UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE FACULTAD DE INGENIERIA DEPARTAMENTO DE INGENIERIA QUIMICA

INFORME N 1

BIOCATLISIS ENZIMTICA: DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMTICA (ENZIMA LIBRE) DE LA LACTASA LACTASA

Ramo: Integrantes:

Bio-reactores Karen Venegas. Diego Castro. Valentina Romo.

Profesor: Ayudantes:

Jorge Lobos. Gabriel Herrera Rodrigo Barrientos

Fecha de experimento: Fecha de entrega:

Lunes 31 agosto, 2009. Lunes 21 septiembre, 2009.

NDICE

1. RESUMEN .................................................................................................................................................... 2

2. OBJETIVOS ................................................................................................................................................. 3

3. TEORA ........................................................................................................................................................ 4

4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.................................................................................................... 7

5. APARATOS Y ACCESORIOS ................................................................................................................. 10

6. DATOS ........................................................................................................................................................ 13

7. RESULTADOS ........................................................................................................................................... 15

8. DISCUSIN ................................................................................................................................................ 17

9. CONCLUSIN ........................................................................................................................................... 20

10. RECOMENDACIONES .......................................................................................................................... 20

11. NOMENCLATURA ................................................................................................................................. 22

12. BIBLIOGRAFA ...................................................................................................................................... 23

13. APNDICE .............................................................................................................................................. 24 APNDICE A: CLCULO DE DATOS APNDICE B: DATOS INTERMEDIOS APNDICE C: DATOS BIBLIOGRFICOS APNDICE D: GRFICOS

1. RESUMEN
La experiencia se realiz en el laboratorio de Reactores del Departamento de Ingeniera Qumica de la Facultad de Ingeniera de la Universidad de Santiago de Chile.

El objetivo es la determinacin de la actividad enzimtica de la lactasa.a distintas temperaturas Para esto, cada uno de los ocho grupos (G) trabaj a una concentracin de enzima y temperatura definida: G1: 15 [mg/L] a 40 C, G2: 30 [mg/L] a 40 C, G3: 15 [mg/L] a 45 C, G4: 30 [mg/L] a 45 C, G5: 15 [mg/L] a 53 C, G6: 30 [mg/L] a 53 C, G7: 15 [mg/L] a 60 C y G8: 30 [mg/L] a 60 C. Se cont con 12 tubos de ensayo, los cuales contenan lactosa como sustrato. Se incubaron a 40 C, temperatura a la cual se quera trabajar. A 10 de ellos, se les agreg lactasa con una concentracin de 15 [mg/L] para permitir la reaccin, dejando los dos restantes como blanco. Los tiempos de reaccin fueron distintos para cada par de tubos, siendo stos 0, 2, 5, 10 y 15 minutos, seguido por 5 minutos en ebullicin para detener la reaccin. Se tomaron muestras de cada uno de los tubos y se analizaron mediante espectrofotometra para obtener cmo vara la concentracin de glucosa en la solucin durante el tiempo. Los resultados fueron que la relacin entre concentracin de glucosa versus el tiempo de reaccin para una concentracin y temperatura de enzima determinada es directamente proporcional. Adems, se obtuvo la variacin de la velocidad de reaccin con respecto a la temperatura para cada concentracin enzimtica especfica. Los resultados fue que el valor la variacin de la velocidad de reaccin en funcin de la temperatura tiene un comportamiento parablico y encuentra su mxima temperatura a los 53 C, para una concentracin enzimtica de [15 mg/L]. Por ltimo, se calcul actividad enzimtica especfica de la lactasa promedio que encuentra su valor mximo a los 53 C y es de 2,470 [UI/mg de enzima].

2. OBJETIVOS

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA LACTASA

Determinar la actividad enzimtica de la lactasa a 40 C, 45 C, 53 C y 60 C y a dos concentraciones diferentes de sta: 15 [mg/L] y 30 [mg/L].

1.

Obtener un grfico de concentracin de glucosa v/s tiempo para cada concentracin especfica y temperatura utilizada.

2.

Obtener un grfico de velocidad de reaccin v/s temperatura para cada concentracin especfica.

3.

Obtener el valor de la actividad enzimtica especfica del preparado enzimtico original, expresado en UI/mg de enzima.

