EFECTO DE LAS CONDICIONES DE AGITACIN Y AIRACIN EN LA

PRODUCCIN DE GIBERELINAS POR G. fujikuroi, EN UN CULTIVO TETRAFASICO

MICELAR
Ma. de la Luz X. Negrete Rodrguez, M. D. Gonzlez Llanes, F. R. Reyes Garca, Eleazar M.
Escamilla Silva
Departamento de Ingeniera Qumica, Instituto Tecnolgico de Celaya
Av. Tecnolgico y A. Garca Cubas S/N. Celaya, Guanajuato, 38010, Mxico.
Resumen
Las giberelinas (GAs) son hormonas promotoras del crecimiento, presentes en las plantas superiores y que tienen
efecto en todas las etapas del crecimiento; desde la germinacin hasta la senescencia. En la actualidad estn
identificadas y caracterizadas 126 GAs en plantas y caldos de cultivo de hongos y bacterias, pero slo una tercera parte
presentan actividad biolgica; las ms importantes son GA
1
, GA
3
, GA
4
, GA
7
. La giberelina GA
3,
tambin llamada
cido giberlico, es la ms representativa de las biolgicamente activas.
En la produccin de GAs es determinante el estudio de parmetros de proceso como el pH, la temperatura, el tipo de
propelas, la velocidad de agitacin y el suministro de gas permiten establecer las mejores condiciones de crecimiento
del hongo para la biosntesis de GAs, y as obtener la mayor productividad del bioproceso
Introduccin
La fermentacin con microorganismos filamentosos, en biorreactores con agitacin mecnica es
compleja, debido a que con el incremento de la biomasa en el curso del cultivo se afecta la
hidrodinmica y la transferencia de oxgeno [5,6,8]; estos aspectos son particularmente
importantes en el cultivo de hongos filamentosos ya que tanto la generacin de biomasa como la
produccin de diversos metabolitos dependen de stos factores, como consecuencia de la
disminucin de la transferencia de masa, la productividad para el metabolito de inters se ve
disminuida [3,6,7].
Al incrementar la velocidad de agitacin se puede mejorar la transferencia de oxgeno y disminuir
los problemas de mezclado, sin embargo, tambin se incrementa la energa suministrada y la
frecuencia a la que el microorganismo circula por la regin del impulsor.
En la regin cercana al impulsor, los esfuerzos de corte son mayores que en la regin cercana a la
pared del biorreactor, este gradiente se incrementa con el aumento de la biomasa. Entonces, las
limitaciones en el mezclado y en la transferencia de oxgeno aumentan a medida que transcurre el
tiempo de cultivo, debido al aumento de la viscosidad aparente. El incremento de la viscosidad
aparente tambin es resultado de la interaccin entre las delgadas, largas y ramificadas hifas del
hongo [1]. El aumento en los esfuerzos de corte, puede provocar la fragmentacin de las hifas, lo
que puede afectar negativamente la productividad del metabolito de inters.
Metodologa
Se estableci un aceite vegetal como nica fuente de carbono, que present mayor produccin de
GAs
.
Posteriormente se estudiaron diferentes condiciones hidrodinmicas mediante la aplicacin
de un diseo experimental fraccionado completo, de donde se seleccion el arreglo de propelas a
usar, la velocidad de alimentacin del gas de alimentacin y la velocidad de agitacin. Teniendo
optimados estos parmetros se realiz el cultivo a dos pH superiores.
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Establecida la fuente de carbono, las condiciones de agitacin/aireacin y el pH de cultivo que
reportaron la mayor productividad de GA
3
, se realizaron cultivos ahora a velocidades de agitacin
superiores (mayor energa suministrada). En cada uno de los bloques de experimentos
mencionados se analiz el efecto de las condiciones de cultivo en el crecimiento de G. fujikuroi, la
biosntesis de GA
3
, GA
4
y GA
7
y productividad de GA
3
.
La estrategia experimental seguida en este trabajo se muestra en la Tabla 1. Las condiciones de
cultivo as como la formulacin del medio de cultivo se presentan para cada bloque de
experimentos.En la Tabla 2 se presentan los niveles para los factores estudiados.
Tabla 1: Estrategia de experimentacin.
Seleccin de la
fuente de carbono Efecto de la agitacin/aeracin Efecto del PH
Efecto de la
velocidad de la
agitacin
Aceite de arroz Factor A: Arreglo de propelas 3R y 2RM PH de 3.5 500 rpm
Aceite de girasol Factor B: Vel. de agitacin, 500 y 600 rpm PH de 4.5 600 rpm
Aceite de soya Factor C : Flujo de gas, 0.5 y 1.0 vvm PH de 5.5 700 rpm
Aceite de crtamo 800 rpm
900rpm
