Factores que influyen en la congelacin del semen de toros

Publicado el: 25/07/2012 Autor/es: DVM PhD. Gustav Decuadro-Hansen. Virbac, France

(4151) (6) Resumen

La fertilidad de los reproductores destinados a un programa de inseminacin artificial (IA) condiciona la produccin de carne o leche, y su incidencia sobre la rentabilidad de los rodeos se acenta cuando la situacin econmica del sector agropecuario decrece. Numerosos factores intervienen en los resultados de una IA. Los factores ligados a el manejo y a la hembra parecieran ser los ms importantes, sin embargo aquellos relacionados con el macho no deben dejarse de lado ya que los mismos pueden ser eventualmente manejados por los CIA. El objetivo de este artculo es analizar los factores de variacin de la congelabilidad y de la fertilidad de los toros de IA relacionados con el toro, eyaculado, edad, estacin del ao, familia, nmero de espermatozoides por dosis de IA y precio de la dosis de semen, y presentar las eventuales dificultades ligadas a la correlacin entre la evaluacin in vitro del poder fecundante del semen de toro y su fertilidad real. Introduccin Muchos trabajos de investigacin cientfica han demostrado que en sistemas de produccin de carne la fertilidad es el factor ms importante desde el punto de vista econmico. La crianza de toros es una industria mundial multimillonaria y hemos constatado en varias ocasiones que ganaderos o centros de inseminacin artificial dan prioridad en la seleccin a la conformacin y el tipo dejando a un segundo plano la eficacia reproductiva y la congelabilidad. Los criadores frecuentemente solicitan evaluaciones reproductivas rutinarias de sus machos (examen androlgico) para confirmar su fertilidad antes de una compra de una venta, para controlar su produccin espermtica diaria (PED) especialmente en reproductores de alto costo, para valorar el potencial reproductor como donante de semen para inseminacin artificial (IA) con semen congelado refrigerado, para una orientacin en problemas de infertilidad aparente y/o anormalidades testiculares. Tales evaluaciones reproductivas dependen de que se logre recolectar el semen apropiadamente y sobretodo de una precisa valoracin del mismo. La falta de xito reproductivo frecuentemente se debe a ms de un factor. Por lo tanto una evaluacin de aptitud reproductiva (EAR), incluir una prueba de libido o de capacidad de servicio, un examen de los genitales externos, una medicin testicular, una palpacin testicular y de los genitales internos, una evaluacin seminal, as como ecografa de testculos y vesculas seminales y prstata en algunos casos. Las pruebas para determinar enfermedades de transmisin sexual, especialmente brucelosis, Paratuberculosis, IBR, etc., son parte crucial de la EAR. Cuando se discute de examen androlgico en toros, el criterio congelabilidad es poco citado. Sin embargo en las condiciones actuales de cra de ganado, el semen congelado es el nico que permite la difusin del material gentico en condiciones prcticas. La incorporacin de un toro en un centro de inseminacin artificial (CIA) se realiza fundamentalmente en funcin de su valor gentico, considerando su ascendencia (pedigr), sus caractersticas de performance individual y su descendencia (progenie). La fertilidad de este reproductor, condicin sine qua non para valorizar este potencial gentico, es evaluada o mejor dicho estimada a nivel del CIA por medio de un examen clnico completo y por la apreciacin de la calidad del semen producido. La fertilidad o poder fecundante de un reproductor no se puede estimar en forma directa; solamente es verificada una proporcin limitada de funciones del animal o de sus gametos. La apreciacin que realizamos es parcial, ya que su valor predictivo negativo es elevado, pero su valor predictivo positivo es bajo. Como regla general son retenidos los toritos jvenes que presentan una buena circunferencia escrotal (CE), una concentracin espermtica elevada, una

buena motilidad antes y despus de la congelacin y pocas anomalas espermticas. La concentracin se encuentra correlacionada favorablemente con la motilidad en masa e individual (+0,4 a +0,9) y el porcentaje de anomalas totales est ligado negativamente a la motilidad y a la concentracin (Dumont 1998). En el toro joven tambin son observadas correlaciones altas entre la CE y los parmetros cuantitativos del eyaculado (concentracin y nmero total de espermatozoides) (Coulter y col. 1987, Thibier y col 1972). Los parmetros de viabilidad espermtica generalmente evaluados en un CIA son la motilidad, la integridad de la membrana y del acrosoma. Los mismos son extremadamente sensibles al enfriado entre 2-8 C as como a la congelacin. Esta congelabilidad del semen bovino solo puede evaluarse gracias a la prctica de la congelacin en si y pocas son las pruebas que un veterinario puede realizar para conocer este parmetro. Una correlacin interesante fue publicada recientemente (Evans y col. 2005), relacionando el modelo de insercin de los pelos de la parte frontal de la cabeza de los toros con el porcentaje de anomalas morfolgicas de los espermatozoides en el eyaculado. Los toros con una insercin espiral de los pelos del rea frontal de la cabeza presentaron significativamente menos anomalas morfolgicas en el eyaculado que aquellos que no la presentaban. Algunos pases (Francia por ej.) emplean un test de control de la funcin sexual en toritos jvenes durante la ltima fase de la seleccin individual antes de ingresar el animal en un centro de produccin de semen. La finalidad de este test es la de evitar de ingresar en test de progenie animales improductivos o de baja produccin y congelabilidad de semen o sea que el mismo contribuye a rentabilizar la inversin realizada (seleccin del torito por pedigr y por caractersticas individuales) y a realizar. Este test consiste en la evaluacin de 5 colectas dobles (10 eyaculados, siendo los dos primeros eliminados). Los parmetros seminales evaluados son: el volumen, la concentracin, la motilidad de masa, una evaluacin de la presencia de leucocitos, la motilidad individual, el porcentaje de anomalas y la motilidad a la post descongelacin inmediata. En regla general 15-20 % de los toritos son eliminados por este nico test. La fertilidad de los reproductores destinados a un programa de inseminacin artificial (IA) condiciona la produccin de carne o leche, y su incidencia sobre la rentabilidad de los rodeos se acenta cuando la situacin econmica del sector agropecuario de un pas decrece. La fertilidad de un toro utilizado en IA es corrientemente evaluada directamente por medio de la "tasa de no retorno" (TNR) o indirectamente estudiando una de sus componentes: la calidad del semen. La relacin calidad del semen/fertilidad fue ampliamente estudiada, sin embargo dos factores influencian los resultados obtenidos de estas investigaciones: a) El factor "eyaculado": El estudio de la relacin entre los resultados de inseminacin y las caractersticas del semen utilizado solo debera hacerse por eyaculado. Esta informacin solo estar disponible cuando pueda identificarse y registrar las pajuelas despus de usado por intermedio del sistema del cdigo de barras, b) El factor "medio ambiente": las condiciones de manejo influencia enormemente los resultados de campo y deben tomarse en cuenta a los efectos de poder presentar conclusiones validas. La TNR corresponde a la proporcin de vacas o vaquillonas inseminadas que no son detectadas nuevamente en celo en un perodo de tiempo preestablecido: 28, 56, o 90 das. La TNR calculada sobre un perodo corto (28 das) puede estar influenciada por numerosos factores como: los aspectos de manejo del rodeo (deteccin de celo, decisin del ganadero con respecto al intervalo parto-IA), la fertilidad intrnseca de los reproductores (machos y hembras) y la mortalidad embrionaria precoz (Humblot 1986). La TNR calculada sobre un perodo mayor, 56 o 90 das, est a su vez influenciada por la mortalidad embrionaria tarda. Hemos constatado desde hace un par de aos una disminucin de la TNR en diferentes pases. La tendencia actual en Francia es de 0,5 puntos porcentuales /ao. Numerosos factores intervienen en los resultados obtenidos (fertilidad) despus de realizar una IA. Los factores ligados al manejo y a la hembra son los ms importantes para la fertilidad del rodeo y han sido objeto de numerosas publicaciones. Sin embargo los factores ligados al macho no deben dejarse de lado ya que los mismos pueden ser eventualmente manejados por un CIA. La siguiente revisin est basada esencialmente en la experiencia clnica, y de investigacin del autor, as como en revisiones bibliogrficas publicadas y el objetivo de la misma es de analizar los factores de variacin que influencian la congelabilidad y la fertilidad de los toros de IA.