3. TEORA
Todas las reacciones qumica que configuran el metabolismo celular son catalizadas por enzimas. Estos biocatalizadores son altamente especficos y activos en condiciones moderadas, lo que les confiere un gran potencial de uso como catalizadores de proceso. Las enzimas son de naturaleza proteica y, aunque muchas contienen en su estructura otro tipo de molculas, su funcionalidad biolgica radica siempre en su porcin proteica. La capacidad cataltica de la enzima reside en su sitio activo, que est conformado por un reducido nmero de residuos aminoacdicos que se agrupan en la estructura tridimensional para generar un nicho, donde el sustrato es ligado y qumicamente transformado1. Desde un punto de vista termodinmico, las enzimas actan rebajando la barrera energtica que representa la energa de activacin requerida para lograr un complejo de transicin cataltica de la enzima, se traduce en un incremento en la velocidad de reaccin catalizada y, dado que en ausencia de la enzima la velocidad es generalmente despreciable, la cuantificacin de la actividad enzimtica se basa en la medicin de la velocidad de reaccin2. De este modo, en la reaccin: S P donde: S E P Se tendr que: actividad v

(3.1)

= = =

Sustrato Enzima Producto

(3.2)

Acevedo, F.; Gentina, J.C.; Illanes, A.; Fundamentos de Ingeniera Bioqumica, 2 edicin, Ediciones Universitarias de Valparaso, Pontificia Universidad Catlica de Valparaso; Valparaso, Chile (2002). Pg 43.
2

bid, pg 44.

donde: v t

= =

Velocidad de reaccin, Tiempo, s

Si se observa la curva de aparicin de producto a travs del tiempo, se aprecia que la velocidad de reaccin (pendiente de la curva) disminuye continuamente a partir de un valor mximo inicial. Esta disminucin puede deberse a diversos factores, como la inactivacin enzimtica, la reversin de la reaccin, la desaturacin respecto al sustrato y la inhibicin por productos. A fin de normalizar su medicin y dado que para lapsos de tiempo cortos, estos factores no inciden, se acostumbra identificar el valor de la actividad enzimtica con el de la velocidad inicial de reaccin. Es precisamente a travs de la medicin de la velocidad inicial que se cuantifica la actividad enzimtica. Luego, se tiene que: actividad v

(3.3)

La actividad enzimtica representa, en consecuencia, el mximo potencial cataltico de la enzima para un conjunto de condiciones ambientales dadas. Sin embargo, cabe sealar que existen situaciones en las cuales no resulta conveniente la cuantificacin de la actividad enzimtica a travs de la medicin de la velocidad inicial de reaccin, como cuando se trata de sustratos heterogneos.

La actividad enzimtica se expresa en trminos de unidades de actividad, definicin propuesta por la Unin Internacional de Bioqumica, conocida como unidad internacional [UI]. Se define una UI como la cantidad de enzima que cataliza la transformacin de un micromol de sustrato por minuto

en condiciones

ambientales definidas (concentracin de sustrato saturante, pH y temperatura ptima). La actividad enzimtica especifica se mide en UI por mg de protena. Para determinar la concentracin de sustrato se debe calcular la absorbancia de la glucosa de acuerdo a un patrn con la siguiente ecuacin:

. Donde:

(3.4)

Luego en conjunto con la curva de calibracin de sustrato se obtiene el valor de la concentracin.

Para reacciones catalizadas por enzimas la velocidad de reaccin viene dada por la ecuacin de Michaelis-Menten: Donde: : :
:

(3.5)

Cuando se trabaja a altas concentraciones de sustrato se tiene que Km<<S por lo tanto se puede suponer que:

(3.6)

Por lo tanto a concentraciones de sustrato altas la pendiente de la ecuacin es la velocidad mxima y la velocidad de reaccin es de primer orden.

4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1. Se ingres al laboratorio de Reactores del Departamento de Ingeniera Qumica del a Universidad de Santiago de Chile.

2.

Se utiliz ropa apropiada, lo cual significa pantalones largos, zapatos y delantal para protegerse.

3.

En el caso de que las personas que experimentaron tuvieran el pelo largo, tuvo que ser amarrado para evitar daarlo con algn qumico y para que no caiga sobre los instrumentos de trabajo.

4.

Antes de comenzar, se cont con cuaderno y lpiz para tomar nota de lo que se realiz durante el experimento y los datos obtenidos.

5.

