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Protocolo de miniprep Casera (laboratorio Javier): 1.

preparacin de soluciones: la preparacin de las soluciones y la manipulacin de los tubos no necesita hacerse en condiciones de esterilidad, solo en esterilidad BM, ademas, las soluciones no necesitan ser de reactivos Merck). a. Solucion I: 25mM TrisHCl pH:8 + 10mM EDTA pH:8 b. Solucion II: SDS 1 % + NaOH 0,1 M (450 ul de solucion de SDS 10% + 450 ul de solucion de NaOH 1 M + 3600 ul de agua destilada). c. Solucion III: acetato de Potasio (puede ser acetato de sodio, pero el de potasio anda mejor!) pH: 4,8-5,2. 2. repicar la colonia de inters en un tubo de vidrio conteniendo 3,5 ml aproximadamente (el volumen debe estar entre 3-10 ml) de medio LB lquido estriles, y dejar crecer toda la noche a 37C en agitacin fuerte. 3. realizar un cepario (si fuera la primera ves que se trabaja con el clon): entre mecheros y guardando las condiciones de esterilidad, colocar 600 ul del cultivo crecido ON en un eppendorf de 1,5 ml esteril, y agregar 200 ul de glicerol al 87% estril. No es necesario usar guantes pero si evitar tocar la boca del eppendorf con la mano, y flameando la boca del tubo de vidrioen el mechero. Aclaracin: el cepario puede quedar a temperatura ambiente un rato, antes de guardarse en un crio-vial a -80C. El cepario permite volver a amplificar el clon elegido, al sacarlo del freezzer y repicarlo tocando con un escarbadientes o tip esteril (esto debe hacerse lo suficientemente rpido como para que los tubos no se descongeles) y mojar un medio LB. Aclaracin 2: las placas con los cultivos no son estables mas de 1 mes y medio en heladera, mientras que el cepario es mas estable, por eso se realiza en lugar de guardar las placas. 4. centrifugar el cultivo (ON) a temperatura ambiente durante 5 min, a 6000 RPM. Para esto, se realizan centrifugaciones sucesivas del cultivo dentro de un mismo eppendorf, descartando el sobrenadante y agregando al pellet lo que queda de cultivo, y volver a centrifugar, as sucesivamente. 5. agregar 200 ul de la Solucin I, al pellet de clulas y resuspenderlas. 6. agregar 300 ul de la Solucin II. Agitar por inversin o en vortex, para que las clulas entren en contacto con la solucin. 7. incubar 5 min en hielo. 8. agregar 300 ul de la solucin III, agitar por inversin y dejar 5 min en hielo. 9. centrifugar 10 min a temperatura ambiente a 12000-130000 rpm. 10. agregar 600 ul de cloroformo, homogeneizar por inversion y centrifugar 10 min a 12000-13000 y temperatura ambiente, y tomar la fase superior (acuosa). 11. agregar 600 ul de cloroformo a la fase acuosa recolectada en el paso anterior, homogeneizar por inversin y centrifugar 10 min a 12000-13000 rpm; tomar nuevamente la fase superior (acuosa). 12. agregar 500 ul de isopropanol a la fase acuosa colectada en el paso anterior y dejar actuar por 10 min a temperatura ambiente, o mas tiempo a 4C. 13. centrifugar 10 min a temperatura ambiente a 12000-13000 rpm. 14. descartar el sobrenadante teniendo cuidado de no perder el pellet. 15. lavar: agregar 1000 ul de etanol al 70%, vortexear y centrifugar por 5 min a 12000-13000 rpm (temperatura ambiente). 16. resuspende el pellet en 50 ul de agua destilada estril, con agregado de RNAsa (0,5 ul por reaccin). Lavado de la RNAsa: si solo fuera para el chequeo del vector, la miniprep concluye en el paso 16, congelando el vector obtenido a -20C, pero si se fuera a secuenciar el vector se procede con los siguientes pasos. 17. Incubar a 37C por 30 min. 18. agregar 14,4 ul de NaCl 2,5 M + 45 ul de PEG800 al 15 % (en agua destilada) + 5,6 ul de agua

19. incubar en hielo durante 20 min. 20. centrifugar 15 min a 4C 21. lavar con etanol 70% y secar 22. resuspender en 20 ul de agua destilada esteril

Protocolo de miniprep Kit Wizard: 1. repicar la colonia de inters en un tubo de vidrio conteniendo 3,5 ml aproximadamente (el volumen debe estar entre 3-10 ml) de medio LB lquido estriles, y dejar crecer toda la noche a 37C en agitacin fuerte. 2. realizar un cepario (si fuera la primera ves que se trabaja con el clon): entre mecheros y guardando las condiciones de esterilidad, colocar 600 ul del cultivo crecido ON en un eppendorf de 1,5 ml esteril, y agregar 200 ul de glicerol al 87% estril. No es necesario usar guantes pero si evitar tocar la boca del eppendorf con la mano, y flameando la boca del tubo de vidrioen el mechero. Aclaracin: el cepario puede quedar a temperatura ambiente un rato, antes de guardarse en un crio-vial a -80C. El cepario permite volver a amplificar el clon elegido, al sacarlo del freezzer y repicarlo tocando con un escarbadientes o tip esteril (esto debe hacerse lo suficientemente rpido como para que los tubos no se descongeles) y mojar un medio LB. Aclaracin 2: las placas con los cultivos no son estables mas de 1 mes y medio en heladera, mientras que el cepario es mas estable, por eso se realiza en lugar de guardar las placas. 3. centrifugar el cultivo (ON) a temperatura ambiente durante 5 min, a 6000 RPM. Para esto, se realizan centrifugaciones sucesivas del cultivo dentro de un mismo eppendorf, descartando el sobrenadante y agregando al pellet lo que queda de cultivo, y volver a centrifugar, as sucesivamente. 4. agregar 250 ul de Cell Lysis Solution y resuspender las clulas. 5. agregar 10 ul de Alkaline Protease Solution, homogeneizar por inversion y 5 min a temperatura ambiente. 6. agregar 350 ul de Neutralition Solution, homogeneizar por inversion y centrifugar 10 min a temperatura ambiente a 12000-13000 rpm. 7. insertar la Spin Column en Collection tube, y rotularlas correctamente. 8. Cargar en la columna todo el contenido del eppendorf. 9. centrifugar durante 1 min a temperatura ambiente a 12000 rpm. 10. Descartar el volumen del tubo colector. 11. agregar 750 ul de Wash Solution a la columna y centrifugar a 12000 rpm 1 min a temperatura ambiente. 12. descartar el lquido del tubo colector, agregar 250 ul de Wash Solution a la columna y centrifugar a 12000 rpm 1 min a temperatura ambiente. 13. transferir la columna a un tubo eppendorf de 1,5 ml y descartar el tubo colector. 14. agregar 50 ul de agua miliQ. 15. dejar que la columnas respiren 2 min (al aire) 16. centrifugar por 1 min a 12000 rpm, temperatura ambiente. 17. guardar el eppendorf a -20C hasta su utilizacin.

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