Componentes de la fertilidad La fecundacin o concepcin en una IA es el resultado del depsito de los gametos masculinos en el interior del tracto genital de la hembra por medio de un vector humano. El porcentaje de concepcin, que podemos llamar corrientemente fertilidad, depende por lo tanto de un componente macho, de un componente hembra y de un componente inseminador. Los modelos de anlisis de los datos de fertilidad de las vacas y vaquillonas permiten observar de forma precisa los efectos de los diferentes factores ligados a la hembra (nmero de partos, intervalo parto-IA, rodeo) y a la inseminacin (CIA, inseminador, mes, da de la semana). La importancia de esos factores no ser tratada aqu. En lo que respecta al componente macho, si bien el efecto "toro" es fcilmente medible, el mismo incluye el poder fecundante del semen eyaculado y la tcnica de procesamiento del semen (diluyente, protocolo de dilucin, tcnica de enfriamiento del semen diluido, congelacin, descongelacin). El inters por esta distincin puede no ser frecuente ya que todo el eyaculado de un toro utilizado en IA es "tratado" de la misma manera y la fertilidad del producto final utilizable es lo que le interesa a los profesionales de los CIA. No obstante, es importante hacer esta diferencia cuando se realizan distintos tratamientos del semen de los toros en un CIA. El poder fecundante del semen eyaculado as como su calidad "tecnolgica" (aptitud para soportar la crioconservacin) es fruto de la calidad intrnseca del esperma del toro y del efecto del medio ambiente inmediato (tcnica y frecuencia de colecta, estacin del ao, estrs, enfermedad transitoria). Finalmente la calidad del esperma depende de la interaccin de un factor propio del toro (gentico) y del efecto "medio ambiente". Todos estos componentes ligados al macho, a la hembra y al inseminador pueden realizar un efecto "aditivo" sobre la fertilidad final o bien interactuar entre s. As por ej. Macmillan y Watson observaron una interaccin entre el momento de la IA y el nivel de fertilidad de los toros. La fertilidad de 3 grupos de toros (superiores e inferiores al promedio del CIA) es diferente cuando la IA se realiza al inicio del celo (74,3%, 62,7% y 58,4% p<0,01), sin embargo no hay diferencias cuando la IA se realiza al final del mismo.

Estimacin de la fertilidad La fertilidad de los toros es estimada por medio de diferentes parmetros en funcin de la fertilidad de las vacas y vaquillonas inseminadas con su semen. El diagnstico de gestacin por medio del dosaje de protenas embrionarias en la sangre, como la PSPB (Humblot 1986), ecografa o palpacin rectal permiten establecer el porcentaje de preez en un rodeo de vacas en un momento dado. Sin embargo, otros mtodos son empleados a gran escala gracias a su simplicidad y a su carcter sistemtico. Los mismos se basan en el no retorno al celo de la vaca. Las TNR precoces (24 o 28 das) sobrestiman la fertilidad, ya que aproximadamente slo el 50% de los retornos al celo son o pueden ser observados en ese momento (Humblot y col 1991). Por otro lado una TNR tarda disminuye el inters del estimador ya que puede no evidenciar la eventual presencia de un problema. Es por esta razn que Van Doormaal aconseja utilizar 56 das y Foote y Oltenacu recomiendan utilizar 59 das despus de la IA como el estimador ptimo. Es interesante recalcar que las TNR 56 o 59 das presentan una correlacin alta (del orden del 96%) con la TNR 60/90 o 75 das (Taylor y col.1985) y que a su vez este tipo de TNR es suficientemente precoz para estimar la fertilidad del toro utilizado. La evolucin de la TNR a partir de dosis de semen a 25, 60 y 90 das fue motivo de varios trabajos cientficos. Recientemente Decuadro-Hansen y col. (Decuadro- Hansen y col. 2000) estudiaron la evolucin de la TNR en 6 toros Holstein de testaje de fertilidad desconocida en eyaculado fraccionado y diluidos en dos diluyentes diferentes: Biociphos plus (B+) y Bioxcell (Bx), en 3 tasas de diluci n distintas. Fueron as utilizadas tres tipos de dosis: 1) diluidas en Biociphos plus con 7 millones de espermatozoides totales antes de la congelacin; 2) Bioxcell con 7 millones de espermatozoides totales antes de la congelacin y 3)

diluidas con Biociphos plus con 20 millones de espermatozoides totales antes de la congelacin (grupo control). La evolucin de la TNR de 25 a 90 das puede apreciarse en la tabla 1. Tabla 1. Evolucin de la TNR a 25, 60 y 90 das en primo-IA (n)

B+= Biociphos plus; BX= Bioxcell Es evidente que los factores de variacin de la TNR a 25 y 90 das no son los mismos. La variacin de la TNR a 90 das est ms ligada a las caractersticas de la poblacin de hembras utilizada que la TNR a 25 das. Esta ltima estara ms influenciada por los factores que pueden actuar en el momento de la IA, como el manejo (deteccin de celo, intervalo parto-IA), las condiciones de inseminacin y el factor toro. En otro orden de cosas Dumont P, comparo las TNR obtenidas a partir de inseminaciones realizadas con semen de 27 toros diferentes y 76 eyaculados diluidos en Bioxcell y Triladyl yema de huevo (split ejaculate) a concentraciones de 8 a 12 millones de espermatozoides por pajuela y no encontr diferencia significativa en materia de TNR (lettre d'Andrologie, n 8 UNCEIA, en prensa). El porcentaje de paricin se refiere al nmero de vacas y vaquillonas que fueron inseminadas y que parieron en un perodo compatible con la duracin promedio de la gestacin. El clculo de este estimador supone el registro sistemtico de los nacimientos, el cual no es realizado en forma rutinaria en todos los rodeos. Asimismo, esta estimacin es demasiado tarda y no puede ser utilizada como instrumento de gestin en un CIA. Por el contrario constituye un parmetro interesante para calcular los ndices genticos de fertilidad (Boichard y coll. 1998). Todos los estimadores de fertilidad obtenidos a partir de IA clsicas precisan de un nmero elevado de hembras para ser estadsticamente aceptables. En cada hembra, el resultado de fertilidad (preez o vacuidad) sigue una ley binomial y su precisin depende del porcentaje observado y no del nmero de hembras. As para una fertilidad del 50% observada sobre 100 vacas, el intervalo de confianza al 95% es de 10 puntos de porcentaje, mientras que sobre 1.000 hembras es solamente de 3,2 puntos de porcentaje. La base mnima de evaluacin de la fertilidad de un toro debera ser por lo menos de 500 IA (Haferstroh y col. 1999). Otro mtodo de estimacin in vivo de la fertilidad que permite reducir costos es la utilizacin de la heterospermia. La misma consiste en inseminar una mezcla de un nmero similar de espermatozoides de 2 o ms toros, a los efectos de clasificar los mismos en funcin del nmero de terneros obtenidos de cada toro. Los terneros obtenidos deben ser identificados fenotpicamente o de lo contrario deben usarse "marcadores genticos" (ADN). La clasificacin de fertilidad obtenida es repetible y en relacin a las IA monosprmicas se necesita un nmero menor de hembras (Beatty y col. 1969). A su vez la utilizacin de toros poco frtiles no disminuye la tasa de concepcin de las hembras y por lo tanto no existen riesgos financieros.

Factores que influencian la congelabilidad del eyaculado El suceso de la crioconservacion depende de interacciones complejas entre la calidad original del eyaculado, el tipo de diluyente empleado, el tipo y velocidad del proceso de congelacin descongelacin y del tamao y tipo de embalaje empleado para el semen.