Tabla 2. Niveles para los factores estudiados en el efecto de la velocidad de agitacin/aireacin sobre la produccin de
GAs.
Factor Nivel 1 Nivel 2
A-arreglo de propelas 3R 2RM
B-velocidad de agitacin, rpm 500 600
C-flujo de gas (aire), vvm 0.5 1.0
Se emple un diseo experimental factorial completo 2
3
,usando dos tipos de arreglo de propelas:
Uno con tres propelas Rushton y otro con dos Rushton y una marinera. La velocidad de agitacin
se trabaj a 500 y 600 rpm y el flujo de aire fue de 0.5 y 1.0 vvm.
Resultados y discusin
Las fuentes y concentracin de los diferentes nutrientes en el medio de cultivo se establecieron a
partir de trabajos [2,4]. Los aceites vegetales, como el aceite de linaza, de girasol, de oliva y de
algodn, estn reportados como una buena opcin en la produccin de GAs, ya que reportaron
incrementos del 300 al 559% en el rendimiento de GAs; con respecto al uso de sacarosa como
fuente de carbono. El incremento en el rendimiento de GAs se atribuye a que los aceites son inertes
a la represin catablica por carbono y a que favorecen la disponibilidad de acetil-CoA [9]; pero
tambin a que pueden comportarse como vectores de oxgeno, favoreciendo la concentracin de
oxgeno disuelto en el medio de cultivo.
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La Figura1 muestra las curvas de crecimiento de G. fujikuroi obtenidas con los diferentes aceites
empleados como nica fuente de carbono; las cuales no presentaron la fase de adaptacin, debido a
que el medio de cultivo empleado estuvo limitado por nitrgeno.
Figura 1. Cintica de crecimiento de G. fujikuroi empleando aceites vegetales
La biomasa acumulada en la fase de balance (I) fue muy similar (10-14 g l
-1
) con los aceites de
crtamo, girasol y arroz, pero inferior con el aceite de soya. La mxima biomasa en la etapa de
almacenamiento (II) mostr relacin con la composicin de cidos grasos saturados de los
diferentes aceites, lo anterior se muestra en la Figura 2. El aceite de arroz, que tiene con la mayor
composicin de cidos grasos saturados, report la menor biomasa y los aceites con menor
composicin de estos cidos grasos reportaron la mayor biomasa; esto se atribuye a que los cidos
grasos insaturados presentan mayor facilidad en su transporte a las clulas que los cidos grasos
saturados.
Figura 2. Mxima biomasa lograda con cada uno de los aceites vegetales y su relacin con la composicin de A.G.S.
A.G.S-cidos grasos saturados A.G.M-cidos grasos mono-insaturados, A.G.P.-cidos grasos poli-insaturados.
La etapa de mantenimiento (III), es la de mayor inters en el cultivo para la produccin, ya que es
donde se presenta la produccin de GAs; el aceite de arroz present la etapa de mantenimiento ms
larga. La etapa de disminucin de la biomasa (IV) se present con el aceite de crtamo y el aceite
de soya, y el que sta etapa se presente, es indicacin de que las reservas de carbohidratos y lpidos
se han agotado o no fueron suficientes para mantener la biomasa y por lo tanto la biosntesis de
GAs se ver afectada.
Las curvas de crecimiento obtenidas fueron bien descritas por el modelo de Gompertz, con
coeficientes de correlacin mayores a 0.99 y sin tendencia en las grficas de dispersin. El modelo
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de Gompertz con dos parmetros fue adecuado para describir las curvas de crecimiento, sin
embargo, cuando se present disminucin en la biomasa el modelo de Gompertz con tres
parmetros present mejor correlacin, por lo que se decidi trabajar con l para describir las
cinticas de crecimiento de G. fujikuroi en el desarrollo de ste trabajo. Las encontradas con los
diferentes aceites fueron de 1.37x10
-2
a 3.45x10
-2
h
-1
, la menor la report el aceite de soya y la
mayor el aceite de arroz.
Las curvas de crecimiento obtenidas se presentan en la Figura 3. La mxima biomasa obtenida en
los cultivos realizados con el arreglo de propelas 3R fue superior, independientemente de la
velocidad de agitacin y aireacin a la encontrada en los cultivos realizados con el arreglo de
propelas 2RM. En promedio, los cultivos con las propelas 2RM reportaron 15 g l
-1
de biomasa
mxima, con una desviacin estndar de 1.54, mientras que las fermentaciones con las propelas 3R
reportaron 20.81 g l
-1
de biomasa mxima, con una desviacin estndar de 1.64. La biomasa
mxima promedio de los cultivos realizados fue de 17.91 g l
-1
,con desviacin estndar de 4.10.

