23/10/2012

Contenido
1. Introduccin 2. Determinacin de protenas por anlisis elemental
Mineralizacin Determinacin de nitrgeno en forma de NH4 + o NH3 Otros mtodos

Parte IV

3. Determinacin de protenas por mtodos qumicos

Mtodo de Biuret Mtodo de Lowry Mtodo de fijacin de colorantes

4. Determinacin de protenas por mtodos instrumentales 5. Determinacin de sustancias nitrogenadas no proteicas

Mg. Sc. Alberto Huamani
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1. INTRODUCCIN Alimentos ..punto de vista nutricional : protenas El trmino prtidos incluye: Protenas Pptidos Aminocidos Importancia Nutricional (aminocidos esenciales) Propiedades organolpticas y de textura en productos agroalimentarios y de origen animal Control de calidad: alergas a ciertas protenas (gluten) Punto de vista de anlisis de alimentos evaluacin del contenido total de protenas = principal inters La mayor parte de los procedimientos de determinacin de protena total se basan en la determinacin del nitrgeno + procedimientos de clculo empricos aproximados.
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PEPTIDOS Y PROTEINAS
Pptido: hasta 50 aminocidos. Oligopptido: pptido pequeo. Polipptido: pptido grande. Protenas oligomricas: formadas por sub unidades idnticas llamadas protmeros. Protenas sencillas prosttico) y conjugadas (grupo
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Apolares CONTENIDO EN PROTENAS EN ALIMENTOS SELECCIONADOS.

ORIGEN ANIMAL Ternera seca Ternera asada Huevos Leche descremada Leche entera ORIGEN VEGETAL Soja Guisantes Frutos secos Trigo, harina Patata Arroz Maz PROTENAS 81-90 72 35-70 34-38 22-25 PROTENAS 33-42 22-28 15-28 10-14 10-13 5-9 0-9
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Polares
Quirales Esenciales Val Leu Ile Thr Phe Met Trp Lys

cidos

Bsicos

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PROTEINA

Secuencia de aminocidos en la insulina de vaca

2. DETERMINACIN DE PROTENAS POR ANLISIS ELEMENTAL (N)

Mineralizacin (mtodo Kjeldahl) Mtodo Nessler : Determinacin de nitrgeno en forma de NH4+ NH3 Mtodo Dumas; Electrodos selectivos sensibles a NH Otros mtodos (neutrnica y protnica)

Los mtodos se basan en medidas de la cantidad de nitrgeno liberado por las protenas: El mtodo Kjeldahl Reactivo de Nessler Mtodo Dumas Las protenas contienen una cantidad de nitrgeno que se puede relacionar con la cantidad de protena por unos factores de conversin: 5.7 para ciertas protenas vegetales 6.25 para el resto Por lo tanto, en las protenas, por trmino medio, debe haber un 16% de nitrgeno (100/16 = 6.25) La AOAC recomienda el uso del factor 6.25 para todas las muestras excepto harina y derivados
Alanina,15.7%N Glicina,18.6%N 16% Triptofano,13.7%N Histidina,26.7%N
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2.1 Mineralizacin (mtodo Kjeldahl) El contenido de nitrgeno se determina despus de mineralizacin o pirlisis de la muestra. El mtodo de mineralizacin fue introducido por Kjeldahl (1883) y es el ms generalizado y utilizado en mtodos de referencia y oficiales. Problema: presencia en las muestras de nitrgeno no proteico. Normalmente, se convierte el amonio formado en amonaco a pH bsico, y se destila recogindolo sobre un exceso medido de HCl.
El fundamento de la etapa de mineralizacin es la conversin de la materia orgnica proteica en in amonio segn la reaccin:
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1) DETERMINACIN CUANTITATIVA DE PROTENA TOTAL ( Kjeldahl)

Este mtodo se basa en la combustin en hmedo de la muestra por ebullicin con cido sulfrico concentrado y en presencia de catalizadores metlicos, la materia orgnica se oxida a CO2 y H2O, mientras que la parte de cido se reduce a SO2 a) DIGESTION
R Muestra H 2 SO4 CATALIZADO CO2 2 SO2 H 2O NH 3

El nitrgeno transformado en NH3 se combina con la parte restante del cido sulfrico para formar el sulfato de amonio.

