DETERMINACION SISTEMA SANGUINEO ABO

INTRODUCCION

En 1900, Landsteiner descubri que el suero de ciertos individuos tena la capacidad de aglutinar los glbulos rojos de otros y que este fenmeno poda utilizarse para clasificar a las personas en distintos fenotipos de grupos sanguneos. Este sistema presenta dos antgenos (Ags), (aglutingenos) (A y B) pudindose as clasificar a los individuos en 4 grupos sanguneos (A, B, AB y O) segn posean uno u otro, los dos o ninguno de estos Ags. Los Anticuerpos (Acs), (aglutininas) son dos: (anti A y anti B) y estn normalmente presentes en el suero de los individuos que no poseen el Ag correspon diente en los glbulos rojos. Se reconocen 4 fenotipos comunes: O, A, B y AB, pero tambin se han identificado subgrupos de las formas A y B. El fenotipo ABO de un individuo se determina comnmente por las reacciones de aglutinacin de sus glbulos rojos con los antisueros Anti-A, Anti-B y Anti-AB. Al probar muestras de sangre de adultos, se puede obtener la confirmacin del grupo sanguneo ABO por la reaccin del suero del individuo con las suspensiones de glbulos rojos testigos A y B (contraprueba, mtodo inverso o indirecto). En la prueba directa de determinacin de grupo sanguneo ABO puede omitirse el suero anti AB, sin embargo, de ser posible debe utilizarse ya que su empleo garantiza resultados mas fidedignos. El sistema ABO es el ms importante desde el punto de vista transfusional e inmunolgico. MUESTRA: Sangre, obtenida por:

a) Puncin venosa. b) Puncin capilar (principalmente en recin nacidos y nios pequeos). c) Proveniente del cordn umbilical (en recin nacidos). La muestra por puncin venosa puede ser tomada con o sin anticoagulante, sin embargo la sangre coagulada tiene la ventaja de permitir un mejor estudio de los Acs. Los Acs sricos pueden estudiarse hasta aproximadamente 3 semanas si la muestra ha sido refrigerada y por 2 aos si la muestra se ha mantenido congelada. Los Ags globulares deben estudiarse dentro de las 24 horas de obtenida la muestra, ya que la reactividad de los Ags disminuye con la conservacin, se debe tener mayor cuidado con las variantes dbiles de este sistema. Las muestras recolectadas en Heparina o EDTA deben tipificarse dentro de 48 horas. Las muestras recolectadas en ACD, CPD, CPD-A y CPDA-1 pueden ser tipificadas hasta 30 das despus de almacenadas.

FUNDAMENTO:

Prueba directa. Metodo de Beth-Vincent: En los GR en estudio se investigan los Ags A y/o B (o formas dbiles de estos) mediante el uso de sueros clasificadores (anti A, anti B y anti AB). Prueba indirecta. Metodo de Simonin-Michon: En el suero en estudio se investigan los Acs naturales anti A y/o anti B, con clulas rojas conocidas de grupo A y B. A esta prueba se le denomina tambin contraprueba, mtodo inverso, mtodo indirecto o de confirmacin srica, ya que como su nombre lo indica, este es solo un mtodo confirmatorio de la prueba directa; el grupo sanguneo ABO de una muestra lo determina la presencia o ausencia de los Ags A y B en los GR en estudio. La determinacin del grupo sanguneo ABO debe constar de ambas partes (Prueba directa e indirecta), ya que cada test sirve como chequeo del otro, deben realizarse rutinariamente, de preferencia la lectura debe hacerse por dos Tecnlogos Mdicos distintos interpretando la prueba directa independientemente de la inversa, debiendo siempre coincidir en sus resultados. METODOS: Clasificacin de lmina Clasificacin en tubo Clasificacin empelando geles Clasificacin en microplaca

El grupo sanguneo de una muestra desconocida, debe realizarse siempre en tubo, debido a la sensibilidad del mtodo, la prueba en lmina solo debe utili zarse para recontrolar un grupo sanguneo que ya haya sido realizado previamente en tubo. Los mtodos en geles y microplacas en la actualidad dan resultados satisfactorios, sin embargo, ante discrepancias es el mtodo en tubo el que debe realizarse para resolver estos problemas y poder informar un resultado correcto. REACTIVOS Prueba directa: Se requieren sueros clasificadores (anti A, anti B y anti AB) frescos, de ttulo ptimo y todos los requisitos exigidos a un buen suero clasificador. Prueba indirecta: GR testigos A1 y B, que cumplan los siguientes requisitos: 1. Frescos y con una buena potencia en los Ags A y B. Si son tomados en CPD A, de manera estril, pueden durar hasta 30 das, despus de ese tiempo pierden poder antignico. 2. Si son tomados sin anticoagulante usar solo en el da. 3. Para su uso deben ser lavados 3 veces en solucin salina fresca y bien preparada y resuspendidos en: - Suero fisiolgico al 0,9% con pH ajustado a 7 o PBS. - EDTA en solucin salina: se conservan muy bien (EDTA AL 1,5% en salino). 4. Una vez resuspendidos los GR deben ser utilizados dentro de las 12 primeras hrs., en EDTA hasta 24 hrs. como mximo, previo recontrol. 5. Deben utilizarse en pool, para asegurar una buena potencia, ms o menos 3 de cada tipo, pool de GR A 1 y pool de GR B. 6. Concentracin de la suspensin celular:

