UNIVERSIDAD AUTNOMA DEL ESTADO DE MXICO FACULTAD DE QUMICA QUMICO FARMACUTICO BILOGO Parasitologa

Medio de Keister modificado para el cultivo de Giardia lamblia in vitro.

INTRODUCCION El primer protozoo parsito fue visto en 1681 por Anthony van Leeuwenhoek en su rudimentario microscopio, en una muestra de sus propias materias fecales que correspondi al flagelado Giardia Blanchard en 1885 observ parsitos similares en renacuajos y los llamo Giardia agulis, en honor al zologo Alfred giard que nada tuvo que ver con el parsito, Blanchard en el mismo ao recoci a Lambl como sus descubridor y lo denomin Lablia intestinalis. CLASIFICACIN GIARDIA Hasta ahora, los estudios moleculares han identificado diversas especies y 7 - 8 tipos genticos, Especies: G. duodenalis - principalmente en mamferos; G. agilis - en anfibios; G. ardeae y G. psittaci - en aves; G. microti y G. muris - en roedores. Giardia duodenalis (Sn: G. lamblia; G. intestinalis) es el nombre del protozoo flagelado del phylum Sarcomastigophora, subphylum Mastigophora, protozoariso que presentan flagelos y membranas ondulantes. Tiene 4 pares de flagelos que nacen de estructuras denominadas blefaroblastos (anterior, posterior, neutral y caudal), es agente causal de la giardiasis. una parasitosis de intestino delgado proximal, cosmopolita, que puede manifestarse como un sndrome diarreico agudo, crnico o intermitente. Tambin existe el estado de portador asintomtico. Giardia lamblia presenta dos formas morfolgica: el trofozoto o forma mvil y el quiste, una forma pequea que resiste las condiciones medio ambientales adversas. La forma mvil se encuentra como parsito en el tubo digestivo del hombre t la forma de resistencia es expulsada en la materia fecal y se encuentra en el medio ambiente. El trofozoto tiene forma simtrica bilateral, es periforme (extremo anterior ancho y extremo posterior delgado, dimetro mayor 12 micras aproximadamente. En la parte anterior tienen una estructura llamada disco suctor, que le permite adherirse al epitelio intestinal, con una parte rgida llamada axolema o axostilo, con funcin de esqueleto. En la parte del ncleo sector presenta dos ncleos idnticos y ovalados con una enorme masa de cromatina central. En la parte media se encuentran los cuerpos parabasales y no contiene citosoma, por lo que tienen que absorber nutrientes mediante endocitosis. El quiste es una estructura ovalada ms pequea que puede medir desde 6 a 7micras hasta 10 o 12. Tiene como carcter fundamental ser la fase de resistencia que le permite vivir en el medio ambiente, esta

caracterstica es gracias a la pared gruesa llamada pared qustica. En el interior del citoplasma contiene ncleos, los maduros tienen 4 y los inmaduros dos. CICLO BIOLOGICO: Los trofozotos se localizan ene l intestino delgado, fijados a la mucosa, principalmente en el duodeno. All se multiplican por divisin binaria aumentan el pH del estmago y el nivel de colesterol cae y los que caen a la luz intestinal dan origen a quistes, debido a que los trofozotos no sobreviven fuera del husped y comienzan a cambiar su forma con procesos de enquistacin de vesculas especficas. Durante la fase de enquistacin cuando las protenas de la pared del quiste son excretadas al superficie del trofozoto, algunas escapa y pueden ser identificadas mediante pruebas antgeno-anticuerpo Los quistes son eliminados con las materias fecales y pueden permanecer viables en el suelo hmedo o en el agua por varios meses. Infectan por va oral y despus de ingeridos resisen la accin del jugo gstrico y se rompen en el intestino delgado para dar origen a 4 trofozotos por cada quiste. Los trofozotos no son infectantes cuando entran por va oral, La enquistacin ocurre conforme el parsito es arrastrado por el trnsito intestinal hacia el colon. El quise es el estado que se encuentra ms comnmente en las heces formadas. Sale en forma de trofozoto cuando no le da tiempo de transformase en quiste, esto por trnsito intestinal acelerado.