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El nitrgeno transformado en NH3 se combina con la parte restante del cido sulfrico para formar el sulfato de amonio

NH 3 H 2 SO4 SO4 ( NH 4 ) 2
Finalmente queda:
R Muestra H 2 SO4 CATALIZADO CO2 ( NH 4 ) 2 SO4 SO2

Bomba de succin

Recipiente de soda

Digestor

Destilador

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b) DESTILACION

En el condensador

El nitrgeno que est en forma de sulfato de amonio, se ataca con un lcali fuerte que es la soda castica (NaOH) para liberar el amoniaco y despus de la condensacin lograda con la parte del refrigerante, el hidrato de amonio se recibe en un vaso precipitado.
En el destilador

NH 3

SO4 ( NH 4 ) 2 2 NaOH

NH 3

SO4( NH 4 )2 2 NaOH 2 NH 3 Na 2 SO4 2 H 2O

El vaso de precipitado contiene: cido brico, con los siguientes indicadores (Tashiro) de pH rojo de metilo y verde de bromocresol, formndose borato de amonio en el vaso.
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( NH 4 ) H 2 BO3

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c) TITULACION Se hace con cido sulfrico clorhdrico de normalidad conocida, el cido clorhdrico reacciona con el borato de amonio. En el punto final ya no hay borato de amonio y un pequeo exceso de cido clorhdrico provocar un cambio de pH y por consiguiente el viraje de la mezcla (verde a rosado)

3.1. Materiales Balanza analtica Baln de Kjeldahl de 250 mL. Calefactor elctrico. Para efectuar la digestin. Equipo de destilacin. Acido sulfrico (d:1.84) Exento de nitrgeno Sulfato de cobre. Sulfato de sodio anhidro. Mortero Tamiz

NH 4 H 2 BO3 HCl H 3 BO3 NH 4Cl

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2 Preparacin de los reactivos

Mezcla catalizadora: Se usa SO4Cu y el SO4K2 en la siguiente relacin (SO4Cu: 0.25 g; y el SO4K2: 1.0 g) ambos previamente triturados mediante un mortero. Solucin 0,05 N de cido clorhdrico o sulfrico. Diluir 8.5 mL de HCl concentrado en un volumen de 2 Lt., posteriormente estandarizar con carbonato de sodio previamente secado. Solucin de hidrxido de sodio 0,1 N.- La normalidad debe controlarse peridicamente. Solucin de hidrxido de sodio al 80% (p/v): se pesa 80 g de hidrxido de sodio (NaOH), en un volumen de 100 mL de agua destilada fra por separados. Cuidado que produce una reaccin exotrmica (produce calor violento). Hacer esto en una campana de extraccin y enfriarla con hielo en una cubeta y almacenarla en un frasco de polietileno. Indicador: solucin mixta para 250 mL Acido brico al 4%: pesar 40 g de cido brico en fiola de 1 litro + verde de bromocresol al 1 %: medir 20 mL y aadir a la fiola + rojo de metilo al 0.1 %: medir 8 mL y aadir a la fiola.
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Procedimiento
Digestin De acuerdo al contenido de nitrgeno, se pesa una porcin de la muestra preparada que contenga 0.2 - 0,3 g de muestra, luego agregar 1 g del catalizador de oxidacin (mezcla de sulfato de potasio: 1g y sulfato de cobre:0,25g) para acelerar la reaccin agregar 2.5 a 3.0 mL de cido sulfrico concentrado. Destilacin 1. Enfriar al aire, agregar 5 mL de agua destilada. 2. 3. Pasar el contenido del baln digestor al destilador y haciendo un lavado al baln con 5 a 10 mL de agua y luego agregar 5 mL de la solucin de NaOH al 80% con sumo cuidado y cerrar la vlvula (en copa debe quedar una pequea cantidad de NaOH ). 4. 5. Conectar el refrigerante y recibir el destilado en un erlemeyer de 125 mL conteniendo 5 mL de la mezcla de cido brico ms indicador de pH. La destilacin termina cuando ya no pasa ms amoniaco y luego de 7 min titular con cido clorhdrico valorado (aprox 0.05N) y anotar el gasto. NOTA: En destilacin tomar tiempo cuando empieza a virar de rojo a verde 20 7 minutos y termina la destilacin.