Determinacin de la actividad de lactasa de Aspergillus oryzae. 5.1 Se enchuf y encendi el bao trmico. 5.1 En un calentador/agitador poner un matraz Erlenmeyer con agua a calentar hasta que el agua hierva y mantenerla en esas condiciones. 5.2 Se prepararon 25 mL una solucin de lactasa a una concentracin de 15 [mg/L]: se agreg 21,25 mL de agua destilada y 3,75 mL de enzima a un vaso precipitado de 250 mL. 5.3 Se coloc 1,8 mL de lactosa (como sustrato) en una concentracin de 100 [g/L] preparada en tampn acetato pH 4,5 0,1 M, en 12 tubos de ensayo, marcados como se muestra en la Figura N 4.1:

Figura N 4.1: Marcas de cada uno de los tubos de ensayo del punto 5.2, donde: A. y B. corresponden a las muestras; .B, los blancos; 0, 2, 5, 10 y 15, tiempos de reaccin dados en el punto 5.5.

5.4 Se incubaron en un bao trmico los tubos de ensayo durante 3 minutos a 40 C para obtener la temperatura a la cual se quiso trabajar. En el caso de los otros grupos, se trabaj a 45 C, 53 C y 60 C. 5.5 Se adicion 0,2 mL de la solucin de lactasa previamente diluida a cada uno de los tubos de ensayo, restando los dos blancos (A.B y B.B). 5.6 Se incub cada tubo durante diferentes tiempos de reaccin: 2, 5, 10 y 15 minutos. 5.7 Se detuvo cada reaccin mediante ebullicin durante 5 minutos. 5.8 Apagar el calentador/agitador y el termorregulador. 5.9 Se observ diferentes colores en cada tubo para los diferentes tubos de reaccin, como se muestra en la Figura N 4.2:

Figura N 4.2: Colores observados en los tubos de ensayo luego de los respectivos tiempos de reaccin.

6.

Determinacin de la concentracin de glucosa en la solucin para cada tiempo de reaccin.

6.1 En un tubo de ensayo, se agreg el reactivo del kit enzimtico y 30 L del tubo A.0. 6.2 Despus de 30 minutos, se midi la absorbancia a 495 nm mediante un espectrofotmetro y anotar los datos para cada tiempo de reaccin. 6.3 Se repitieron los pasos 6.1 y 6.2 con los tubos restantes.

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5. APARATOS Y MATERIALES

Tabla N 5.1: Sustrato utilizado para actividad enzimtica

Lactosa Concentracin 100 [g/L] en tampn acetato pH 4,0 0,1 M

Tabla N 5.2: Solucin tampn utilizada

Tampn acetato Concentracin Componentes 0,1 M cido actico (cido) 0,2 M y acetato de sodio (base) 0,2 M

Tabla N 5.3: Enzima utilizada para la reaccin

Lactasa Fuente natural Modelo Marca Concentracin Hongo Aspargillus oryzae Fungal Lactase ENZECO 100 [mg/L]

Tabla N 5.4: Caractersticas del termorregulador u tilizado

Termoregulador Marca Rango Trilab 25 100 C

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Tabla N 5.5: Caractersticas del calentador agitad or utilizado

Calentador agitador Marca Modelo IKA C- mag HS4

Tabla N 5.6: Cronmetro utilizado

Cronmetro Marca Sensibilidad Sony Ericsson 0,1 [s]

Tabla N 5.7: Caractersticas micropipetas utilizad as

Micropipeta 1 Marca Sensibilidad Marca Sensibilidad Ependorff Arquimed research. Arq. 1 5 (mL) Arquimed 100- 10 (L)

Tabla N 5.8: Caractersticas vasos precipitados ut ilizados

Vaso precipitado 1 2 Capacidad Capacidad 250 (mL) 500 (mL)

Tabla N 5.9: Tubos de ensayo utilizados

Tubo de ensayo Cantidad 24

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Tabla N 5.10: Espectrofotmetro utilizado

Espectrofotmetro Marca Modelo Shimadzu 1605

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6. DATOS

Tabla N 6.1: Absorbancia de muestras A y B a diferentes concentraciones de enzima a 40 C

Temperatura [C] Concentracin [mg/L] 15

40 30

Absorbancia a 495 [nm]

0 Tiempo [min] 2 5 10 15

0,008 0,037 0,076 0,109 0,198

0,01 0,037 0,063 0,105 0,181

0,022 0,088 0,154 0,218 0,295

0,046 0,071 0,161 0,204 0,291

Blanco

0,002

0,008

Tabla N 6.2: Absorbancia de muestras A y B a diferentes concentraciones de enzima a 45 C

Temperatura [C] Concentracin [mg/L] 15

45 30

Absorbancia a 495 [nm]