Los factores pueden clasificarse en: 1. Factores que influencian la capacidad fecundante de un toro 2. Los medidas de manejo y medio ambiente 3. La tecnologa de tratamiento del semen

1. Factores que influencian la capacidad fecundante de un reproductor 1. a: Influencia de las caractersticas de los espermatozoides sobre la fertilidad y la congelabilidad En razn de la complejidad del proceso de espermatognesis es fcil imaginarse cmo los cambios que sufren los espermatozoides a nivel del ncleo y de la membrana pueden desencadenar un problema. De esta manera una anomala del acrosoma, de la cabeza del espermatozoide o de su cola pueden detectarse rpidamente en el torito joven que ingresa en un CIA, lo cual puede determinar su eliminacin de la produccin de semen. Por el contrario si la anomala es menos evidente, como por ejemplo aquellas que alteran la membrana del espermatozoide, el torito puede ingresar en una prueba de progenie y/o utilizarse en IA si la fertilidad no es muy baja. Las anomalas de los espermatozoides (defectos morfolgicos o funcionales) pueden ser clasificadas en "compensables" y "no compensables". Esta clasificacin utilizada por Saacke y col. (1994) corresponde a la utilizada por Pace y col. (1981) de "extrnsecas" e "intrnsecas". Los defectos compensables son todos aquellos cuya presencia disminuye las posibilidades de fecundacin, limitando por ejemplo el trnsito de los espermatozoides hacia el oviducto. La disminucin de la fertilidad es desencadenada por una disminucin del porcentaje de espermatozoides normales en el sitio de la fecundacin. El trmino compensable sugiere que dicho problema puede ser "compensado" por una elevacin del nmero de espermatozoides en la pajuela. Por el contrario, los defectos no compensables son aquellos cuya presencia no limita el trnsito de los espermatozoides ni la probabilidad de fecundacin. En este caso los espermatozoides anormales entran en competicin con los normales. En sentido estricto este tipo de defectos no influencian el porcentaje de fecundacin pero disminuyen el porcentaje de preez ya que son responsables de mortalidad embrionaria. Entre los defectos compensables se encuentran aquellos que alteran la motilidad y la aptitud de los espermatozoides para capacitarse (reaccin acrosmica); entre los no compensables estn todas las anomalas de la cabeza del espermatozoide, responsables de alteraciones nucleares, como por ejemplo los crteres o vacuolas. Sea cual sea la anomala presente es importante tener un mtodo de trabajo preciso para evaluarlas y disminuir los errores en el CIA. Por lo menos seria necesario: diluir la muestra, inmovilizar los espermatozoides, evaluar un numero de espermatozoides suficientemente importante (mnimo 200 espermatozoides), trabajar en contraste de fases (ideal con contraste interferencial) y un mnimo de x 400 aumentos, y contar con personal entrenado y formado. Adems de la probabilidad que un espermatozoide posee de fecundar un ovocito y de desarrollar el embrin normalmente, debe tenerse en cuenta el tipo de anomala presente en el semen, la cual indica en qu grado est alterada la espermatognesis de un toro. Por ejemplo, la presencia de "cabezas sueltas" o espermatozoides decapitados es considerada como una anomala menos grave que la presencia de la gota proximal. Podemos pensar que un espermatozoide decapitado tiene menos posibilidades de fecundar un ovocito que un espermatozoide que tiene gota proximal. Sin embargo es universalmente admitido que la presencia de gota proximal indica una alteracin grave de la espermatognesis. Por lo tanto debe drsele ms

importancia a la presencia de un 20% de gota proximal que a un 20% de espermatozoides decapitados en el eyaculado destinado a la congelacin. Muchos estudios han investigado el mecanismo por el cual el semen de toro se daa cuando los espermatozoides llegan a 4 C o luego de la congelacin. Si bien diferentes partes de los espermatozoides pueden verse afectadas, es la membrana que aparece como una de las principales causas de muerte celular. La rotura de la membrana plasmtica est claramente asociada con la prdida de viabilidad celular, pero una membrana plasmtica intacta no siempre indica que la clula sea viable. Los daos que pueden producirse en stas pueden ser modificaciones en su organizacin, permeabilidad y composicin lipdica. Las membranas espermticas que pueden verse afectadas por la criopreservacin incluyen la membrana plasmtica, la membrana externa del acrosoma y las membranas mitocondriales. En cualquier caso, la criopreservacin, cuyo propsito es garantizar la supervivencia del semen, causa daos irreversibles en la membrana plasmtica, lo que conlleva la muerte de un gran nmero de espermatozoides o, en los supervivientes, cambios similares a los observados durante la capacitacin espermtica, que provoca un acortamiento de su perodo de vida til. La evaluacin morfolgica de la integridad de la membrana plasmtica se realiza usando la ptica de contraste de fases, la ptica de contraste diferencial de interferencia o de Nomarski o las tinciones supravitales, como el verde rpido/eosina o la eosina/azul de anilina, el tripn azul/Giemsa o el amarillo de naftol/eritrosina. Tambin ha sido valioso el examen a travs de la microscopa electrnica o de barrido, para determinar aspectos de la integridad espermtica. Actualmente, se estn utilizando diversas tinciones fluorescentes, las cuales presentan una mayor precisin en el estudio de las caractersticas de la membrana plasmtica. As, se ha estado usando ampliamente el diacetato de carboxifluorescena y el ioduro de propidio, visualizndose con esta tcnica los espermatozoides viables de color verde, frente a los muertos que se observan de color rojo anaranjado. La evaluacin funcional de la misma puede llevarse a cabo mediante test de resistencia osmtica o Host. Esta prueba se basa en la capacidad del espermatozoide para captar agua en un medio hiposmtico y en que la hinchazn osmtica est asociada con el enrollamiento de la cola del espermatozoide, que se desenrolla cuando la clula es devuelta a un medio isosmtico. Para que esta respuesta se produzca, la membrana plasmtica del espermatozoide debe estar ntegra y con los mecanismos de intercambio de fluidos funcionando correctamente. La entrada de agua provoca en estas clulas un hinchamiento y enrollamiento del flagelo. Las clulas con la membrana fsica o funcionalmente daada no experimentan cambios en la forma del flagelo. Los valores obtenidos en esta prueba se correlacionan con otros parmetros de calidad seminal, como la motilidad, la viabilidad o la morfologa.

1.b Efecto toro La evidencia de la existencia de un efecto toro sobre la fertilidad de las vacas es corrientemente mencionada en la literatura (Everett y col. 1986, Humblot y col. 1991). Este efecto se manifiesta precozmente despus de la IA, y la clasificacin no vara enormemente cuando se estudian las TNR a 24 o a 90 das (Humblot 1986). Existe una correlacin de 0,90 entre la TNR 28 y 56 (Reurink y col. 1990) y de 0,96 entre la TNR 56 y la TNR 60/90 das (VanDoormaal 1998). La amplitud de esta variacin entre toros es elevada cuando se consideran las IA destinadas a la prueba de progenie, ya que se observaron hasta 42 puntos porcentuales de diferencia en paricin para una muestra de 913 toros Holstein utilizados con 300 a 700 IA (2). Los valores extremos son raros ya que para esta muestra de toros expresando la fertilidad de los mismos con respecto a su raza, 26 toros fueron estrictamente inferiores a 10, y 11 toros fueron estrictamente superiores a +6. La amplitud de estos resultados fue del orden de 3,9%, prxima a la observada por Everett y Bean (1986) sobre una muestra de 4.500 toros. Sin embargo, cuando se consideran los toros de servicio, o sea aquellos testeados que representan el 85% de las IA realizadas, las fluctuaciones son mucho ms limitadas. En Francia, sobre 75 toros Holstein, Montblaird y Normandos (+ de 20.000 IA cada uno entre los aos 1996 y 1998), el porcentaje de paricin expresado con respecto a un promedio vari de 8 a +4. De la misma manera, sobre los 20 toros ms utilizados en Holanda, la TNR 56 vari de 5 a +2 (29). Esta amplitud menor de la TNR, se explica por el refugo de los toros de testaje de baja fertilidad y por el nmero elevado de IA realizadas lo cual mejora la precisin.

1.c Efecto eyaculado Frecuentemente se observa en los CIA que la calidad de un eyaculado no es constante y que en determinadas ocasiones los mismos presentan una motilidad inferior o un porcentaje de anomalas mayor. Es probable que la capacidad fecundante de tal eyaculado sea baja, lo que en realidad no se sabe ya que es eliminado por el CIA. Esta prctica contribuye a uniformar la calidad de los eyaculados de un toro e indirectamente reduce la variacin entre toros. A los efectos de obtener semen de alta calidad a la descongelacin, es necesario obtener semen puro de alta calidad lo cual esta influenciado por :

La preparacin sexual antes de la colecta El trabajo con los toros en sala de monta El ritmo de colecta La alimentacin La ausencia de patologa locomotoras o de pene y prepucio La temperatura El toro en si. La diferencia entre el primer y el segundo:

Existen, algunas diferencias entre el primer y segundo eyaculado colectado en un toro en una misma sesin de colecta. Segn experiencia del autor el porcentaje de anomalas es siempre menor en los segundos eyaculados colectados, sin embargo el porcentaje de espermatozoides mviles al descongelado no difiere en forma significativa. Asimismo, Schenk (1998) constato una composicin diferente en el plasma seminal de los primeros y segundos eyaculados:

Caractersticas seminales del primer y segundo eyaculado de toro colectado con 20 minutos de intervalo (Schenck 1998)

1.d Efecto edad El efecto edad del toro en relacin al poder fecundante del semen se ha estudiado muy poco en razn de la falta de trazabilidad en lo que respecta a la fecha de produccin del eyaculado y la IA. Sin embargo, este factor ha sido considerado ligndolo a la hembra y al ao de produccin.