Titulacin
La muestra recibida en el vaso con la solucin de cido brico valorar con cido clorhdrico 0.05N y tomar nota del gasto de HCl obtenido.

2.2 METODO NESSLER : determinacin del NH4+ NH3 2.2.1 Reactivo de Nessler

N2

en forma de

Clculos
%N2 = mL de HCl x Normalidad x meq.del N2 x100 / g (muestra) %N2 = mL de HCl x 0,05 x 0,014 x100 / g (muestra) % Protena bruta = %N2 x Factor

Basado en medidas colorimtricas sobre la propia muestra mineralizada Genera en presencia de NH4+ (NH3 en medio bsico) un complejo de color entre amarillo y rojo:

NH 3 2 K 2 HgI 4 3 KOH 2 HgOINH

7 KI 2 H 2 O

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mg de NH3/100 g de pescado Especie Cuplea spratus (lacha) Engraulis (boquern) Mugil cefalus (lisa) Mullus barbatus (salmonete) Scomber scombrus (caballa) Trachurus trachurus (jurel) Boops boops (boga) Gobius paganellus (gobio) Solea solea (lenguado) Merluccius merluccius (merluza) Raja clavata (raya)
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Fresc Menos fresco o 25 35 27 30 32 33 25 30 25 30 20 35

Alterado 240 230 215 235 220 190 225 220 185 220 240
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enchrasicholus 20 20 20 17 15 20 20 16 20 30

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2.2.2 Electrodos selectivos sensibles a NH Un electrodo que contiene NH4+ y una membrana permeable a NH3, que la atraviesa y desplaza el equilibrio:

Nitrgeno bsico voltil- ndice de putrefaccin: Aplicacin: carne vacuna, pescado

Fundamento: El pH de msculo de pescado fresco est entre 6,6 y 6,8 (lo conserva en el momento de la muerte). Despus de muerto se acumula cido lctico, provocando cada de pH, pero como en el msculo hay compuestos con carcter buffer, no permiten que se vea ese descenso. Por descomposicin del msculo se acumulan amonaco, dimetilamina y trimetilamina. Si en ese momento se produce contaminacin bacteriana, entonces comenzar a subir el pH (primero lentamente y rpido al final), en condiciones extremas de deterioro puede llegar a 7,5-8,0. Ocurre un proceso de autolisis que lleva al aminocido:
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NH 4 H 2 O NH 4 OH

Cuando se alcanza el equilibrio dentro del electrodo, el potencial de ste es proporcional a la concentracin de amonaco en la disolucin de muestra

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2.2.3 Mtodo de Dumas por pirlisis

Se basa en la calcinacin de la muestra en presencia de oxido de cobre, se eliminan posteriormente todos los gases (CO2 y H2O) excepto el nitrgeno (N2) que se mide de forma volumtrica. Aplicaciones: como mtodo micro con sistemas que permiten analizar hasta muestras de 1g en tiempos de anlisis cortos (unos 5 minutos por muestra). Ventajas:
o o o + rpido que Kjeldahl, sin reactivos txicos, automatizacin, simple. Tiempo de anlisis de unos 4 minutos/muestra. Resultados comparables a los del Kjeldahl.

Hay accin sobre el xido de trimetilamina que existe en algunos peces de agua salada. El lctico en el msculo es reductor y acta sobre el O=N(CH3)3 (precursor).