0 Tiempo [min] 2 5 10 15 Blanco

0,277 0,319 0,308 0,452 0,423

0,354 0,36 0,355 0,386 0,407

0,44 0,549 0,66 0,905 0,999

0,483 0,536 0,7 0,752 1,005

0,375

0,408

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Tabla N 6.3: Absorbancia de muestras A y B a diferentes concentraciones de enzima a 53 C

Temperatura [C] Concentracin [mg/L] 15

53 30

Absorbancia a 495 [nm]

0 Tiempo [min] 2 5 10 15

0,466 0,524 0,614 0,687 0,862

0,446 0,502 0,613 0,695 0,881

0,475 0,53 0,638 0,753 0,809 0,545

0,476 0,552 0,634 0,785 0,862 0,553

Blanco

0,417

0,424

Tabla N 6.4: Absorbancia de muestras A y B a diferentes concentraciones de enzima a 60 C

Temperatura [C] Concentracin [mg/L] 15

60 30

Absorbancia a 495 [nm]

0 Tiempo [min] 2 5 10 15 Blanco 1 Blanco 2

0,031 0,105 0,145 0,183 0,221

0,038 0,115 0,132 0,199 0,226

0,073 0,314 0,508 0,789 0,921

0,072 0,34 0,567 0,793 0,947

0,075 -----

0,078 -----

0,146 0,12

0,152 0,133

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7. RESULTADOS

1800 1600 1400 [Glucosa] [mol/L] 1200 1000

15 [mg/L] de enzima 45C 30 [mg/L] de enzima a 40 C 30 [mg/L] de enzima a 45 C 30 [mg/L] de enzima a 53 C 15[mg/L] de enzima a 40C

800 600 400 200 0 0 5 10 [min] 15 20

15 [mg/L] de enzima a 53C 15 [mg/L] de enzima a 60C 30 [mg/L] de enzima a 60C

Grfico 7.1: Muestra la concentracin de glucosa versus el tiempo de reaccin para una concentracin de enzima de 15 [mg/L] y 30 [mg/L] a distintas temperaturas.

Velocidad de reaccin [molL-1 min-1]

120,000 100,000 80,000 60,000 40,000 20,000 0,000 30 40 50 Temperatura[C] 60 70

[Enzima] 15 [mg/L] [Enzima] 30 [mg/L]

Grfico 7.2: Muestra curva de velocidad de reaccin en funcin de la temperatura a distintas concentraciones de enzimas 15 [mg/L] y 30 [mg/L]

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Tabla N 7.3: Muestra los valores de actividad enzimtica especfica promedio para las distintas temperaturas

Actividad enzimtica especfica [UI/mg de enzima]

Temperatura [C] 40 45 53 60

1,319

1,681

2,470

2,378

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8. DISCUSIN
8.1 Al analizar el grfico 7.1 que muestra la concentracin de glucosa versus el

tiempo de reaccin para una concentracin y temperatura de enzima determinada, al aumentar el tiempo aumenta la concentracin de glucosa lo que indica que hay catlisis enzimtica y que a mayor concentracin de enzimas mayor concentracin de glucosa a un tiempo exceptuando la curva de 53C a una concentracin enzimtica de 30[mg/L]. En tanto se puede observar que a diferencia de lo esperado, las velocidades de produccin de glucosa no fueron delimitadas intrnsecamente solo por la concentracin de enzima y de temperatura de trabajo, ya que en teora se debiese dar que a mayor concentracin de enzima mayor debi haber sido la produccin de glucosa en funcin del tiempo a una temperatura determinada, lo cual no sucedi como por ejemplo para el caso de temperatura 53 C y 30 mg/L de enzima, que temperaturas menores obtuvieron mayores concentraciones de glucosa en tiempo, como por ejemplo a 45 C siendo que la temperatura terica ptima de trabajo 53 C, por lo que generara en primera instancia que no es posible encontrar una en relacin entre lo que expresa la teora sobre la concentracin de enzima y la temperatura con los resultados obtenidos en esta experiencia ya que habran otros factores que incidiran. Ahora, para estas curvas se esperaban rectas al menos al inicio de la reaccin puesto que tericamente a altas concentraciones de sustrato se debiera estar en el rango lineal teniendo su origen en el punto (0,0), minimizando las posibles inhibiciones por producto, evitando la desaturacin de sustrato y tambin la posible reversibilidad de la reaccin, esta condicin se cumple para la mayora de las curvas exceptuando la de concentracin de enzima de 15 [mg/L] a 45C, de la cual se deduce que la enzima utilizada es impura debido a la concentracin de glucosa presentada en el tiempo cero. En cuanto a las irregularidades curva de concentracin de glucosa en el tiempo contrastando con la temperatura, como la de 53C y concentracin enzimtica de 30[mg/L] lo cual nos indicara posiblemente la presencia principalmente de una inactivacin enzimtica y en un segundo plano problemas con los componentes visto del punto de vista de poca