De esta forma, la fertilidad de un toro de 1 ao puede aumentar cuando cumple 2 aos, ya que se han observado 4-6 puntos ms en el porcentaje de preez y de paricin en un estudio realizado con toros de monta natural sobre 748 vacas (Makarechian y col. 1993). En lo que respecta a los toros viejos, los mismos presentaron una fertilidad menor como en el estudio de Murray y col. (1983), en donde toros Holstein de 14 aos presentaron una TNR 60/90 das inferior en 4% en relacin a los toros de un ao. En realidad la estimacin del porcentaje de paricin de los toros de progenie Holstein no difiere de aquella de los toros de servicio entre 60 a 107 meses (Taylor y col. 1985) y la reduccin de la fertilidad comienza a observarse a partir de los 5 aos de edad. Un estudio realizado sobre la razas Holstein y Guernsey mostr que la regresin de la TNR en relacin a la edad de los toros fue significativa para las dos razas a partir de 2 aos (tabla 2)(p<0,01). Esta disminucin fue de 0,31% de 2 a 16 aos para los Holstein y de 0,50% para los Guersney de 2 a 13 aos (Collins y col. 1962). Tabla 2: Regresion de la fertilidad de Toros Holsteins en relacion a su edad

1.e Efecto familia Una familia de toros se define como el conjunto de terneros machos nacidos del mismo padre. Si la fertilidad de los machos es "heredable", la fertilidad observada de los toros de testaje o progenie debiera lgicamente ser influenciada por el padre. As los resultados de pariciones obtenidos a partir de inseminaciones realizadas en Francia entre 1996 y 1998 permitieron observar la fertilidad de los toros de testaje nacidos de 13 familias de 3 razas: Holstein (n=9) ; Montbliard (n=3) y Normando (n=1). Cada una de las familias estaba constituida por no menos de 40 toritos, los cuales realizaron 300 IA entre los aos 96-98. Entre los fenmenos observados entre esas familias llam la atencin los resultados obtenidos en 3 de ellas que proporcionaron sistemticamente una tasa de paricin menor al promedio de las mismas y ms variabilidad.

1.f Efecto anomalas cromosmicas Una de los estudios que debe realizarse cuando se obtiene una TNR baja en un nmero significativo de hembras en diferentes establecimientos con semen congelado de toros que no presentan problemas de

calidad de semen (motilidad y morfologa normal) es el cariotipo. La primera anomala cromosmica en ganado bovino relacionada con la fertilidad fue descubierta en 1964: translocacin 1/29. En el 2000 Ducos y col (2000), estudiaron un caso de baja fertilidad a campo (< 30% en mas de 400 IAP) en 3 toros de la raza Montbliard. El anlisis citogentico evidenci la presencia de una translocacin cromosmica 12:17.

2. Los medidas de manejo y medio ambiente 2.1 Colecta de semen y sala de monta El trabajo en sala de monta realizado por el equipo de un CIA comprende una fase de preparacin sexual o periodo de pre-excitacin y una fase de excitacin propiamente dicha compuesta de falsas monta sobre un scubo o maniqu. Todo responsable de un CIA debe acompaar esta fase y monitorear la misma por lo menos una vez cada 15 das. No existe en opinin del autor ningn otro equipo de trabajo en un CIA que pueda influenciar en forma tan significativa la cantidad y calidad de semen. La colecta de semen influencia en forma importante la calidad de semen producida por intermedio de su personal, la calidad y limpieza de la sala de monta, el tipo y preparacin de la vagina artificial., y el ritmo o frecuencia de colecta. Optimizar la frecuencia de colecta a los efectos de reducir las reservas de semen en el epiddimo y aumentar el transito epididimario es una de los mtodos ms antiguos para mejorar la calidad de semen (Amman, 1961). En regla general los CIA de Europa y Amrica del Norte usan un ritmo de colecta de 2 x 2 (2 eyaculados 2 veces por semana). Es interesante remarcar que en regla general los toros colectados con este ritmo presentan una calidad post descongelada superior en los segundos eyaculados colectados (Schenk 1998) . En regla general, es altamente recomendado de estimular sexualmente los toros antes de la colecta. Esta practica de manejo puede dividirse en dos fases: a) pre excitacin sexual de 15-20 minutos en toros lecheros y 30 minutos en toros de carne de razas europeas colocando los animales en un brete contiguo a la sala de colecta y permitiendo a los animales observar a los otros toros saltando, y b) falsas montas, siendo una de las mejores tcnicas para producir semen en cantidad y calidad en toros de razas europeas practicar dos falsas montas 5 minutos de espera restringida al lado del scubo y una tercera falsa monta antes e colectar (Schenk J 1998). Un trabajo interesante fue presentado por Yates J en 2002 comparando el comportamiento, libido y las caractersticas de semen antes y despus de congelado de toros Holstein y Braham colectados en rgimen diurno y nocturno. A pesar de una mejor respuesta a la colecta en rgimen nocturno no se constato diferencia en la congelabilidad del semen.

2.2 Efecto estacin del ao En los pequeos rumiantes es comn observar un factor "estacional" sobre la calidad del semen y la fertilidad. La primavera constituye un perodo desfavorable para la gran mayora de las razas ovinas, debido al aumento de la duracin de los "horas luz", a la cual son sensibles carneros y machos cabros (Colas y col. 1983 , Corteel y col. 1980). En el bovino la variacin estacional de la fertilidad es ms discreta pero se conoce desde los aos sesenta (Courot y col. 1968). La utilizacin de la tcnica de congelacin de semen en bovinos permiti distinguir la responsabilidad del macho y de la hembra en materia de estacin del ao, lo cual no era posible antiguamente cuando slo se empleaba semen fresco. As, los trabajos de Courot y col. (1968) en Francia mostraron que el semen de toros de raza Montbliard producido en primavera fue ms fecundo que aquel producido en otoo (2,4 puntos ms de TNR 60/90 das). Por el contrario, Sullivan y Elliot (1968) observaron una menor TNR 60/90 das (74,2%; P<0,01) obtenida con

semen producido durante la primavera y verano, que aquella obtenida con semen producido en otoo e invierno (76,3%). Para Everett y Bean (1986) igualmente el efecto "mes" de produccin del semen influy en forma significativa sobre la fertilidad, haciendo variar el porcentaje de concepcin en 1,33%. En cambio, otros estudios no han puesto en evidencia un efecto claro del mes de produccin sobre la TNR 30/60 y 60/90 das (Dimitripoulus 1968) ni sobre el porcentaje de paricin (Sullivan y col. 1968). En Amrica Latina destaca el trabajo presentado por investigadores Brasileros en la regin Sureste de este pas: Anchieta y col 2005, comparando razas taurinas a cebuinas en dos grandes pocas del ao: lluviosa y seca, ambas con temperaturas elevadas ( > 19 C). En regla general, el la congelabilidad del semen, juzgada por apreciacin subjetiva a la colecta, fue superior en las de razas taurinas que en las cebuinas, as como el descarte de eyaculados mayor en pocas lluviosas.

2.3 Alimentacin Pocos son los trabajos que han relacionado la alimentacin de los toros de CIA con la produccin y calidad del semen. El autor empleo durante varios aos en CIA en Europa con toros estabulados dos estrategias de alimentacin segn que los reproductores se encontrasen en fase de produccin de semen o en lay-off (reposo sexual). Toros en produccin:

Heno de alfalfa o pradera a voluntad Cama de paja Racin concentrada (3-4 Kg/toro/da en Holstein y 1-3 K en Normando) con 14.5% de protenas, materia grasa 2,3%, 12,3 % de celulosa bruta, 7,6 % de cenizas

Toros en lay-off (16 meses a 3.5-4 aos):

15 K de ensilado de maz 7-8 K de heno 400 g por da de un concentrado a base de soya y minerales para los toritos con menos de 24 meses y para aquellos con ms de 24 meses solo minerales.

