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Tratamiento de Muestras (3) 1. Determinacin de Biomasa por el Mtodo de Peso Seco.

Cortar el papel filtro en 8 porciones cuadradas y proceder de la siguiente manera para cada porcin de papel filtro: (ver Anexo 12) Secar una porcin de papel filtro a una temperatura de 75C por 2 horas y enfriar en un desecador por 30 minutos. Pesar el papel filtro que ha sido previamente secado. Filtrar los 60 mL de la muestra recolectada durante el proceso de fermentacin y recibir el filtrado en un Erlenmeyer estril de 125 mL rotulado. Guardar el filtrado para realizar otras determinaciones. Lavar el papel filtro con tres porciones de 5 mL de agua destilada estril y recibir los lavados en un vaso de precipitado de 100 mL. Colocar el papel filtro pre- pesado sobre una placa de petri y someterlo a una temperatura de 75C por 2 horas; enfriar en un desecador por 30 minutos. Pesar el papel filtro en balanza analtica y por diferencia de peso, determinar la biomasa, la cual representar en cada muestra el crecimiento o decrecimiento microbiano.

Nota: Proceder de igual manera para las muestras recolectadas a las 0, 3, 6, 12, 15, 18, 21 y 24 horas. 2. Elaboracin de la Curva Estndar de Sacarosa. (3) (Anexos 3 y 13) Pesar 0.02 g de sacarosa estndar y transferirla a un baln volumtrico de 100 mL. Adicionar al baln 30 mL de agua destilada. Agitar hasta su completa disolucin. Aforar con agua destilada para obtener una concentracin de 200 g/mL. Homogenizar. Preparar a partir de la solucin de sacarosa, las soluciones que se detallan en el anexo 3. Llevarlas a temperatura ambiente. Leer la absorbancia en el Spectronic 20-D a una longitud de onda de 490 nm. Utilizar como blanco la solucin del tubo nmero 1, (anexo 3). Llevar triplicados de todas las soluciones. Anotar las absorbancias y graficar una curva de absorbancia VS concentracin.

3. Determinacin de Azcares por el Mtodo de Fenol-Sulfrico (3) La determinacin de azcares totales se realizar en el filtrado obtenido en la determinacin de Biomasa por peso seco. (Numeral 1) Seguir el ejemplo del tubo nmero 6 para la preparacin de las muestra (Anexos 3 y 13) Medir volumtricamente 10 mL del filtrado. Colocarlos en un tubo de ensayo rotulado, adicionar 1 mL de solucin de sulfato de zinc al 10% y 1mL de hidrxido de sodio 0.5 M, utilizando para ello pipetas Mohr, la adicin de estos reactivos es para desproteinizar las muestras. Dejar reposar por 15 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar por 15 minutos a 1000 rpm y utilizar el sobrenadante obtenido para la cuantificacin de azcares. Tomar una alcuota de 2.5 mL del sobrenadante y adicionar 2.5 mL de agua destilada, 0.1 mL de fenol al 80%. Sumergir los tubos en bao de hielo y adicionar lentamente 5 mL de cido sulfrico concentrado, utilizar pipetas de Mohr. Agitar y dejar reposar por 30 minutos exactos a temperatura ambiente. Proceder a leer inmediatamente en el Spectronic 20-D a una longitud de onda de 490 nm. Repetir el mismo procedimiento para las muestras recolectadas a las 0, 24, 48, 72, 89, 144, 168 y 192 horas, llevando cada muestra por triplicado.

4. Elaboracin de la curva Estndar de cido Glutmico (3) Pesar 0.02 g de cido glutmico y transferirlos a un baln volumtrico de 100 mL. Adicionar al baln 30 mL de agua destilada. Agitar hasta su completa disolucin. Aforar con agua destilada para obtener una concentracin de 200 g/mL. Homogenizar. Preparar a partir de la solucin de cido glutmico las soluciones indicadas en anexo 6. Antes de adicionar la acetona al 75%, calentar cada tuvo en bao de Mara a 80C por 10 minutos y enfriar a temperatura ambiente. Agitar. Leer la absorbancia de cada tubo, en el Spectronic 20-D a una longitud de onda de 570 nm. Utilizar como blanco la solucin del tubo nmero 1, anexo 6. Llevar triplicados de todas las soluciones.

Anotar las absorbancias y graficar una curva de absorbancia VS concentracin.

5. Determinacin de cido Glutmico en las muestras (3) La determinacin de cido glutmico se realizar en el filtrado obtenido en la determinacin de Biomasa por peso seco (numeral 1). Seguir el ejemplo del tubo nmero 6 (anexo 6) para la preparacin de las muestras Medir una alcuota de 2.5 mL del filtrado, colocarlos en un tubo de ensayo y adicionar 2.5 mL de agua destilada. Agregar 1mL de solucin de ninhidrina. Agitar, calentar cada tubo en bao Mara por 5 minutos a 75C. Dejar enfriar a temperatura ambiente. Adicionar 7 mL de acetona y homogenizar. Leer la absorbancia de cada tubo, en el Spectronic 20-D a una longitud de onda de 570 nm. Repetir el mismo procedimiento para las muestras recolectadas a las 0, 24, 48, 72, 89, 144, 168 y 192 horas, llevando cada muestra por triplicado.

Anexos