Enzima de restriccin

Enzima de restriccin
Un enzima de restriccin (o endonucleasas de restriccin) es aquella que puede reconocer una secuencia caracterstica de nucletidos dentro de una molcula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado sitio o diana de restriccin, o en un sitio no muy lejano a este. Los sitios de restriccin cuentan con entre 4 y 12 pares de bases, con las que son reconocidos. El mecanismo de corte de DNA se realiza a travs de la ruptura de dos enlaces fosfodister en la doble hebra, lo que da lugar a dos extremos de DNA. stos pueden ser romos (cuando los enlaces rotos coinciden) o Cohesivos/escalonados. Estos ltimos tienen tendencia a volver a unirse de modo espontneo, ya que los extremos se pueden unir a otros extremos coincidentes que pueda haber en la cercana (Apareamiento de Watson & Crick). Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por otras enzimas llamadas ligasas. Las enzimas de restriccin que a pesar de ser distintas y provenir de distintas especies, tienen la misma secuencia de reconocimiento y dejan el mismo extremo cohesivo, pero no cortan en el mismo sitio, son llamadas isoesquizmeros. Por ejemplo, estn los isoesquizmeros Asp718 y KpnI. El Premio Nobel de Medicina de 1978 fue concedido a los microbilogos Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith por el descubrimiento de las endonucleasas de restriccin lo que condujo al desarrollo de la tecnologa de ADN recombinante. El primer uso prctico de su trabajo fue la manipulacin de la bacteria E. coli para producir insulina humana para los diabticos.

Corte de EcoRI dejando extremos cohesivos.

Restriccin de SmaI dejando extremos romos.

Uno de los campos en los que las enzimas de restriccin han tenido mayor implicacin ha sido el diagnstico de enfermedades genticas relacionadas con cambios en la secuencia del ADN, ya sean mutaciones puntuales, inserciones o deleciones de fragmentos. Si stas se producen en un sitio de reconocimiento de la enzima de restriccin, al producirse eliminarn o agregarn nuevos sitios de corte. Al aplicar esta enzima al gen de una persona sana y una enferma se deberan observar distintas cantidades de fragmentos para cada caso en una electroforesis.

Sistemas de restriccin-modificacin (M-R)

El sistema de restriccin-modificacin (M-R) es usado in vivo por bacterias para protegerse de ataques de DNA exgenos (normalmente vricos) que ingresen en la bacteria, eliminando las secuencias ajenas al genoma de estas. El ADN propio no sufre delecin por parte de las enzimas de restriccin del organismo que las produce, puesto que previamente ha sido modificado por metilacin a travs de la accin de una metiltransferasa, enzima que transfiere grupos metilo desde S-adenosil-metionina (SAM) a bases especficas. Este sistema fue descubierto en 1968, a resultas de una serie de estudios sobre la infeccin del fago l en dos cepas diferentes de Escherichia coli (las llamadas cepas K12 y B). Este sistema consta de dos partes: Restriccin: Este sistema le permite a la bacteria protegerse de DNA exgenos para evitar la promiscuidad en los intercambios genticos. Esto le confiere inmunidad frente a bacteriofagos que pudieran poner en peligro la individualidad gentica o incluso la vida de la bacteria, lo que se realiza a travs de cortes mediante endonucleasas de restriccin a los DNA exgenos que ingresen a la bacteria. Modificacin: Consiste en la introduccin de grupos metilo (CH3-) en determinadas bases dentro de determinadas secuencias del ADN, lo cual est catalizado por una metilasa especfica. Existen varios mecanismos de accin generales de estos sistemas, de los cuales destacan el tipo I y el tipo II:

Enzima de restriccin M-R tipo I: Fueron los primeros en ser descritos. Lo caracterstico de los sistemas M-R de tipo I es que las actividades de modificacin y las de restriccin estn producidas por un complejo multiproteico, que realiza los dos tipos de actividades. Algunas caractersticas son: Reconocen secuencias relativamente grandes que no presentan simetras. La actividad de restriccin (de las subunidades R) corta lejos del sitio de reconocimiento (del orden de unos 1000 pb), y en lugares inespecficos. La restriccin requiere de ATP. La actividad metilasa del complejo hace uso de S-adenosil-metionina (SAM) como donador de los grupos metilo. M-R tipo II: Aqu cada subunidad del dmero reconoce la misma secuencia, presente en cada una de las partes especulares del palndromo, y realiza un corte en un lugar especfico, que obviamente tiene su correspondiente en la otra cadena de la otra mitad del palndromo. Ms de la tercera parte de las cepas bacterianas presentan al menos un sistema M-R de tipo II. Muchas de ellas son codificadas a partir de genes situados en plsmidos. Algunas caractersticas que tiene este mecanismo son: Las dos actividades las realizan dos protenas distintas que no forman complejos multiproteicos. No utilizan ATP. Slo necesitan iones Mg++ para funcionar. La metilasa usa SAM como donador de metilos. Cada miembro de la pareja de modificacin y restriccin reconoce la misma secuencia especfica de ADN. El sitio de reconocimiento consta de 4 6 pb que constituyen una secuencia palindrmica. La metilasa suele ser una protena monomrica, que introduce grupos metilo en una A o en una G (segn la metilasa en cuestin), en ambas cadenas, dentro del sitio de reconocimiento. La enzima de restriccin suele ser una protena formada por dos subunidades del mismo tipo, ensambladas simtricamente. Pueden dejar extremos cohesivos o extremos romos. Algunas enzimas de restriccin dejan extremos sobresalientes 5', mientras que otras dejan extremos sobresalientes 3'.

Tipos de enzimas de restriccin

Existen, en general, 3 sistemas de enzimas de restriccin: Tipo 1: Una sola enzima (con 3 subunidades) tiene actividad de restriccin (corta) y modificacin (metila). Al reconocer la secuencia especfica de DNA corta al azar en sitios distintos al sitio de reconocimiento, ya sea corriente arriba o corriente abajo. El corte deja extremos cohesivos. Necesitan de ATP para moverse en el DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte (unas 1000 pares de bases aproximadamente), adems de SAM (S-adenosil-metionina) y Mg++ como cofactores. Tipo 2: Solo tienen actividad de restriccin. Otras enzimas llevan a cabo la metilacin. El corte es efectuado en el sitio de reconocimiento, o bien, cerca de l, por lo que el corte es resistente y predecible. Por esta caracterstica es que son muy utilizadas para clonacin de genes, ya que al cortar en sitios especficos se pueden recuperar secuencias conocidas. Slo requieren Mg++ como cofactor, no necesitan de ATP... Tipo 3: Se utiliza una enzima oligomrica que realiza todas las actividades enzimticas. Tienen funcin de restriccin y modificacin. Cortan de 25 a 27 pares de bases lejos del sitio de reconocimiento, dejando extremos cohesivos. Requieren dos secuencias de reconocimiento en orientacin opuesta en la misma cadena de DNA. Necesitan ATP, Mg++ y SAM (S-adenosil-metionina) como cofactores. Hay otros sistemas de restriccin descubiertos actualmente, como el sistema tipo 4 de E. coli (Eco571) que consta de una sola enzima que corta nicamente DNA metilado en una secuencia especfica, y que adems metila.

Enzima de restriccin

Nomenclatura
1. Tres letras que corresponden al nombre cientfico del microorganismo (ej. Escherichia coli (Eco); Haemophilus influenzae (Hin)); y por ello las tres primeras letras del nombre se escriben en cursiva. 2. La cepa o estirpe si la hubiese (ej. EcoR, aislada de la cepa "RY13" de E. coli ) 3. En nmeros romanos, un nmero para distinguir si hay ms de una endonucleasa aislada de esa misma especie. No confundir con el tipo de enzima de restriccin. 4. Todas deberan llevar delante una R de restriccin o un M de metilasa segn la funcin de la enzima, pero generalmente se omite. De esta manera, el nombre de la enzima de restriccin EcoRI se construira de la siguiente manera:
Nomenclatura E co R I Ejemplo Escherichia coli RY13 Corresponde a: Gnero de la bacteria Especie de la bacteria Cepa de la bacteria

La primera enzima identificada Orden de identificacin de la enzima en la bacteria

As mismo, las enzimas HaeII y HaeIII provienen de Haemophilus aegyptius, MboI y MboII de Moraxella bovis, etc.