Uno de los factores ms conocidos en los CIA es el efecto negativo de las dietas altas en energa. En efecto, Coulter y col (1997) pusieron en evidencia un efecto nefasto de dietas altamente energticas (80 % granos y 20 % forraje) en toritos de carne destetados Angus y Hereford, a cual indujo una circunferencia escrotal importante pero un tono testicular reducido y una capacidad de termorregulacin testicular menos eficiente. Asimismo, el examen de semen de los toritos as alimentados revel un porcentaje mayor de anomalas espermticas y un numero inferior de espermatozoides con motilidad progresiva frente a toros alimentados con dietas menos energticas. La alimentacin de los toros juega un papel fundamental en el desarrollo y la aparicin de problemas en las pezuas, las manifestaciones de lceras y abscesos en la lnea blanca constituyen muchos episodios de cojeras. Ambas enfermedades (salvo el absceso en la lnea blanca producto de un traumatismo) son consecuencia de la incapacidad del corion para producir una pezua de calidad y para ello la alimentacin juega un papel decisivo. Cambios bruscos en la alimentacin, baja calidad de los ensilados, poca fibra en la racin conducir a una menor salivacin y por consiguiente a una reduccin del efecto tampn que tiene la saliva en el rumen por lo que el riesgo de acidosis ser mayor.

A los efectos de prevenir los problemas de pezuas en toros es necesario:

Mantener la estabulacin de los toros limpia y seca, proporcionando en el brete una cama ya sea de arena o paja o agua, Cuidar del piso de la sala de monta que debe ser antideslizante y con declive lateral , incluir un tapete de goma de 3 m x 2 m en la zona de colecta, Todos los pisos donde los animales permanecen un cierto tiempo (incluido el de la sala de monta) deben ser tratados por acido actico 10 das antes que los toros ingresen (1 litro de vinagre diluido en 10 litros de agua, neutralizar el cemento a razn de 5 litros por cada 100 m2) Realizar siempre una transicin alimentara gradual de por lo menos 10 das para permitir que la flora ruminal se adapte, Realizar la toilette (recorte funcional) de las pezuas 2 veces/ao Suplementar la racin de los toros con materias primas que intervienen en la salud de las pezuas: Zinc, metionina, cisteina, Vitamina A y E, Biotina, Ca, P y relacin Ca/P (muy importante en toros), Cobre, Selenio, Azufre. Usar bicarbonato de sodio (200 g /da) en caso de alimentacin en base a ensilaje

La suplementacin de Zinc (forma orgnica por ej. propionato) en las raciones de toros ha sido revisada recientemente. El Zinc influencia la produccin y secrecin de testosterona, insulina y corticoides suprarenales en consecuencia procesos como la esperamatogenesis estn en parte mediados por este mineral (Mc Dowell y col. 1993). Kumar y col. 2006 encontraron que algunos parmetros seminales de los toros suplementados con 35 ppm de Zinc orgnico (motilidad masal, nmero de espermatozoides por eyaculado y test de penetracin de espermatozoides en mucus cervical) se mejoraban luego de un perodo de suplementacin de 6 meses.

3. tecnologa de tratamiento del semen 3.1 Efecto Diluyente Desde el desarrollo de la criopreservacin del semen (Polge 1949) , la yema de huevo, la albmina bovina o humana, la leche, una base salina compuesta, y el glicerol fueron empleados en los diluyentes de semen bovino. En la especie bovina, la gran mayora de los diluyentes a excepcin de aquellos a base de leche, poseen 20 % de yema de huevo o un substituto del mismo en su composicin. El rol de la yema de huevo durante la congelacin es la de proteger los espermatozoides del efecto nefasto de la dilucin as como del "cold shock" que ocurre durante el proceso de congelacin-descongelacin (Moussa y col. 2001). El mecanismo por el cual la yema de huevo protege a los espermatozoides es hasta hoy desconocida. En regla general la yema de huevo utilizada es la de gallina, sin embargo en los ltimos aos y en especies consideradas como "difciles de congelar" (ex. Burros baudet du poitou) se ha empleado yema de huevo de codorniz que se caracteriza por ser mas rica que la yema de huevo de gallina en fosfatidilcolina, menos en fosfatilidiletalonamina y una relacin baja de cidos grasos saturados e insaturados (Trimeche y col. 1997). Los ltimos avances en materia de diluyentes de semen bovino pueden clasificarse en: 1. aquellos que estn relacionados a la proteccin de la membrana durante el proceso de congelacindescongelacin 2. aquellos que incorporan substancias a carcter antioxidante en el diluyente

1. aquellos que estn relacionados a la proteccin de la membrana durante el proceso de congelacindescongelacin 1.a: Se admite que el dao que los espermatozoides sufren durante el proceso de congelacindescongelacin es superior a el ocasionado por la dilucin o el agregado de glicerol El mismo es ocasionado por efecto

temperatura y osmtico y afecta la morfologa y fisiologa de los espermatozoides incluyendo la regulacin del calcio intracelular, la fluidez de la membrana plasmtica, la permeabilidad, la composicin lipdica y la actividad mitocondrial (Watson 1995) as como la induce la perdida de protenas plasmticas de membrana necesarias durante la fecundacin en el tracto genital de la vaca (Lessar y col. 2000). Los daos ocasionados por este proceso pueden ser reducidos usando crioprotectores como el glicerol, la yema de huevo y azucares en los diluyentes. Una nueva generacin de diluyentes de semen bovino (Biociphos plus, Bioxcell , Andromed ) hizo aparicin a mitades de los aos 90, se trata de diluyentes sintticos sin productos de origen animal. La caracterstica principal de los mismos es la de emplear un substituto de la yema de huevo. El objetivo principal de este tipo de producto no ha sido el de mejorar la respuesta a la congelacin, sino el de evitar la contaminacin bacteriolgica del diluyente por intermedio de la yema de huevo (que puede llegar a 6 proporciones de mas de 10 UFC/ml, Decuadro-Hansen 2004) as como el de facilitar la fabricacin cotidiana del diluyente en CIA y la de mejorar la lectura al microscopio del semen congelado (nitidez de la lectura). Numerosos test de campo han permitido confirmar las excelentes TNR obtenidas con este tipo de diluyente versus los diluyentes a base de yema de huevo inclusive en baja concentracin de espermatozoides congelados por dosis (ver tabla 3). Tabla 3: TNR despus de inseminacin artificial con semen congelado obtenida con dosis de 15 y 5 millones de espermatozoides totales diluidos en diluyentes a base de Tris-yema de huevo (Triladyl) y diluentes sin yema de huevos : Bioxcell y Andromed. El test de campo incluye 5000 IAP por diluyente (Nehring H et Rothe L 2003)

No obstante, persistirn algunos parmetros o interacciones que pueden favorecer un diluyente en relacin a otro ya sea con o sin yema de huevo, como por ejemplo, la "velocidad del enfriado del semen" de +32-34C a +2-4C, el nmero de espermatozoides totales o con motilidad progresiva utilizados que pueden "esconder" las diferencias o la "preferencia" que un semen puede tener con un diluyente en relacin a otro. As por ejemplo si comparamos 2 diluyentes entre s en condiciones de campo, sera interesante disminuir la concentracin de espermatozoides por dosis, a los efectos de detectar diferencias significativas entre diluyentes en materia de TNR. Es altamente probable que el semen de algunos toros "prefieran" un diluyente en particular con respecto a otro. Cuando se comparan 2 o ms diluyentes, a los efectos de disminuir los factores que influencian la fertilidad, debera utilizarse sistemticamente la tcnica del "eyaculado fraccionado" en uno o mejor varios CIA. Esto permite comparar diluyentes reduciendo los factores que eventualmente pueden influenciar la prueba, como ser: el CIA, el tratamiento del semen (protocolo de dilucin, enfriamiento y envasado), el factor toro y el factor eyaculado 1.b : El LDL (lipoprotenas de baja densidad de la yema de huevo) y el colesterol: Numerosos autores han mencionado que la fraccin de lipoprotenas de baja densidad de la yema de huevo conocida como LDL interacciona con la membrana de los espermatozoides durante el proceso de congelacindescongelacin y es la responsable de la proteccin durante la dilucin y la crioconservacin. Un nuevo mtodo de extraccin del LDL fue desarrollado en el INRA de Rennes (France) y experimentado en semen bovino con excelentes resultados. El LDL as extrado ha sido empleado como fuente de lipoprotenas en diluyentes a base de Tris, acido ctrico y fructosa comerciales y ha permitido confirmar el rol crioprotector de esta molcula as como la concentracin optima en los diluyentes de semen bovino: 8 % w/v (Antn, INRA de Rennes comunicacin personal). Los resultados obtenidos por el equipo de Briandt-Amarat y col. (2006) han permitido confirmar el efecto benfico de esta nueva metodologa de extraccin del LDL ya que ms espermatozoides motiles (54.4%) a la descongelacin fueron hallados con el uso de un diluyente a base de Tris, acido ctrico fructosa + 8 w/v de LDL que con el mismo diluyente adicionado de 20 % de yema de huevo (30,2%). En otro orden de cosas, Graham. y col 2006 reporta una mejor viabilidad del semen bovino cuando el mismo es tratado previamente con colesterol y ciclodextrinas , sin embargo no existen hasta el da de hoy ningn test de campo que confirme que este tratamiento previo la congelacin permita mejorar los resultados de fertilidad de los toros problema.

