Avaliação de R.I Mediadas Por Macrófagos

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRINGULO MINEIRO BRUNA FRANA MATIAS
AVALIAO DA RESPOSTA IMUNE MEDIADA POR MACRFAGOS, CLULAS NK E LINFCITOS T CITOTXICOS EM PACIENTES ONCOLGICOS SUBMETIDOS IMUNOTERAPIA COM CLULAS DENDRTICAS
UBERABA MG 2010
UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRINGULO MINEIRO BRUNA FRANA MATIAS
AVALIAO DA RESPOSTA IMUNE MEDIADA POR MACRFAGOS, CLULAS NK E LINFCITOS T CITOTXICOS EM PACIENTES ONCOLGICOS SUBMETIDOS IMUNOTERAPIA COM CLULAS DENDRTICAS
Dissertao apresentada ao Curso de PsGraduao em Patologia, rea de concentrao Patologia Clnica, da Universidade Federal do Tringulo Mineiro, como requisito parcial para obteno do Ttulo de Mestre.
Orientadora: Michelin
Profa.
Dra.
Mrcia
Antoniazi
Co-orientador: Prof. Dr. Eddie Fernando Candido Murta
UBERABA MG 2010
DEDICATRIAS
minha me Crita, que sempre acreditou nos meus sonhos, me dando foras para lutar por eles. Pela compreenso, pacincia, carinho e apoio incondicional em todas as minhas decises! Obrigada por me permitir ter chegado at aqui, sem voc nada disso teria sido possvel;
Ao meu noivo Eduardo, pela imensa contribuio em todos os momentos dessa trajetria, por compreender meu cansao e minha falta de tempo. Acima de tudo, agradeo pelo amor, carinho, companheirismo e por tornar os meus dias mais felizes!
Ao meu pai Tadeu, por sempre acreditar que a educao o melhor caminho, por confiar nas minhas escolhas e torcer pelas minhas vitrias;
minha irm Paula, que mesmo longe sempre esteve to prxima, com quem sempre pude contar e me apoiar, minha verdadeira amiga e, tambm, por proporcionar-me o maior presente da minha vida, o meu sobrinho Rafael, a quem meu amor indescritvel.
AGRADECIMENTOS
Agradeo, sobretudo, a Deus pela vida e inspirao de todos os dias; Deus nos concede, a cada dia, uma pgina de vida no livro do tempo. Aquilo que colocamos nela, corre por nossa conta. Chico Xavier Dra. Mrcia Antoniazi Michelin, minha orientadora, por sua participao e auxlio ao longo de toda a caminhada e agradeo, principalmente, pelos conhecimentos compartilhados, pela amizade, pacincia e compreenso durante todos os momentos dessa caminhada. Este trabalho tambm fruto da sua dedicao como grande pesquisadora;
Ao Dr. Eddie Fernando Candido Murta, meu coorientador, pela ateno, correes e apoio durante a realizao deste trabalho. Sua postura tica e sua carreira profissional so de minha imensa admirao e respeito;
grande amiga e parceira cientfica, Cludia Mendona, que durante esses trs anos mostrouse uma verdadeira companheira em todos os projetos compartilhados. Com voc aprendi a ser mais forte e sua presena foi essencial nessa jornada. Os amigos so irmos que Deus nos permite escolher;
A todos os amigos e colegas do Instituto de Pesquisa em Oncologia (IPON), que me ajudaram direta ou indiretamente na realizao deste estudo, em especial aos amigos Andr, Ariana, Christianne, Douglas, Letcia, Nelson e Pmela, pela amizade e companheirismo;
Aos pacientes, que voluntariamente participaram deste projeto, meus sinceros e especiais agradecimentos;
Ao apoio da Universidade Federal do Tringulo Mineiro (UFTM), do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq), e da Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), agradeo aos recursos financeiros destinados elaborao desta pesquisa;
Agradeo a todos que, de alguma forma participaram e colaboraram com este trabalho e queles que me ensinaram a prosseguir sempre.
"Mestre no quem sempre ensina, mas quem de repente aprende". Guimares Rosa
RESUMO
A imunidade inata a primeira linha de defesa do hospedeiro contra as clulas neoplsicas e os principais tipos celulares envolvidos incluem clulas NK, macrfagos e clulas dendrticas (CDs). Aps a induo da resposta imune inata, o microambiente preparadodo para uma resposta mais sofisticada, a adquirida, sendo os linfcitos a populao celular mais especfica contra os antgenos tumorais. As clulas dendrticas funcionam como ponte entre a resposta imune inata e a adquirida, devido sua alta capacidade de apresentao antignica. No presente estudo foram avaliados oito pacientes com cncer avanado, submetidos imunoterapia com clulas dendrticas autlogas amadurecidas in vitro, objetivando-se analisar a influncia dessa abordagem teraputica sobre populaes celulares envolvidas na imunidade inata e adquirida. Para tanto, as CDs autlogas foram obtidas por meio da diferenciao de clulas mononucleares do sangue perifrico, mantidas em cultura e, posteriormente, eletroporadas com o antgeno tumoral obtido do paciente por bipsia. A vacina foi administrada por via subcutnea com um intervalo mdio de 15 dias. Amostras do sangue perifrico foram colhidas para a anlise das populaes de clulas imunes, sendo que as anlises celulares foram realizadas antes de iniciar a terapia e durante as vacinaes. As marcaes celulares foram realizadas por citometria de fluxo, utilizando-se os anticorpos intra e extracelulares seguintes: macrfagos ( -CD14 PE, -IFN- FITC, -TNF- FITC e -IL12 FITC), clulas NK (-CD56 PE, -CD25 PE, -IL-12 FITC e -IL-2 FITC) e linfcitos T citotxicos (-CD8 PE, -CD25 PE e -IL-2 FITC). Os oito pacientes foram analisados de forma individual, atravs de grficos lineares para os marcadores avaliados, submetendo-os a linhas de tendncias. Para a anlise estatstica utilizou-se o teste de Kruskal-wallis, considerando-se a amostragem significante quando p0,05. Diante dos resultados obtidos, verificou-se elevao da expresso celular dos macrfagos com o TNF- (p=0,0465) e dos linfcitos T citotxicos com a IL-2 (p=0,0445). Portanto, o aumento dessas populaes celulares indica que a imunoterapia com CDs influencia positivamente as clulas alvo da imunidade inata e adquirida, em pacientes com cncer avanado. Contudo, aps um longo perodo de estmulo imunoteraputico essas populaes adotaram uma tendncia diminuio, possivelmente, devido a um novo mecanismo de evaso tumoral.
Palavras-chave: imunoterapia, cncer, imunidade inata, imunidade adquirida, clulas dendrticas, clulas NK, macrfagos, linfcitos T.
ABSTRACT
Innate immunity is the first line of host defense against tumor cells and the main cell types involved include NK cells, macrophages and dendritic cells (DCs). After induction of innate immune response, the microenvironment is prepared to a more sophisticated one, the acquired response, and lymphocytes are the most specific cell population against tumor antigens. Dendritic cells act as a bridge between innate and acquired immune response, due to its high capacity for antigen presentation. In this study we evaluated eight patients with advanced cancer undergoing immunotherapy with autologous dendritic cells matured in vitro, aiming to analyze the influence of this therapeutic approach on cell populations involved in innate and acquired immunity. For this purpose, autologous DCs were obtained by differentiation of peripheral blood mononuclear cells maintained in culture and subsequently electroporated with tumor antigens obtained from biopsy. The vaccine was administered subcutaneously with an average interval of 15 days. Peripheral blood samples were collected for analysis of immune cells populations, and the analysis were performed before starting therapy and during vaccinations. The cells markings were made by flow cytometry, using intracellular and extracellular antibodies as follows: macrophages (-CD14 PE, -IFN- FITC, -TNF- FITC and -IL-12 FITC), NK cells (-CD56 PE, -CD25 PE, -IL-12 FITC and -IL-2 FITC) and cytotoxic T lymphocytes (-CD8 PE, -CD25 PE and -IL-2 FITC). The eight patients were analyzed individually, using line graphs for the markers evaluated, subjecting them to trendlines. For the statistical analysis we used Kruskal-wallis test, considering the sampling significant when p 0.05. Based on these results, there was elevation of the cellular expression of macrophages with TNF- (p=0.0465) and cytotoxic T lymphocytes with IL-2 (p=0.0445). Therefore, the increase of these cell populations indicates that immunotherapy with DCs influences the target cells of innate and acquired immunity in patients with advanced cancer. However, after a long period of immunotherapeutic stimulation, the populations adopt a tendency to decrease, possibly due to a novel mechanism of tumor evasion.
Keywords: immunotherapy, cancer, innate immunity, acquired immunity, dendritic cells, NK cells, macrophages, T lymphocytes.
LISTA DE ILUSTRAES
Figura 1: Tipos de cncer mais incidentes estimados para 2010, exceto de pele no melanoma, na populao brasileira....................................................................................................................... 15
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Mecanismos de evaso tumoral......................................................................................... Tabela 2: Descrio do grupo estudado............................................................................................ Tabela 3: Marcaes intra e extracelulares...................................................................................... Tabela 4: Critrios utilizados para anlise celular dos pacientes...................................................
20 29 32 33
LISTA DE GRFICOS
Grfico 1: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD14 com o IFN-, com o TNF- e com a IL-12 no paciente 1............................................................................................................................. .... Grfico 2: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD14 com o IFN-, com o TNF- e com a IL-12 no paciente 2............................................................................................................................. .... Grfico 3: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD14 com o IFN-, com o TNF- e com a IL-12 no paciente 3............................................................................................................................. .... Grfico 4: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD14 com o IFN-, com o TNF- e com a IL-12 no paciente 4............................................................................................................................. .... Grfico 5: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD14 com o IFN-, com o TNF- e com a IL-12 no paciente 5............................................................................................................................. .... Grfico 6: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD14 com o IFN-, com o TNF- e com a IL-12 no paciente 6............................................................................................................................. .... Grfico 7: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD14 com o IFN-, com o TNF- e com a IL-12 no paciente 7.............................................................................................................................. ... Grfico 8: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD14 com o IFN-, com o TNF- e com a IL-12 no paciente 8................................................................................................................................. Grfico 9: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD56 com IL-2, com IL-12 e com CD25 no paciente 1........................................................................................................................................ Grfico 10: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD56 com IL-2, com IL-12 e com CD25 no paciente 2........................................................................................................................................ Grfico 11: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD56 com IL-2, com IL-12 e com CD25 no paciente 3........................................................................................................................................ Grfico 12: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD56 com IL-2, com IL-12 e com CD25 no paciente 4........................................................................................................................................ Grfico 13: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD56 com IL-2, com IL-12 e com CD25 no paciente 5........................................................................................................................................ Grfico 14: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD56 com IL-2, com IL-12 e com CD25 no paciente 6........................................................................................................................................ Grfico 15: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD56 com IL-2, com IL-12 e com CD25 no paciente 7........................................................................................................................................ Grfico 16: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD56 com IL-2, com IL-12 e com CD25 no paciente 8........................................................................................................................................ Grfico 17: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD8 com IL-2 e com CD25 no paciente 1.................................................................................................................................................
34
35
35
36
36
37
37
38
40
40
41
41
42
42
43
43
45
Grfico 18: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD8 com IL-2 e com CD25 no paciente 2................................................................................................................................................. Grfico 19: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD8 com IL-2 e com CD25 no paciente 3................................................................................................................................................. Grfico 20: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD8 com IL-2 e com CD25 no paciente 4................................................................................................................................................. Grfico 21: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD8 com IL-2 e com CD25 no paciente 5................................................................................................................................................. Grfico 22: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD8 com IL-2 e com CD25 no paciente 6................................................................................................................................................. Grfico 23: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD8 com IL-2 e com CD25 no paciente 7................................................................................................................................................. Grfico 24: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD8 com IL-2 e com CD25 no paciente 8................................................................................................................................................. Grfico 25: Anlise linear das medianas, mximos e mnimos do CD14 com IFN- do grupo estudado, submetido estatstica pelo teste de Kruskal-wallis.......................................................... Grfico 26: Anlise linear das medianas, mximos e mnimos do CD14 com TNF- do grupo estudado, submetido estatstica pelo teste de Kruskal-wallis.......................................................... Grfico 27: Anlise linear das medianas, mximos e mnimos do CD14 com IL-12 do grupo estudado, submetido estatstica pelo teste de Kruskal-wallis.......................................................... Grfico 28: Anlise linear das medianas, mximos e mnimos do CD56 com IL-2 do grupo estudado, submetido estatstica pelo teste de Kruskal-wallis.......................................................... Grfico 29: Anlise linear das medianas, mximos e mnimos do CD56 com IL-12 do grupo estudado, submetido estatstica pelo teste de Kruskal-wallis.......................................................... Grfico 30: Anlise linear das medianas, mximos e mnimos do CD56 com CD25 do grupo estudado, submetido estatstica pelo teste de Kruskal-wallis.......................................................... Grfico 31: Anlise linear das medianas, mximos e mnimos do CD8 com IL-2 do grupo estudado, submetido estatstica pelo teste de Kruskal-wallis.......................................................... Grfico 32: Anlise linear das medianas, mximos e mnimos do CD8 com CD25 do grupo estudado, submetido estatstica pelo teste de Kruskal-wallis..........................................................