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pureza ya que como se puede observar en el grafico 7.3 no presenta actividad en los primeros minutos. 8.2 Para el caso del grafico 7.2 de la velocidad inicial de reaccin en funcin de la

temperatura, se puede extraer que para el caso de 15 mg/L de enzima logra su temperatura ptima de trabajo a los 53 C aproximada mente, cabe recordar que la temperatura optima de trabajo corresponde a los 53C segn la teora,por lo cual estara completamente correcto. Para el caso de 30 mg/L de enzima no es posible obtener un optimo de temperatura debido a que la curva que se obtiene expresa el punto a los 60 C que en teora si se extrapolase se obtendra otro pick, esto se desliga completamente de la teora que para este tipo de curvas se debiesen obtener parbolas con pendiente negativa que exhiben solo un mximo, y que si a esto le sumamos por una parte la sensibilidad de las enzimas a la temperatura, ya que uno al mirar la curva podra decir que a mayor temperatura pasando los 60C mayor velocidad siendo que mientras ms nos alejamos de los 53C la enzima en teora debiese estar cada vez mas inactivada por desnaturacin, y por otra parte siendo que a 53 C debi por teora dar la mayor velocidad inicial de reaccin y sorprendentemente dio una velocidad bajsima muy cercana a la velocidad de a 40 C, se reafirma d e que el comportamiento de esta curva esta completamente errtico en relacin a la teora, ahora, es posible que este comportamiento est dado por una inactivacin parcial de la enzima generada por un mal empleo de esta o que simplemente se encontraba defectuosa, ya que al analizar el grafico B.2 que en teora se debiesen comportar que al duplicar la concentracin de enzima la velocidad se debiera aumentar, pero solo para la velocidad a 53 C y a 30 mg/L de enzima la temperatura disminuye generando as el punto errado en nuestra curva 7.2. Es por todo lo anterior que probablemente los datos fueron mal tomados o hubieron errores experimentales y/o en la enzima que se trabajo a esta temperatura y concentracin se encontraba inactivada parcialmente o defectuosa lo que genero este defecto en la grafica 7.2. 8.3 De acuerdo a la tabla 7.3 se observa que los valores de actividad especfica promedio aumenta al subir la temperatura hasta tener su valor mximo 2,470 UI/mg de enzima a 53 C, y luego baja a los 2,378 UI/mg de enzima a los 60 C lo que concuerda

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con la teora ya que a pH cido 4,5 y a esta temperatura la lactasa posee las condiciones optimas para la reaccin enzimtica. Si bien es cierto este valor debiese ser mucho ms alto a una temperatura mayor, que el obtenido se debe principalmente a que a las condiciones de 30 mg/L de enzima a esta temperatura se obtuvo una actividad enzimtica baja debido a que es un valor ponderado, estas inferencias fueron discutidas en el punto 8.2 debido principalmente a la inactivacin parcial a esas condiciones. 8.4 Las fallas en las mediciones de algunos grupos pueden ser errores en los procedimientos usados por la mayora de los grupos, a partir de posibles errores humanos en las cantidades agregadas de sustrato, enzima, etc. Que si bien fueron medidos usando una micro pipeta, pueden haber errores de uso tales como la presencia de burbujas y/o aire en vez de sustrato o enzima, la presencia de contaminaminantes en las muestras, falta de adecuacin de las cubetas de absorbancia, la reutilizacin de las puntas de las micropipetas, etc. Que finalmente el conjunto de todos estos factores pueden generar errores significativos.

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9. CONCLUSIN

9.1

La relacin entre concentracin de glucosa versus el tiempo de reaccin para

una concentracin y temperatura de enzima determinada es directamente proporcional. 9.2 La enzima utilizada para la curva a 15 [mg/L] a 45C estaba en condiciones

impuras. 9.3 La curva de concentracin enzimtica de 30[mg/L] y 53 C presenta

principalmente inactivacin enzimtica. 9.4 La temperatura ptima de trabajo para la enzima de concentracin 15 mg/L

corresponde a 53C. 9.5 El valor la variacin de la velocidad de reaccin en funcin de la temperatura

tiene un comportamiento parablico y encuentra su mxima temperatura a los 53 C. 9.6 53 C. El valor de actividad especfica promedio mximo es 2,470 [UI/mg de enzima] a

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10. RECOMENDACIONES

10.1

Utilizar al menos 2 replicas para cada corrida experimental, para obtener valores

de velocidad ms representativos. 10.2 Tomar a intervalos de tiempos cortos para as trabajar en la zona lineal.