2. aquellos que incorporan substancias a carcter antioxidante (AOX) en el diluyente La dinmica de la membrana plasmtica de la clula espermtica cumple un papel importante en los procesos de maduracin, capacitacin y fecundacin (Wolfe et al., 1998; Mller et al., 1999); sin embargo, el aumento de los radicales libres (ROS) pueden daarla (Clarkson y Thompson, 2000) y una de las principales causas del deterioro espermtico es el estrs oxidante que causa peroxidacin de los lpidos de la membrana plasmtica, modifica su fluidez y altera la permeabilidad, lo que puede conducir a la clula a un proceso de muerte celular (Batellier et al., 2001). La membrana de los espermatozoides contienen una alta concentracin de cidos grasos polinsaturados lo que le transmite a la misma una alta susceptibilidad a los problemas de dao oxidativo (oxidacin o peroxidacin) lo cual puede interferir en el proceso de fecundacin. Este fenmeno fue recientemente confirmado en el trabajo de Kasimanickam R y col. en 2006. Con base en lo anterior se puede considerar que un rea prometedora de estudio es el posible pretratamiento contra los procesos de peroxidacin de los espermatozoides o en el medio de dilucin para proteger o conservar la integridad de su membrana durante el proceso de congelacin y descongelacin (Leboeuf et al., 2000), ya que se sabe que los metabolitos generados por las ROS durante los procesos oxidantes trastornan la fusin espermatozoide-ovocito, la movilidad espermtica y la integridad del ADN (Aitken et al., 1998). La acumulacin de ROS ha sido tambin comprobada durante la conservacin de semen fresco de toro as como despus de la descongelacin del semen. Este "stress oxidativo" se ha asociado en el esperma humano con baja fertilidad y alteracin del desarrollo embrionario (Aitken et al, 1996; Griveau and LeLannou, 1997, De Iuliis et al, 2006). Sustancias antioxidantes estn normalmente presentes en los espermatozoides y en el plasma seminal. Algunos de ellos son molculas no enzimticos como el -tocopherol, acido ascrbico , glutathione (Halliwell and Gutteridge, 1989) piruvato (de Lamirande and Gagnon, 1992), taurina, hypotaurina y albmina (Alvarez and Storey, 1983). Se han llevado a cabo varios experimentos usando substancias AOX en diferentes especies animales para mejorar la calidad del semen y la fertilidad del mismo. Hasta ahora pocos resultados son realmente concluyentes. Bilodeau y col. (2002) trabajando con un diluyente a base de Tris-yema de huevo glicerol encontr que el agregado de fluido de oviducto rico en catalasa y piruvato mantena la motilidad y viabilidad del semen as como los niveles de ATP intracelular cuando el semen era desafiado con H202. Foote y col. (2002) usaron glutation reducido (GSH), superoxyde dismutase (SOD), acido ascrbico, hypotaurina, Tempo y Tempol en un diluyente a base de leche. Entre los AOX usados solo el GSH consigui mejorar los parmetros in vitro del semen liquido y descongelado sin aumento significativo de la fertilidad a campo. Bing rond y col (2001) hallan que el agregado de glicina y betaina (100 o 200 mM) a diluyentes tipo Talp-yema de huevo o Tres-Test-yema de huevo mejora en forma significativa la motilidad del semen fresco a 20, 5 y 0 C en toros de baja y buena congelabilidad. Identificacin de la eficacia de la accin antioxidante en el semen: Para desafiar el semen con ROS Grard y col agregaron al semen bovino diluido cantidades crecientes de peroxido de hidrogeno (de 0 a 1 mM) y ensayaron 36 molculas con actividad antioxidante en concentraciones de 50 micro M hasta 5 m para medir el rol protector de algunas. Solo 4 (designadas como N, AC, AE y AF) de las 36 molculas testeadas permitieron mantener la motilidad y el vigor del semen (ver tabla 4 caso del AC). Tabla 4: Evolucin del porcentaje de espermatozoides vivos descongelados desafiados con cantidades crecientes de H2O2; (AC versus control).

Efecto de los AXO sobre las caractersticas in Vitro de los espermatozoides cuando los mismos son agregados a los diluyentes comerciales. Semen fresco o lquido (Grard O 2006) 11 centros de produccin de semen de Francia participaron en el siguiente test a) Semen fresco: El semen de 7 toros colectados 2 veces por semana durante 3 semanas fue tratado por la tcnica del "split ejaculate" en 3 fracciones y diluidas con un diluyente comercial a base de Trisyema de huevo (control, A01 Tris-yema enriquecido con AOX N a 1 mM y A05 Tris-yema enriquecido con AOX N a 5 mM, ver tabla 5). La adicin de dicho AOX tuvo un claro efecto positivo (motilidad y vigor) a la concentracin de 1 mM desde el da 2 y hasta el da 4. Tabla 5: Evolucin del porcentaje de espermatozoides mviles en cada fraccin del eyaculado de 7 toros (21 muestras).

Efecto de los AXO sobre las caractersticas in Vitro de los espermatozoides cuando los mismos son agregados a los diluyentes comerciales. Semen congelado

El semen de 10 toros colectados 2 veces por semana durante 3 semanas fue tratado por la tcnica del "split ejaculate" y diluido con un diluyente comercial a base de Tris-yema de huevo o un diluyente sinttico sin productos de origen animal enriquecido o no con 4 diferentes AOX y 2 concentraciones diferentes. El semen congelado as producido fue evaluado por microscopia de contraste de fases y sistema CASA (Ivos HT) para los parmetros de motilidad y vigor, as como por citometria de flujo para los parmetros de viabilidad .Solo los AOX N y AC a una concentracin de 5 mM mostraron una respuesta positiva. Los resultados de 4 de los CIA que participaron en este test se encuentran en la tabla 6. Cuando fueron usados 5 mM la viabilidad del semen no fue significativa diferente pero los parmetros de velocidad si. Tabla 6: Influencia de la adicin de N y AC a dos concentraciones diferentes en los parmetros de calidad seminal (Experimento N, n=80 eyaculados ; 4 CIA, 10 toros, 2 colectas de semen, Experimento AC, n=40 eyaculados).

Teniendo en cuenta estos resultados promisorios se realizo un test de campo con semen fresco y con semen congelado. Semen fresco: 3 toros Holstein fueron colectados y su semen fraccionado en dos por la tcnica del split ejaculate y diluido en Tris-yema de huevo, Tris-yema de huevo + AOX, las dosis fueron concentradas con 5 millones de espermatozoides totales cada una. Paralelamente semen de los mismos toros pero de otros eyaculados fue colectado diluido con Tris-yema de huevo y congelado. Tabla 7: TNR18-75 usando FC (Semen Fresco Control), FN (Semen fresco con AOX N 1mM) y semen congelado (FS) (Grard O 2006).

Tabla 8: TNR18-75 usando FC (Semen Fresco Control), FN (Semen fresco con AOX N 1mM) y semen congelado (FS), resultado por toro (Grard 2006) .

La adicin de AOX a el diluyente aumento de forma significativa la TNR del toro 1 y 2 ( + 13% y + 6 % respectivamente, tabla 7 y 8) mientras que fue levemente deprimida en el toro 3 (-3%). A sealar que para todos los toros la TNR fue superior en semen fresco enriquecido en N que en semen congelado. Semen congelado (Grard O 2006) Varios test fueron realizados para confirmar el efecto benfico del uso de AOX AC en el diluyente usado para congelar semen bovino y no es el objetivo de este trabajo de describirlos en detalle. En regla general, si bien se observa un efecto toro, el agregado del AOX AC permiti mejorar la fertilidad medida por la TNR 90 das en 3 puntos (tabla 9).