PATOLOGIA
El principal mecanismo de accin patgena en giardiasis se debe a la accin de los parsitos sobre la mucosa del intestino delgado, principalmente el duodeno y yeyuno. Esta accin se hace por fijacin de los trofozotos por medio de la ventosa, permite penetrar un poco la mucosa, generando absorcin deficiente de los nutrientes, se observa tambin la secrecin de moco como producto de la irritacin que produce la presencia de los trofozotos en la pared del epitelio intestinal. Ese moco genera una doble obstruccin para la absorcin y provoca adems una reaccin inflamatoria. En este casos las vellosidades intestinales se encuentran atrofiadas, hay inflamacin de la lmina propia y alteraciones morfolgicas de las clulas epiteliales. Las pruebas de absorcin de vitaminas A, B12 y la D-xilosa estn alteradas Se ha relacionado la patologa de esta parasitosis con la presencia de hipogammaglobulemia, principalmente deficiencia de IgA secretora. Algunos casos de giardiasis grave se han asociado con la presencia de hiperplasia nodular linfoide en intestino delgado y grueso. No se acepta que haya invasin en vas biliares y por consiguiente no es correcto atribuirle patologa hepato-billiar. La sintomatologa de la giardiasis, principalmente es diarrea, tiene mecanismos multifactoriales , podemos dividir en dos grupos a.- lesiones de la mucosa: la alteracin de las vellosidades intestinales que pueden ser a su vez por atrofia e inflamacin con aumento de linfocitos o por la presencia de productos secretorios y excretores de los parsitos que lesiones los enterocitos B.- Factores luminales: estos pueden dividirse en dos grupos : 1 aumento de la flora bacteriana, con capacidad de desdoblar sales biliares y dificultar absorcin . 2 disminucin de enzimas como disacaridas, tripsina y lipasa que aumentan la eliminacin de grasa y contribuyen a la malabsorcin de electrolitos, solutos y agua. Los cuadros clnicos oscilan entre el estado de portador asintomtico y las enfermedades aguda y crnica. El perodo de incubacin es de 1 - 2 semanas. Un gran porcentaje de personas presenta infecciones asintomticas, con malabsorcin intestinal imperceptible.. Entre las manifestaciones de la enfermedad aguda se encuentran: diarrea acuosa o pastosa, esteatorrea (evacuaciones grasosas, generalmente explosivas y ftidas), dolor epigstrico postprandial, anorexia, distensin abdominal, flatulencia y ocasionalmente, cefalea, febrcula, manifestaciones alrgicas (artralgias, mialgias, urticaria). La enfermedad aguda puede resolverse en unas semanas, an sin tratamiento, pero un porcentaje importante de pacientes desarrolla una parasitosis crnica, con diarrea recurrente, esteatorrea, evidencia bioqumica de malabsorcin de grasas, lactosa y otros disacridos, vitamina A y vitamina B12, disminucin de peso y deficiencias en el crecimiento y desarrollo infantil. Tambin se ha asociado a Giardia y a otros protozoos con el sndrome de intestino irritable.

FISIOPATOLOGIA

ESPECTRO CLNICO.

Diagnstico diferencial: Deben contemplarse rotavirus, adenovirus, Campylobacter, E. histolytica, Cryptosporidium, Escherichia coli enteropatgena, Strongyloides stercoralis, enfermedad celiaca, lcera duodenal. - Antecedentes epidemiolgicos y cuadro clnico. - Observacin microscpica de trofozotos (en materia fecal acuosa - mediante el examen directo en fresco, con solucin salina y lugol) y quistes (en materia fecal slida o semislida - se utilizan exmenes coproparasitoscpicos de concentracin por flotacin), estudios de baja sensibilidad y alta especificidad. - ELISA para captura de coproantgenos e inmunoelectrotransferencia. - Tcnicas basadas en la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). - Procedimientos seguros cuando son realizados por profesionales, y que constituyen un recurso ms en el diagnstico de giardiasis son la endoscopa con examen de contenido duodenal y biopsia intestinal.

DIAGNSTICO.