46
46
47
47
48
48
49
50
51
51
52
53
53
54
55
LISTA DE ABREVIATURAS
ADCC: APC: CD: CDs: CEP: CHP: CNPq: DNA: EDTA: EGF: ELISA: FAPEMIG: FITC: GM-CSF: H2O2: ICAM: iCD: IFN: IgG: IL: INCA: iNOS: IPON: LAMP3: LPS: M-CSF: MDP: MMP: NK: NO: PBS:
Citotoxicidade celular dependente de anticorpo Clula apresentadora de antgeno Cluster of Differentiation (Molcula de superfcie) Clulas dendrticas Comit de tica em Pesquisa Complexo de histocompatibilidade principal Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico cido desoxirribonuclico cido etileno tetra-actico Fator de crescimento endotelial Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (Ensaio Imunoenzimtico) Fundao de Amparo Pesquisa do Estado de Minas Gerais Fluorescein Conjugate Fator estimulador de colnia de macrfagos e granulcitos Perxido de hidrognio Molcula de adeso intercelular Clula dendrtica imatura Interferon Imunoglobulina G Interleucina Instituto Nacional do Cncer xido ntrico sintetase induzvel Instituto de Pesquisa em Oncologia Protena de membrana 3 associada ao lisossomo Lipopolissacardeo Fator estimulador de colnia de macrfagos Muramil dipeptdeo Metaloproteinase Natural Killer (clula matadora natural) xido ntrico Soluo salina tamponada com fosfato
pCD: PE: PGE-2: RNA: SIDA: TAAs: TAMs: TCR: TGF-: Th: TILs: TNF: Treg: UFTM: VEGF: VLPs: WHO:
Clula dendrtica plasmocitide Phycoerythrin Prostaglandina E2 cido ribonuclico Sndrome da Imunodeficincia Adquirida Antgenos associados ao tumor Macrfagos associados ao tumor Receptor da clula T Fator de crescimento transformador beta T helper Linfcitos T infiltrantes do tumor Fator de necrose tumoral Clula T regulatria Universidade Federal do Tringulo Mineiro Fator de crescimento endotelial vascular Virus like particles (partculas semelhantes a vrus) World Health Organization
SUMRIO
RESUMO............................................................................................................................................. V ABSTRACT........................................................................................................................................ VI
LISTA DE ILUSTRAES.............................................................................................................. VII LISTA DE TABELAS........................................................................................................................ VIII LISTA DE GRFICOS..................................................................................................................... LISTA DE ABREVIATURAS.......................................................................................................... 1 1.1 1.2 1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.7.1 2 2.1 2.2 3 3.1 IX XI
INTRODUO................................................................................................................ 15 Transformao Celular Neoplsica................................................................................ 15 Resposta Imune aos Tumores......................................................................................... 17
Resposta Imune Inata......................................................................................................... 18 Resposta Imune Adquirida................................................................................................. 18 Vigilncia Imunolgica e Escape Tumoral........................................................................ 19 O papel das Clulas Dendrticas no Cncer.................................................................. Macrfagos....................................................................................................................... 21 22
Clulas NK........................................................................................................................ 24 Linfcitos T citotxicos.................................................................................................... 24 Imunoterapia do Cncer................................................................................................. 25
Vacina baseada em Clulas Dendrtica............................................................................. 26 OBJETIVOS.................................................................................................................... 28
Objetivo Geral.................................................................................................................. 28 Objetivos Especficos....................................................................................................... MATERIAIS E MDOTOS.......................................................................................... Casustica.......................................................................................................................... 28 29 29
3.1.1 3.1.2 3.2 3.3 3.4 4 4.4.1 4.4.2 4.4.3 4.4.1 4.4.1 4.4.1 5 6
Critrios de Incluso.......................................................................................................... 29 Critrios de Excluso......................................................................................................... 30 Preparao da Vacina de Clulas Dendrticas Autlogas............................................ Anlise Celular por Citometria de Fluxo...................................................................... Anlise dos Resultados.................................................................................................... RESULTADOS................................................................................................................ 30 30 32 34
Anlise dos Macrfagos..................................................................................................... 34 Anlise das Clulas NK..................................................................................................... Anlise dos Linfcitos T citotxicos.................................................................................. 39 45
Anlise Estatstica dos Macrfagos................................................................................... 50 Anlise Estatstica das Clulas NK.................................................................................... 52 Anlise Estatstica dos Linfcitos T citotxicos................................................................. 54 DISCUSSO..................................................................................................................... 56 CONCLUSO.................................................................................................................. 64 65 77
REFERNCIAS................................................................................................................................. ANEXOS.............................................................................................................................................
1 INTRODUO
1.1
Transformao Celular Neoplsica
As neoplasias so consideradas doenas resultantes da quebra da integridade funcional do ciclo celular, como consequncia de alteraes moleculares ou por ao de estmulos diversos. Essa mutao pode ser adquirida pela ao de agentes ambientais, como agentes qumicos, radiao, vrus, ou pode ser herdada geneticamente (LOEB e HARRIS, 2008). As neoplasias malignas constituem importante causa de doena e morte mundialmente e, segundo a Organizao Mundial da Sade (WHO) em 2008, cerca de 12,7 milhes novos casos de cncer e 7,6 milhes de bitos ocorreram no mundo todo. Em relao ocorrncia de cncer no Brasil, estimativas para o ano de 2010, vlidas tambm para o ano de 2011, indicam que ocorrero 489.270 novos casos de cncer. Em 2010, estima-se que o cncer de pele do tipo no melanoma ser o mais incidente na populao brasileira (114 mil casos novos), seguido pelos cnceres de prstata (52 mil), mama (49 mil), clon e reto (28 mil), pulmo (28 mil), estmago (21 mil) e colo do tero (18 mil) (Figura 1) (INCA, 2010).
Figura 1: Tipos de cncer mais incidentes estimados para 2010, exceto de pele no melanoma, na populao brasileira.
Fonte: Instituto Nacional do Cncer INCA, 2010.
Diante desse levantamento epidemiolgico, os tipos de cncer mais incidentes no sexo masculino, exceo do cncer de pele do tipo no melanoma, sero os de prstata e pulmo, e no sexo feminino os de mama e colo do tero, o que segue o mesmo perfil de amplitude observado na Amrica Latina (INCA, 2010). A carcinognese um processo em diversas etapas tanto em nvel fenotpico quanto genotpico. Um tumor maligno apresenta diversas caractersticas fenotpicas, tais como: crescimento excessivo, invasividade local e capacidade de formar metstases distncia. Essas caractersticas so adquiridas de maneira gradativa, consistindo em um fenmeno chamado de progresso tumoral. No que se refere ao envolvimento molecular, a progresso resulta do acmulo de leses genticas que em alguns casos so favorecidas por defeitos no reparo do DNA (cido desoxirribonuclico) (LINDAHL,1993; LOEB e HARRIS, 2008). Os genes que modificam protenas do ciclo celular e previnem eventos que levam a transformao maligna das clulas so denominados de genes supressores tumorais. O primeiro gene de supresso tumoral clonado, conhecido como gene Rb por ser descrito nos retinoblastomas, expressa a protena pRb. o principal regulador do ciclo celular, codifica a protena nuclear que regula a expresso gentica e sua disfuno leva a perda dos controles inibitrios do ciclo celular (JOHUNG et al., 2007). Contudo, atualmente, vrios outros genes supressores so conhecidos, como por exemplo, os BRCA1 e 2 que esto envolvidos com cncer de mama, o gene APC com o cncer colorretal, o WT1 com o tumor de Wilms, o p16ink4 com o melanoma familiar, o NF1 e 2 com a neurofibromatose; dentre outros (HUSSAIN e HARRIS, 2000; SHIH, 2000). Mais de 50% dos tumores malignos apresentam mutao pontual em um dos alelos do gene p53 e perda do outro (HOLLSTEIN et al., 1991; LAMB e CRAWFORD, 1986). Essas mutaes podem ser devidas a fatores ambientais ou genticos. O gene p53 parece ser o maior envolvido nas mutaes genticas do cncer humano, tendo como principal finalidade supervisionar se todos os genes esto ntegros (HUSSAIN e HARRIS, 2000; WEISZ et al., 2007). As mutaes no gene p53 tm sido extensivamente estudadas e descritas em diversas malignidades humanas. Em tais casos, o gene p53 pode perder suas funes e o ciclo celular no pode progredir para a fase G1/S, levando a instabilidade do genoma e acmulo de mutaes podendo resultar em transformaes neoplsicas (HOLLSTEIN et al., 1991; KOYAMATSU et al., 2003).
1.2
Resposta Imune aos Tumores
O sistema imune tem um importante papel na preveno do desenvolvimento tumoral, sendo capaz de identificar ameaas a homeostase orgnica, reagindo de forma a eliminar, neutralizar ou tolerar aes danosas. A complexidade das interaes entre as clulas tumorais e o sistema imune do hospedeiro envolve diversas linhagens celulares e mediadores, alm disso, respostas imunolgicas podem se comportar de maneiras diferentes em cada indivduo. A resposta imune em alguns hospedeiros pode inibir o crescimento tumoral levando a remisses espontneas ou pode promover inflamao crnica induzindo a progresso tumoral e angiognese (DOUGAN e DRANOFF, 2009). A associao entre as clulas do sistema imune e o cncer conhecida h tempos, embora os mecanismos que envolvam tal interao ainda no estejam completamente elucidados. Inicialmente, acreditava-se que os infiltrados de leuccitos encontrados ao redor de neoplasias representavam uma tentativa do hospedeiro em erradicar as clulas neoplsicas. De fato, o extenso infiltrado de clulas matadoras naturais (NK - do ingls, Natural Killer) em cnceres gstricos ou colorretais est associado a um melhor prognstico (COCA et al., 1997; ISHIGAMI et al., 2000). Entretanto, estudos populacionais revelam que pacientes que mantm um estado inflamatrio crnico apresentam maior risco de desenvolver cncer (KARIN e GRETEN, 2005). Acredita-se que o processo de eliminao do tumor compreende tanto a imunidade inata quanto adquirida, formando um sistema integrado de defesas do hospedeiro contra tumores, no qual diversas clulas e molculas funcionam mutuamente. A imunidade inata a primeira linha de defesa do hospedeiro contra patgenos e clulas tumorais e os principais tipos celulares envolvidos incluem clulas NK e macrfagos. A resposta imune adaptativa est envolvida na eliminao de microorganismos invasores e na defesa do hospedeiro em fases mais tardias do crescimento tumoral, sendo o linfcito T o tipo celular mais especfico contra os antgenos tumorais e responsvel pela memria imunolgica (LEHRNBECHER et al., 2008; LOOSE e VAN DE WIELE, 2009).
1.2.1 Resposta Imune Inata
O controle tumoral feito, sobretudo, por meio de citocinas (interferon IFN, interleucina IL e fator de necrose tumoral TNF), macrfagos e clulas NK. Quando o sistema imune estimulado pela primeira vez, h ativao e recrutamento de clulas inflamatrias e linfcitos atravs da liberao de citocinas e quimiocinas especficas (SHI et al., 2003). O reconhecimento e a lise de clulas tumorais por clulas NK tambm so de extrema relevncia na imunidade inata contra tumores. Clulas NK podem ser ativadas por citocinas, como a IL-2 e o IFN-, desencadeando um processo de destruio da clula-alvo atravs da liberao de granzima e perfurina. Adicionalmente, a IL-12 produzida por macrfagos e outras clulas apresentadoras de antgenos, possui participao importante na fase inicial da ativao de clulas NK estimulando-as a exercerem citotoxicidade e a produzirem mais IFN- que, por sua vez, aumenta o potencial tumoricida dos macrfagos (ENZLER et al., 2003; De VISSER et al., 2006). Em seguida, so produzidos os IFNs tipo I que ativam as clulas apresentadoras de antgenos (APCs), especialmente as clulas dendrticas (CDs), consideradas sentinelas do hospedeiro e responsveis pela iniciao da imunidade adquirida (KAPLAN, 1998). Algumas citocinas so prontamente produzidas em resposta a sinais de alerta e podem alterar substancialmente a funo das CDs, por induzir a diferenciao, ativao, migrao e maturao dessas clulas como, por exemplo, fator estimulador de colnia de granulcitomacrfago (GM-CSF), IFN-, IL-4, IL-5, IL-12 e TNF (YOO et al.,2002; LANGENKAMP et al., 2000; SERAFINI et al., 2004).
1.2.2 Resposta Imune Adquirida
Aps a induo da primeira linha de defesa do hospedeiro, o ambiente organizado para uma resposta imune mais sofisticada, onde interaes entre APCs maduras e citocinas levam a uma resposta imune mais eficiente e direcionada. As clulas da resposta imune adquirida, como os linfcitos B e linfcitos T, so diferenciadas dos leuccitos da imunidade inata pela expresso de receptores antignicos, produzidos por rearranjos genticos, que
permitem um repertrio de ao mais vasto do que as clulas da imunidade inata (De VISSER et al., 2006). O direcionamento resposta imune adaptativa especfica contra as clulas tumorais depende da apresentao de eptopos antignicos por molculas do complexo de histocompatibilidade principal (CHP) classe I no stio de inflamao, sendo o linfcito T citotxico (tambm conhecido por linfcito T CD8+) o principal tipo celular responsvel pela destruio e eliminao dessas clulas. Para que isso seja possvel, as CDs podem reconhecer e apresentar o antgeno tumoral de forma cruzada para clulas T CD8+, e, ao mesmo tempo, ativar clulas T auxiliares (tambm denominadas por T CD4+) que so capazes de produzir citocinas pr-inflamatrias e irromper uma resposta imune antitumoral (GUERMONPREZ et al., 2003; HEATH et al., 2004). Esse processo, chamado de cross-priming, foi primeiramente proposto por Bevan no ano de 1975 (BEVAN, 1975). A apresentao cruzada fundamental na ativao de clulas T CD8+, uma vez que clulas dendrticas possuem uma habilidade especial de transportar o antgeno tumoral dos compartimentos endossomais ao citosol para o acesso convencional do CHP de classe I (GUERMONPREZ et al., 2003; HOUDE et al., 2003; LIN et al., 2008). Como os linfcitos B e T so derivados de um nico precursor, a expanso clonal a partir do reconhecimento e interao com antgenos extrnsecos fundamental. Durante a resposta primria, parte dos linfcitos se diferencia em clulas de memria de longa sobrevivncia resultando em respostas sustentadas exposio dos antgenos (SCHNURR et al., 2004; VAN DER BRUGGEN et al., 2002).