Tabla 9: TNR90 por toro (CIA) y por fraccin de semen (dosis enriquecidas en AC 1811 inseminaciones versus control 1707 inseminaciones)

3.2 Efecto tratamiento del semen : curva de enfriado Una vez el eyaculado colectado pocas son los mtodos que permiten mejorar la calidad del semen a la descongelacin. El semen de toro se colecta en general sobre tubo seco y estril sin diluyente. Un estudio reciente (Wendee 2007) narra las bondades de realizar la colecta sobre un dispositivo llamado BreedMaX el cual contiene diluyente en su interior que se de be entibiar a 37 C antes de realizar la colecta. No obstante el semen de toro puede permanecer sin diluyente alguno en un bao mara durante un periodo de 30 minutos. En efecto, a la fin de los aos 60 algunos CIA practicaban este mtodo llamado "holding" (mantenimiento del semen puro 1030 minutos en bao mara antes de la dilucin). Es en parte lo que se sigue realizando cuando dos colectas se hacen sucesivamente a 20 minutos de intervalo, sin embargo es opinin del autor que en eyaculados altamente concentrados (> 2 billones de espermatozoides/ml) es interesante realizar una pre dilucin. Gran parte de los cuidados y tiempos respetados usados en el laboratorio del CIA son destinados a evitar el cold schock. En regla general, despus de colectado, el semen debe enfriarse a 4-5 C en forma gradual (1.5-2 h mnimo) y luego equilibrarse (tiempo de espera a 4-5 C hasta la congelacin) durante 3-24 h. Es opinin del autor que poco se ha experimentado con la primera fase de la curva (37 C hasta 4-5 C). As por ejemplo, diluyendo y llenando las paillettes a temperatura ambiente, el autor obtuvo buenos resultados de motilidad y viabilidad con semen calificado mediocre a el examen post colecta bajando la temperatura desde 20 C hasta 4 C en 160 minutos a 0.1 C/minuto en un congelador programable (Minidigtcoll IMV-Technologies). Es posible que este tipo de descenso de la temperatura sea mas regular, homogneo y lento que el enfriado en masa realizado en recipientes en donde la tcnica no esta estandardizada (descenso con recipiente sumergido en agua del bao mara o no, calidad y potencia del refrigerador, etc.). Sin embargo, numerosas experiencia han sido realizadas con la equilibracin y han mostrado que es ms importante el tiempo de incubacin del semen diluido a 4-5 C que el tiempo en el cual el semen esta en presencia del glicerol (Salisbury y col 1978). Los trabajos de Gilbert y Almquist (1978) as como de Frijters (2003) estn a favor de una equilibracin prolongada de 9 y 16 h respectivamente debido a una mejor motilidad, porcentaje de acrosomas normales y viabilidad (integridad de la membrana) obtenida frente a periodos de equilibracin ms cortos. El uso de tiempos de equilibracin largos fue experimentado a campo por Foote y Kaproth (2002) quienes compararon en un test a gran escala (14.000 IA) dos tiempos de equilibracin del semen bovino diluido en diluyente a base de leche: 4 versus 28 h sin observar diferencias significativas en la fertilidad. En Francia el tiempo promedio de equilibracin es hoy en da de 5 horas. Pribenszky y col. (2006) presentaron una mejora sustancial de los resultados a la descongelacin y de la fertilidad del semen bovino despus que las paillettes fueron tratadas con presin de 300 bar durante 90 minutos a temperatura ambiente antes de practicar el enfriado a 4-5 C. Esta estrategia puede ser interesante para toros de baja congelabilidad no obstante es necesario que se evalu con un numero de toros importante.

El tipo de embalaje usado para contener el semen: pajuelas finas, medias, pellets influencia la curva de congelacin, sin embargo pocos son los artculos cientficos que han comparado en eyaculado fraccionado la calidad de cada embalaje frente a la fertilidad a campo. En regla general el autor considera que no existen diferencias significativas de fertilidad entre las pajuelas finas y las medias en acuerdo con Kupferschmied (1982). Las tcnicas de congelacin del semen en si han evolucionado en forma importante en estos ltimos 10 aos. Hoy en da la mayoras de los CIA poseen un congelador programable que permite modular la curva de enfriado en ritmos de 0.1 C/minuto hasta 60 C/minuto. La curva de descenso de temperatura para el semen bovino puede realizarse a diferentes velocidades (Saacke 1982), sin embargo en opinin del autor los mejores resultados son obtenidos con una velocidad de descenso de 40-50 C/minuto entre -10 y 100 C.

3.3 Efecto nmero de espermatozoides por dosis de IA Uno de los conceptos principales con respecto a la evaluacin de la fertilidad de los toros es la relacin entre la calidad y cantidad de espermatozoides. Dentro de este concepto propuesto por Salisbury en 1961 (32) se considera que para una caracterstica dada del semen, la fertilidad aumenta en funcin del incremento de la misma hasta un valor mximo a partir del cual los factores limitantes son otras caractersticas del semen o la poblacin de hembras. Esta "caracterstica" puede ser: 1) un factor cualitativo del eyaculado (motilidad, protenas del plasma seminal, etc.), 2) el nmero de espermatozoides inseminados, o 3) o el nmero de espermatozoides con una caracterstica particular. Pace y col. (1981), as como Den Das (1992) demostraron que esta relacin con la fertilidad existe realmente para el nmero de espermatozoides que posean una serie de criterios de viabilidad. Es decir que el nmero de espermatozoides inseminados (y no el porcentaje) que presentan ciertos parmetros de viabilidad (motilidad progresiva, integridad del acrosoma, aptitud a reaccionar a la prueba de resistencia osmtica, aptitud para atravesar un filtro de Sephadex, etc.) est correlacionado con la fertilidad. Esta relacin es de tipo exponencial y tiende a una asntota (Figura 1). En lo que respecta al nmero de espermatozoides con motilidad progresiva, Pace y col. (1981) informaron que la TNR 90 das disminuy en 4,9% cuando el nmero de espermatozoides mviles despus de la descongelacin pas de 8 a 2 millones por dosis. En otro estudio, Foote y Parks (1993) remarcaron que la fertilidad disminuy un 1% (p<0,05) cuando el nmero de espermatozoides totales pas de 24 a 12 millones. Sin embargo este efecto de la disminucin eventual de la fertilidad en funcin del nmero de espermatozoides no se observa en todos los toros. Por otro lado es importante sealar que los toros catalogados como "poco frtiles" no podrn alcanzar una fertilidad correcta o comercialmente aceptable, a pesar de utilizar dosis de semen altamente concentradas en espermatozoides (34). Januskauskas y col. (1996) compararon los resultados de fertilidad obtenidos con 5 toros que fueron utilizados en IA con una concentracin de entre 10 y 15 millones de espermatozoides por dosis. Dos toros mantuvieron su fertilidad mientras que los otros tres perdieron 3,4 a 4,7% de TNR 56 das. Es interesante resaltar que el toro con peores resultados de fertilidad era menos frtil an con 15 millones de espermatozoides. En regla general los toros poco frtiles requieren ms espermatozoides por dosis para alcanzar su valor mximo de TNR Stalhammar y col. 19943). A su vez este tipo de toros no alcanzan a tener una TNR dentro de lo que puede considerarse como aceptable a pesar de aumentar la concentracin de espermatozoides en la pajuela. Estas dos nociones: 1) aumento ms lento de la fertilidad en funcin del nmero de espermatozoides inseminados y 2) un mximo de fertilidad alcanzado menor al resto de los toros del CIA nos hace recordar los principios mencionados al principio como factores compensables y no compensables. Como lo muestra la Figura 1, el toro A es de referencia, el toro B presenta una deficiencia que puede ser compensada aumentando la concentracin de espermatozoides en las pajuelas y el toro C presenta factores no compensables que no le permiten alcanzar una TNR aceptable. Figura 1. Correlacin entre fertilidad y el nmero de espermatozoides inseminados, en 3 toros diferentes, A, B y C (TA, TB y TC).