Segn publicaciones de la OMS, ms de la quinta parte de la poblacin mundial est infectada por uno o varios parsitos intestinales y en muchos pases de Amrica Central y Sudamrica el promedio de infecciones parasitarias es del 45%. Se estima en 1000 millones las personas infectadas por Ascaris lumbricoides, 500 millones con Trichuris trichiura, 480 millones con Entamoeba histolytica y 200 millones con Giardia lamblia. Se estima que alrededor de 200 millones personas presentan la enfermedad en Asia, frica, Latinoamrica, con 500 000 casos nuevos/ao. (Thompson RCA. 2008) desde 1960 la giardiasis se ha asociado a brotes epidmicos importantes en pases altamente industrializados, por ingesta de agua contaminada y en guarderas. Actualmente, se reporta un aumento en el nmero de casos. Afecta a diversos mamferos, anfibios, reptiles y aves. Los animales domsticos y el ganado representan reservorios potenciales importantes de Giardia (se ha hecho mencin de brotes zoonticos aislados). Cabe resaltar que en Mxico, la prevalencia (7.4 - 68.5%) e incidencia ms altas se encuentran entre lactantes, preescolares y escolares. La prevalencia en zonas endmicas es dos a tres veces mayor en nios que en adultos, atribuible a la adquisicin de anticuerpos protectores, por infecciones repetidas La prevalencia y sintomatologa son mayores en adultos extranjeros que visitan zonas endmicas, comparadas con adultos nativos de la regin. 3.- Pacientes con hipogammaglubulinemia presentan mayor frecuencia de diardiasis y mayor sintomatologa. En el diagnstico clnico, el cultivo de los protozoarios parsitos no juega un papel importante, la microscopia sigue siendo la tcnica de eleccin har identificacin de la mayora de ellos, aunque no es posible el cultivo in vitro de todos los protozoarios parsitos, algunos de se pueden aislar y cultivar en medio de cultivo.

