de variabilidad mayor. (Figura 15).

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En la ubicacin espacial se diferencian las regiones donde fueron colectados los materiales, esto puede deberse a que lo sitios muestreados estuvieron distantes y no hubo un muestreo continuo. Se muestrearon las regiones Oriental, Nororiental y Sur de los departamentos del Valle, Cauca y Nario respectivamente.

Valle Cauca Nario Donaciones

Figura 15. Representacin espacial de la estructura gentica de 29 accesiones de Rubus glaucus usando los Microsatlites RAMs. Elaborado mediante el Anlisis de Correspondencia Mltiple.

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Cuando se comparan los materiales del Valle con los del Cauca y Nario, se presenta una alta variacin y diversidad gentica, atribuida a diferencias existentes dentro de los grupos, que se deduce de una varianza del 67% y un coeficiente de diferenciacin gentica, de 0.3; mientras que la variacin entre grupos es relativamente baja equivalente al 33%. (Tabla 16).

Tabla 16. Anlisis de Varianza Molecular (AMOVA) para los 4 grupos de Rubus glaucus. FUENTE VARIACION ENTRE GRUPOS DENTRO GRUPOS TOTAL GL 3 25 28 SUMA CUADRADOS 94 177 271 VALOR 3.5876 7.1508 (%) 33 67

4.9 ANLISIS DE LOS AGRUPAMIENTOS POR SITIO GEGRAFICO

El agrupamiento de las accesiones de acuerdo con el sitio geogrfico donde fueron colectados, muestran que los valores promedios de heterocigosidad no son significativamente diferentes (Tabla 17). Sin embargo el valor ms alto de heterocigosidad de 0.2897, corresponde al Departamento del Valle del Cauca, siendo el Corregimiento de Juntas, Vereda La Cecilia, el lugar que exhibe una amplia diversidad gentica, atribuida principalmente a sus caractersticas edafoclimticas, ambientales, sociales y econmicas propias de la regin.

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Tabla 17. Heterocigocidad promedio estimada y porcentaje de loci polimorficos entre regiones y localidades analizadas.
LOCI POLIMORFICOS 95%

REGION

LOCALIDAD

INDIVIDUOS

HETEROCIGOCIDAD INSESGADA

TRUJILLO PALMIRA TULA VALLE LA MINA JUNTAS HERMOSAS TOTAL VALLE CAUCA TIERRADENTRO NARIO COCHA IPIALES TOTAL NARIO QUINDIO DONACIONES POBLACIN TOTAL

2 1 2 3 6 4 18 5 5 3 8 5 36

0.1724 **** 0.1207 0.2195 0.2591 0.2167 0.2897 0.2482 0.2402 0.2264 0.2435 0.2556 0.3125

34 *** 24 33 64 53 81 55 59 43 71 55 87.9310

Es importante destacar que en esta zona existe una amplia variacin altitudinal, la cual determina un relieve muy complejo, que vara de quebrado a fuertemente quebrado con pendientes pronunciadas, a veces superiores al 50%; en ella predominan las reas en pastos, pero se encuentran tambin zonas boscosa y en cultivos (caf, pltano, frjol, frutales). El complejo relieve de la Unidad de Sonso-Guabas-Guadalajara presenta una serie de importantes vertientes (o lneas de interseccin de dos inclinaciones divergentes) que condicionan su abundante y similarmente complicado sistema hidrogrfico (CVC, 1992). Como resultado de la interaccin de su variada distribucin altitudinal con los diferentes factores climticos existentes en la regin se presentan cuatro pisos tmicos que abarcan reas comprendidas desde un piso trmico clido moderado hasta un piso trmico paramuno. El rgimen de precipitacin no es