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11. NOMENCLATURA
Tabla N 11.1: Nomenclatura utilizada.

SMBOLO

DESCRIPCIN

UNIDADES EN SI

A B .B E P S t UI v

Muestra A Muestra B Blanco Enzima Producto Sustrato Tiempo Unidad Internacional: medicin de actividad enzimtica Velocidad de reaccin

------------------------s mol min mol s

Tabla N 11.2: Subndices utilizados.

SMBOLO R E .B

DESCRIPCIN Real Experimental Blanco

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12. BIBLIOGRAFA

1. Acevedo, F.; Gentina, J.C.; Illanes, A.; Fundamentos de Ingeniera Bioqumica, 2 edicin, Ediciones Universitarias de Valparaso, Pontificia Universidad Catlica de Valparaso; Valparaso, Chile (2002). 2. Broadhurst, T.E. y H.A. Becker, "Onset of Fluidization and Slugging in Beds of Uniform Particles", AIChE J., 21, 238 (1975).

3. Kunii, D. y O. Levenspiel, "Fluidization Engineering", 2da Edicin, ButterworthHeinemann, Boston (1991).

4. Levenspiel, O; Flujo de fluidos e intercambio de calor, Revert, Espaa (2003)

3 edicin, Editorial

5. McCabe, W. L. y col.; Operaciones unitarias en Ingeniera qumica: 4 edicin, Editorial Mc Graw Hill, Madrid (1996).

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13. APNDICE
Apndice A: Clculo de datos A.1 Clculo de la concentracin de glucosa en el tiempo.

A.1-1 Clculo de la absorbancia real. Como la absorbancia no es un valor absoluto se utiliza un patrn en este caso el blanco para determinar su valor. Segn la ecuacin (3.4) . Se tomarn como ejemplo de clculo, datos de la tabla 6.1 a Concentracin de enzima de 15 mg/L para la muestra A y a tiempo de reaccin igual a 0 minutos. 0,008 0 0,008 Este dato se encuentra en la tabla B.2

A.1-2 Clculo de la absorbancia promedio. Para determinar un valor representativo para ambas corridas experimentales A y B sometidas a las mismas condiciones se calcular el promedio de las absorbancias.

Como ejemplo de clculo se utilizar la tabla B.2 a tiempo de reaccin igual a 0 minutos. 0,008 0,01 0,009 2

Este dato se encuentra en la tabla B.2.

A.1-3 Clculo de la concentracin de glucosa.

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Para determinarlo se utilizar la ecuacin determinada con la curva de calibracin de la glucosa, que se encuentra en la tabla D.1 360,8293 Como ejemplo de clculo se utilizar la tabla B.2 para concentracin de enzima de 15 mg/L y a un tiempo de 0 minutos. El resultado quedar expresado en la misma. 360,8293 0,009 3,247 Pero el resultado quedar expresado en moles/L 3,247 1000 180

18,041

Se grafic la concentracin de glucosa en funcin del tiempo de reaccin a distintas temperaturas y a distintas concentraciones de enzima con Microsoft Excel. (Grfico 7.1)

A.2 Determinacin de la velocidad de reaccin. Para este objetivo se utiliza la ecuacin 3.6 y con los grficos D.2 al D.9 se determina el valor de la pendiente la cual corresponde a la velocidad para cada uno de ellos. Los valores de la velocidad estn en la tabla B.6.

Luego se grafica con Microsoft Excel velocidad de reaccin en funcin de la temperatura a distintas concentraciones de enzima (Grfico 7.2)

A.3 Determinacin de la actividad enzimtica. Para este clculo se utiliza la expresin de actividad especfica las velocidades de reaccin (UI) [mol/min], determinadas en el punto A.2 a distintas temperaturas.

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Como ejemplo utilizaremos la tabla B.6 para una temperatura de 40 C y concentracin enzimtica de 15 [mg/L] 22,843 15 1,5229

Luego para determinar un valor representativo para cada temperatura se calcula el promedio para ambas concentraciones enzimticas. 1,5229 1,1158 1,319 2

Este dato se encuentra en la tabla 7.3 y B.7.