EPIDEMIOLOGIA

MEDIO DE CULTIVO

La importancia de medios de cultivo de protozoarios es principalmente por motivos de investigacin de las especies de dichos organismos. Hay tres tipos bsicos de sistemas de cultivos XENICO: En el cual el parasito es cultivado en presencia de una flora indefinida Monoxenico: en el cual el parasito es cultivado en ausencia de cualquier organismo Polixenico: cultivos de los cuales es conocida la identidad de todas las especie presentes. El cultivo in vitro de Giardia lamblia ha sido reportado de mucha importancia por los investigadores, ya que el estudio de varias cepas especialmente aquellas que parasitan al hombre, permite el aislamiento de rutina del organismo del hospedero, mejorado as el abordaje diagnstico de esta enfermedad, adems de que ayuda a adentrarse mejor en su clasificacin y epidemiologia. Se ha cultivado Giardia lamblia con xito, los medios de cultivo se han ido modificando adaptndolos a la cepa, con sus ventajas y limitaciones. Hasta la fecha se ha utilizado 3 medios bsicos de cultivo TPS-1 (Tripticase, panmede, serum), TYI-S-33 (trypticase, yeast extrac, irno-serum) y el medio libre de suero. En 159 Karepetyan logr cultivar Giardia lablia junto con hongo parecido a la levadura, utilizando un cultivo con fibroblastos de pollo. Un caldo hecho con extracto de embrin de pollo, suero humano, digerido de carne y solucin de hanks. El cultivo duro 7 meses, y los parsitos continuaron su reproduccin aun cuando los fibroblastos hubieran muerto. En cultivo axenico, el microorganismo mora en un intervalo de 1 a 2 das, el investigar supuso que para su crecimiento la guardia utilizaba substancias producto de las levaduras. En 1965 meyer intento cultivar guardia utilizando el mtodo de karapetyan; sin embargo, los trofozotos persistieron en el tubo de cultivo de cuatro a 7 das, ninguno sobreviva ms de 11 das. Atribuyo que S.cerevisiae de karapetyan se multiplicaba con ms rapidez que la de ellos, proporcionando al cultivo ms productos metablicos. Meyer resolvi el problema agregando diariamente ms levadura al medio. Mantuvo el cultivo de guardia por 18 meses. Ms tarde Panmede y diamond encontraron que el extracto de levadura suplementado con hierro, vitamina b12, cido tctico y tween 80 era el sustituto apropiado para incrementar la eficacia le llamaron TYI-33. En 1983, David Keister desarrollo un medio de cultivo en donde usa como base el medio TY-S-33 de Diamond, combinndolo con bilis bovina para axenizar y cultivar giardia lablia, tomando en cuenta que este parasito habita en la parte superior del intestino delgado, quiso comprobar si la bilis favoreca su crecimiento, encontrado que , efectivamente, al agregar bilis cruda aumentaba el crecimiento del parasito, se suprimi el uso de la mezcla de vitaminas y tween 80 del medio TYI-S-33 ya que este no favoreca el creciente de giardia. Este medio de cultivo se utiliza en el CDC (center of diease control). Se hace una mezcla de fuente primaria para crecimiento, como el requerimiento de carbohidratos mediante el uso de glucosa, el requerimiento proteico con el uso de digerido pancretico de casena una protena usada como de almacenamiento fcil de degradar y por lo tanto poder permitir la ingesta de aminocidos, hidrocloruro de cistena, la cual ayuda tambin como fuente de Azufre, suplementos vitamnicos con el extracto de levadura ya adems de que cuenta con un alto contenido proteico por lo tanto complementa la ingesta proteica junto con la casena, cuenta con un gran nmero de vitaminas del complejo B, y cuenta tambin con algunos factores de crecimiento. El fosfato y di fosfato se utilizan para crear un ambiente amortiguador en el medio y mantener el pH entre 7 y 7.2 cloruro de sodio se utiliza para regular la presin osmtica de la solucin y no crear lisis celular. El cido ascrbico y el cloruro frrico de amonio son factores de crecimiento que se utilizan en menor cantidad, pero necesarios para el buen desarrollo de las clulas parasticas. Como fuente de nitrgeno, vitamina C e Hierro. El sulfato de estreptomicina y la ampicilina al ser antibiticos de amplio espectro evitar crecimiento bacteriano principalmente gram (-) que habita de forma muy abundante en el colon y que por tener un crecimiento mucho ms acelerado que los parsitos compiten por los nutrientes en el medio invadindolo en horas y no permiten el desarrollo de los parsitos.

Fundamento de medio de cultivo:

Dos componentes muy importantes son la bilis deshidratada y el suero desnaturalizado ambos de origen bovino, debido a que la bilis le genera la enquistacin de Giardia intestinalis, regulando ms el cultivo, y el suero bovino est altamente enriquecido con componentes proteicos y colesterol que son muy necesarios para el desarrollo del parasito, como en el suero se encuentran todos los componentes nutrimentales del animal, y Giardia lamblia, parasita estos animales se concluye que adicionando con suero bovino es cmo manejar un ambiente en nutrimentos ms parecidos al del animal, por si algn componente que tiene el suero no se puede adicionar de forma sinttica, porque se desconoce, pero que al adicionar el suero bovino se han visto resultados de incremento en produccin de parsitos, que con suero humano, quizs por presencia de anticuerpos, y que en ausencia de suero. En algunos casos se recomienda el uso de tejido viseral de pollo debido a que el parasito se alimenta de clulas epiteliales del intestino delgado. Detalles del medio de cultivo AQU LO DE PAGUINA 19

1.-MEDIO DE CULTIVO DE KEISTER Materiales y reactivos SOLUCIN #1 - I g Fosfato dibsico de potasio (K2HPO4) - 600 mg Fosfato monobsico de potasio (KH2PO4) - 30.8 gramos de biosato (BBL) (preparado especial que contiene 65% de digerido pancretico de casena y 35% de extracto de levadura, y fabricado especialmente para estos medios de cultivo) -2g de Cloruro de Sodio -22.8 mg citrato frrico de amonio (Sigma) -750 mg bilis bovina deshidratada (Sigma) SOLUCIN #2 -10 g de glucosa -200 mg cido ascrbico -2 g de Hidrocloruro de cistena (Sigma)