Inconvenientes: coste inicial representatividad de la muestra

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alto,

problemas

con

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2.2.4 OTROS MTODOS

Activacin neutrnica:

Basados en activacin (neutrnica y protnica) y posterior medida de la radiacin emitida Desarrollos con gran originalidad para determinacin de nitrgeno en protenas: Son rpidos (unos segundos) Simples Automatizados Coste por muestra bajo Equipamientos muy costosos la

Medida de la radiacin gamma emitida cuando el nitrgeno 15 generado vuelve a su estado fundamental

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Activacin protnica:
14 N 1H 14 O n
14 O 14 N
La medida de la radiacin gamma liberada por el 140 es proporcional a la cantidad de nitrgeno. La medida es muy selectiva al utilizar una energa caracterstica (2.31 MeV) Las dos tcnicas de activacin presentan resultados semejantes y comparables a Kjeldahl, con mucha rapidez (hasta 10 muestras por minuto).
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Procedimientos basados en el uso de propiedades fsicas o qumicas de las protenas Problemas: Interferencias al utilizar propiedades que no son especficas de las protenas Las respuestas varan de una protena a otra Etapas previas en los procedimientos qumicos: Tratamiento de la muestra para solubilizar las protenas con una base, p.ej. disolucin de KOH (no en muestras lquidas o disoluciones. Separacin por precipitacin (con cido trifluoractico o sulfosaliclico,...) y centrifugacin o filtracin
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3. DETERMINACIN DE PROTENAS MTODOS QUMICOS Colorimetrico Mtodo de Biuret Mtodo de Lowry Mtodo de fijacin de colorantes

POR

TITULACION CON FORMOL Cuando se adiciona formalina a una solucin acuosa neutralizada, que contiene protenas, el grupo NH2 reacciona para formar el grupo metilenoimino N=CH2 con la liberacin de un protn que puede titularse.

-N=CH2

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El procedimiento ha sido descrito por Taylor (1957) y se ha usado para la determinacin de slidos de leche en los helados de crema (Crowhurst, 1956) y con una modificacin potenciomtrica por Hill y Stone (1964). Roeper (1974) ha utilizado la titulacin con formol para la estimacin del nitrgeno protenico y de la casena en la leche descremada.

Casena 1. Colocar 10 mL de leche (a 17 18 C). en un vaso de precipitado de 100mL 2. Agregar 1 mL de solucin de fenolftaleina. Al 0.5% 3. Mezclar y reposar algunos minutos. 4. Neutralizar con soda 0,1 N. (hasta el primer tono rosado) 5. Agregar 2 ml de formalina al 40%. 6. Reposar algunos minutos. 7. Titular con soda 0,1 N y nicamente el gasto de esta segunda neutralizacin. Gasto(a). Blanco 1. En un vaso colocar 2 ml de formalina 2. Agregar 10 ml de agua 3. titular con NaOH 0.1 N (gasto b)
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Clculo: % protena = 1.95 x(a-b)% sin el uso de oxalato % protena = 1.7 x(a-b)% con el uso de oxalato NOTA: para evitar la accin de las sales solubles clcicas, algunos autores le agregan 0,4 mL de una solucin saturada de oxalato de potasio por cada 10 mL de leche.

3.1 MTODO DE BIURET Basado en la reaccin entre los enlaces peptdicos y disoluciones alcalinas de Cu(II), dando un complejo de coloracin prpura.

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coloracin prpura Procedimiento: Rpido Simple Econmico Especfico de protenas: la reaccin la dan los 38 enlaces peptdicos

No es un procedimiento absoluto: es necesario hacer una calibracin para cuantificar:

Con patrones (normalmente BSA, Bovine Serum Albumine) Por comparacin con procedimientos de referencia, Kjeldhal.