105

abundante en la mayor parte del rea, sin embargo en la parte paramuna se presentan precipitaciones continuas en forma de llovizna, lo cual ocasiona altitudinales y climticas, en la regin se hacen presentes cinco diferentes zonas de vida (o unidades climticas naturales); en cada una de las cuales se agrupan determinadas asociaciones vegetales. Las caractersticas fsicas, qumicas y mecnicas de los suelos, varan segn su material parental y los procesos de meteorizacin propios de su respectivo paisaje fisiogrfico. Como consecuencia de ello varan tambin, sus aptitudes de uso y manejo. Por todas las caractersticas anteriormente mencionadas, la regin rene las condiciones necesarias para el establecimiento de ciertas especies frutales de gran importancia econmica como la mora, el lulo, tomate de rbol, uva y maracuy. Las principales regiones productoras de mora fueron La Magdalena, Lulos, La Cecilia, Las Hermosas y Juntas; y aquellas de uva y maracuy las de Ginebra, El Castillo y Santa Elena. Las reas destinadas a estos cultivos se han incrementado apreciablemente durante los ltimos aos 3 a 4 aos, con excelentes resultados econmicos, a raz de las campaas de fomento y crdito emprendidas por la CVC. Adems cuenta con una asociacin de moreros la cual impulsa y promueve el cultivo en la regin. (CVC, 1992). La zona alberga una amplia diversidad gentica, al poseer materiales en estado silvestre de especies vegetales como Physalis peruviana L. (Bonilla & Espinosa, 2003), Rubus spp, guayaba (Psidium guajava), lulo (Solanum quitoensis), entre otras; siendo una fuente potencial de diversidad gentica. Por otra parte para el desarrollo de una estrategia de mejoramiento gentico que conduzca a la obtencin de nuevas variedades de mora, se hace

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necesario ampliar las zonas de muestreo en esta regin, especialmente en aquellas reas donde la actividad humana es mnima, y donde se incluyan especies silvestres, que son fuente de variacin. La deforestacin en algunas localidades ha contribuido a la prdida de la diversidad encontrada en la regin, por la tala indiscriminada de los bosques para ampliar las reas de cultivo, por lo que se hace necesario continuar con la coleccin para rescatar la diversidad que all puede existir. La disminucin del nmero de familias moreras en contraposicin con la regeneracin natural ha permitido que se incrementen las poblaciones de plantas provenientes posiblemente de semillas. Al comparar los promedios de Heterocigosidad entre Cauca, Nario y los materiales donados, no se han encontrado diferencias significativas entre stos valores, lo que indica la posible homogenizacin por la diseminacin de materiales comerciales. El anlisis de varianza molecular AMOVA presentado en la tabla 18, permite detectar que de la variacin gentica total, el 74% est explicada por la variacin entre individuos dentro de las localidades. Esta alta variacin podra indicar la presencia de niveles de subdivisin o jerarquizacin mayores o ms importantes a los considerados en este estudio. Se puede observar que existe una pequea variacin gentica molecular entre las regiones muestreadas al igual que entre localidades con valores correspondientes al 12 y 15% respectivamente.

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Tabla 18. Anlisis de Varianza Molecular (AMOVA) para regiones y localidades analizadas. FUENTE VARIACIN REGIONES ENTRE REGIONES DENTRO REGIONES TOTAL GL 3 6 26 35 SUMA CUADRADOS 76 77 209 362 VALOR 1.2588 1.5941 8.0218 % 12 15 74

Posiblemente

dentro

de

cada

localidad

existan

otros

niveles

de

subestructuracin, definidos por diferentes factores de las condiciones ecolgicas (sobretodo en poca de floracin), adems de los factores biolgicos de la reproduccin de la especie en estudio, como nivel de alogamia (alto, medio o bajo), tipo de polen (liviano, pesado, pegajoso o no pegajoso), abundancia o escasez de polinizadores, tipos de semillas o frutos (dehiscentes o no; adherentes o no). De acuerdo a lo anterior se hace necesario la realizacin de estudios microgeogrficos que permitirn entender la dinmica espacial y temporal de poblaciones aisladas y de paso ayudara a determinar cuales son las causas que explican apropiadamente la distribucin de la variacin gentica a nivel local.

108

5. CONCLUSIONES

Se probaron diferentes protocolos para la extraccin de ADN siendo el de Dellaporta et al (1983) modificado por Palacio (2000), el que permiti obtener ADN de buena calidad tanto de accesiones cultivadas como silvestres del gnero Rubus. Las diferentes soluciones presentes en el Buffer de extraccin as como el uso de solventes orgnicos como el Mercaptoetanol, y de detergentes como el PVP (Polivinil Pirrolidona), posiblemente facilitaron la obtencin de ADN total.

