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IDENTIFICATION DES CONTAMINANTS BACTERIENS PAR LA TECHNIQUE ARDRA

C. MINTY , P. DASSE , J.P. de FARCY , A. BAYOL SANOFI ~ SYNTHELABO RECHERCHE Centre de Labge

Position du problme

Contamination de procd

problme industriel majeur

Caractrisation des contaminants

matrise du procd

Identification classique

peu performante (environnement)

Technique ARDRA universelle (empreinte gne rARN16s) ARDRA = Amplified rDNA Restriction Analysis

Les 3 domaines du vivant (Woese, 1987)

Une constante chez les tres vivants : la synthse des protines

LARN ribosomique 16S

Espce bactrienne : dfinition

La dfinition de lespce bactrienne repose sur le seul caractre invariant des cellules : le gnome

Lespce bactrienne est lensemble des souches prsentant plus de 70 % dhomologie par la technique dhybridation ADN/ADN

Corrlation hybridation / homologie 16S

Espce diffrente

Genre diffrent

Hybridation ADN/ADN Homologie Squence 16S

< 70 %

< 20 %

< 98 %

< 94 %

Devereux et al. (1990) J. Bacteriol. 3609-3619

Deux techniques didentification molculaire

Colonie isole

Extraction ADN

Amplification du 16S rDNA

ARDRA

Squenage

Amorces (primers)

500

1000

1500

20001454 20001456 20001457

20001455 20001458

Amplification par le couple 20001454-20001455 1540 pb environ Bacteria Universel Archaea

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Amorces du gne de rRNA 16S des Bacteria

Amorce 20001454

Squence 5-AGA-GTT-TGA-TCC-TGG-CTC-AG-3

Sens sens

Mers 20

Position* 1-20

TM 60

20001455

5-AAG-GAG-GTG-ATC-CAG-CC-3

Antisens

17

1531-1548

54

* Par rapport la squence de Desulfohalobium retbaense

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Contrle de lamplification

10000 bp

10000 bp

1500 bp 500 bp

1500 bp 500 bp

Gel 2% agarose Dpt 4 l de produit PCR Marqueur de taille 1 Kb

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Principe
Colonie isole Extraction ADN

Amplification du 16S rDNA

Coupure de lADN par des enzymes de restriction

Mesure de la taille des fragments

Profil ARDRA Empreinte gntique

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Schma gnral de lidentification ARDRA

Amplification 16S rDNA

Restriction par : AvaI, HhaI, BstUI, RsaI Identification ARDRA

Electrophorse 16 h

Acquisition image (Fluor Imager)

Calcul taille bandes (Bio Image)

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Gnralisation Choix des enzymes

Enzymes de la banque ARDRA Labge : AvaI : C(TC)CG(AG)G HhaI : GCGC BstUI : CGCG RsaI : GT AC
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Rsultat : gel 20 pistes = 4 souches

AvaI HhaI BstUI RsaI

AvaI

HhaI BstUI RsaI AvaI HhaI BstUI RsaI

AvaI

HhaI BstUI RsaI

100 bp
100 bp 100 bp 100 bp 100 bp

100 bp
1500 1200 1000
900

1500 1200 1000

900

800 700 600

517

800 700 600

517

500 400 300 200 100

500 400 300 200 100

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Exemple de rsultat
AvaI
Nbr de bandes Tailles des bandes Nbr de bandes Tailles des bandes Nbr de bandes Tailles des bandes Nbr de bandes Tailles des bandes Nbr de bandes Tailles des bandes Nbr de bandes Tailles des bandes 0 0 2 248 455

HhaI
3

BstUI
3

RsaI

Espce la plus proche

Profil

232 266 570

204 258 474 Arthrobacter sp.

OP 202

0 0

2 252 439

3 224 260 575

3 252 356 466 Rf :U85896

Profil connu

0 0

3 227 418 452

4 227 281 295 385

3 256 359 472 Microbacterium keratanolyticum

OP 206

Profil

0 0

3 226 409 438

4 227 279 295 378

3 252 356 457

Profil connu

Rf :Y14786 0 0 3 251 457 607 3 226 276 577 3 201 252 478 Brevibacterium avium

OP 207

Profil

0 0

3 252 438 604

4 226 229 273 574

3 205 252 461

Profil connu

Rf :Y17962

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Analyse comparative

Technique ARDRA
Arthrobacter sp. Microbacterium keranolyticum Brevibacterium avium

Technique classique

OP 202 OP 206 OP 207

OP 202 Rhodococcus equi OP 206 Chryseomonas luteola OP 207 Coryneforme non identifi Caractrisation non homogne : OP 206 incorrect, OP 202 (groupe 22), OP 207 (groupe 20)

Caractrisation homogne : Bergeys, 9me dition, Gram positifs du groupe 20

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Remerciements

G G G G

Alain Bayol Pacme Dasse Michel Magot Catherine Minty

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Bactries et caractres exprims

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PCR : Polymerase Chain Reaction (Amplification gnique)

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PCR : Polymerase Chain Reaction (Amplification gnique)

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Mix damplification
Pour 1 raction damplification (50l) :
36 l H2O 5 l de tampon PCR 10x 3 l de MgCl2 25 mM 1,25 l damorce 20001454 1,25 l damorce 20001455 1 l de dNTP 10 mM 1 l dUDG 1 l de Taq Polymerase 1 l dADN gnomique bactrien NB : tous les ractifs sont ceux du Core Kit Plus (Boehringer) SAUF les dNTP (Ne pas mettre dUTP)

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Cycles damplification
1 cycle 5 cycles o 3 mn 95C o 1 mn 94C o 30 sec 58C o 1 mn 30 72C o 30 sec 94C o 30 sec 58C o 1 mn 30 72C o 5 mn 72C o conserv 4C

25 cycles

1 cycle

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Restriction

4 enzymes de restriction : AvaI, HhaI, BstUI, RsaI Pour chacune des 4 ractions : 8 l de produit PCR 1 l de tampon 10x appropri chaque enzyme 1 l (5 10 units) denzyme Incubation 2 heures 37C (AvaI, HhaI, RsaI) 60C (BstUI)

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Sparation en gel dagarose

250 ml dagarose High Resolution (Quantum Appligene) Gel horizontal 20 x 25 cm avec circulation du tampon En tampon TAE Dpt de la totalit de la solution de restriction (10 l + 3 l de solution de bleu de migration 5 x) Migration pendant 1617 heures 50 V Coloration au BET - Dcoloration

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27