 Para mtodo en lmina: 20-50% Para mtodo en tubo: 2-6%

Las glbulos rojos en estudio: Se pueden preparar suspensiones en su propio suero o plasma, suero fisiolgico o en tampn fosfato salino pH 7,0 (PBS), El suero fisiolgico o PBS para realizar las suspensiones debe estar siempre muy bien preparado y fresco

CAUSAS EN ERROR EN LA CLASIFICACION ABO METODO DIRECTO I. REACCIONES FALSAS NEGATIVAS. A. Dependientes de los GR a clasificar: 1. Uso de sangre vieja, los Ags han perdido potencia. 2. Reaccin hemoltica en el paciente previo a la clasificacin. 3. Muestra hemolizada. 4. Concentracin inadecuada de los GR en estudio (muy elevada o muy baja). 5. Presencia de variantes dbiles de los Ags A o B, en estos casos la Prueba in versa es de gran ayuda, ya que de lo contrario pueden darse por grupo sanguneo O, adems el uso de lectinas es de importancia en estos casos. 6. Clasificacin de ancianos o de recin nacidos: atenuacin o perdida de potencia o falta de maduracin de los Ags respectivamente. En estos casos se debe usar sueros clasificadores potentes y el mtodo en tubo siempre. 7. Clasificacin de pacientes con ciertas enfermedades (hematolgicas, neoplsicas), en los cuales se presenta alteracin de los Ags. En estos casos la prueba inversa favorece la tipificacin. Se puede recurrir a las tcnicas de absorcin, elucin y determinacin del estado de secretor tiara dilucidar el grupo sanguneo de la muestra a estudiar. 8. Presencia de poblacin doble de GR, es una causa frecuente y se observa en pacientes de grupo A, B o AB que han recibido sangre O. Hemorragias fetomaternas, transfusin intrauterina y en el subgrupo A3 con Anti A (patrn de aglutinacin). 9. Quimerismo (constitucional): individuo con 2 lneas celulares genticamente diferentes que pueden tener grupos sanguneos distintos.

B. Dependiente de los antisueros: 1. Neutralizacin de los anticuerpos por sustancias solubles de grupo sanguneo, afortunadamente no es comn. Puede suceder al clasificar a algunos pacien tes con neoplasias digestivas y quiste mucoide del ovario. En estos pacientes la presencia de grandes cantidades de Ags solubles en el suero puede neutralizar los sueros clasificadores parcial o totalmente. En este caso la prueba inversa no concuerda con la directa y previo a la clasificacin los GR del paciente deben ser lavados 3 veces y suspendidos en PBS. 2. Emplear antisueros de bajo titulo.

3. Utilizar antisueros o sueros clasificadores vencidos. 4. Utilizar antisueros mal conservados.

C. Dependiente de la tcnica: 1. Leer apresuradamente y en forma breve. 2. Centrifugacin insuficiente en tiempo y/o velocidad, cuando se usa el mtodo en tubo. El botn de clulas debe ser bien definido, no tan apretado que las clulas no aglutinadas no se puedan resuspender con una manipulacin suave, tampoco la centrifugacin debe ser tan escasa que no favorezca la unin Ag Ac, el sobrenadante debe ser claro. 3. No disponer de una buena fuente de luz. 4. Temperatura inadecuada: el calentar la mezcla suero-clulas disminuye la actividad de los reactivos. La determinacin ABO de debe realizarse a temperatura ambiente. II. REACCIONES FALSAS POSITIVAS A. Dependientes de los GR a clasificar: 1. Uso de sangre contaminada: a) Alteracin de los GR in vitro : Fenmeno conocido con el nombre de Hubener Thomson - Friedenreich, en este caso se produce alteracin de los GR debido a la presencia de enzimas liberadas por algunas bacterias Ej: cocobacilos, vibrin del clera, las cuales pueden poner de manifiesto el Ag T de la membrana del GR, los sueros normales de la mayora de los individuos presentan Acs anti T, (excepto recin nacidos y nios pequeos), lo que provoca la aglutinacin de los GR alterados. En este caso se debe pedir una nueva muestra y clasificarla fresca. b) Alteracin de los GR in vivo: En pacientes con algunas infecciones microbianas pueden alterarse sus Ags eritrocitarios por accin de enzimas provenientes de los microorganismos. En estos casos al usar suero AB se obtiene reaccin positiva con los GR del paciente. La prueba inversa en estos casos es muy importante para dilucidar el grupo sanguneo del paciente. Las clulas adquieren en su superficie el Ag Tk que las hacen poliaglutinables por los Acs anti Tk presentes en la mayora de las personas. 2. Presencia de rouleaux: (Apilamiento de los GR.), fenmeno que puede observarse en pacientes con hiperproteinemia, hiperglobulinemia, mieloma, enfermedad de Waldenstrom, infecciones graves, afecciones hepticas, neoplasias, nefritis, mesenquimopatias, Sndrome de Hiperviscosidad y cirrosis. Frente a una VHS muy elevada puede esperarse este fenmeno. El fibringeno puede inducir rouleaux. Para evitar este problema los GR deben ser lavados 3 veces en solucin salina antes de su tipificacin. Para diferenciar aglutinacin verdadera de rouleaux: Poner una gota de sangre del paciente en una lmina y agregar una gota de suero fisiolgico o PBS, si se trata de rouleaux (pseudoaglutinacin) desaparece, ya que de esta manera se aumenta el potencial Z. 3. Sangre que no ha completado bien el proceso de coagulacin.