- 100 mL de agua destilada SOLUCIN #3 -Hidrxido de Sodio 2N Aparte: 100 mL de suero bovino inactivado (56oC por 30 min). (Sigma) Mantener congelado. -1g de Sulfato de estreptomicina -1milln de unidades de Penicilina G Potsica -Filtros Nalgene para esterilizar de 0.45 m -tubos para cultivo de 16 x 100 mm - Erlenmeyer de 500 y 1000 mL - Probetas - Mezcaldor -Balanza analtica -Incubadora de Baja Temperatura -Refrigeradora -Agitador -Potencimetro Procedimiento: 1.- Para preparar la solucin #1 se mezclaron uno a uno los reactivos, en el orden de aparecimiento, a 890 mL de agua destilada, Se ajust el pH entre 7.0-7.2 con hidrxido de sodio, fue esterilizado en autoclave (121C,15min) y se almacen congelado en frascos estriles, hasta su utilizacin. 2.- Para la solucin #2 se mezclaron los ingredientes. Se esteriliz por filtracin y se almacen congelado, hasta utilizarse. 3.- La solucin #3 se esteriliz en autoclave y fue almacenada en un frasco estril, a temperatura ambiente. 4.- Estreptomicina: se diluy con agua destilada para obtener una solucin 12mg por 0.2 mL. Penicilina G Potsica: se diluy con agua destilada para preparar una solucin de 12,000 unidades por 0.2 mL. Se esterilizaron ambas por filtracin y se almacenaron congeladas en cantidades de 2mL, hasta su utilizacin. 5.- Unos minutos antes de inocular, se colocaban en bao Mara, a 37 grados Centgrados, la solucin 1, 2 y 3, el suero y los antibiticos. Se pepararon los tubos con el medio, bajo condiciones estriles, de la siguiente forma: Solucin A: 13ml Solucin B: 1.5 mL Suero: 1.5 mL Estreptomicina: 0.2 mL Penicilina0.2 mL Inoculacin de los medios: Los medios se dispensan en tubos de vidrio de 13x100 mm, con tapa de rosca, llenndolos al 90% de su capacidad total, se inocularon con 0.5ml de suspensin de trofozoitos de G. lamblia 2.-DESNQUISTACION: 3.-METODO GENERAL Materiales Microscopio de luz Portaobjetos Cubreobjetos Lugol Pipetas Incubadora Procedimiento:

Despus de verificar y comprobar que el proceso de desenquistacion ha sido efectivo examinando muestras en el microscopio de luz, y teniendo los tubos de ensayo preparados con el medio de cultivo a 37C, el concentrado de quistes se inocula aspticamente, se tapan y se colocan en incubadora, a 37C, en posicin horizontal por una hora. Al cabo de este tiempo, se extrae el 50% del medio de cultivo y se sustituye por medio de cultivo fresco. Se colocan de nuevo en la incubadora, hasta el da siguiente, se evala crecimiento.

BIBLIOGRAFIA:
Rosales-Borjas D., Daz-Rivadeneyra J., Doa-Leyva A., Mascaro C, Osuna A, Ortiz-Ortiz L., Medio de Keister modificado para el cultivo de Giardia lamblia in vitro. Revista Mdica de la Extensin Portuguesa ULA.2009. 3(1): 35-37 UNAM, DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA Y PARASITOLOGIA. Dra. Teresa Uribarren Berrueta Giardiasis Giardiosis Consultado el 20 de agosto de 2013 [Disponible en] http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/parasitologia/giardiasis.html BOTERO D. Parasitosis humana 4ta ed, Ed. CIB. Colombia 2005, pp-64-67 SANCHEZ DE LEON B.C. Implementacion de cultivo de Girardia lamblia (ensayo con un nuevo medio de cultivo) presenta tesis a la unidad de investigacin de la facultad de medicina, Guatemala, 1991. SERVICIO DE MICROBIOLOGA. HOSPITAL UNIVERSITARIO DOCTOR PESET ALEIXANDRE. ValenciaAlcaraz Soriano M.J. Giardia Y GIARDIOSIS