1.2.3 Vigilncia Imunolgica e Escape Tumoral
Em 1909 foi elaborado o conceito de vigilncia imunolgica pelo imunologista alemo Paul Ehrlich, mas s foi consolidado em 1957 por Burnet e Thomas (BARONZIO et al., 2009; BURNET, 1957; THOMAS, 1959). De acordo com a teoria da vigilncia imunolgica, o sistema imune relevante no controle do crescimento tumoral, tendo em vista que clulas da imunidade reconhecem e destroem clones de clulas mutadas do hospedeiro, antes que elas se desenvolvam em tumores. Eventos que envolvem desde a mutao da primeira clula at os processos de metstase, angiognese, invaso e evaso imune
dependem da interao entre as clulas tumorais, imunes, estromais e endoteliais (FERRANTINI et al., 2007; GABRILOVICH, 2004; KAH-WAI et al., 2006). A maioria dos antgenos tumorais so imungenos fracos e funes imunes como a resposta de clula T antgeno-especfica e a regulao imune mediada por clulas T regulatrias (Treg) frequentemente falham e no funcionam de maneira adequada podendo levar ao crescimento tumoral (FERRANTINI et al., 2007). Estudos conduzidos na ltima dcada identificaram vrios mecanismos de escape associados ao crescimento tumoral que podem envolver tanto as clulas tumorais e os antgenos associados ao tumor como o sistema imune do hospedeiro (Tabela 1) (GABRILOVICH et al., 2004; ROTH et al., 2001; SOMBROEK et al., 2002).
Tabela 1: Mecanismos de evaso tumoral. Clulas tumorais e antgenos associados ao tumor (TAAs) Sistema imune do hospedeiro
*
Baixa imunogenicidade (maioria so antgenos prprios e poucos so neoantgenos tumorais) Diminuio ou perda da expresso de molculas do CHP classe I Baixa expresso de molculas co-estimulatrias Diminuio de eventos apoptticos (baixa expresso de Fas/FasL solvel) Diminuio da regulao da expresso dos genes associados apresentao antignica Secreo de mediadores e citocinas imunossupresoras (TGF-, IL-10, IL6 e PGE-2*) Perda dos eptopos antignicos durante o tratamento convencional Presena de barreiras fsicas que impedem o acesso das clulas imunes efetoras Falncia do sistema imune em no reconhecer os antgenos tumorais nas fases iniciais do crescimento tumoral Tolerncia de clulas T aos antgenos especficos do tumor Supresso de clulas T Defeitos na apresentao antignica pelas APCs
Notas: TGF- (fator de crescimento transformador beta); PGE-2 (prostaglandina E2). Fontes: GABRILOVICH, 2004; ROTH ,2001; SOMBROEK, 2002.
Os tumores, sob certas condies, suprimem as funes das CDs para prevenir uma resposta imune, sendo capazes de reverter mecanismos de ataque e controle da progresso tumoral. A natureza exata das interaes entre as clulas tumorais e as CDs ainda no est clara, e tambm no se sabe exatamente se clulas dos tecidos normais simplesmente se
comportam neutras em relao s CDs e falham em ativ-las pela falta de sinais de perigo, ou se elas produzem ativamente sinais inibitrios para prevenir a ativao de CDs (RABINOVICH et al., 2007). Alm dos tumores se desenvolverem por mecanismos relacionados deficincia da vigilncia imunolgica, eles podem induzir tolerncia como resultado de desequilbrios no microambiente tumoral. Interaes de estimulao mtua entre as CDs e clulas T citotxicas podem iniciar uma resposta imunognica ou tolerognica (STEINMAN et al, 2003).
1.3
O papel das Clulas Dendrticas no Cncer
As clulas dendrticas fazem parte do sistema fagoctico mononuclear e funcionam como ponte entre a resposta imune inata e adquirida, devido sua capacidade de apresentao antignica. Em 1868, essas clulas foram identificadas, pela primeira vez, pelo patologista alemo Paul Langerhans, a partir do isolamento de clulas presentes na pele, nomeando-as de clulas de Langerhans. Mais de um sculo depois, em 1973, essas clulas foram descritas nos linfonodos e no timo, por Steinman e Cohn, e desde ento se tornaram chave no entendimento do sistema imune (LANGERHANS, 1868; SHURIN e SALTER, 2009; STEINMAN e COHN, 1973). As CDs originam-se de clulas pluripotentes CD34+ presentes na medula ssea, na qual possuem duas vias de diferenciao. A via mielide gera trs classes de CDs mielides, que compreende as clulas de Langerhans, encontradas no epitlio estratificado como a pele e a mucosa, as CDs intersticiais que so encontradas nos interstcios dos tecidos e, por ltimo, as CDs dermais, uma populao de clulas localizada na derme. A via linfide gera clulas dendrticas plasmocitides que se apresentam em uma proporo substantivamente menor quando comparado as CDs mielides (conhecidas tambm como CDs convencionais), e esto presentes nos rgos linfides como o timo, medula ssea, bao, tonsilas e linfonodos (BANCHEREAU e STEINMAN, 1998; FONG e ENGLEMAN, 2000; TOEBAK et al., 2009). Em estudos clnicos, a classificao atravs da expresso de molculas de superfcie tem sido extensivamente utilizada, na qual CDs so agrupadas em: mielides e plasmocitides, sendo diferenciadas pelo marcador mielide CD11c (CD - do ingls, Cluster of Differentiation). As clulas dendrticas mielides possuem marcao
CD14-/CD11c+/CD123-,
enquanto
as
plasmocitides
so
CD14-CD11c-/CD123+
(BALLESTRERO et al, 2008; PULENDRAN et al., 1999; SHORTMAN e LIU, 2002). Originalmente, as CDs deixam a medula ssea ainda numa forma imatura, denominadas CDs imaturas (iCD), que se caracterizam pela grande capacidade de capturar e processar antgenos, todavia, possuem pequena habilidade em estimular linfcitos T. Clulas dendrticas imaturas apresentam pouca ou nenhuma expresso de molculas co-estimulatrias como CD40, CD80 e CD86 alm de no produzirem IL-12 suficiente para a proliferao de linfcitos T (KELLEHER e KNIGHT, 1998; SCHWARTZ, 1990). Formas imaturas de CDs tm propriedades tolerognicas e esto localizadas na maioria dos tecidos perifricos. Diferentes modelos tm sido propostos para explicar os mecanismos pelos quais as CDs so capazes de induzir e manter tolerncia imunolgica, sendo eles: CD imaturas agem como APCs tolerognicas, converso de clulas T virgens em clulas T regulatrias, liberao de citocinas imunossupressoras (IL-10), inibio da maturao da iCD por clulas T reguladoras, CDs tolerognicas mutadas geneticamente (MORELLI et al., 2001; STEINMAN et al., 2003). Aps a captura antignica nos locais de inflamao, as CDs passam por mudanas fenotpicas e funcionais, resultando em um estgio maduro. Estudos indicam que o processo de maturao das CDs est fortemente associado sua migrao dos tecidos perifricos para os rgos linfides de drenagem, sendo justificado por uma srie de eventos simultneos, tais como: a perda dos receptores endocticos e/ou fagocticos, o aumento da expresso de molculas co-estimulatrias como CD40, CD58, CD80 e CD86, e mudanas na sua morfologia, como o aumento da expresso de LAMP3 (protena de membrana 3 associada ao lisossomo) nos compartimentos lisossomais, alm da expresso aumentada de CHP classe I e II na superfcie, que so eventos necessrios para a apresentao eficiente de peptdeos e estimulao de clulas T (CELLA et al., 1997; JEFFORD et al., 2001).
1.4 Macrfagos
Os macrfagos pertencem ao sistema fagoctico mononuclear e fazem parte, principalmente, da primeira linha de defesa contra patgenos, podendo ser identificados pela presena do marcador de superfcie CD14 (WRIGHT et al., 1990). Atuam basicamente nos processos inflamatrios e no controle de clulas tumorais. So clulas com extensa
participao em eventos regulatrios, dentre eles a promoo ou inibio da inflamao, atuao no reparo e renovao dos tecidos, ao tumoricida e microbicida, alm de participarem na interao da resposta imune inata com a adquirida (KLIMP et al., 2002). Infiltrados de macrgafos so frequentemente observados nos tecidos neoplsicos, podendo destruir clulas tumorais atravs da produo dos intermedirios reativos do oxignio (ROIs) e do TNF-, quando ativados por diversos fatores, como os lipopolissacardeos (LPS) bacterianos, muramil peptdeo (MDP), cido ribonuclico (RNA) de filamento duplo e citocinas; dentre as quais se destacam o IFN-, o GM-CSF, e o fator estimulador de colnia de macrfago (M-CSF) (KLIMP et al., 2002). Alm disso, macrfagos so fagcitos profissionais e responsveis tambm pela fagocitose de clulas tumorais opsonizadas por anticorpos (SHI et al., 2003). Nas ltimas dcadas, o papel dos macrfagos no crescimento tumoral tem sido extensivamente estudado, embora os mecanismos que envolvem essas clulas na resposta imune contra os tumores permaneam intrigantes e contraditrios. No microambiente tumoral, os macrfagos podem secretar certas substncias que so capazes de estimular o crescimento neoplsico, dependendo do estgio e da natureza do tumor (KLIMP et al., 2002). Aps a migrao dessas clulas mononucleares para os stios neoplsicos, ocorrem mudanas nas suas propriedades tanto fenotpicas quanto genotpicas (SHURIN e SALTER, 2009). Em estudo conduzido por Chen e colaboradores (2005), revelou-se que mais de 50 genes foram diferentemente expressos em macrfagos associados aos tumores (TAMs), quando comparados aos controles, incluindo IL-6, IL-8 e MMP-9 (metaloproteinase - 9). Alm disso, em determinadas condies, os TAMs podem produzir menores quantidades de xido ntrico (NO) que os macrfagos presentes em tecidos normais, prejudicando sua atividade tumoricida (BASKIC et al., 2001). No microambiente tumoral, os TAMs podem liberar uma variedade de agentes txicos como o perxido de hidrognio (H2O2), proteases, substncias imunossupressoras, alm de diversos fatores de crescimento e citocinas (fator de crescimento endotelial - EGF, fator de crescimento endotelial vascular - VEGF, M-CSF, IL-1, IL-8) e, consequentemente, podem levar ao aumento da atividade mittica e criao de uma rede imunossupressora que promove o crescimento tumoral, invaso e neoangiognese (MANTOVANI et al., 1992; SHURIN e SALTER, 2009).
1.5 Clulas NK
As clulas NK foram descritas pela primeira vez em 1975, quando foi demonstrado que determinadas clulas possuam atividade citotxica contra ampla gama de clulas tumorais de forma espontnea, ou seja, sem necessidade de pr-condicionamento (JOSEPH e LEWIS, 2009; KIESSLING et al., 1975). Clulas NK podem ser identificadas pela presena dos marcadores de superfcie CD56 e CD16 e, tambm, pela ausncia do CD3, encontrado em todos os linfcitos T (COOPER et al., 2001). A origem das clulas NK ainda permanece desconhecida, contudo muitos estudos indicam que essas clulas so derivadas de precursores da medula ssea e no dependem do timo para seu desenvolvimento (CALIGIURI, 2008; YOON et al., 2007). Quando clulas NK so ativadas, elas exercem um papel central na imunovigilncia contra neoplasias, levando destruio da clula maligna e liberao de antgenos tumorais que, por sua vez, podem iniciar uma resposta imune adaptativa especfica (ZAMAI et al., 1998). Dentre os linfcitos, as clulas NK so as primeiras a responder ativao por IL-2, produzindo vasta gama de citocinas como IFN-, TNF-, TNF-, GM-CSF, IL-12 e IL-15. Clulas NK ainda possuem atividade citoltica para determinados alvos tumorais, mas no para todos; experimentos demonstram que clulas ativadas por IL-2, IL-12 e IL-18 possuem uma letalidade mais ampla (BIRON et al., 1999; FEHNIGER et al., 2003; LEHRNBECHER et al., 2008).
1.6 Linfcitos T citotxicos
Os linfcitos T so originados de precursores hematopoiticos da medula ssea, sendo que parte de sua maturao ocorre no timo. Os linfcitos T citotxicos possuem um marcador de membrana especfico, o CD8 e, devido a isso, podem ser conhecidos por clulas T CD8+. Outro marcador de membrana, presente em todos os linfcitos T, o CD3, componente essencial do receptor de membrana presente nessas clulas, o receptor de clula T (TCR). A molcula CD8 uma glicoprotena de membrana dimrica de 30 kDA, que pode ser constituda essencialmente por dois tipos de cadeias: e . Outra molcula de superfcie de
grande importncia para ativao dos linfcitos T CD8+ o CD25, cadeia do receptor da IL-2, que pode estar presente em linfcitos e clulas NK e possui papel determinante na diferenciao e proliferao de clulas T CD8+, alm de permitir a identificao dos linfcitos T reguladores (Tregs) (AROSA e CARDOSO, 2007; YU e FU, 2006). O principal mecanismo de eliminao das clulas tumorais depende da ao de linfcitos T citotxicos que reconhecem antgenos apresentados pelo CHP classe I. A ativao dessas clulas citotxicas condiciona a sua diferenciao em clulas com funes imunomoduladoras, indutoras ou supressoras da resposta imune (LIN et al., 2008). Os linfcitos T infiltrantes do tumor (TILs) tm sido reconhecidos em inmeros tumores e so alvos de pesquisas e debates. Estudos realizados em pacientes com melanoma, cncer de ovrio e clon, evidenciaram que a presena dos TILs so muito frequentes e geram achados clnicos favorveis (LIAKOU et al., 2007). J em estudo conduzido por Usubtn e colaboradores (1998), com cncer de clulas renais, a presena de linfcitos ou macrfagos intratumorais no teve valor prognstico. Alm dos efeitos citotxicos diretos, os TILs podem alterar o microambiente tumoral pela secreo de citocinas como TNF-, IL-4 e IL-10, favorecendo a proliferao e neoangiognese tumoral (BLANKENSTEIN, 2005). Em estudo conduzido por Maluf e colaboradores (2008), observou-se elevada presena dos TILs CD3+ em amostras de NIC III relacionados com recorrncia da leso aps o tratamento definitivo com conizao. Foi concludo que a presena expressiva de CD3+ em leses recorrentes pode ser fator para pior prognstico da doena. Monnier-Benoit e colaboradores (2006) avaliaram a progresso tumoral de pacientes com NIC I, NIC III e cncer invasivo e observaram que, nos pacientes que evoluram para tumores invasivos, havia predomnio de linfcitos T CD8+ em relao aos T CD4+. Os autores sugeriram que a presena de clulas T CD4+ em fases iniciais asseguraria a presena precoce de clulas efetoras T CD8+, favorecendo a eliminao das clulas tumorais.
1.7 Imunoterapia do Cncer
A aplicao clnica de agentes imunoterpicos tem sido alvo de investigao no tratamento de neoplasias, devido percepo de que muitos antgenos tumorais so sensveis
ao de clulas imunes potencialmente funcionais. Nas ltimas dcadas, atravs de experimentos animais e, mais recentemente em humanos, notou-se a relevncia do sistema imune em reconhecer, processar e apresentar os antgenos tumorais desencadeando respostas antitumorais, embora o cncer seja capaz de impedir respostas eficientemente adequadas. Com o avano na investigao de alternativas teraputicas contra o cncer, foi possvel produzir vacinas baseadas em DNA, clulas dendrticas, clulas tumorais modificadas, protenas recombinantes, peptdeos sintticos, alm de vetores virais, bacterianos e vrus semelhantes a partculas (VLPs - do ingls, Virus-like particles) quimricos (FELTKAMP et al., 1993; PENG et al., 2004; TILLMAN et al., 2000). Vacinas de clulas dendrticas podem ser a melhor maneira para induo de respostas em clulas T citotxicas, pois antgenos codificados so sintetizados no citoplasma e entram na via de apresentao antignica do CHP classe I, explorando as enormes capacidades dessas clulas para a estimulao do sistema imune (BANCHEREAU e STEINMAN, 1998; TILLMAN et al., 2000).
1.7.1 Vacina baseada em Clulas Dendrticas
Atravs do potencial imunognico que as CDs proporcionam, alguns estudos tm sido desenvolvidos a fim de elaborar uma vacina a partir dessas clulas amadurecidas in vitro, pulsadas com antgenos tumorais para pacientes com neoplasias. Atravs dessa nova interveno teraputica, o sistema imune estimulado a uma resposta especfica, alm de discriminar com muita exatido seus alvos, tornando os mecanismos de ataque altamente precisos para os tecidos neoplsicos. Outra vantagem que a vacina contra o cncer pode provocar menos efeitos colaterais, pois no leva imunossupresso, como os quimioterpicos ou radioterpicos (HUNG et al., 2007). O isolamento das DCs in vitro, embora possvel, trabalhoso e pouco eficiente. Contudo, foi descrita a possibilidade de induzir, em cultura, a diferenciao de outros tipos celulares em clulas dendrticas. Dentre esses tipos precursores est o moncito, uma clula facilmente obtida do sangue perifrico e que d origem a clulas morfolgica e funcionalmente equivalentes s dendrticas (COOLS et al., 2007).