El

anlisis

intraespecfico

con

marcadores

RAMs

(Microsatlites

Amplificados al Azar) permiti detectar la variabilidad gentica entre y dentro de las accesiones de mora Rubus spp. Esta tcnica discrimin los individuos no slo por la especie a la cual pertenecen, R. glaucus, R.urticifolius y R. robustus, sino tambin el lugar de procedencia de los mismos, adems identific materiales muy similares en la coleccin como UNAPM19 y UNAPM25. Por lo anterior esta tcnica puede ser considerada como una herramienta til a la hora de evaluar la diversidad gentica en poblaciones naturales. Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que a pesar de que Rubus glaucus es una especie que ha sufrido seleccin por parte de los agricultores, se mantiene una variabilidad gentica entre las accesiones, de tal manera que se pueden diferenciar mediante los marcadores RAMs segn su ubicacin geogrfica.

109

Para la evaluacin de la diversidad gentica del gnero Rubus

se

seleccionaron seis cebadores (CT, AG, TG, CCA, CGA, CA) que generaron un patrn de 58 bandas, de las cuales se seleccionaron 43 por ser las que contribuyeron en ms de un 70% a la discriminacin de los materiales. El nmero de bandas por iniciador vari de 8 para primer CT y 11 para el primer TG, con pesos moleculares entre 260 y 1500 Kb. Los patrones de amplificacin obtenidos permitieron detectar la variacin existente entre los individuos analizados. Los seis cebadores utilizados permitieron identificar entre los materiales patrones de bandas nicos, sugiriendo una diferenciacin gentica entre ellos. La informacin de la distribucin de las bandas entre y dentro de los individuos tiene implicaciones para la gentica de conservacin, siendo la base para futuros trabajos de mejoramiento, clonacin, identificacin de especies o taxones. El anlisis mediante el coeficiente de Nei-Li, a un nivel de Similaridad de 0.55, diferenci la poblacin en 6 grupos (A,B,C,D,E,F) y stos a su vez en 27 haplotipos. Se encontr un valor de 0.40 de Similaridad entre los materiales silvestres de Rubus urticifolius y los pertenecientes a la especie Rubus glaucus, lo que sugiere la existencia de relaciones de tipo filogentico, morfolgico, distribucin, propagacin de la especie, flujo de genes, etc. La especie Rubus robustus present el valor ms bajo de Similaridad correspondiente al 0.25, al presentar caractersticas morfolgicas y/o moleculares nicas que la diferencian de las otras especies analizadas, constituyndose as en una fuente de variabilidad mayor, que debe ser estudiada con ms detalle.

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La heterocigosidad promedio para la poblacin total fue de 0.3125, cuyos valores fluctuaron entre 0.01 para la especie Rubus robustus (grupo F) formado por las accesiones UNAPM19 y UNAPM25, y 0.25 para el grupo B que incluye accesiones procedentes de los departamentos del Valle, Cauca y Nario, siendo este ltimo el que mayor aporte hizo a la varibilidad gentica encontrada. Los resultados obtenidos revelan un gran polimorfismo gentico en los grupos analizados, lo cual puede estar asociado a la probable naturaleza alogama de la especie, migracin, flujo de genes, trasferencia de materiales entre una regin y otra, presencia de accesiones silvestres, entre otros factores.

El valor de Fst fue de 0.4980 con una desviacin estndar 0.05. Segn Wright (1978), valores por encima de 0.25 muestran una gran diferenciacin gentica, por lo que el resultado obtenido evidencia una alta variacin entre las especies de Rubus analizadas. El Fst encontrado en este estudio, es un parmetro importante puesto que ayuda a entender la dinmica espacio-temporal de las especies de mora (Rubus spp) as como la estructura de cruzamientos entre ellas.

El Anlisis de Correspondencia Mltiple mostr una alta variacin entre los individuos dentro de cada grupo gentico. Los coeficientes de similitud dentro de grupos y entre grupos fueron de 54% y 37% respectivamente. La alta variacin gentica encontrada indica que hay bastante diferenciacin dentro de cada grupo, como posible resultado del tipo de reproduccin de la especie, migraciones o flujos de genes.