3.1 b) Protena total (Biuret, Bradford). La cuantificacin de una protena requiere un ensayo biolgico especfico que permita medir su actividad (ej: ensayo de la actividad de un enzima). Parmetros ms utilizados: ACTIVIDAD: unidades totales de la protena (definir 1 U) ACTIVIDAD ESPECIFICA: n unidades de la protena/mg de protena total. A lo largo del proceso de purificacin va disminuyendo la actividad total y aumentando la actividad especfica.
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Longitud de onda de medida: entre 540 y 650 nm, segn las protenas presentes (habitualmente a 550 nm) Reactivos de Biuret
Mucha variedad disponible Disoluciones de Cu(II) en medio alcalino con adicin de un complejante como tartrato para evitar la precipitacin.
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3.2 MTODO DE LOWRY (1951, J. Biol. Chem., 193, 265-275)

Mtodo con muy alta sensibilidad (hasta 100 veces ms sensible que el mtodo de Biuret) y una relativa especificidad: pocas interferencias importantes Procedimiento emprico: intensidad de color vara con los aminocidos presentes y condiciones analticas (tiempo de incubacin, pH,...). Inconvenientes: mtodo destructivo, largo y que requiere la incubacin de la muestra entre la adicin de los diferentes reactivos.

Uno de los ms conocidos y utilizados para la determinacin de protenas en alimentos (y otras muestras biolgicas) Basado en la interaccin de las protenas con el reactivo de Folin (tungstato, molibdato y fosfato) en medio alcalino (pH 1010.5) y con Cu (II) Reaccin debida principalmente a la presencia de aminocidos fcilmente oxidables como la tirosina, cistena y triptfano. Reaccin entre el enlace peptdico y el cobre (como Biuret) y despus una oxidacin con el reactivo de Folin por parte del grupo fenol, tiol,... y el fosfomolibdato: color azul (500-750 nm)
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MTODO DE LOWRY Equipment In addition to standard liquid handling supplies a spectrophotometer with infrared lamp and filter is required. Glass or polystyrene (cheap) cuvettes may be used. Reagents 1. Reagent A consists of 2 gm sodium potassium tartrate x 4 H20, 100 gm sodium carbonate, 500 ml 1N NaOH, H20 to one liter (that is, 7mM Na-K tartrate, 0.81M sodium carbonate, 0.5N NaOH final concentration). Keeps 2 to 3 months. 2. Reagent B consists of 2 gm 2 gm sodium potassium tartrate x 4 H20, 1 gm copper sulfate (CuSO4 x 5H20), 90 ml H20, 10 ml 1N NaOH (final concentrations 70 mM Na-K tartrate, 40 mM copper sulfate). Keeps 2 to 3 months. 3. Reagent C consists of 1 vol Folin-Ciocalteau reagent diluted with 15 vols water. Assay 1. Prepare a series of dilutions of 0.3 mg/ml bovine serum albumin in the same buffer containing the unknowns, to give concentrations of 30 to 150 micrograms/ml (0.03 to 0.15 mg/ml). 2. Add 1.0 ml each dilution of standard, protein-containing unknown, or buffer (for the reference) to 0.90 ml reagent A in separate test tubes and mix. 3. Incubate the tubes 10 min in a 50 degrees C bath, then cool to room temperature. 4. Add 0.1 ml reagent B to each tube, mix, incubate 10 min at room temperature. 5. Rapidly add 3 ml reagent C to each tube, mix, incubate 10 min in the 50 degree bath, and cool to room temperature. Final assay volume is 5 ml. 6. Measure absorbance at 650 nm in 1 cm cuvettes.
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3.3 MTODO DE FIJACIN DE COLORANTE

Fundamento: formacin de un precipitado (par inico insoluble) entre la protena y ciertas molculas orgnicas coloreadas (colorantes orgnicos)
Separar el precipitado del sobrenadante por centrifugacin o filtracin y por comparacin entre la absorvancia inicial de la disolucin de colorante y la absorvancia del sobrenadante, determinar la concentracin de colorante precipitado y relacionarlo con protenas. Colorantes cidos (por ejemplo con grupos sulfnicos) que reaccionan con los grupos bsicos de las protenas a pH bajo (~ 2) ya que se encuentran protonados. Procedimientos totalmente empricos. Definir y controlar rigurosamente las condiciones experimentales para garantizar la calidad de los resultados Principal ventaja: rapidez, con equipos comerciales a 100 muestras por hora, sin necesidad de manipulacin experta ni uso de reactivos altamente corrosivos
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Colorantes:

Mtodo de Bradford, Coomasie Brilliant Blue G-250 (comercial desde 1980) reactivo absorbe a 465nm, pero cuando se adsorbe sobre la arginina de las protenas cambia su mximo de absorcin a 595 nm.