Ao longo dos anos, o cncer foi, principalmente, tratado por intervenes cirrgicas, quimioterapia e radioterapia, com fortes impactos citotxicos tanto para as clulas tumorais como para clulas normais, podendo acarretar efeitos adversos severos e, alm disso, muitas vezes no impedir a progresso da doena e o surgimento de metstases (BAXEVANIS et al., 2009). Contudo, o desenvolvimento de vacinas enfrenta grandes obstculos. Qualquer cncer, ao se desenvolver pode ser submetido a mecanismos de seleo imunolgica, que culminam no estabelecimento de um equilbrio entre a doena e o sistema imune. O rompimento desse equilbrio, imprescindvel para o estabelecimento de uma resposta contra o tumor no paciente, torna-se objetivo difcil de ser alcanado, pois a compreenso dos mecanismos que circundam o sistema imune e o cncer ainda esto longe de serem totalmente elucidados. O nmero de casos de cncer tem aumentado de maneira considervel em todo o mundo, configurando-se, na atualidade, como um dos mais importantes problemas de sade pblica mundial. Diante desse cenrio, justifica-se a necessidade do desenvolvimento de aes abrangentes para o controle do cncer, especialmente no que tange ao tratamento da doena j instalada. Tendo em vista que o sistema imune potencialmente capaz de controlar e orquestrar uma resposta antitumoral atravs do reconhecimento das clulas mutadas por clulas dendrticas, a disponibilizao de um ambiente favorvel para a elaborao de uma vacina teraputica in vitro a proposta maior deste estudo a fim de aumentar a perspectiva de vida de pacientes com cncer, inclusive nos estgios mais avanados. Para tanto, a relevncia dessa pesquisa fundamenta-se em compreender a interao entre clulas do sistema imune inato e adaptativo durante a imunoterapia com clulas dendrticas para pacientes oncolgicos, para que possamos aumentar a expectativa de vida dos pacientes, com o objetivo de prevenir a progresso neoplsica e estimular a sua regresso.
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar a resposta imune sistmica em pacientes com cncer avanado, submetidos imunoterapia com clulas dendrticas.
2.2 Objetivos Especficos Analisar por citometria de fluxo a resposta imune inata e adquirida, atravs da avaliao dos macrfagos, clulas NK e linfcitos T citotxicos, em pacientes oncolgicos antes e durante a imunoterapia com clulas dendrticas. Avaliar o comportamento e ativao dessas clulas por meio de marcaes extracelulares (CD14, CD56, CD8 e CD25) e marcaes de citocinas intracelulares (IL-2, IFN- e IL-12).
3 MATERIAIS E MTODOS
3.1 Casustica
O projeto destinado imunoterapia com clulas dendrticas em pacientes foi aprovado pelo Comit de tica e Pesquisa da UFTM, sob o no 683-2006/CEP (ANEXO A). Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento livre aps esclarecimento (ANEXO B). Essa linha de pesquisa encontra-se financiada pela FAPEMIG e CNPq. Neste projeto, realizamos a avaliao imunolgica em humanos antes e durante toda a terapia. Foram estudados oito pacientes (Tabela 2), previamente selecionados no Instituto de Pesquisa em Oncologia (IPON) da Universidade Federal do Triangulo Mineiro (UFTM), no perodo de junho de 2008 a julho de 2010.
Tabela 2: Descrio do grupo estudado. Pacientes 1 2 3 4 5 6 7 8 Idade (anos) 76 77 48 17 66 39 80 27 Sexo* f f f m f f f f Tipo de Tumor Cncer de vagina Melanoma de vagina Cncer de vagina Neurofibromatose Cncer de mama Cncer de colo uterino Cncer de mama Cncer de mama Estadio (TNM)* IIIB (T3N1M0) IIC (T4NxMx) 0 (tumor in situ) benigno IV (T4dN2M1) IVB (T2bN0M1) IIIC (T4dN3Mx) IV (T2N1M1) Perodo de Tratamento 07/07/08 - jul/10 04/05/09 - jul/10 22/05/09 - jul/10 23/02/10 - jul/10 27/08/09 - 18/11/09 27/06/08 - 26/08/08 25/06/08 - 22/10/08 17/08/09 - 08/09/09
*Notas: TNM = classificao do estadio tumoral, onde T refere-se ao tamanho, N ao acometimento linfonodal e M presena de metstases distncia. Sexo = m (masculino) e f (feminino).
3.1.1 Critrios de Incluso
Pacientes com tumores slidos passveis de bipsia. Pacientes em qualquer idade ou sexo.
3.1.2 Critrios de Excluso
Pacientes com doenas imunossupressoras, exceo do cncer, como SIDA (Sndrome da Imunodeficincia Adquirida) e doenas auto-imunes severas. Pacientes que fazem qualquer outra terapia adicional seja ela a quimioterapia, radioterapia, ou at o uso de drogas antitumorais. Pacientes com menos de dois meses de trmino por quimioterapia ou radioterapia.
3.2 Preparao da Vacina de Clulas Dendrticas Autlogas
Para a obteno da vacina de clulas dendrticas autlogas dos pacientes, foi coletado 20 mL de sangue perifrico em heparina e as clulas foram separadas em gradiente de FICOLL para obteno de clulas mononucleares. Aps a separao, as mesmas foram mantidas em cultura in vitro, 370C e 5% CO2, durante sete dias em meio RPMI enriquecido com GM-CSF e IL-4 para diferenciao em clulas dendrticas. Para a obteno dos antgenos, foi realizado o procedimento de lisado das clulas tumorais, atravs do congelamento da bipsia em nitrognio lquido seguido por descongelamento, lisando assim, as clulas tumorais e, por conseguinte, liberando os antgenos. As clulas diferenciadas foram colocadas em contato com os antgenos tumorais, obtidos de cada paciente e submetidas eletroporao. A infuso das clulas dendrticas amadurecidas in vitro com os antgenos tumorais foi realizada por via subcutnea.
3.3 Anlise Celular por Citometria de Fluxo
As clulas totais do sangue perifrico foram coletadas uma vez antes de iniciar a terapia com clulas dendrticas (anlise pr-terpica) e uma vez a cada injeo da vacina imunoterpica, para que fosse possvel acompanhar a evoluo da terapia em cada paciente. A
cada anlise, foram coletados dois tubos de sangue total com anticoagulante EDTA (cido etileno tetra-actico), equivalente a aproximadamente 10 mL, por paciente. Para a obteno dos leuccitos, o sangue colhido foi transferido para tubos cnicos de 50 mL, adicionando-se uma soluo de lise (BD Biosciences - FACSTM Lysing Solution) na proporo 1:20 mL. Aps incubao temperatura ambiente por 20 minutos, o material foi centrifugado por 10 minutos, temperatura de 4C, em uma rotao de 1200g. Aps a centrifugao, desprezou-se o sobrenadante cuidadosamente, conservando o precipitado de clulas. O excesso da soluo de lise foi removido por centrifugao lavando-se as clulas por 3 vezes com 30ml de PBS (soluo salina tamponada com fosfato) em cada lavagem, a 4C e a velocidade de 1200g por 10 minutos. Adicionou-se 1 mL de PBS no precipitado de clulas, acrescentando 2 uL da protena transportadora inibitria (BD GolgistopTM) para cada 3 mL de sangue inicialmente colhidos em EDTA. Incubou-se por, no mnimo, 20 minutos a 4C e, posteriormente, as clulas foram lavadas por centrifugao com 30 mL PBS para retirar o excesso de protena. Aps a centrifugao, foi retirado o sobrenadante preservando-se apenas o precipitado e ento, as clulas foram ressuspendidas em 1 mL de PBS. Em seguida, a quantidade de clulas obtidas foi determinada por contagem em cmara de Neubauer. A suspenso de clulas foi transferida para tubos de ensaio sendo, primeiramente, realizada a marcao extracelular. Dois tubos foram destinados aos isotipos controles, trs para a marcao de macrfagos, trs para clulas NK e dois para linfcitos T citotxicos (Tabela 3). Os anticorpos utilizados para a marcao de membrana (extracelular) dos isotipos controles foram: -IgG1 PE BD (PE - Phycoerythrin), -IgG2a PE BD e -IgG1 FITC BD (FITC - Fluorescein Conjugate). Para a marcao de membrana dos macrfagos utilizou-se o anticorpo -CD14 PE BD, para as clulas NK o anticorpo -CD56 PE BD e para os linfcitos T citotxicos o -CD8 PE BD. Alm desses, foi tambm utilizado o anticorpo -CD25 FITC BD para a marcao de membrana das clulas NK e linfcitos T citotxicos. Aps a primeira marcao, as clulas eram incubadas a 4C por 30 minutos, no escuro. Em seguida, foi feita a lavagem das clulas com PBS para a remoo do excesso de anticorpos. Posteriormente, as clulas foram incubadas
TM
com
soluo
de
permeabilizao
fixao
(BD
Cytofix/Cytoperm intracelular.
), a 4C por 20 minutos, no escuro; para que fosse possvel a marcao
Para essa marcao, os anticorpos utilizados para os isotipos controles foram o -IgG1 FITC BD e -IgG1 PE BD. Para os macrfagos utilizaram-se os anticorpos -IFN- FITC BD, - TNF- FITC BD e -IL-12/23 FITC BD; para clulas NK o -IL-2 FITC BD e -IL12/23 FITC BD; e para linfcitos T citotxicos o anticorpo -IL-2 FITC BD. Aps a marcao intracelular, as clulas eram novamente incubadas a 4C por 30 minutos, no escuro; e lavadas em soluo tampo (BD Perm/WashTM Buffer) para a remoo do excesso de marcadores. Finalmente, as clulas eram ressuspendidas em 500 uL de PBS para a leitura no citmetro BD FACSCalibur (ANEXO C).
Tabela 3: Marcaes intra e extracelulares. Tubos 1 2 3 Linfcito T CD8 4 5 6 7 8 9 10 Clula NK Macrfago -CD8 PE -CD14PE -CD14 PE -CD14 PE -CD56 PE -CD56 PE -CD56 PE+ -CD25 FITC -IL-2 FITC -IFN- FITC -TNF- FITC -IL-12/23 FITC -IL-2 FITC -IL-12/23 FITC ISO1 ISO2 ISO2 ISO2 ISO1 ISO1 ISO1 Descrio Isotipo 1 Isotipo 2 Marcao Extracelular -IgG1 PE -IgG2a PE -CD8 PE + -CD25 FITC Marcao Intracelular -IgG1 FITC -IgG1 FITC Isotipo Controle ISO1
3.4 Anlise dos Resultados
Os pacientes foram analisados por duas formas diferentes: de maneira individual e agrupada, sendo essa, utilizada para o emprego da estatstica. Para a anlise individual, os pacientes foram avaliados por grficos lineares para cada marcador utilizado, submetendo-os a linhas de tendncias.
Para a anlise estatstica, os oito pacientes foram agrupados e o comportamento das clulas do sistema imune, de uma maneira geral, foi analisado antes e durante a imunoterapia com CDs. Como a distribuio dos dados no era pareada e havia perda de seguimento, uma anlise de natureza no paramtrica foi empregada utilizando-se o software GraphPad Prism 5.03. Os dados foram analisados pelo teste estatstico de Kruskal-wallis. Em todas as anlises, as diferenas foram consideradas significativas quando p0,05. Os pacientes foram analisados antes de iniciar a imunoterapia com CDs, denominado como anlise da pr-terapia. As anlises seguintes foram realizadas no dia de cada aplicao da vacina, sendo que o sangue foi colhido antes da vacinao, e cada anlise celular era destinada a terapia que se precedia, nomeadas por anlises ps-terapia 1, 2, 3, e assim por diante, ou apenas por algarismos, como demonstrado nos grficos a seguir. Os pacientes que permaneceram no grupo de estudo por um perodo de tempo mais prolongado, a anlise celular do sistema imune se manteve a cada duas aplicaes subsequentes, de acordo com a descrio da tabela 4.
Tabela 4: Critrios utilizados para anlise celular dos pacientes. Pacientes NO de vacinas NO de anlises celulares Incio da anlise celular a cada duas vacinas 1 33 26 A partir da 17 vacina 2 28 21 A partir da 12 vacina 3 26 19 A partir da 10 vacina 4 11 12 5 4 5 6 3 4 7 3 4 8 2 3 -
Os valores em todos os grficos seguintes so expressos de acordo com a porcentagem de fluorescncia da dupla marcao avaliada (eixo y) pelo seguimento das anlises celulares (eixo x), sendo que as escalas podem variar, porque a expresso das clulas do sistema imune relativamente instvel. No intuito de facilitar a compreenso do comportamento dessas clulas, linhas tendenciais (polinmios) foram traadas e, principalmente atravs dessas tendncias que as anlises seguintes sero descritas.
4 RESULTADOS 4.4.1 Anlise dos Macrfagos
Os grficos foram representados para cada paciente de acordo com os marcadores avaliados para os macrfagos, incluindo o marcador de membrana CD14 para este tipo celular e os marcadores intracelulares para anlise das citocinas secretadas por essas clulas como o IFN-, o TNF- e a IL-12.
Grfico 1: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD14 com o IFN-, com o TNF- e com a IL-12 no paciente 1.
Os nveis de expresso dos marcadores CD14 com IFN-, representado em azul nos grficos, nos pacientes 1, 2, 3, 4, 6 e 7 iniciam-se entre 10 e 80%, tendem e elevar-se aps as primeiras vacinas com CDs, seguidos por uma tendncia de diminuio de expresso at o final das anlises. Nos pacientes 1 e 2, que receberam uma maior quantidade de vacinas, essa reduo foi mais expressiva entre a sexta e nona anlise celular. Os pacientes 5 e 8 comearam o tratamento com expresses celulares variando de 30 a 70%, adotando um comportamento semelhante aps a imunoterapia: inicialmente houve uma diminuio da porcentagem de expresso dos marcadores analisados, mas seguiu-se uma tendncia ao aumento. Com relao anlise da dupla marcao, CD14 com TNF-, representado em vermelho nos grficos, os pacientes 1, 2 e 3 iniciaram uma expresso celular entre 0 e 45%, que aps as primeiras vacinas com CDs, foi observado um aumento dos nveis de expresso nos trs pacientes, contudo, entre a terceira e oitava anlises celulares, a tendncia foi de diminuio. Os pacientes 4, 5 e 8 mantiveram os nveis de expresso entre 0 e 10% do incio ao final das anlises. O paciente 6 comeou a imunoterapia com aproximadamente 15% de expresso desse tipo celular, acompanhada por uma tendncia de diminuio at a segunda anlise, seguido por um aumento. O paciente 7 iniciou a terapia com uma elevada expresso
desses marcadores, por volta de 50%, com tendncia ao aumento aps a primeira vacina e evidente decrscimo at o final das anlises. A avaliao dos macrfagos atravs da dupla marcao do CD14 com a IL-12, representada em verde nos grficos, demonstra que, nos pacientes 1, 2, 3, 4, 5 e 8, a anlise da expresso dessas clulas, pelas linhas de tendncia, manteve-se entre 0 e 20%, sendo que nos pacientes 1 e 2 observou-se picos de estimulao aps o incio do tratamento seguidos por diminuio entre a quarta e oitava anlises celulares. Os demais pacientes referidos se mantiveram com baixas expresses, sem oscilaes relevantes. O paciente 6 iniciou a imunoterapia com nveis de expresso dos marcadores em torno de 35%, porm houve uma tendncia de diminuio at o final das anlises. De maneira peculiar, o paciente 7 praticamente no apresentou expresso desse tipo celular na anlise da pr-terapia; aps a primeira vacina com CDs os nveis dos marcadores aumentaram sensivelmente, contudo, houve uma tendncia a diminuio nas anlises seguintes. 4.4.2 Anlise das Clulas NK
A anlise das populaes de clulas NK foi realizada pela marcao das molculas de superfcie CD56, especfica para esse tipo celular, e CD25, cadeia do receptor da IL-2. Sua atividade foi acompanhada pela anlise das citocinas expressas por essas clulas, a IL-2 e IL12.
Grfico 9: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD56 com IL-2, com IL-12 e com CD25 no paciente 1.
Ao analisar a dupla marcao do CD56 com a IL-2, os pacientes 1, 2, 6, 7 e 8 iniciaram a imunoterapia com CDs expressando baixos nveis desses marcadores, prximos a 2,5%, evidenciando aumento aps as primeiras vacinas, porm, seguido por um decrscimo dos nveis de expresso. Nos pacientes 1 e 2, que se mantiveram em tratamento por um perodo mais prolongado, observou-se que essa reduo ocorreu apenas entre a stima e dcima anlise celular. Os pacientes 3 e 5 demonstraram uma anlise inicial em torno de 2%, com tendncia a diminuio aps a terapia, no entanto, nas ltimas anlises, tendeu-se ao aumento. O paciente 4 comeou a imunoterapia com CDs expressando valores baixos dos marcadores, de 0 a 0,2%, e aps aplicaes da vacina observaram-se poucas oscilaes, sendo que a tendncia manteve-se baixa durante todas as anlises. Com relao s anlises celulares dos marcadores CD56 com IL-12, os pacientes 1, 2, 4 e 7 iniciaram o tratamento com baixos nveis de expresso, por volta de 0,5% e, a partir dos primeiros estmulos imunoteraputicos, observou-se aumento desses nveis, porm, seguidos por uma tendncia diminuio. Nos pacientes 1 e 2, essa reduo foi evidenciada por volta da oitava anlise; por outro lado, no paciente 4 observou-se, novamente, o aumento da porcentagem de expresso dessas clulas nas ltimas anlises. O paciente 3 comeou a imunoterapia com baixa expresso celular, aproximadamente 1,5%, manteve um perfil oscilatrio de expresso durante todo tratamento, com tendncia de diminuio at a nona anlise, acompanhada por aumento a partir de ento. O paciente 5 iniciou a terapia com praticamente nenhuma expresso celular, em torno de 0%, seguindo o mesmo perfil at o final das anlises. Os pacientes 6 e 8 obtiveram uma anlise da pr-terapia similar, prxima 0,5%, contudo, adotaram respostas antagnicas, enquanto o paciente 6 tendeu a aumentar os nveis de expresso aps a imunoterapia com CDs, o paciente 8 teve uma tendncia diminuio dos valores at o final das anlises. Ao analisar a dupla marcao da membrana celular atravs do CD56 com o CD25, evidenciou-se que os pacientes 1, 3 e 4, inicialmente, apresentavam pouca ou nenhuma expresso desse tipo celular, de 0 a 1,5%, e que, aps as primeiras vacinas com CDs, houve uma elevao desses nveis acompanhado de comportamentos oscilatrios com uma tendncia diminuio. Nos pacientes 1 e 3 essa reduo foi mais evidenciada por volta da dcima anlise celular. Com o paciente 4 houve uma tendncia inicial a aumentar a expresso at a sexta anlise diminuindo a partir dela. Os pacientes 5, 6 e 7 iniciaram a imunoterapia com pouca expresso dos marcadores avaliados, de 0 a 0,5%; aps o tratamento houve uma tendncia de aumento desses nveis at o final das anlises. J os paciente 2 e 8, do incio ao