Apndice B: Clculos intermedios

Tabla N B.1: Datos curva de calibracin de concentracin de glucosa [mg/L] vs absorbancia a 495 [nm]

[Glucosa] [mg/L] 0 20 50 80 100

Absorbancia a 495 [nm] 0 0,055 0,135 0,215 0,284

Tabla N B.2: Valores de absorbancia a 495 nm y concentracin de glucosa para las muestras A y B a concentraciones de 15 y 30 [mg/L] de enzima a 40C.

Temperatura 40 C Absorbancias a 495 nm [min] AR 15 0,008 0,037 0,076 0,109 0,198 30 0,020 0,086 0,152 0,216 0,293 BR 15 0,010 0,037 0,063 0,105 0,181 30 0,038 0,063 0,153 0,196 0,283 15 0,0090 0,0370 0,0695 0,1070 0,1895

30 0,0290 0,0745 0,1525 0,2060 0,2880

Concentracin glucosa [mg/L] 15 3,247 13,351 25,078 38,609 68,377 30 10,464 26,882 55,026 74,331 103,919 [mol/L] 15 18,04 74,17 139,32 214,49 379,87 30 58,13 149,34 305,70 412,95 577,33

Concentracin de enzima [mg/L]

0 2 5 10 15

Tabla N B.3: Valores de absorbancia a 495 nm y concentracin de glucosa para las muestras A y B a concentraciones de 15 y 30 [mg/L] de enzima a 45C.

Temperatura 45 C AR 15 0 2 5 10 15 0,277 0,319 0,308 0,452 0,423 Absorbancias a 495 nm BR 30 0,065 0,174 0,285 0,530 0,624 15 0,354 0,360 0,355 0,386 0,407 30 0,075 0,128 0,292 0,344 0,597 15 0,3155 0,3395 0,3315 0,4190 0,4150

[min]

Concentracin de enzima [mg/L] 30 0,0700 0,1510 0,2885 0,4370 0,6105 15 113,842 122,502 119,615 151,187 149,744 30 25,258 54,485 104,099 157,682 220,286 15 632,45 680,56 664,53 839,93 831,91 30 140,32 302,70 578,33 876,01 1223,81

Concentracin glucosa [mg/L] [mol/L]

28

Tabla N B.4: Valores de absorbancia a 495 nm y concentracin de glucosa para las muestras A y B a concentraciones de 15 y 30 [mg/L] de enzima a 53C.

Temperatura 53 C Absorbancias a 495 nm [min] 15 0 2 5 10 15 0,049 0,107 0,197 0,270 0,445 AR 30 0,000 0,000 0,093 0,208 0,264 15 0,022 0,078 0,189 0,271 0,457 BR [mg/L] Concentracin de enzima [mg/L] 30 0,000 0,000 0,081 0,232 0,309 15 0,0355 0,0925 0,1930 0,2705 0,4510 30 0,0000 0,0000 0,0870 0,2200 0,2865 15 12,809 33,377 69,640 97,604 162,734 30 0,000 0,000 31,392 79,382 103,378

Concentracin glucosa [mol/L] 15 71,16 185,43 386,89 542,25 904,08 30 0,00 0,00 174,40 441,01 574,32

Tabla N B.5: Valores de absorbancia a 495 nm y concentracin de glucosa para las muestras A y B a concentraciones de 15 y 30 [mg/L] de enzima a 60C.

Temperatura 60 C AR 15 0,000 0,030 0,070 0,108 0,146 Absorbancias a 495 nm BR 15 0,000 0,037 0,054 0,121 0,148 30 0,000 0,188 0,415 0,641 0,795 15 0,0000 0,0335 0,0620 0,1145 0,1470

[min]

Concentracin de enzima [mg/L] 30 0,000 0,168 0,362 0,643 0,775 30 0,0000 0,1780 0,3885 0,6420 0,7850 15 0,000 12,088 22,371 41,315 53,042 30 0,000 64,228 140,182 231,652 283,251 15 0,00 67,15 124,29 229,53 294,68 30 0,00 356,82 778,79 1286,96 1573,62

Concentracin glucosa [mg/L] [mol/L]

0 2 5 10 15

Tabla N B.6: Muestra los valores de velocidad de reaccin a distintas concentraciones de enzimas y temperaturas experimentales.