Orange G Amido black

Tres veces ms sensible que Amido Black. Menos interferencias que Lowry. Se trabaja en disolucin (no hay que precipitar)

Cochineal red (rojo cochinilla)

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4. DETERMINACIN DE PROTENAS ANLISIS INSTRUMENTAL

TCNICA

POR

METODO DE INFARROJO
La radiacin infrarroja es la base del amplio uso de un rpido equipo automtico particularmente para leche y para granos. Las series IRMA de NEI Electronics son absorcimetros de doble rayo, diseados para la determinacin simultnea de protenas, lactosa y grasa en la leche.

Fluorescencia UV Turbidimetria, nefelometria Electrodos especficos de protenas

CARACTERSTICAS DEL MTODO Protenas: absorcin en el UV entre 190 y 290 nm Medida de la absorcin a 280 nm (evitar problemas instrumentales a longitudes de onda ms bajas, 200-215 nm muy sensible) Absorcin debida fundamentalmente a: tirosina, triptfano y fenilalanina, que se encuentran en cantidades semejantes en las protenas Tcnica muy utilizada en bioqumica y en control de fraccionamiento de protenas por LC Mtodo simple, rpido y no destructivo Emisin de radiacin a 340 nm despus de excitacin a 275-280 nm (Triptfano) Aplicar directamente sobre suspensiones Rpido y no destructivo Suspensiones de protenas con los precipitantes habituales de protenas (cido tricloroactico, ferricianuro o cido sulfosaliclico Los resultados dependen mucho de la reproducibilidad de las condiciones experimentales Un electrodo especfico con una membrana de Ag2S mide el contenido 47 en protenas con grupos SH en medio alcalino

Espectrofotometria UV

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Tambin se dispone de los instrumentos Milko-Scan de Foss. La reflectancia en el infrarrojo cercano es el desarrollo ms moderno para el anlisis de cereales molidos y otros alimentos slidos. Tanto en Rank Neotec GQA como el Technicon InfraAlyzer pueden estimar protenas, aceite y humedad en tan solo unos pocos minutos. Los instrumentos son calibrados con muestras de composicin conocida. Williams ha realizado una evaluacin de ellos (1975).

Determinacin de la masa espectrometra de masas

de

una

protena

por

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50

Resultado de una espectrometra de masas

5.

DETERMINACIN DE SUSTNCIAS NITROGENADAS NO PROTEICAS

Inters en la determinacin de las sustancias nitrogenadas presentes en los alimentos diferentes de las protenas Este grupo incluye: Aminocidos Aminas (heterocclicas) Nitrosamines Derivados inorgnicos (NH4+, NO3- y NO2-)

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Contribuir al valor nutricional de los alimentos, etc... (aminocidos) Relacionadas con (degradacin,...) procesos que pueden modificar la calidad

Nitrosaminas (cancergenas)

Compuestos txicos: N-nitrosamines, Aminas Aromticas Heterocclicas (HAAs) o Acrilamida con actividad txica, mutagnica o carcinognica Derivados inorgnicos del nitrgeno: amonaco, nitrato y nitrito Primera etapa: eliminar las protenas de las muestras (o extractos de muestra): Precipitacin (con agentes precipitantes de protenas como TFA) Dialisis (muy adecuada para obtener muestras representativas de N no proteico) Ultracentrifugacin (sedimentar las protenas) Los extractos libres de protenas se pueden analizar para determinar los compuestos nitrogenados no proteicos
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Nitrito + aminas

Nitrato

Protenas

Aminas Heterocclicas Aromticas

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DETERMINACIN DE SUSTNCIAS NITROGENADAS NO PROTEICAS Acrilamida Formacin en frituras, tostados (mg/kg)

Determinacin de la masa molecular de una protena por electroforesis en poliacrilamida-SDS

Patata fritas Azcares reductores T 175-200C

Caf

CH2 = CH C - NH2 II O Acrilamida MW 71 Patrones

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10