final do tratamento, mantiveram uma tendncia de baixa expresso, entre 0 e 0,5%, sendo observado no paciente 2 um perfil oscilatrio ao longo das anlises celulares. 4.4.3 Anlise dos Linfcitos T citotxicos
Os linfcitos T citotxicos foram analisados similarmente aos macrfagos e clulas NK. Foram realizadas marcaes de molculas de superfcie CD8, que especfica para essa populao celular; e CD25, cadeia do receptor da IL-2. Alm disso, foi analisada a expresso da citocina IL-2.
Grfico 17: Anlise linear e tendencial (polinmio) do CD8 com IL-2 e com CD25 no paciente 1.
Ao analisar a dupla marcao para os linfcitos T citotxicos, atravs do CD8 e da IL2, comportamentos de expresso seguindo um mesmo padro foram evidenciados na maioria dos pacientes. Dentre eles, os pacientes 1, 2, 3, 4, 6 e 7, que iniciaram a imunoterapia com CDs expressando baixos nveis dos marcadores, de 0 a 8% e, aps as primeiras aplicaes da vacina, aumentaram substancialmente seus nveis de expresso, com comportamentos oscilatrios, seguidos por tendncias diminuio. Nos pacientes que apresentavam maiores quantidades de anlises celulares (1, 2, 3 e 4), essa reduo foi mais evidente por volta da dcima anlise. O paciente 5 comeou o tratamento com pouca expresso dos marcadores, entre 5 e 10%, mantendo-se com pequenas oscilaes e tendncia discreta diminuio. Em contrapartida, o paciente 8 iniciou a imunoterapia com elevada expresso da dupla marcao, em torno de 18%, e aps o tratamento apresentou severa diminuio dessa expresso. Em relao aos marcadores de membrana CD8 com CD25, observou-se que os pacientes 1, 3 e 8 iniciaram o tratamento expressando de 1 a 8% desses marcadores celulares, com tendncias a diminuio do incio ao final das anlises, sendo que os pacientes 1 e 3 adotaram perfis oscilatrios com picos de estimulao durante algumas anlises e essa reduo foi principalmente evidenciada nas ltimas anlises. Os pacientes 2, 6 e 7 possuam uma anlise inicial com pouca expresso, em torno de 2%, foram estimulados aps o incio da imunoterapia com CDs, contudo adotaram uma tendncia de diminuio at o final das
anlises. No paciente 2 essa reduo foi mais evidenciada aps a dcima primeira anlise. Os pacientes 4 e 5 apresentaram uma expresso celular de comportamento semelhante, com uma tendncia inicial de diminuio seguida por aumento, entretanto algumas particularidades devem ser consideradas, como a manuteno de um perfil oscilatrio no paciente 4 e acentuada reduo dos nveis celulares iniciais do paciente 5. 4.4.4 Anlise Estatstica dos Macrfagos
Os resultados da anlise estatstica foram expressos atravs de grficos lineares das medianas, incluindo-se barras de erros para os valores mximos e mnimos obtidos.
Grfico 25: Anlise linear das medianas, mximos e mnimos do CD14 com IFN- do grupo estudado, submetido estatstica pelo teste de Kruskal-wallis.
150
p=0,1158
% de Fluorescncia
100
CD14+IFN-
50
0 Pr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Anlises Celulares
Grfico 26: Anlise linear das medianas, mximos e mnimos do CD14 com TNF- do grupo estudado, submetido estatstica pelo teste de Kruskal-wallis.
p=0,0465
80
% de Fluorescncia
60
40
CD14+TNF-
20
0 Pr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Anlises Celulares
Grfico 27: Anlise linear das medianas, mximos e mnimos do CD14 com IL-12 do grupo estudado, submetido estatstica pelo teste de Kruskal-wallis.
p=0,3480
80
% de Fluorescncia
60
40
CD14+IL-12
20
0 Pr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Anlises Celulares
O grfico 25, que analisa os macrfagos expressando IFN-, demonstrou oscilao apresentando picos de estimulao na quarta, sexta e dcima terceira anlises. A partir de ento, assumiu uma tendncia ao declnio, com o p=0,1158. O grfico 26, que representa a expresso de TNF- pelos macrfagos, evidenciou uma estimulao significativa aps o incio da imunoterapia com CDs, no entanto, a partir da segunda anlise tendeu a diminuir, com o p=0,0465. Ao analisar o grfico 27, que avalia a expresso da IL-12 nos macrfagos, no foram observadas alteraes significativas do incio ao final das anlises, sendo o p=0,3480.
4.4.5 Anlise Estatstica das Clulas NK
15
p=0,0741
% de Fluorescncia
10
CD56+IL-2
5
0 Pr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Anlises Celulares
p=0,8839
5
% de Fluorescncia
CD56+IL-12
2
0 Pr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Anlises Celulares
Grfico 30: Anlise linear das medianas, mximos e mnimos do CD56 com CD25 do grupo estudado, submetido estatstica pelo teste de Kruskal-wallis.
p=0,3272
% de Fluorescncia
CD56+CD25
0 Pr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Anlises Celulares
O grfico 28, que avalia a expresso da IL-2 pelas clulas NK no grupo estudado, demonstra que houve aumento da expresso dos marcadores analisados aps as primeiras vacinas com CDs, embora exista uma tendncia de diminuio principalmente observada a partir da sexta anlise celular, com o p=0,0741. Ao analisar a expresso da IL-12 pelas clulas NK, demonstrado no grfico 29, houve um comportamento oscilatrio dessa populao celular durante todo o seguimento dos pacientes, sendo o p=0,8839. De maneira similar, no grfico 30 que analisa as clulas NK com o CD25, aps a imunoterapia com CDs, os pacientes no apresentaram variaes importantes pela anlise da mediana, ocorreu baixa expresso celular e algumas oscilaes do incio ao final da terapia, com o p=0,3272. 4.4.6 Anlise Estatstica dos Linfcitos T citotxicos
p=0,0445
20
% de Fluorescncia
15
10
CD8+IL-2
0 Pr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Anlises Celulares
Grfico 32: Anlise linear das medianas, mximos e mnimos do CD8 com CD25 do grupo estudado, submetido estatstica pelo teste de Kruskal-wallis.
p=0,4123
8
% de Fluorescncia
CD8+CD25
0 Pr 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25
Anlises Celulares
O grfico 31, que avalia a expresso da IL-2 pelos linfcitos T citotxicos, evidenciou um aumento significativo dessa populao celular aps a imunoterapia com CDs, todavia, aps a dcima anlise houve uma tendncia diminuio, com o p=0,0445. Com relao ao CD25, analisado nessas clulas (grfico 32), foi observado um estmulo ao aumento aps a terapia, porm, com um perfil muito oscilatrio, sendo o p=0,4123.
5 DISCUSSO
Sabe-se que a resposta imune controlada por fatores genticos e, assim sendo, possui caractersticas e peculiaridades prprias para cada indivduo. Inicialmente, realizamos uma anlise individual de cada paciente acompanhando-os por um longo perodo, uma vez que a imunidade adota comportamentos variados em cada pessoa. Foram estudados oito pacientes com cncer avanado seguidos ininterruptamente. Alm disso, uma anlise geral foi importante para simular o desempenho da vacina com clulas dendrticas frente a mecanismos complexos e versteis de que os tumores dispem para o escape imunolgico. Um aspecto comumente observado foi a maneira inconstante em que o sistema imune se comportou nos pacientes, nos quais as concentraes de clulas e citocinas apresentaram mesmo perfil de instabilidade. Para tanto, diversos fatores podem influenciar no comportamento de clulas e mediadores da resposta imune, como os estados de inflamao (gripes, resfriados, ou qualquer doena inflamatria), o prprio tipo tumoral, estados de estresse, depresso, dentre uma ampla gama de fatores associados estimulao da imunidade. Logo, esse tipo de anlise muito sensvel e valores oscilatrios so comumente observados. As clulas dendrticas so reconhecidas como potentes adjuvantes naturais, sendo consideradas clulas apresentadoras de antgenos profissionais capazes de mediar respostas em linfcitos T, desencadeando uma resposta imune especfica contra uma variedade de antgenos. Nos ltimos anos, devido ao potencial imunognico que essas clulas possuem, a imunoterapia com clulas dendrticas contra antgenos tumorais tem sido alvo de pesquisas, e os seus efeitos na imunidade do hospedeiro a pea chave para o desenvolvimento do presente trabalho. A resposta imune sistmica foi avaliada, por citometria de fluxo, atravs das principais clulas da imunidade inata que possuem atividade antitumoral, os macrfagos e clulas NK, e pela clula que possui papel central na imunidade adquirida contra os tumores, os linfcitos T citotxicos. Nossos resultados demonstram uma estimulao da resposta imune com aumento dessas populaes celulares expressando citocinas do perfil Th1, aps o incio da imunoterapia com clulas dendrticas autlogas pulsadas com antgenos tumorais especficos e aplicadas por via subcutnea em um intervalo mdio de 15 dias.
As vacinaes com CDs autlogas foram bem toleradas sem efeitos colaterais considerveis. Embora, uma das pacientes em tratamento por melanoma maligno metasttico de vagina (Paciente 2), que j apresentava a doena auto-imune de Vitiligo, teve um agravamento aps a imunoterapia com CDs, contudo, sabe-se que pode ocorrer resposta autoimune contra melancitos durante o tratamento antimelanoma (ROSENBERG e WHITE, 1996). Em estudo conduzido por Van Furth e Cohn (1968), caracterizou-se a morfologia e propriedades cinticas e funcionais dos macrfagos, atravs do isolamento in situ dessas linhagens celulares presentes na cavidade peritoneal, fgado e pulmo de camundongos. Atravs desse estudo foi determinado que populaes de macrfagos so renovadas mesmo nos estados estacionrios, caracterstica de essencial importncia conhecida por plasticidade. Essa propriedade das clulas mononucleares, em resposta a estmulos externos, torna-as fenotipicamente diferentes, ora moncitos, ora macrfagos, ou mesmo clulas dendrticas, desempenhando funes especficas nos diversos tecidos e estados de inflamao (BISWAS e MANTOVANI, 2010; GEISSMANN et al., 2010). A orquestrao da funo das clulas mononucleares um elemento chave que liga a inflamao e o cncer e oferece um paradigma para a plasticidade e a funo dos macrfagos. Uma das funes dos macrfagos, no microambiente tumoral, fornecer um mecanismo de defesa contra as clulas cancerosas, onde so capazes de reconhecer e destruir tais clulas, atravs da ligao especfica por receptores presentes na membrana (BISWAS e MANTOVANI, 2010; UTSUGI et al., 1991). Estudos tm demonstrado que a quantidade de fosfatidilserina na membrana externa das clulas tumorais e no tumorais um dos fatores responsveis pelo reconhecimento especfico da clula tumoral (ELNEMR et al., 2000; UTSUGI et al., 1991). Westenfelder e colaboradores (1993) demonstraram a importncia da estrutura de carboidratos para ativao de moncitos, indicando que a glicosilao alterada pelas clulas tumorais pode ser responsvel pela induo de uma resposta antitumoral. A destruio de clulas tumorais envolvendo os macrfagos pode ocorrer por dois mecanismos distintos. O primeiro conhecido por citotoxicidade tumoral mediada por macrfagos e o segundo, citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Na citotoxicidade mediada por macrfagos, molculas de adeso como o ICAM-1 (molcula de adeso intercelular-1) so essencialmente importantes na interao entre as clulas tumorais e os macrfagos (JONJIC et al., 1992; WEBB et al., 1991). Na ADCC, a presena de
anticorpos para o reconhecimento antignico necessrio. Em ambos os processos haver liberao de mediadores citotxicos, incluindo TNF-, IL-1, NO e intermedirios do oxignio reativo (QI et al., 1995; SHAW et al., 1978). Em 1986, Mosmann e colaboradores realizaram um estudo observando que clones de clulas T CD4+ poderiam ser divididas em duas classes, Th1 e Th2, dependendo do perfil de citocinas produzido por essas clulas. Por sua vez, clulas secretoras de IFN-aumentam a capacidade tumoricida dos macrfagos, pela liberao de substncias citotxicas, como o NO e IL-1 (BOEHM et al., 1997; DILEEPAN et al., 1995). Mais recentemente, foi tambm descoberta uma diversidade de perfis de citocinas que modulam a resposta imune durante os processos de inflamao como: Treg, Th17, Th22 e Th9 (AWASTHI e KUCHROO, 2009; EYERICH et al., 2009; VELDHOEN et al., 2008). No presente estudo, analisamos populaes de macrfagos expressando IFN-, TNF- e IL-12 em pacientes com cncer avanado tratados com imunoterapia baseada em clulas dendrticas e verificamos que houve estmulo ao aumento nas trs populaes avaliadas, embora a expresso da IL-12 tenha sofrido pouca influncia na anlise agrupada. A produo de IFN- pelos macrfagos foi descrita, pela primeira vez, h mais de 30 anos por Neumann e Sorg, ao observarem que determinadas populaes dessas clulas poderiam ser induzidas a produzir interferon, dependendo do seu estado de diferenciao (NEUMANN e SORG, 1977). Entretanto, pouco se conhece a respeito da produo de IFNpelos macrfagos em resposta imunoterapia com clulas dendrticas. Nossos achados, embora no tenham sido significantes, podem contribuir para futuras investigaes, visto que pouco do assunto tem sido publicado na literatura mundial. Com relao expresso intracelular de TNF- nos macrfagos, nossos resultados foram estatisticamente significantes (p0,05), evidenciando um aumento expressivo durante as primeiras anlises celulares aps a imunoterapia com CDs. Nossos resultados indicam que essas clulas so estimuladas e podem participar, atravs da imunidade inata, do processo de induo e manuteno de respostas antitumorais. O TNF- produzido por macrfagos, induz apoptose de clulas tumorais atravs da gerao de intermedirios reativos do oxignio, induo da expresso de iNOS (xido ntrico sintetase induzvel), quebra de DNA e induo de atividade proteoltica. Sob certas circunstncias, o TNF- exerce efeitos citotxicos no endotlio vascular e modula propriedades endoteliais pr-coagulantes. Estudos envolvidos em imunoterapia celular adotiva com moncitos/macrfagos demonstraram respostas biolgicas
relacionados elevao de TNF- no lquido peritoneal, porm observou-se pouco resultado quanto regresso tumoral (ANDREESEN et al., 1990; HENNEMANN et al., 1995). A IL-12 uma citocina de especial importncia, pois regula a resposta imune inata e determina o tipo e a durao da resposta imune adquirida. produzida principalmente, em resposta a estmulos de moncitos, macrfagos e clulas dendrticas. Uma das suas principais aes a induo de outras citocinas, especialmente o IFN-, que coordena a imunidade. Inicialmente, a IL-12 age nas clulas NK e clulas T, amplificando a resposta imune inata e, posteriormente, junto a IL-18, age de maneira sinrgica aumentando a atividade citoltica e potencializando a imunidade nessas clulas (LAUWERYS et al., 1999; MICALLEF et al., 1996; ROBINSON et al., 1997). As clulas NK possuem importante papel na induo de respostas antitumorais e potencializam atividades nas clulas dendrticas atravs da liberao de citocinas prinflamatrias, como o IFN- e a IL-12 (FERNANDEZ et al., 1999). De maneira recproca, CDs so capazes de estimular clulas NK pela liberao de IL-12, IL-15 e IL-18 que participam na proliferao, ativao e manuteno das clulas NK, contribuindo ainda mais para a atividade antitumoral nessas clulas (SANCHEZ et al, 2010). Avaliamos a expresso das citocinas IL-12, IL-2 e a cadeia do seu receptor, o CD25, nas clulas NK, e verificamos que houve aumento desses marcadores aps as primeiras vacinas com CDs. Nossos achados sugerem que a imunoterapia com CDs tem a capacidade de induzir respostas imunes efetoras em clulas NK, com a estimulao de um perfil de resposta Th1 aps o incio da imunoterapia. Apesar de no se ter analisado linfcitos T CD4+ nesse estudo, que so consideradas as principais clulas secretoras de citocinas, estudos prvios realizados com o mesmo grupo de pesquisa confirmam a manuteno do perfil de resposta Th1, aps a vacina de CDs. A IL-2 possui relevante papel na conduo da proliferao celular e protege as clulas imunes da morte pela induo de mecanismos anti-apoptticos. Por sua vez, o receptor para a IL-2 essencial para a manuteno da apresentao antignica, podendo influenciar na transduo do sinal atravs da qualidade, fora e tempo da sinalizao (ELLERY e NICHOLLS, 2002; KIM et al., 2006). Dao e colaboradores (2005) realizaram um estudo experimental in vitro, utilizando o linfoma de clulas B humano como modelo, em que a apresentao cruzada dos antgenos dessas clulas pelas CDs requer auxlio de clulas NK. Segundo os autores, na cultura de