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El anlisis de varianza molecular AMOVA muestra que de la variacin gentica total el 52% se debe al componente dentro de los grupos y el 48% entre los grupos. Esta alta variacin podra indicar la existencia de niveles de subdivisin y jerarquizacin mayores a los evaluados en este estudio, as como a las diferencias propias de los individuos dentro de cada uno de ellos.

El agrupamiento de las accesiones de acuerdo con el sitio geogrfico donde fueron colectados, muestran que los valores promedios de heterocigosidad no son significativamente diferentes. Sin embargo el valor ms alto de heterocigosidad (0.2897) corresponde al Departamento del Valle del Cauca, siendo el Corregimiento de Juntas, Vereda La Cecilia, el lugar que exhibe una amplia diversidad gentica, atribuida principalmente a sus caractersticas edafoclimticas, ambientales, sociales y econmicas propias de la regin.

Los resultados obtenidos en este estudio permiten concluir que a pesar de las especies del gnero Rubus han sufrido seleccin por parte de los agricultores, se mantiene la variabilidad gentica entre las accesiones, de tal manera que se pueden diferenciar mediante marcadores RAMs segn su ubicacin geogrfica.

112

6. RECOMENDACIONES

El anlisis de la interaccin de los estudios genticos con los ecolgicos, ambientales y reproductivos de la especie, podran clarificar el porqu se presenta una determinada estructura gentica en una regin. En este sentido, es igualmente de inters adelantar investigaciones relacionadas con estructura floral, gametognesis, nivel de alogamia, apomixis, compatibilidad e incompatibilidad, nivel de plodia, arreglo cromosmico, tipo de polinizacin, clase de polinizadores y viabilidad de las especies del gnero Rubus, para establecer las bases genticas de un programa de mejoramiento.

Debido a los constantes procesos de alteracin a que se ven sometidos los habitats neotropicales por causa de procesos antrpicos, es necesario la realizacin de estudios a nivel molecular, que permitan investigar los efectos de dicha alteracin y posibles soluciones, alternativas de preservacin, conservacin y repoblamiento.

En el desarrollo de una estrategia de mejoramiento gentico sera de gran inters incluir otras especies de Rubus silvestres con el fin de caracterizarlas, analizar su diversidad y ampliar la base gentica de las variedades comerciales.

Debido a que la alta variabilidad gentica es hallada dentro de cada uno de los grupos analizados, se hace necesario la realizacin de estudios microgeogrficos, as como ampliar los sitios de colecta, que permitirn entender la dinmica espacial y temporal de poblaciones aisladas, y de

113

paso ayudaran a determinar cuales son las causas que explican apropiadamente la distribucin de la variacin gentica a nivel local. El uso de marcadores moleculares de herencia codominante, podran ser una herramienta til para estimar la diversidad gentica dentro del gnero Rubus, al establecer mejor las diferencias en los diferentes niveles de estructuracin de la poblacin. Las introducciones UNAPM19 y UNAPM25 pertenecientes a la especie Rubus robustus, deben ser estudiadas con mayor detalle y a la vez incluidas como una fuente potencial de variabilidad en futuros programas de mejoramiento. Establecimiento de la coleccin in vitro, y su duplicacin en otro sitio para evitar riesgos.

Se observaron clones de buen comportamiento en cuanto a precocidad y produccin, stos deben evaluarse en ensayos de rendimiento.

114

7. BIBLIOGRAFA

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127

ANEXOS

128

ANEXO 1. Formato de Colecta para las introducciones de mora Rubus spp.

Accesin Fecha de colecta Departamento Municipio Vereda Altura Latitud Longitud Colectores Morillo, Zamorano, Vsquez, Muoz Morillo, Zamorano, Vsquez, Muoz Morillo, Zamorano, Vsquez, Muoz Morillo, Zamorano, Vsquez, Muoz Morillo, Zamorano, Vsquez, Muoz Morillo, Zamorano, Vsquez, Muoz Morillo, Zamorano, Vsquez, Muoz Donantes Estado del material Fuente del material