[Enzima][mg/L] 15 30

Velocidad a distintas temperatura [C] 40 45 53 60

22,843 33,475 14,783 71,306 53,044 42,109 19,377

103,930

29

Tabla N B.7: Muestra los valores de actividad enzimtica especfica para las distintas temperaturas

Temperatura [C]

Actividad enzimtica especfica [UI/mg de enzima]

40

45

53

60

1,5229 1,1158 1,319

0,9855 2,3769 1,681

3,5363 1,4036 2,470

1,2918 3,4643 2,378

30

Apndice C: Datos bibliogrficos

Peso molecular glucosa = 180 gr/mol.

31

Apndice D: Grficos
120 100 [Glucosa] [mg/L] 80 60 40 20 0 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3

Absorbancia 495 [nm]

Grfico D.1: Curva de calibracin obtenida de concentracin de glucosa [mg/L] vs absorbancia a 495 [nm]

Tabla D.1: Muestra el ajuste lineal de la calibracin obtenida de concentracin de glucosa [mg/L] vs absorbancia a 495 [nm]

Ecuacin de la recta [Glucosa] = 360,8293 * Abs

0,9980

400 350 [Glucosa][mol/L] 300 250 200 150 100 50 0 0 2 4 6 8 [min]

Grfico D.2: Muestra la concentracin de glucosa en funcin del tiempo de reaccin para una concentracin de 15 [mg/L] de enzima a 40C

10

12

14

16

32

Tabla D.2: Muestra el ajuste lineal del grfico D.2

Ecuacin de la recta [Glucosa] = 22,803 +19,24

0,9706

700 600 [glucosa] [mol/L] 500 400 300 200 100 0 0 2 4 6 8 [min]
Grfico D.3: Muestra la concentracin de glucosa en funcin del tiempo de reaccin para una concentracin de 30 [mg/L] de enzima a 40C.

10

12

14

16

Tabla D.3: Muestra el ajuste lineal del grfico D.3

Ecuacin de la recta [Glucosa] = 33,475 +86,451

0,9783

33
900 800 [glucosa] [mol/L] 700 600 500 400 300 200 100 0 0 2 4 6 8 [min]
Grfico D.4: Muestra la concentracin de glucosa en funcin del tiempo de reaccin para una concentracin de 15 [mg/L] de enzima a 45C Tabla D.4: Muestra el ajuste lineal del grfico D.4
2

10

12

14

16

Ecuacin de la recta [Glucosa] = 14,783 + 635,26

0,8422

1400 1200 [glucosa] [mol/L] 1000 800 600 400 200 0 0 2 4 6 8 [min] 10 12 14 16

Grfico D.5: Muestra la concentracin de glucosa en funcin del tiempo de reaccin para una concentracin de 30 [mg/L] de enzima a 45C. Tabla D.5: Muestra el ajuste lineal del grfico D.5
2

Ecuacin de la recta [Glucosa] = 71,306 + 167,88

0,9948

34
1000 900 800 [glucosa] [mol/L] 700 600 500 400 300 200 100 0 0 2 4 6 8 [min] 10 12 14 16

Grfico D.6: Muestra la concentracin de glucosa en funcin del tiempo de reaccin para una concentracin de 15 [mg/L] de enzima a 53C Tabla D.6: Muestra el ajuste lineal del grfico D.6
2

Ecuacin de la recta [Glucosa] = 53,044 + 78,478

0,9830

700 600 500 [glucosa] [mol/L] 400 300 200 100 0 -100 0 2 4 6 8 [min] 10 12 14 16

Grfico D.7: Muestra la concentracin de glucosa en funcin del tiempo de reaccin para una concentracin de 30 [mg/L] de enzima a 53C Tabla D.7: Muestra el ajuste lineal del grfico D.7
2

Ecuacin de la recta [Glucosa] = 42,109 -31,55

0,9739

35
350 300 [glucosa] [mol/L] 250 200 150 100 50 0 0 2 4 6 8 [min] 10 12 14 16

Grfico D.8: Muestra la concentracin de glucosa en funcin del tiempo de reaccin para una concentracin de 15 [mg/L] de enzima a 60C Tabla D.8: Muestra el ajuste lineal del grfico D.8
2

Ecuacin de la recta [Glucosa] = 19,377 + 19,116

0,9821

1800 1600 [glucosa] [mol/L] 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 0 2 4 6 8 [min] 10 12 14 16

Grfico D.9: Muestra la concentracin de glucosa en funcin del tiempo de reaccin para una concentracin de 30 [mg/L] de enzima a 60C

Tabla D.9: Muestra el ajuste lineal del grfico D.9

Ecuacin de la recta [Glucosa] = 103,930 + 134,110

0,9635

36