Ejemplos
Consultar el artculo principal lista de sitios de corte de enzimas de restriccin. En esta tabla se presentan algunas enzimas de restriccin, con su respectivo origen bacteriano y sitio de reconocimiento.
Enzima EcoRI Origen Bacteriano Escherichia coli Sitio de Reconocimiento 5'GAATTC 3'CTTAAG 5'GGATCC 3'CCTAGG 5'GATC 3'CTAG | CH3 5'AAGCTT 3'TTCGAA 5'TCGA 3'AGCT 5'GCGGCCGC 3'CGCCGGCG 5'GANTC 3'CTNAG 5'GATC 3'CTAG 5'CAGCTG 3'GTCGAC 5'CCCGGG 3'GGGCCC Resultado del Corte 5'---G AATTC---3' 3'---CTTAA G---5' 5'---G GATCC---3' 3'---CCTAG G---5' 5'---GA 3'---CT TC---3' AG---5' | CH3

BamHI

Bacillus amyloliquefaciens

DpnI*

Diplococcus pneumoniae

HindIII

Haemophilus influenzae

5'---A AGCTT---3' 3'---TTCGA A---5' 5'---T CGA---3' 3'---AGC T---5' 5'---GC GGCCGC---3' 3'---CGCCGG CG---5' 5'---G ANTC---3' 3'---CTNA G---5' 5'--GATC---3' 3'---CTAG ---3' 5'---CAG 3'---GTC 5'---CCC 3'---GGG CTG---3' GAC---5' GGG---3' CCC---5'

TaqI

Thermus aquaticus

NotI

Nocardia otitidis

HinfI

Haemophilus influenzae

Sau3A

Staphylococcus aureus

PovII*

Proteus vulgaris

SmaI*

Serratia marcescens

Enzima de restriccin

4
Haemophilus egytius 5'GGCC 3'CCGG 5'AGCT 3'TCGA 5'GATATC 3'CTATAG 5'GGTACC 3'CCATGG 5'CTGCAG 3'GACGTC 5'GAGCTC 3'CTCGAG 5'GTCGAC 3'CAGCTG 5'---GG 3'---CC 5'---AG 3'---TC 5'---GAT 3'---CTA CC---3' GG---5' CT---3' GA---5' ATC---3' TAG---5'

HaeIII*

AluI*

Arthrobacter luteus

EcoRV* Escherichia coli

KpnI PstI

[1]

Klebsiella pneumonia

5'---GGTAC C---3' 3'---C CATGG---5' 5'---CTGCA G---3' 3'---G ACGTC---5' 5'---GAGCT C---3' 3'---C TCGAG---5' 5'---G TCGAC---3' 3'---CAGCT G---5' 5'---G CATGC---3' 3'---CGTAC G---5' 5'---T CTAGA---3' 3'---AGATC T---5'

Providencia stuartii

SacI

Streptomyces achromogenes

SalI

Streptomyces albue

SphI

Streptomyces phaeochromogenes 5'GCATGC 3'CGTACG Xanthomonas badrii 5'TCTAGA 3'AGATCT

XbaI

* = ADN queda con extremos romos

Aplicaciones en el diagnstico de enfermedades genticas

Gracias a las enzimas de restriccin somos capaces de diagnosticar ciertas enfermedades genticas, bien sean debidas a una variacin en el material gentico (duplicacin, delecin, etc) o bien sean debidas a una mutacin en una base puntual. El procedimiento para dicho diagnstico consistira en amplificar por PCR una regin concreta del cromosoma donde sepamos que debera estar o no ese cambio gentico y aadir la enzima o enzimas de restricin para que as se realicen los cortes pertinentes. Tras realizar dichos cortes, correremos nuestras muestras en un gel de electroforesis y veremos las diferencias de tamaos que existen. Si la mutacin genera una delecin, al correr en la electroforesis observaremos un fragmento menor al que esperaramos de un paciente sano, de tal manera que lo podriamos diagnosticar. Si la mutacin, por el contrario, genera una mutacin puntual, podremos aprovecharla para utilizar una enzima en ese punto y que as, si no existe dicha mutacin, ese corte no se producir y obtendremos un fragmento mayor en el gel de electroforesis.

Referencias
[1] Molecular cell biology. Lodish, Harvey F. 5. ed. : - New York : W. H. Freeman and Co., 2003, 973 s. b ill. ISBN 0-7167-4366-3

Enlaces externos
Base de datos de enzimas de restriccin (REBASE) http://rebase.neb.com/rebase/rebase.html

Fuentes y contribuyentes del artculo

Fuentes y contribuyentes del artculo

Enzima de restriccin Fuente: http://es.wikipedia.org/w/index.php?oldid=68855209 Contribuyentes: 3coma14, Aaapipoaaa, Asasia, Aurochs1, Axxgreazz, BanSnake, CASF, EKhan, Eloy, F.A.A, Flakinho, Gcatalan, Gonn, Jordi domenech, Joseaperez, Juan Quisqueyano, Kryser, Laura Fiorucci, McPolu, Natrix, Nomarcland, Retama, SuperBraulio13, The nemesis, UPO649 1213 fmannun, Xvazquez, YHIM, Zerosxt, 49 ediciones annimas

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