UNAPM 1

Julio 5/02

Valle

Juntas

La Cecilia

2010

34754.2

760911.7

Espontnea

Semilla

UNAPM 2

Mar-02

Valle

Palmira

La Buitrera

1800

33012

762230

Cultivo

Finca

UNAPM 3

Octubre 24/02

Nario

Pasto

La Cocha

2600

19925

7709550

Silvestre

Borde carretera

UNAPM 4

Julio 5/02

Valle

Juntas

La Mina

2010

33213

761787.4

Cultivar nativo

Cultivo

UNAPM 5

Julio 5/02

Valle

Juntas

La Cecilia

2050

34745.9

760911.7

Cultivar nativo

Bosque

UNAPM 6

Julio 5/02

Valle

Juntas

La Mina

2010

33213

761787.4

Cultivar nativo

Cultivo

UNAPM 7

Julio 5/02

Valle

Juntas

La Cecilia

2010

34745.9

760911.7

Silvestre

Bosque

129

UNAPM 8

Octubre 25/02

Nario

Pasto

Cabrera

2830

1 13 13

7713289

Morillo, Zamorano, Vsquez, Muoz Morillo, Zamorano, Vsquez, Muoz Banguero Morillo, Zamorano, Vsquez, Muoz Morillo, Zamorano, Vsquez, Muoz Morillo, Zamorano, Vsquez, Muoz Morillo, Zamorano, Vsquez, Muoz Morillo, Zamorano, Vsquez, Muoz Zamorano, Velasco Zamorano, Velasco

Cultivada

Cultivo asociado

UNAPM 9

Octubre 25/02 Noviembre 4/02

Nario Valle del Cauca Nario

Pasto

San Juan

2500

0053757

7732559

Cultivada Cultivar Nativo Cultivar nativo

Finca Finca acodo terrestre Finca

UNAPM 10

Miranda

1600

31512

761350

UNAPM 11 Octubre 25/02

Ipiales

San Juan

2500

0053757

7732559

UNAPM 12 Octubre 25/02

Nario

Pasto

La Cocha

2600

19925

7709550

Silvestre

Borde de carretera

UNAPM 13

Julio 5/02

Valle

Juntas

La Cecilia

2050

34745.9

760911.7

Cultivar nativa

Cultivo

UNAPM 14

Julio 5/02

valle

Juntas

La Cecilia

2040

34750.7

760909.4

Cultivada

Finca

UNAPM 15 Octubre 25/02

Nario

Ipiales

San Juan Carmen Portugal Beln

2500

0053757

7732559

Cultivar

Finca

UNAPM 16 UNAPM 17

Julio 12 /02 Julio 12/02

Cauca Cauca

Inza Inza

2020 1860

23324 23624

761200 761050

Silvestre Silvestre

Finca Bosque

130

UNAPM 18

Julio 12/02 Septiembre 20/02

Cauca

Inza

Carmen portugal Alto Bonito

1980

23324

761200

Zamorano, Velasco Morillo, Zamorano, Vsquez, Muoz Morillo, Zamorano, Vsquez, Muoz Morillo, Zamorano, Vsquez, Muoz Zamorano, Velasco Morillo, Zamorano, Vsquez, Muoz Morillo, Zamorano, Vsquez, Muoz Morillo, Zamorano, Vsquez, Muoz Morillo, Zamorano, Vsquez, Muoz

Silvestre

Bosque

UNAPM 19

Valle

Trujillo

2400

4 14 92

76 24 77

Cultivada

Cultivo

UNAPM 20 Octubre 25/02

Nario

Pasto

La Cocha

3250

1 10 67

7710763

Silvestre

Margen

UNAPM 21 Octubre 25/02

Nario

Pasto

La Cocha Carmen portugal

3250

1 10 67

7710763

Silvestre Cultivar Avanzado

Mrgenes Finca Avelino Muoz

UNAPM 22

Julio 12/02

Cauca

Inza

2000

23524

761200

UNAPM 23

Septiembre 20/02

Valle

Trujillo

Alto Bonito

2280

4 14 66

76 2135

Silvestre

Bosque

UNAPM 24

Julio 5/02

Valle

Juntas

La Cecilia

2040

34750.7

760909.4

Cultivar nativo

Finca campo

UNAPM 25 Octubre 25/02

Nario

Ipiales

San Juan

2540

00530.5

7733150

Cultivar ecuatoriano

Cultivo

UNAPM 26

Julio 5/02

Valle

Juntas

La Cecilia

2010

34745.9

760911.7

Silvestre

Bosque

131

UNAPM 27

Julio 20/02

Valle

Ginebra

Hermosas

2100

346521

7608452

Morillo, Zamorano, Vsquez, Muoz Morillo, Muoz Morillo, Muoz Morillo, Muoz Muoz, Morillo.

