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VICERRECTORA ACADMICA INSTITUTO DE CIENCIAS NATURALES

CBI 410

Fundamentos de Microbiologa y Parasitologa


Instituto de Ciencias Naturales

Gua N 6. Determinacin de S. aureus en alimentos

2013

VICERRECTORA ACADMICA INSTITUTO DE CIENCIAS NATURALES

DETERMINACION Y ENUMERACIN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS EN ALIMENTOS.

ANTECEDENTES.

Staphylococcus aureus pertenece a la Familia Micrococcaceae. Es una bacteria inmvil, Gram positiva, esfrica y usualmente agrupada en racimos, aerobia y anaerobia facultativa, catalasa positiva. Produce generalmente la enzima coagulasa, fermenta el manitol y otros azcares formando cido pero no gas. El crecimiento ocurre en un amplio rango de temperatura (6.5 a 50C), siendo el ptimo 30 40C. Tolera concentraciones altas de cloruro de sodio y es capaz de desarrollarse aerbicamente en alimentos con baja actividad de agua (0.86). Staphyloccus aureus es un microorganismo que se destruye fcilmente con altas temperaturas y por casi todos los agentes desinfectantes, por lo cual la presencia de esta bacteria en alimentos procesados o en equipos, generalmente indica higiene deficiente o contaminacin postproceso de origen humano. El crecimiento de S. aureus en alimentos presenta un riesgo en salud pblica debido a que algunas cepas producen enterotoxinas termoestables (A, B, C1, C2, C3, Y E), las cuales causan intoxicacin alimentaria de alta incidencia. Los sntomas ms caractersticos de esta intoxicacin son: vmitos, nuseas, diarrea, y el periodo de incubacin es de 1 a 6 horas. Los alimentos comnmente asociado a intoxicaciones son: lcteos, productos de pastelera especialmente con crema, carne y productos crneos, etc. El mtodo a desarrollas consiste en extender 0.25 ml de alimento homogeneizado, y de las diluciones decimales subsiguientes, sobre la superficie de un agar de Baird.Parker, este medio contiene varias sustancias inhibidoras que no impiden el desarrollo de S. aureus, como ste reduce el telurito potsico e hidroliza la yema de huevo que contienen el medio, se forma colonias negras rodeadas de una zona clara, caracterstica de S. aureus: Como procedimiento confirmatorio para determinar la identidad del S. aureus, este mtodo utilizar prueba de la coagulasa, una sustancia producida por S. aureus que coagula el plasma del hombre y de los animales.

CBI 410 Fundamentos de Microbiologa y Parasitologa

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1.- OBJETIVOS 1.1.1.2.1.3.Desarrollar un ensayo cuantitativo para S. aureus sobre Agar Baird-Parker y describir las colonias tpicas sobre este medio de cultivo. Nombrar medios de cultivo y describir las colonias tpicas de Salmonella en ellos. Nombrar al menos tres especies importantes de Salmonellas.

2.- MATERIALES Estufa de incubacin, balanza, vrtex, pipetas graduadas, placas Petri, asas de platino, rastrillo de vidrio, tubos de ensayo, gradillas, mecheros, medios de cultivo. 3.- PROCEDIMIENTOS 3.1.Pesar aspticamente 10 grs de la muestra de alimento y homogeneizarla en 90 ml de solucin reguladora de peptona, obteniendo as la dilucin 10-1 Traspasar 1 ml de la dilucin 10-1 a un tubo que contiene 9 ml de la solucin diluyente, pipetear 8 a 10 veces de tal manera que quede bien homogeneizado, obteniendo as la dilucin 10-2, repetir esta operacin para preparar las diluciones decimales consecutivas hasta 10-4, siempre trabajar cerca del mechero. Sobre la superficie de las placas con Agar Baird-Parker, se vierten con una pipeta estril, 0.25 ml de homogeneizado y de sus diluciones, se extiende el inculo con un rastrillo de vidrio que se esteriliza flamendolo sobre el mechero cada vez que se cambias de dilucin. De cada dilucin preparar placas duplicadas.

3.2.-

3.3.-

3.4.-

Incubar las placas invertidas a 35C durante 48 horas. Realizar recuento de todas las colonias de color negro o gris oscuro, brillante, convexas, de 2 3 mm de dimetro. De consistencia cremosa y que presenten una o ms de las siguientes caractersticas: - Discreta zona de precipitado debajo de la colonia - Una zona clara o halo alrededor de la colonia, con una zona de precipitado debajo de ella - Una zona clara o halo alrededor de la colonia, sin precipitado.

3.5.-

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3.6.- Registrar como recuento presuntivo la suma del nmero de colonias obtenidas en cada serie de 2 placas y multiplicar por el valor recproco de la dilucin. 4.- PRUEBA PARA LA PRODUCCIN DE COAGULASA a) Sembrar con asa de platino utilizando las tcnicas aspticas que usted conoce, 3 a 5 colonias sospechosas de S. aureus, en tubos que contienen Caldo Cerebro Corazn. Incubar los tubos a 35C durante 24 a 48 horas. Al cabo de este tiempo traspasar 0.1 ml de cultivo del caldo cerebro corazn con pipeta estril a un tubo pequeo con 0.3 ml de plasma de conejo previamente rehidratado. Incubar a 35C, examinar los tubos a las seis horas, para observar la formacin de cogulo. Solamente un cogulo firme y completo que permanece en su lugar al agitar o invertir el tubo, es considerado positivo para S. aureus. Si se obtiene una coagulacin parcial como las designadas con 2+ y 3+ (ver ilustracin), estas deben ser confirmadas mediante la prueba de Nucleasa Termoesatable

b) c)

d)

5.- CLCULO Y EXPRESION DE LOS RESULTADOS El recuento confirmado se obtiene mediante la siguiente frmula: Recuento Presuntivo = Recuento N de colonias confirmadasde S. aureus N de colonias sometidas a confirmacin

El resultado se expresa en ufc (unidades formadoras de colonias) de S. aureus por gr o ml de alimento. Tipos de Reacciones de la Prueba de Coagulasa NEGATIVO 1+ 2+ POSITIVO 3+ 4+

Negativo No hay de formacin de fibrina CBI 410 Fundamentos de=Microbiologa y evidencia Parasitologa 1+ 2+ 3+ = = = Cogulo pequeo desorganizado Cogulo pequeo organizado Cogulo grande organizado