3.4 Efecto nmero de espermatozoides viables por dosis de IA Desde el inicio de la IA en bovinos, los CIA procuraron un mtodo simple, preciso ,eficaz y relacionado con la fertilidad a campo para evaluar el semen de toro. Los exmenes del semen como el volumen, la motilidad de masa e individual as como la concentracin son particularmente eficaces para eliminar los eyaculados o pajuelas de mala calidad pero ineficaces para determinar la fertilidad de los toros. Por ejemplo, la subjetividad e imprecisin del control de motilidad post-descongelado de las paillettes bovinas imposibilita la harmonizacin de los criterios de aceptacin del semen entre CIA. En los ltimos aos, una serie de pruebas de laboratorio se han desarrollado para evaluar otros parmetros seminales tales como la integridad de la membrana de los spz o del acrosoma , en base al uso de soluciones hiposmticas o en el uso de colorantes fluorescentes y un citmetro de flujo. Christensen y col (.2000) desarrollaron un mtodo destinado a estudiar la relacin entre la viabilidad del semen estimada por citometra de flujo (FACSCount BD/SYBR14/PI) y la fertilidad a campo. Decuadro Hansen y col observaron una correlacin positiva entre la TNR y el nmero de espermatozoides viables por dosis de IA (Figura 2) en una prueba a campo realizado en Francia con 13 toros diferentes y 2154 IAP. Figura 2: Nmero de espermatozoides viables por dosis de IA x TNR 60/90 d (r=0.69 , P<0.01).

3.5 Precio de la dosis de semen El precio de venta de la dosis de semen es un factor que el CIA debe tener en cuenta cuando analiza la fertilidad de un toro. As por ejemplo en Canad, Van Doormaal, (1993) encontr que las dosis de menos de 15 dlares canadienses presentaban una "fertilidad" superior a aquellas ms caras. En efecto, los productores utilizan estas dosis ms caras sobre vacas de alta calidad gentica y por ende con una produccin lechera mayor, lo cual castiga la fertilidad de las dosis utilizadas. As un aumento de la produccin de leche de +1.000 Kg determin una disminucin de 3% en la TNR 28 das y de 4% en la TNR 90 das (1999).

Eleccin de un nmero de espermatozoides / dosis Con motivo de simplificar el trabajo, la mayora de los CIA utilizan un objetivo comn para todos los toros, que se expresa en el nmero de espermatozoides por dosis o nmero de espermatozoides con motilidad progresiva por dosis. La existencia de numerosas fuentes de variacin de fertilidad (toro, eyaculado, estacin del ao, nmero de espermatozoides, IA, hembra) impone al CIA escoger un nmero de espermatozoides por dosis bastante elevado, lo cual establece un cierto margen de seguridad. Esto justifica el empleo de cantidades altas de espermatozoides por dosis en los toros de razas lecheras (aproximadamente de 20 millones), lo cual, segn el porcentaje de espermatozoides con motilidad progresiva obtenido despus de la descongelacin (por ejemplo 30 a 50%), permite disponer de entre 6 a 10 millones de espermatozoides con motilidad progresiva por dosis para la gran mayora de los eyaculados. La TNR 90 das promedio que se puede esperar segn la frmula de Pace y col. (1981) sera de 70,4 y 71,4% respectivamente.

Relacin entre la evaluacin in vitro y la fertilidad

Es comn en los CIA de limitar el examen de semen descongelado a una simple evaluacin de la motilidad inmediata o diferida (test de termoresistencia). Sin embargo, Amann (1961) y Pace y col (1981) demostraron ms de una vez que dosis que presentaban un adecuado nmero de espermatozoides con motilidad progresiva a el descongelado podan ser responsables de un porcentaje bajo de fertilidad. Asimismo, Stalhammar y col. (1994) estiman que si bien la motilidad antes y despus de la congelacin es diferente entre los toros de un CIA, la misma slo representa 1% de la variabilidad de la TNR. El uso de los sistemas CASA permiti darle objetividad a los parmetros de motilidad y estudiar otros no detectables por el ojo humano. Recientemente Hallap y col (2006), encontraron una correlacin interesante entre la fertilidad a campo y algunos parmetros CASA: la velocidad promedio medida (VAP) (p < 0.001), la motilidad total (p < 0.01), la linearidad (p < 0.05) y el numero de espermatozoides mviles (p < 0.05), todos medidos despus de practicar el swim-up. La evaluacin de un reproductor al ingreso en un CIA consiste en un examen clnico completo, con especial atencin al tracto genital y al aparato locomotor, una serie de exmenes complementarios destinados al control sanitario (serolgicos, control de enfermedades venreas, Schalm test, etc.), y un examen minucioso de las caractersticas del eyaculado: volumen, concentracin, motilidad, examen de las anomalas morfolgicas de los espermatozoides ( mnimo 3 sobre los segundos eyaculados), y evaluacin de la aptitud a la congelacin (motilidad, acrosomas, integridad de la membrana). Luego de esta evaluacin del potencial reproductor del toro, los animales son generalmente clasificados en aceptables, inaceptables o regulares. Generalmente los animales clasificados como "aceptables" y "regulares" ingresan dentro del esquema de produccin de semen, sabiendo que los segundos sufrirn un examen complementario. Los animales "infrtiles" son generalmente eliminados dentro de este esquema, sin embargo debemos tener siempre presente que es "riesgoso" querer clasificar los animales nicamente sobre la base de las apreciaciones in vitro. Como sabemos, existen diferencias importantes entre CIA y laboratorios en lo que se refiere a los criterios de eliminacin de los eyaculados y pajuelas de un toro lo cual demuestra la falta de harmonizacin as como la subjetividad e imprecisin de los criterios generalmente utilizados (motilidad) para calificar un reproductor. Efectivamente como vimos, los factores que influencian la fertilidad son numerosos e interactan entre s. La evaluacin in vitro es delicada ya que los coeficientes de correlacin entre la misma y la fertilidad in vivo raramente sobrepasan a 0,4. Esto se debe a la poca variabilidad existente entre los toros utilizados en IA (los cuales son seleccionados por este carcter), a la concentracin elevada de espermatozoides por dosis y a los numerosos cofactores que influencian la fertilidad. Como regla general no existe correlacin alta entre los test de evaluacin in vitro del semen y la fertilidad. Sin embargo una correlacin importante, prxima a uno (r= 0.99), fue hallada por Christensen y col. entre la viabilidad del semen evaluada por citometra de flujo y la fertilidad (2000). Dentro de los parmetros seminales que podran considerarse como altamente correlacionados con la TNR se encuentran: la motilidad individual de los espermatozoides en el eyaculado fresco inmediatamente despus de colectado y la motilidad inmediata al descongelado (Christensen y col 1999). El criterio de fertilidad que debemos privilegiar es la tasa de paricin o en su defecto una TNR tarda.

Problemas prcticos en la evaluacin de la fertilidad Si suponemos que todos los aspectos ligados a la hembra y a la IA son correctamente controlados, la fertilidad de los toros de IA no caracteriza el poder fecundante del reproductor sino el poder fecundante de la dosis de semen utilizada. Sin embargo muchos factores pueden confundirnos en la apreciacin de la fertilidad de un toro, sobre todo si consideramos los elementos sobre los que vamos a calcular el poder fecundante (Tabla 10). Por ejemplo, si se quiere estimar el poder fecundante a partir de las pajuelas utilizadas, la fertilidad del macho observada permite obtener una buena estimacin poco influenciada por el factor inseminador y por la hembra, en la medida que el semen sea de buena calidad y el nmero de IA importante. Tabla 10: Factores a tener en cuenta cuando se quiere estimar la fertilidad de los toros

Conclusin Cuando se analiza la fertilidad de un toro a nivel de campo se pone en evidencia un conjunto de factores ajenos al toro mismo. Sin embargo para un CIA con un nmero importante de toros en produccin y practicando el mismo manejo de los eyaculados (dilucin, enfriamiento, equilibramiento y congelacin), es posible identificar que el factor "toro" pesa de forma preponderante en el resultado final obtenido (TNR). La observacin de este efecto macho, autoriza a pensar que quizs en un futuro prximo se pueda contribuir a mejorar la fertilidad de los rodeos por medio de una seleccin activa sobre los factores que mejoran este carcter en el macho. En este sentido sera muy importante que los CIA vigilaran este aspecto (fertilidad de los toros) sobre todo debido a la difusin masiva de esos mismos toros en los rodeos comerciales. Un mejoramiento pragmtico de la fertilidad y la difusin de un toro en IA reposa sobre un estudio "individual" de cada animal en relacin al nmero de espermatozoides inseminados y la fertilidad.

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