Jaime Garca

Cultivar Nativo Silvestre

Finca (Bella vista) Bosque Finca (Bella vista) Finca (Bella vista) Finca In Vitro Cultivo inVitro

UNAPM 28 UNAPM 29 UNAPM 30 UNAPM 31 UNPM 32 UNAPM 33

20-Jul-02 20-Jul-02 12-Jul-02 Julio 12 2002 Marzo 4/02 Julio 05 2002

Valle Valle Valle Valle Caldas Caldas Quindo Caldas Caldas Caldas Valle Valle Valle del Cauca

Ginebra Ginebra Ginebra Ginebra Manizales Manizales Salento Manizales

Hermosas Hermosas Hermosas Hermosas

2040 2100 2100 2100 1600 1600 2000 1600 1700 1830 2260 1800 1900

346586 346521 346521 346 521 50412 50412 43823 50412 5153.7 5205 43823 35003 347590

7608428 7608452 7608452 7608452 753114 753114 753420 753114 752656.7 752550 761200 762018 7609630

Jaime Garca

Cultivar Nativo Silvestre Cultivar Nativo

Universidad del Quindo

Cultivar

Universidad Variedad o del Quindo Ecotipo

UNAPM 34 Marzo 4 2002 UNAPM 35 UNAPM 36 UNAPM 37 UNAPM 38 UNAPM 39 UNAPM 40 Marzo 4/02 Febrero 3/ 2003 Febrero 3/ 2003 Marzo 30/03 Marzo 30/03 Mayo 11/03

Universidad Variedad o Cultivo in Vitro del Quindo Ecotipo Universidad Variedad o del Quindo Ecotipo Corpoica Manizales Norberto Serma Carlos Escobar Carlos Escobar Morillo, Vsquez. In vitro

Manizales Zona indust. Manizales Zona indust. Tula Calima Ginebra El Porvenir San Jos (parte alta) La Cecilia

En campo Colecta campo ViveroCampo Silvestre Cultivar Silvestre Vivero Campo Ladera Finca Doa Leo, Ladera Bosque regeneracin

132

ANEXO 2

MTODO DE DELLAPORTA et al (1983) MODIFICADO POR HENRIQUEZ (2000). Buffer de Extraccin Solucin final Solucin inicial 0.5 M de NaCl (4M NaCl) 12.5 ml 0.2 M de Tris pH. 7.5 (1M Tris) 20 ml 10 mM EDTA (0.5 M) 2 ml 1% de SDS 1 gr Agua Bidestilada 65 ml Buffer 1X TE 200 ml de solucin Tris HCl 1M EDTA 0.5 M 2 ml 0.4 ml

CUANTIFICACIN DE ADN: Buffer 10X TNE 1000 ml de solucin 12.11 g Tris-HCl 3.72 g EDTA 116.89 g NaCl Ajustar pH a 7.4 ELECTROFORSIS: Buffer 10X TBE 1000 ml de solucin Trisma Base 108 g cido Brico 55 g EDTA 0.5 M 40 ml 100mM 10mM 2M

133

ANEXO 3
MTODO DE FULTON, et al (1995) MODIFICADO POR RESTREPO (2003) BUFFER DE EXTRACCIN Sorbitol Tris Base EDTA 0.35M 0.1M 0.05M 6.38 gr/100 ml 1.21 gr /100ml 0.186 gr/100ml

Ajustar el pH a 7.5 con HCl concentrado (aprox. 620 l de 32%). Guardar a 4C. BUFFER DE LISIS ( PARA 100 ML) Tris 0.2M EDTA 0.05M NaCl 2M CTAB 2% Agua 20ml 10ml 40ml 20ml 10ml Tris HCl EDTA NaCl CTAB 1M 0.5M 5M 10X (10%)

Ajustar el pH a 7.5 con HCl concentrado (aprox. 950 l de 32%). Guardar a temperatura ambiente. SOLUCIN DE SARKOSYL AL 5% Sarkosyl Agua 1g. 20ml

MICROPEP BUFFER Buffer de Extracc. de ADN Buffer de lisis Soluc. De Sarkosyl al 5% Volumen final 25 ml 25 ml 10ml 60ml

Adicionar 0.2 g. De bisulfito de sodio inmediatamente antes de usar.