clulas NK adicionadas a linfcitos T citotxicos e CDs sensibilizadas com antgenos, houve aumento de IL-18 e diminuio de IL-12 e IL-15, justificando que a efetiva apresentao cruzada exige mais ativao de CDs por clulas NK e uma abundante produo de IL-18 que, juntamente com mecanismos ainda indefinidos, contribuem para a gerao de linfcitos T citotxicos responsivos aos linfomas de clulas B. Suminoe e colaboradores (2009) conduziram um estudo que avaliou a atividade citotxica das clulas NK e o potencial de ativao dos linfcitos T CD8+, antes e durante a administrao de clulas dendrticas pulsadas com peptdeos tumorais especficos e combinadas com a protena imunognica KLH (do ingls - keyhole limpet hemocyanin), em cinco crianas com tumores slidos refratrios. A atividade citotxica das clulas NK foi determinada pelo ensaio padro K562 com marcao celular
51
Cr e, segundo essa avaliao,
trs dos cinco pacientes tiveram um aumento da atividade citotxica das clulas NK aps a imunoterapia com CDs, sendo que dois desses pacientes apresentaram uma citotoxicidade duradoura (12 17 meses). O potencial de resposta das clulas T CD8+ foi determinado pela anlise de linfcitos do sangue perifrico, duplamente marcados com anticorpos CD8+ IFN- e CD8+ HLA-DR+ para avaliao das clulas por citometria de fluxo. Dois dos cinco pacientes obtiveram aumento desses tipos celulares e, alm disso, apresentaram um efeito imunossupressor tumoral mais evidente. Segundo os autores, importante uma ativao recproca entre as clulas NK e as CDs para que seja possvel uma amplificao da resposta imune antitumoral. Em experimento conduzido por Borg e colaboradores (2004), investigou-se o papel da IL-12 sobre as clulas dendrticas estimuladas por IFN-produzido pelas clulas NK, em sistemas in vitro animais (camundongos) e humanos. Para tanto, inicialmente clulas mononucleares do sangue perifrico foram mantidas em cultura e amadurecidas, dando origem s CDs que, por sua vez, foram ativadas com LPS. Posteriormente, foi realizado a cocultura de clulas NK com CDs, para os dois sistemas estudados, e o sobrenadante foi colhido aps 24 horas. Nesse material, foram realizadas as dosagens de IL-12 e IFN-por Ensaio Imunoenzimtico (ELISA - do ingls, Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) e, foi observado que CDs maduras podem estimular as clulas NK a secretar IFN- e esse estmulo dependente de IL-12. Assim sendo, o estmulo secreo do IFN- pelas clulas NK pode levar a polarizao da resposta Th1, ao mesmo tempo em que, clulas NK podem estimular CDs a produzir IL-12, otimizando uma resposta efetora pelos linfcitos T citotxicos, evento sinergicamente recproco conhecido por cross-talk.
A interao entre as clulas NK e as clulas dendrticas foi demonstrada em estudo conduzido por Liu e colaboradores (2008), em que as clulas dendrticas plasmocitides (pCDs) foram transfectadas com um vetor CpG-ODN-2216 em camundongos induzidos ao melanoma B16, demonstrando que pCDs ativadas induziram a progresso lenta do tumor e aumentavam o tempo de sobrevida, induzindo uma infiltrao vigorosa de linfcitos T citotxicos especficos aos antgenos. Nesse trabalho demonstrou-se que as pCDs induzidas fazem apresentao cruzada para clulas T citotxicas e so dependentes das clulas NK infiltrantes do tumor. Os autores concluram que clulas NK iniciam a morte da clula tumoral por uma atividade citoltica aumentada. A apresentao cruzada dos antgenos tumorais por CDs ativadas leva a uma expanso especfica dos linfcitos T citotxicos. Analisamos a IL-2 e o CD25 nos linfcitos T citotxicos, demonstrando que houve estmulo dessas clulas pelo aumento dos marcadores avaliados aps a imunoterapia com clulas dendrticas. Nossos resultados demonstraram, sobretudo, que a estimulao das clulas dendrticas in vitro, potencializa respostas imunes efetoras em clulas T citotxicas, pois aps as vacinaes, observou-se aumento significativo da IL-2 nessas clulas (p0,05). Nossos achados corroboram com a literatura. Brossart e colaboradores (2000) conduziram um estudo em pacientes com cncer de mama e ovariano avanados, vacinados com DC autlogas pulsadas com peptdeos HER-2/neu ou MUC1. A resposta antgenoespecfica foi determinada pela anlise da produo de IFN- pelos linfcitos T citotxicos, atravs de citometria de fluxo. Aps as trs vacinas iniciais, cinco dos dez pacientes apresentaram aumento da resposta pelos linfcitos T, sendo que em dois desses pacientes, as respostas foram identificadas mesmo aps seis meses da vacinao. Estudos realizados por Avigan e colaboradores (2004), utilizando vacina de clulas dendrticas autlogas preparadas por fuso com o antgeno tumoral, em pacientes com cncer de mama metasttico e cncer renal, demonstraram elevao da porcentagem dos linfcitos T atravs do aumento da expresso da citocina IFN-, aps a exposio com o lisado tumoral, levando induo imunolgica e clnica de atividade antitumoral. Entretanto, como CDs alognicas so dependentes da expresso de molculas do CHP classe I para a apresentao de antgenos eficientemente, aps determinado perodo de vacinao, houve perda da expresso de CHP classe I pelos antgenos tumorais, conhecido por um dos principais mecanismos de evaso da imunidade do hospedeiro.
Diante desses achados, novos estudos tm sido abordados a fim de potencializar a vacina de clulas dendrticas para uma imunogenicidade mais duradoura. Speiser e colaboradores (2010) conduziram um estudo em que a induo de respostas T citotxicas reforada, mediante a apresentao antignica pelas CDs e por estmulos inatos, como ligantes dos receptores toll-like. Nesse estudo, foi desenvolvida uma vacina contra o melanoma, a partir da ligao do peptdeo especfico do melanoma (Melan-A/Mart-1) com um vrus como nanopartculas (VLPs) carregadas com um ligante para o receptor toll-like 9 (A-type CpG), para a ativao e o processamento das CDs pelos VLPs (mtodo de transfeco de vetor em CDs). Avaliou-se 22 pacientes com melanoma e foi realizado a anlise das citocinas IFN-, TNF- e IL-2 para avaliar a funo das clulas T, no sangue perifrico por citometria de fluxo. Houve elevao significativa de clulas T citotxicas, aps 14 semanas de anlises. A produo das citocinas tambm foi aumentada nas clulas T durante esse perodo, demonstrando que a vacinao resulta em estimulao de resposta em clulas T citotxicas humanas com propriedades de imunoproteo a longo prazo. No presente estudo, no houve pareamento dos pacientes em relao idade, sexo e tipo tumoral, pois estudos desse tipo no consentem a escolha seletiva de pacientes, visto que do ponto de vista tico permitida a realizao da imunoterapia com CDs apenas em pacientes cujos recursos teraputicos convencionais tenham se esgotado ou que se recusem a us-los. Contudo, nossos resultados mostram a relevncia da imunoterapia com clulas dendrticas autlogas para pacientes com cncer avanado, pois alm da otimizao da resposta imune aps o tratamento, estudos prvios conduzidos no Instituto de Pesquisa em Oncologia (IPON) evidenciam uma melhora da resposta clnica com aumento da sobrevida em alguns pacientes (estudos ainda em andamento). Outro estudo tambm vem sendo desenvolvidos no IPON, dentro da mesma linha de pesquisa, para analisar respostas pr-tumorais, atravs da anlise de clulas Treg e dos linfcitos T CD4+ expressando citocinas do perfil Th2, e no se observou o envolvimento dessas clulas aps a imunoterapia com clulas dendrticas (estudo ainda em andamento). Diante dos resultados obtidos no presente estudo, demonstrou-se que aps um perodo prolongado de terapia, houve uma diminuio de todas as populaes celulares, de maneira mais evidente entre a oitava e dcima anlises. Esses achados indicam que, mesmo com a
estimulao da resposta imune inicialmente, aps determinado momento, os tumores podem desenvolver novos mecanismos de evaso tumoral. Possveis mecanismos, que podem estar envolvidos na ineficcia da vacina com clulas dendrticas para o tratamento do cncer, incluem heterogeneidade das populaes de CDs, uso de protocolos inadequados para a preparao da vacina, estgio de maturao incompleto e inabilidade de trfego das CDs, mutaes do antgeno tumoral, imunossupresso tumoral mediada por auto-tolerncia, baixa avidez de clulas T para os antgenos associados ao tumor e supresso por clulas T reguladoras (EVEL-KABLER e CHEN, 2006; MATHIS e BENOIST, 2004).
CONCLUSO Aps a interveno imunoteraputica com clulas dendrticas estimuladas in vitro e pulsadas com antgenos tumorais especficos para cada paciente, observou-se o aumento das populaes celulares de macrfagos, clulas NK e linfcitos T citotxicos, por meio da avaliao das molculas de superfcie presentes nessas clulas (CD14+ para macrfagos, CD56+ para clulas NK e CD8+ para linfcitos T citotxicos), das citocinas intracelulares expressas (IFN- e TNF- para macrfagos, IL-12 para macrfagos e clulas NK e, IL-2 para clulas NK e linfcitos T citotxicos) e do receptor de membrana CD25 (para clulas NK e linfcitos T citotxicos). Nossos resultados confirmam, sobretudo, o aumento do potencial de resposta dos macrfagos pela expresso do TNF- e dos linfcitos T citotxicos, pela IL-2, aps a imunoterapia com CDs. Esse estudo indica que, aps determinado tempo de estimulao da resposta imune contra os antgenos tumorais, ocorre uma diminuio dessa resposta, mais observada entra a oitava e a dcima anlise celular, possivelmente, em virtude da adaptao do tumor ao estmulo imunoteraputico dispondo-se de um novo mecanismo de evaso tumoral.
REFERNCIAS
ANDREESEN, R.; SCHEIBENBOGEN, C.; BRUGGER, W. et al. Adoptive transfer of tumor cytotoxic macrophages generated in vitro from circulating blood monocytes: a new approach to cancer immunotherapy. Cancer Research. v. 50, n. 23, p. 7450-6, 1990.
AROSA, F.A.; CARDOSO, E.M. Linfcitos T. In:______. Fundamentos de Imunologia. Ed. Lidel. Lisboa, 2007. cap. 8, p. 123-145.
AVIGAN, D.; VASIR, B.; GONG, J. et al. Fusion cell vaccination of patients with metastatic breast and renal cancer induces immunological and clinical responses. Clinical Cancer Research. v. 15, n. 10, p.4699-708, 2004.
AWASTHI, A.; KUCHROO, V.K. Th17 cells: from precursors to players in inflammation and infection. International Immunology. V. 21, n. 5, p. 489-498, 2009.
BALLESTRERO, A.; BOY, D.; MORAN, E. et al. Immunotherapy with dendritc cells for cancer. Advanced Drug Delivery Review. v.60, p. 173-183, 2008.
BANCHEREAU, J.; STEINMAN, R. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. v.19, p. 245252, 1998.
BARONZIO, G.; FIORENTINI, G.; COGLE, C.R. Cancer Microenvironment and Therapeutic Implications: Tumor Pathophysiology Mechanisms and Therapeutic Strategies. In: BARONZIO, G.; FREITAS, I.; FIORENTINI, G.; CRUGNOLA, A.R.; HAGER, D., CEPPODOMO, D.; KISELEVSKY, M.V. 1a. Ed. Springer, 2009, c. 9, p. 157.
BASKIC, D.; ACIMOVIC, L.; SAMARDZIC, G. et al. Blood monocytes and tumor associated macrophages in human cancer: differences in activation levels. Neoplasma. v.48, p. 169174, 2001.
BAXEVANIS, C.N.; PEREZ, S.A.; PAPAMICHAIL, M. Combinatorial treatments including vaccines, chemotherapy and monoclonal antibodies for cancer therapy. Cancer Immunology Immunotherapy. v. 58, n. 3, p. 317-24, 2009.
BEVAN, M.J. Interaction antigens detected by cytotoxic T cells with the major histocompatibility complex as modifier. Nature. v. 256, n. 5516, p. 419-421, 1975.
BIRON, C.A.; NGUYEN, K.B.; PIEN, G.C. et al. Natural killer cells in antiviral defense: function and regulation by innate cytokines. Annual Review Immunology. v.17, p. 189220, 1999.
BISWAS, S.K.; MANTOVANI, A. Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: cancer as a paradigm. Nature Immunology. v.11, p.889 896, 2010.
BLANKENSTEIN, T. The role of tumor stroma in the interaction between tumor and immune system. Current Opinion in Immunology. v. 17, p. 180186, 2005.
BOEHM, U.; KLAMP, T.; GROOT, M.; HOWARD, J.C. Cellular responses to interferongamma. Annual Review of Immunology. v. 15, p. 749-795. 1997
BORG, C.; JALIL, A.; LADERACH, D. et al. NK cell activation by dendritic cells (DCs) requires the formation of a synapse leading to IL-12 polarization in DCs. Blood. v. 104, n. 10, p. 3267-3275, 2004.
BROSSART, P.; WIRTHS, S.; STUHLER, G. et al. Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses in vivo after vaccinations with peptide-pulsed dendritic cells. Blood. v. 96, n. 9, p. 3102-3108, 2000.
BURNET, M. Cancer: a biological approach. I. The processes of control. British Medical Journal. v. 1, n. 5022, p. 779786, 1957.
CALIGIURI, M.A. Human natural killer cells. Blood. v.112, n.3, p.461-469, 2008.
CELLA, M.; SALLUSTO, F; LANZAVECCHIA, A. Origin, maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Current Opinion in Immunology. v. 9, n.1, p.10-16, 1997.
CHEN, J.J.; LIN, Y.C.; YAO, P.L. et al. Tumor associated macrophages: the double-edged sword in cancer progression. Journal of Clinical Oncology. v. 23, n. 5, p. 953964, 2005.
COCA, S.; PEREZ-PIQUERAS, J.; MARTINEZ, D. et al. The prognostic significance of intratumoral natural killer cells in patients with colorectal carcinoma. Cancer. v. 79, n. 12, p. 2320-2328. 1997.
COOLS, N.; PONSAERTS, P.; VAN TENDELOO, V.F.I.; BERNEMAN, Z. N. Balancing between immunity and tolerance: an interplay between dendritic cells, regulatory T cells, and effector T cells. Journal of Leukocyte Biology. v. 82, n. 6, p. 1365-1374, 2007.
COOPER, M.A.; FEHNIGER, T.A.; CALIGIURI, M.A. The biology of human natural killercell subsets. Trends in Immunology. v. 22, n. 11, p. 633-640, 2001.
DAO, T.; GOMEZ-NUNEZ, M.; ANTCZAK, C. et al. Natural killer cells license dendritic cell cross-presentation of B lymphoma cell--associated antigens. Clinical Cancer Research. v. 11, p. 8763-72, 2005.
De VISSER, K.E., EICHTEN, A., COUSSENS, L.M. Paradoxical Roles of the Immune System During Cancer Development. Nature Reviews. Cancer. v. 6, n. 1, p. 24-37, 2006.
DILEEPAN, K.N.; PAGE, J.C.; LI, Y.; STECHSCHULTE, D.J. Direct activation of murine peritoneal macrophages for nitric oxide production and tumor cell killing by interferongamma. Journal Interferon Cytokine Research. v. 5, p. 387-394, 1995.
DOUGAN, M.; DRANOFF, G. Immune therapy for cancer. Annual Review of Immunology. v. 27, p. 83-117, 2009.
ELLERY, J.M.; NICHOLLS, P.J. Alternate signalling pathways from the interleukin-2 receptor. Cytokine & Growth Factor Reviews. v. 13, n. 1, p. 27-40, 2002.
ELNEMR, A.; OHTA, T.; YACHIE, A. et al. N-ethylmaleimide-enhanced phosphatidylserine externalization of human pancreatic cancer cells and immediate phophatidylserine mediated phagocytosis by macrophages. International Journal of Oncology. v. 16, n. 6, p. 1111-1116, 2000.
ENZLER, T.; GILLESSEN, S.; MANIS, J.P. et al. Deficiencies of GM-CSF and interferongamma link inflammation and cancer. The Journal of Experimental Medicine. v. 197, p. 1213-1219, 2003.
EVEL-KABLER, K.; CHEN, S.Y. Dendritic cell-based tumor vaccines and antigen presentation attenuators. Molecular Therapy. v. 13, n. 5, p. 850-858, 2006.
EYERICH, S.; EYERICH, K.; PENNINO, D.; et al. Th22 cells represent a distinct human T cell subset involved in epidermal immunity and remodeling. The Journal of Clinical Investigation. v. 119, n. 12, p. 3573-3585, 2009.
FEHNIGER, T.A.; COOPER, M.A.; NUOVO, G.J. et al. CD56 bright natural killer cells are present in human lymph nodes and are activated by T cell-derived IL-2: a potential new link between adaptive and innate immunity. Blood. v. 101, n. 8, p. 3052-3057, 2003.
FELTKAMP, M. C.; VREUGDENHIL, G. R.; VIERBOOM, M. P. et al. Vaccination with cytotoxic T lymphocyte epitope-containing peptide protects against a tumor induced by human papillomavirus type 16-transformed cells. European Journal of Immunology. v. 23, n. 9, p. 22422249, 1993.
FERNANDEZ, N.C.; LOZIER, A.; FLAMENT, C. et al. Dendritic cells directly trigger NK cell functions: cross-talk relevant in innate anti-tumor immune responses in vivo. Nature Medicine. v. 5, p. 405411, 1999.
FERRANTINI, M.; CAPONE, I.; BELARDELLI, F. Dendritic cells and cytokines in immune rejection of cancer. Cytokine & Growth Factor Reviews. v. 19, p. 93-107, 2007.
FONG, L.; ENGLEMAN, E.G. Dendritic cells in cancer immunotherapy. Annual Reviews Immunology. v. 18, p. 245-273, 2000.
GABRILOVICH, D. Mechanisms and functional significance of tumor-induced dendritic-cell defects. Nature Reviews Immunology. v. 4, p. 941-952, 2004.
GEISSMANN, F.; MANZ, M.G.; JUNG, S. et al. Development of Monocytes, Macrophages, and Dendritic Cells. Science. v. 327, n. 5966, p. 656-661, 2010.
GUERMONPREZ, P.; SAVEANU, L.; KLEIJMEER, M. et al. ER-phagosome fusion defines an MHC class I cross-presentation compartment in dendritic cells. Nature. v. 425, p. 397402, 2003.