Figura 3. Cinticas de crecimiento de G. fujikuroi bajo diferentes condiciones de agitacin/aireacin (diseo 2
3
)
El anlisis de varianza de la mxima biomasa report que el arreglo de propelas fue el nico factor
significativo, con confianza de 95%.
En la Figura 4a se muestra la grfica de superficie de respuesta para la productividad en funcin
del arreglo de propelas y velocidad de agitacin. Donde se observ que el arreglo de propelas 3R a
600 rpm increment la productividad.
La Figura 4b muestra la superficie de respuesta de la productividad en funcin del arreglo de
propelas y del flujo de aire, donde se observ que el arreglo 3R y el flujo de 1 vvm de gas
favorecieron la productividad. La Figura 4c muestra la superficie de respuesta de la productividad
en funcin de la velocidad de agitacin y el flujo de aire, en esta grfica se observ que 600 rpm y
1 vvm de aire incrementaron la productividad.

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Figura 4. Superficie de respuesta para la productividad de GA
3
en funcin: a) del arreglo de propelasy de la velocidad
de agitacin, b) del arreglo de propelas y del flujo de aire, y c)de la velocidad de agitacin y del flujo de aire.
El anlisis estadstico sobre la productividad de GA
3
mostr que el arreglo de propelas 3R, la
mayor velocidad de agitacin, 600 rpm, y de aireacin, 1 vvm, favoreci la productividad. Los
diferentes experimentos generaron como ya se mencion diferentes condiciones de suministro de
oxgeno, pero adems las diferentes condiciones de operacin influyeron en la dispersin de la fase
orgnica (aceite vegetal) en el medio de fermentacin.

Conclusiones
Se encontr una relacin inversa entre la composicin de cidos grasos saturados de los diferentes
aceites estudiado con la mxima biomasa lograda; el aceite de arroz que presenta la mayor
composicin de cidos grasos saturados, report la menor biomasa.
El medio de cultivo formulado para estudiar la produccin de GA
3
, empleando como nica fuente
de carbono diferentes aceites vegetales, report las ms altas concentraciones de GA
3
con aceite de
arroz y con aceite de crtamo. El cultivo con aceite de arroz report la mayor productividad de
GA
3
; adems, tambin report uno de los ms bajos rendimientos y productividades para GA
7
. El
cultivo con aceite de crtamo report la segunda mayor productividad para GA
3
, pero la mayor
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para GA
7
. Reformulando el medio de cultivo se logr incrementar la productividad de GA
3
empleando aceite de arroz como nica fuente de carbono.
Las diferentes condiciones hidrodinmicas estudiadas no presentaron un claro efecto sobre la . En
general, la mxima biomasa obtenida fue mayor con el arreglo de propelas 3R que con el arreglo
de propelas 2RM. Sin embargo, s se observ un claro efecto en la produccin de GA
3
, los cultivos
con el arreglo de propelas 3R reportaron las mayores productividades de GA
3
. El arreglo de
propelas 3R (D/d=3), 600 rpm y 1 vvm de gas (aire) report la mayor productividad de GA
3
.
Slo el cultivo a 600 rpm mostr un efecto en la . Al incrementar la velocidad de agitacin
(energa suministrada) se favoreci la disminucin del tiempo en que se alcanz la mayor
concentracin de GA
3
.
Referencias
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morphology of submerged fermentation.Biotechnology and Bioengineering, (1997).
2.Escamilla-Silva, E. M., Dendooven, L., Uscanga-Reynell, J.A., Monroy-Ramrez, A.I.,
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7. Patio, V. M., Establecimiento de un proceso de fermentacin sumergida para la produccin de
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Biotecnologa. Instituto de Biotecnologa, UNAM, Cuernavaca, Morelos. (1995).
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gene cluster. Fungal Genetics and Biology,(1998).


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