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ANEXO 4
MTODO DELLAPORTA et al (1983) MODIFICADO POR PALACIO (2003) REACTIVO Tris- HCl 100 mM EDTA 50 mM NaCl 500 mM STOCK 50 ml 100 ml 250 ml 1M 5 ml 10 ml 25 ml 0.5 M 5 ml 10 ml 25 ml 5M 5 ml 10 ml 25 ml

Ajustar el volumen con agua deshionizada. Autoclavar por 15 min. Adicionar 1% (p/v) de PVP (PM 40.000), disolver agitando (0.5, 1 y 2.5 gr. respectivamente). Adicionar 2% (v/v) de - mercapto etanol (1, 2 y 5 ml respectivamente). No almacenar por ms de un mes. ANEXO 5 BUFFER Y MEDIOS BUFFER PARA PCR 10X KCl 500 mM Tris-HCl pH 8.8 100 mM Tritn X-100 1% BUFFER TBE 10X Para 1000 ml : Tris Base 108 g cido Brico 55 g EDTA 0.5M pH 8.0 40 ml Completar el volumen con agua bidestilada. T10 E1 Para 500 ml mezclar: Tris-HCL 1M pH 8.0 5 ml EDTA 0.5M pH 8.0 1 ml Completar el volumen con agua destilada. Autoclavar y conservar a 4C.

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BUFFER DE EXTRACCIN 150 mM Tris-HCl pH 8.0 15 mM EDTA 15mM NaCl 1M CTAB 1.5% -mercaptoetanol 1.2% PVP 1% El -mercaptoetanol y el PVP se agregan justo antes de usar el Buffer. BLUE JUICE Preparar una solucin con Azul de Bromofenol 0.25% y Glicerol en Agua 30%. Almacenar a 4C. EDTA 0.5M pH 8.0 Para preparar un litro de EDTA (0.5M) EDTA 186.1 g NaOH 18 g Medir pH 8.2. Autoclavar. Tris-HCL 1M En 800 ml de Agua destilada estril disolver 121.1g de Tris-HCl Base. Ajustar el pH deseado adicionando HCl concentrado: pH 7.4 7.6 8.0 HCl 70 ml 60 ml 42 ml

Ajustar volumen a 1.000 ml. ACETATO DE AMONIO En 350 ml de Agua destilada disolver 77.08 gr de Acetato de Amonio. Completar el volumen a 500 ml. Autoclavar.

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ANEXO 6 PRINCIPIOS QUMICOS DE ALGUNOS REACTIVOS REACTIVO TRIS (Hidroximetil metano) EDTA (Etilen diamino actico) Acetato de Sodio Acetato de Potasio Fenol Cloroformo amino tetra CARACTERISTICA Tampn biolgico Agente Quelante Sal Sal Solvente orgnico Solvente orgnico FUNCION Mantener estable el pH de la solucin (pH: 7.0-8.0) Toma iones Mg++ Precipita el ADN Precipita protenas Desnaturaliza protenas Remueve lpidos Desnaturaliza protenas Solubiliza al fenol y elimina de la solucin.

lo

SDS (Sodio dodecil sulfato) CTAB (Hexadecil Bromuro de Amonio) Trimetil

Detergente Aninico Detergente Catinico Detergente Aninico Detergente Polar Antioxidante Alcohol

Solubiliza protenas, tejidos y membranas. Solubilza polisacridos Inhibe Hexoquinasas Disuelve componentes de tejidos y membranas Evita el color pardo Escinde puentes disulfuro Agentes antioxidantes Disminuye formacin interfases de

Sarkosyl Lauryl Sarcosina Tritn X-100 - Mercaptoetanol Octanol-alcohol isoamlico

PVP (Polivinil pirrolidona)

Detergente

Elimina compuestos fenlicos que pueden inhibir actividad enzimtica. Precipitan Ac. Nuclecos (a bajas temperaturas). Elimina ARN Equilibran inicas. las fuerzas

Etanol-Isopropanol RNasa NaCl, KCl

Alcoholes Enzima Sales

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