HEATH, W.R.; BELZ, G.T.; BEHRENS, G.M. et al. Cross-presentation, dendritic cell subsets, and the generation of immunity to cellular antigens. Immunological reviews. v. 199, p. 9-26, 2004.
HENNEMANN, B.; SCHEIBENBOGEN, C.; ANDREESEN, R. Biological response to intrahepatic adoptive immunotherapy with autologous interferon activated macrophages. European Journal of Cancer. v. 31A, n. 5, p. 852, 1995.
HOLLSTEIN, M.; SIDRANSKY, D.; VOGELSTEN, B. P53 mutations in human cancers. Science. v. 253, p. 49-53, 1991.
HOUDE, M.; BERTHOLET, S.; GAGNON, E. et al. Phagosomes are competent organelles for antigen cross-presentation. Nature. v. 425, p. 402-406, 2003.
HUNG, C.F.; MONIE, A.; ALVAREZ, R.D.; WU, T.C. DNA vaccines for cervical cancer: from bench to bedside. Experimental & Molecular Medicine. v. 39, n. 6, p. 679-89, 2007.
HUSSAIN, S.P; HARRIS, C.C. Molecular epidemiology and carcinogenesis: endogenous and exogenous carcinogens. Mutation Research. v. 462, p. 311-322, 2000.
INCA INSTITUTO NACIONAL DE CNCER. Ministrio da Sade. Coordenao de Preveno e Vigilncia de Cncer. Estimativas 2010: Incidncia de Cncer no Brasil. Rio de Janeiro, 2010. Disponvel em: <http://www.inca.org.br>. Acesso em 18/07/2010.
ISHIGAMI, S.; NATSUGOE, S.; TOKUDA, K. et al. Clinical impact of intratumoral natural killer cell and dendritic cell infiltration in gastric cancer. Cancer Letters.; v.159, p. 103-108, 2000.
JEFFORD M, MARASKOVSKY E, CEBON J, DAVIS I D. The use of dendritic cells in cancer Therapy. The Lancet Oncology. v. 2, p. 343-353, 2001.
JOHUNG, K.; GOODWIN, E.C.; DIMAIO, D. Human papillomavirus E7 repression in cervical carcinoma cells initiates a transcriptional cascade driven by the retinoblastoma family, resulting in senescence. The Journal of Virology. v. 81, p. 2102-2116, 2007.
JONJIC, N.; ALBERTI, S.; BERNASCONI, S. et al. Heterogeneous susceptibility of human melanoma clones to monocyte cytotoxicity: role of ICAM-1 defined by antibody blocking and gene transfer. European Journal of Immunology. v. 22, p. 2255-2260, 1992.
JOSEPH C.S.; LEWIS L.L. Natural killer cells remember: An evolutionary bridge between innate and adaptive immunity? European Journal of Immunology. v. 39, n. 8, p. 2059-2064, 2009.
KAH-WAI L.; JACEK T.; JACEK R. Dendritic cells heterogeneity and its role in cancer immunity. Journal of Cancer Research and Therapheutics. v. 2, n. 2, p. 35-40, 2006.
KAPLAN, D.; SHANKARAN, V.; DIGHE, A.S. et al. Demonstration of an interferon gamma -dependent tumor surveillance system in immunocompetent mice. The Proceedings of the National Academy of Sciences. v. 95, p. 7556-7561, 1998.
KARIN, M.; GRETEN, F.R. NF-B: linking inflammation and immunity to cancer development and progression. Nature Reviews Immunology. v.5, p. 749759, 2005.
KELLEHER, P.; KNIGHT, S.C. IL-12 increases CD80 expression and the stimulatory capacity of bone marrow-derived dendritic cells. International Immunology. v. 10, n. 6, p. 749755, 1998.
KIESSLING, R.; KLEIN, E.; PROSS, H.; WIGZELL, H. Natural killer cells in the mouse. II. Cytotoxic cells with specificity for mouse Moloney leukemia cells. Characteristics of the killer cell. European Journal of Immunology. v. 5, p.117121, 1975.
KIM, H.P.; IMBERT, J.; LEONARD, W.J. Both integrated and differential regulation of components of the IL-2/IL-2 receptor system. Cytokine & Growth Factor Reviews. v. 17, n. 5, p. 349-366, 2006.
KLIMP, A.H.; DE VRIES, E.G.; SCHERPHOF, G.L.; DAEMEN, T. A potential role of macrophage activation in the treatment of cancer. Critical Reviews in Oncology/Hematology. v. 44, n. 2, p. 143-161, 2002.
KOYAMATSU, Y.; YOKOYAMA, M.; NAKAO, Y. et al. A comparative analysis of Human papillomavirus types 16 and 18 and expression of p53 gene and Ki-67in cervical, vaginal and vulvar carcinoma. Gynecology Oncology. v.90, p. 547-551, 2003.
LAMB, P.; CRAWFORD, L. Characterization of the human p53 gene. Molecular Cell Biology. v. 6, p. 13791385, 1986.
LANGENKAMP, A.; MESSI, M.; LANZAVECCHIA, A.; SALLUSTO, F. Kinetics of dendritic cell activation: impact on priming of TH1, TH2 and nonpolarized T cells. Nature Immunology. v. 1, p. :311316, 2000.
LANGERHANS, P. Uber die Nerven der menschlichen Haut. Virchow Archives of Pathological Anatomy and Histology. v. 44, p. 325337, 1868.
LAUWERYS, B.R.; RENAULD, J.C.; HOUSSIAU, F.A. Synergistic proliferation and activation of natural killer cells by interleukin-12 and interleukin-18. Cytokine v. 11, n. 11, p. 822830, 1999.
LEHRNBECHER, T.; KOEHL, U.; WITTEKINDT, B. et al. Changes in host defense induced by malignancies and antineoplastic treatment: implication for immunotherapeutic strategies. The Lancet Oncology. v. 9, p. 269-278, 2008.
LIAKOU, C.I.; NARAYANAN, S.; TANG, D. et al. Focus on TILs: Prognostic significance of tumor infiltrating lymphocytes in human bladder cancer. Cancer Immunology. v. 26, p.7 10, 2007.
LIN, H.H.; RAY, S.; TONGCHUSAK, S. et al. Evaluation of MHC class I peptide binding prediction servers: applications for vaccine research. BMC Immunology. v. 16, n.9, p.8, 2008.
LINDAHL, T. Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature. v. 362, p. 709 715, 1993.
LIU, C.; LOU, Y.; LIZE, G. et al. Plasmacytoid dendritic cells induce NK cell-dependent, tumor antigen-specific T cell cross-priming and tumor regression in mice. The Journal of Clinical Investigation. v. 118, n. 3, p. 1165-1175, 2008.
LOEB, L.A.; HARRIS, C.C. Advances in Chemical Carcinogenesis: A Historical Review and Prospective. Cancer Research, v. 68, p. 6863-6872, 2008.
LOOSE, D.; VAN DE WIELE, C. The immune system and cancer. Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals. v. 24. N. 3, p. 369-376, 2009.
MALUF, P.J.; MICHELIN, M.A.; ETCHERBEHERE, R.M. et al. T lymphocytes (CD3) may participate in the recurrence of cervical intraepithelial neoplasia grade III. Archives of Gynecology and Obstetrics, v. 278, p. 525-530, 2008.
MANTOVANI, A.; BOTTAZZI, B.; COLOTTA, F. et al. The origin and function of tumor associated macrophages. Immunology Today. v. 137, p. 265270, 1992.
MATHIS, D.; BENOIST, C. Back to central tolerance. Immunity. v. 20, p. 509-516, 2004.
MICALLEF, M.J.; OHTSUKI, T.; KOHNO, K. et al. Interferon--inducing factor enhances T helper cytokine production by stimulated human T cells: synergism with interleukin-12 for interferon-production. European Journal of Immunology. v.26, n. 7, p. 16471651, 1996.
MONNIER-BENOIT S.; MAUNY, F.; RIETHMULLER, D. et al. Immunohistochemical analysis of CD4+ and CD8+ T-cell subsets in high risk human papillomavirusassociated premalignant and malignant lesions of uterine cervix. Gynecology Oncology. v. 102, p. 22-31, 2006.
MORELLI, A.E.; HACKSTEIN, H.; THOMSON, A.W. Potential of tolerogenic dendritic cells for transplantation. Seminars in Immunology. v.13, p. 323-335, 2001.
MOSMANN, T.R.; CHERWINSKI, H.; BOND, M.W. et al. Two types of murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. The Journal of Immunology. v. 136, p. 23482357, 1986.
NEUMANN, C; SORG, C. Immune interferon. I. Production by lymphokine-activated murine macrophages. European Journal of Immunology. v. 7, n. 10, p. 719-725, 1977.
PENG, S.; TOMSON, T.; TRIMBLE, C. et al. Development of a DNA vaccine targeting HPV-16 oncogenic protein E6. The Journal of Virology. v. 78, p. 8468-8476, 2004.
PULENDRAN, B.; SMITH, J.L.; CASPARY, G. et al. Distinct dendritic cell subsets differentially regulate the class of immune response in vivo. The Proceedings of the National Academy of Sciences. v. 96, n. 3, p.1036-1041, 1999.
QI, C.F.; NIERODA, C.; De FILIPPI R. et al. Macrophage colonystimulating factor enhancement of antibody-dependent cellular cytotoxicity against human colon carcinoma cells. Immunology Letters. v. 47, n.1-2, p.15-24, 1995.
RABINOVICH, G.A.; GABRILOVICH, D.; SOTOMAYOR, E.M. Immunosuppressive Strategies that are Mediated by Tumor Cells. Annual Reviews Immunology. v. 25, p. 26796, 2007.
ROBINSON, D.; SHIBUYA, K.; MUI, A. et al. IGIF does not drive Th1 development but synergizes with IL-12 for interferon- production and activates IRAK and NF-B. Immunity. v. 7, n. 4, p. 571-81, 1997.
ROSENBERG, S.A.; WHITE, D.E. Vitiligo in patients with melanoma: normal tissue antigens can be targets for cancer immunotherapy. Journal of immunotherapy with emphasis on tumor immunology. v. 19, n.1, p. 8184, 1996.
ROTH, W.; ISENMANN, S.; NAKAMURA, M. et al. Soluble decoy receptor 3 is expressed by malignant gliomas and suppresses CD95 ligand-induced apoptosis and chemotaxis. Cancer Research. v. 61, p. 27592765, 2001.
SANCHEZ, C.J.; LE TREUT, T.; BOEHRER, A. et al. Natural killer cells and malignant haemopathies: a model for the interaction of cancer with innate immunity. Cancer Immunology, Immunotherapy. 2010.
SCHNURR, M.; CHEN, Q.; SHIN, A. et al.. Tumor antigen processing and presentation depends critically on dendritic cell type and the mode of antigen delivery. Blood. v. 105, p. 2465-2472, 2004.
SCHWARTZ, R.H. A cell culture model for T cell anergy. Science. v.248, p. 1349-1356, 1990.
SERAFINI, P.; CARBLEY, R.; NOOMAN, K.A.; BORRELLO, I. High-Dose GranulocyteMacrophage Colony-Stimulating Factor-Producing Vaccines Impair the Immune Response through the Recruitment of Myeloid Suppressor Cells. Cancer Research. v. 64, p. 63376343, 2004.
SHAW, G.M.; LEVY, P.C.; LOBUGLIO, A.F. Human monocyte antibody-dependent cellmediated cytotoxicity to tumor cells. The Journal of Clinical Investigation. v. 62, n. 6, p. 1172-1180, 1978.
SHI, Y.; EVANS, J.E.; ROCK, K.L. Molecular identification of a danger signal that alerts the immune system to dying cells. Nature. v.425, p. 516-521, 2003.
SHIH, H.; NATHANSON K.; SEAL. S. et al. BRCA1 and BRCA2 mutations in breast cancer families with multiple primary cancers. Clinical Cancer Research. v. 6, p. 42594264, 2000.
SHORTMAN, K.; LIU, Y.J. Mouse and human dendritic cell subtypes. Nature Reviews Immunology. v.2, p. 151-161, 2002.
SHURIN, M.R.; SALTER, R.D. Dendritic cells in Cancer. 1a. Ed. Springer, 2009.
SOMBROEK, C.C.; STAM, A.G.; MASTERSON, A.J. et al. Prostanoids play a major role in the primary tumor-induced inhibition of dendritic cell differentiation. The Journal of Immunology. v. 168, n. 9, 4333-4343, 2002.
SPEISER, D.E.; SCHWARZ, K.; BAUMGAERTNER, P. et al. Memory and effector CD8 Tcell responses after nanoparticle vaccination of melanoma patients. Journal of Immunotherapy. v. 33, n. 8, p. 848-858, 2010.
STEINMAN, R.M.; COHN, Z.A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. The Journal of Experimental Medicine. v. 137, p. 11421162, 1973.
STEINMAN, R.M.; HAWIGER, D.; NUSSENZWEIG, M.C. Tolerogenic dendritic cells. Annual Review of Immunology. v.21, p. 685-711, 2003.
SUMINOE, A.; MATSUZAKI, A.; HATTORI, H.; KOGA, Y.; HARA, T. Immunotherapy with autologous dendritic cells and tumor antigens for children with refractory malignant solid tumors. Pediatric Transplantation. v. 6, p. 746-753, 2009.
THOMAS, L. Reactions to homologous tissue antigens in relation to hypersensitivity. Cellular and humoral aspects of the hypersensitive states. Editado por Lawrence, H.S. Hoeber-Harper, Nova York. p. 529532, 1959.
TILLMAN, B.; HAYES, T.; DeGRUIJL, T. et al. Adenoviral vectors targeted to cd40 enhance the efficacy of dendritic cell-based vaccination against human papillomavirus 16induced tumor cells in a murine model. Cancer Research. v. 60, p. 5456-5463, 2000.
TOEBAK, M.J.; GIBBS. S.; BRUYNZEEL, D.P. et al. Dendritic cells: biology of the skin. Contact Dermatitis. v. 60, p. 2-20, 2009.
USUBTN, A.; AYHAN, A.; UYGUR, M.C. et al. Prognostic factors in renal cell carcinoma. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. v. 17, p. 77-81, 1998.
UTSUGI, T.; SCHROIT, A.J.; CONNOR, J. et al. Elevated expression of phosphatidylserine in the outer membrane leaflet of human tumor cells and recognition by activated human blood monocytes. Cancer Research. v. 51, p. 3062-3066, 1991.
VAN DER BRUGGEN, P.; ZHANG, P.; CHAUX, V. et al. Tumor-specific shared antigenic peptides recognized by human T cells. Immunology Reviews. v. 188, p. 51-64, 2002.
Van FURTH R.; COHN Z.A. The origin and kinetics of mononuclear phagocytes. The Journal of Experimental Medicine. v. 128, n. 3, p. 415435, 1968.
VELDHOEN, M.; UYTTENHOVE, C.; VAN SNICK, J. et al. Transforming growth factorbeta 'reprograms' the differentiation of T helper 2 cells and promotes an interleukin 9producing subset. Nature Immunology. v.9, n. 12, p. 1341-1346, 2008.
WEBB D.S.; MOSTOWSKI, H.S.; GERRARD, T.L. Cytokine-induced enhancement of ICAM-1 expression results in increased vulnerability of tumor cells to monocyte-mediated lysis. The Journal of Immunology. v.146, p. 3682-3686, 1991.
WEISZ, L.; OREN, M.; ROTTER, V. Transcription regulation by mutant p53. Oncogene. v. 26, p. 2202-2211, 2007.
WESTENFELDER, U.; SCHRAVEN, B.; MANNEL, D.N. Characterization of monocyteactivating tumour cell membrane structures. Scandinavian Journal of Immunology. v. 38, p. 388-394, 1993.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. World health statistics 2008. Geneva , 2008. Cap.1, p. 21 (1:112).
WRIGHT S.D.; RAMOS, R.A.; TOBIAS, P.S. et al. CD14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein. Science. v. 249, p. 1431-1433, 1990.
YOO, J.K.; CHO, J.H.; LEE, S.W.; SUNG, Y.C. IL-12 provides proliferation and survival signals to murine CD4_ T cells through phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway. The Journal of Immunology. v.169, p. 3637-3643, 2002.
YOON, S.R.; CHUNG, J.W.; CHOI, I. Development of natural killer cells from hematopoietic stem cells. Molecules and Cells. v. 24, n.1, 1-8. 2007.
YU, P.; FU, Y.X. Tumor-infiltrating T lymphocytes: friends or foes? Laboratory Investigation. v. 86, n. 3, p. 231-45, 2006.
ZAMAI, L.; AHMAD, M.; BENNETT, I.M. et al. Natural killer (NK) cell-mediated cytotoxicity: differential use of TRAIL and Fas ligand by immature and mature primary human NK cells. Journal of Experimental Medicine. v. 188, p. 2375-2380, 1998.
ANEXO A Cpia do aceite do Comit de tica em Pesquisa da UFTM (683-2006/CEP).
ANEXO B Modelo do termo de consentimento livre aps esclarecimento.
TERMO DE ESCLARESCIMENTO Voc est sendo convidado a participar do estudo Imunoterapia com clulas dendrticas no tratamento do cncer. Os avanos na rea da sade ocorrem atravs de estudos como este, por isso sua participao importante. O objetivo deste estudo : - Estudar possveis alteraes imunolgicas e patolgicas de tumores. - Avaliar o tratamento imunoteraputico. Sintomas como dor muscular e aumento da temperatura podem ocorrer. Estas alteraes podem ser tratadas e os pesquisadores orientaro sobre a medicao. - Caso voc participe, ser necessrio coletar amostra de sangue e do tumor (bipsia) para o estudo que estamos propondo e que normalmente coletado para seus exames ou tratamentos, e que no lhe trazem risco de vida. Voc poder obter todas as informaes que quiser e poder no participar da pesquisa ou retirar seu consentimento a qualquer momento, sem prejuzo no seu atendimento. Pela sua participao no estudo, voc no receber qualquer valor em dinheiro, mas ter a garantia de que todas as despesas necessrias para a realizao da pesquisa no sero de sua responsabilidade. Seu nome no aparecer em qualquer momento do estudo, pois voc ser identificado com um nmero.
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE, APS ESCLARECIMENTO
Eu,
, li e/ou ouvi o esclarecimento
acima e compreendi para que serve o estudo e qual procedimento a que serei submetido. A explicao que recebi esclarece os riscos e benefcios do estudo. Eu entendi que sou livre para interromper minha participao a qualquer momento, sem justificar minha deciso e que isso no afetar meu tratamento. Sei que meu nome no ser divulgado, que no terei despesas e no receberei dinheiro por participar do estudo. Eu concordo em participar do estudo.
Uberaba, ............./ ................../................
Assinatura do voluntrio ou seu responsvel legal
Documento de Identidade
Assinatura do pesquisador responsvel Prof. Dr. Eddie Fernando Candido Murta
Telefone de contato dos pesquisadores: (34) 3318-5326/ 3318-5595/ 9148-3373
Em caso de dvida em relao a esse documento, voc pode entrar em contato com o Comit tica em Pesquisa da Universidade Federal do Tringulo Mineiro, pelo telefone 3318-5854.
ANEXO C Modelo da anlise por citometria de fluxo. Paciente 1: Avaliao da porcentagem de fluorescncia nos linfcitos T citotxicos, atravs da dupla marcao CD8+ IL-2+, nas anlises da pr-terapia, ps-terapia 9 e 14.

Avaliação de R.I Mediadas Por Macrófagos

Transféré par

Informations du document

Titre original

Copyright

Formats disponibles

Partager ce document

Partager ou intégrer le document

Options de partage

Avez-vous trouvé ce document utile ?

Ce contenu est-il inapproprié ?

Droits d'auteur :

Formats disponibles

Avaliação de R.I Mediadas Por Macrófagos

Transféré par

Droits d'auteur :

Formats disponibles

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRINGULO MINEIRO BRUNA FRANA MATIAS

UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRINGULO MINEIRO BRUNA FRANA MATIAS

Co-orientador: Prof. Dr. Eddie Fernando Candido Murta

Vacina baseada em Clulas Dendrtica............................................................................. 26 OBJETIVOS.................................................................................................................... 28

Transformao Celular Neoplsica

Fonte: Instituto Nacional do Cncer INCA, 2010.

Resposta Imune aos Tumores

1.2.1 Resposta Imune Inata

1.2.2 Resposta Imune Adquirida

1.2.3 Vigilncia Imunolgica e Escape Tumoral

O papel das Clulas Dendrticas no Cncer

1.6 Linfcitos T citotxicos

1.7 Imunoterapia do Cncer

1.7.1 Vacina baseada em Clulas Dendrticas

2.1 Objetivo Geral

3.1.1 Critrios de Incluso

3.1.2 Critrios de Excluso

3.2 Preparao da Vacina de Clulas Dendrticas Autlogas

3.3 Anlise Celular por Citometria de Fluxo

), a 4C por 20 minutos, no escuro; para que fosse possvel a marcao

3.4 Anlise dos Resultados

4 RESULTADOS 4.4.1 Anlise dos Macrfagos

4.4.5 Anlise Estatstica das Clulas NK

Cr e, segundo essa avaliao,

ANEXO A Cpia do aceite do Comit de tica em Pesquisa da UFTM (683-2006/CEP).

ANEXO B Modelo do termo de consentimento livre aps esclarecimento.

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE, APS ESCLARECIMENTO

, li e/ou ouvi o esclarecimento

Uberaba, ............./ ................../................

Assinatura do voluntrio ou seu responsvel legal

Assinatura do pesquisador responsvel Prof. Dr. Eddie Fernando Candido Murta

Telefone de contato dos pesquisadores: (34) 3318-5326/ 3318-5595/ 9148-3373

Vous aimerez peut-être aussi