4. Sangre con gelatina de Wharton: Se presenta cuando la sangre a estudiar proviene del cordn umbilical. Para evitar este problema los GR del RN deben lavarse a lo menos 3 veces en PBS antes de la clasificacin. Si el problema persiste despus de varios lavados (7 u 8), se debe pedir una nueva muestra obtenida por puncin venosa o capilar. 5. Muestra con crioaglutininas: Estas corresponden frecuentemente a Acs anti I, que actan en fro frente a los GR portadores del Ag I, el cual se halla presente en la mayora de los GR de los adultos, estos Acs actan tambin con los GR del propio paciente, su temperatura optima de accin: 4C. Esta es una reaccin reversible, desapareciendo a 37C y reapareciendo a bajas temperaturas. Las crioaglutininas tambin pueden observarse en pacientes con Hemoglobinuria Paroxistica, AHA, Neumopatias, Tripanosomiasis, en embarazadas y en individuos sanos. Se debe lavar los GR 3-4 veces en solucin salina calentada a 37C. Si se esta clasificando en lamina, calentarla a 37C. Para verificar su presencia: colocar una gota de sangre en estudio en una lmina y calentar a 37C; si desaparece la aglutinacin, se debe a crioaglutininas. 6. Anticuerpos recubriendo las clulas: Las clulas pueden estar tan densamente recubiertas o sensibilizadas con Acs irregulares (Enf. Hemoltica del RN, Anemia Hemoltica Autoinmune, despus de una transfusin incompatible, etc.) que pueden aglutinar espontneamente con reactivos de alto contenido proteico, incluyendo aquellos para tipificar ABO (en la actualidad con los antisueros modernos esto prcticamente no se observa). El Ac debe ser eludo (separado) antes de estudiar los GR. 7. Presencia de Ag B adquirido (en grupo A): ocurre solo en personas del grupo A. una enzima bacteriana la D-acetilasa puede separar el grupo acetilo de la Nacetilgalactosamina terminal que es una sustancia caracterstica del grupo A y deja galactosamina en la superficie del GR, similar a la galactosa que es el azcar terminal de la sustancia del grupo B, el Anti B puede reaccionar con este Ag. Segn la prueba directa parece AB y en el suero contiene anti B que no reacciona con las clulas propias. Si el individuo es secretor solo tendra sustancia A. este fenmeno puede ocurrir en cncer de colon o recto, presencia de infecciones intestinales.

B. Dependiente de los antisueros: 1. Uso de sueros contaminados: a) Por bacterias: Algunas bacterias (seudomonas, estafilococos) pueden alterarlos y hacerlos reactivos frente a cualquier GR humano. Este fenmeno se conoce con el nombre de Davidohn-Tonarsky, para evitar este problema: usar siempre antisueros frescos y/o libres de contaminacin bacteriana. b) Por otros Acs en forma accidental: Por Ej. Mezcla de anti A con anti B.

C. Dependientes de la tcnica: 1. Leer retardadamente, fundamentalmente cuando se clasifica en lmina. 2. Uso de material sucio o contaminado. 3. Centrifugacin excesiva en tiempo y/o velocidad, al clasificar en tubo.

METODO INDIRECTO I. REACCIONES FALSAS NEGATIVAS A. Dependientes del suero en estudio: 1. Presencia de hemolisinas: Estos Acs hemolizan a los GR en presencia de Co, suelen encontrarse en personas de grupo O, pero tambin pueden verse en otros grupos sanguneos cuando la muestra es fresca (presencia de Co), estos Acs hemolticos anti A y anti B se deben a sensibilizacin (feto-materna, postransfusional y otras). En este caso el grupo sanguneo se comprueba utilizando suero conservado o inactivado a 56C por 30 minutos. 2. Neutralizacin de los Acs del paciente por el Co : En este caso las pruebas no concuerdan, por ejemplo, en estos casos puede encontrarse un paciente A sin anti B en el mtodo inverso, afortunadamente este hecho es muy raro. Se soluciona inactivando el suero a 56C para impedir la accin del Co. 3. Ttulos bajos de anti A y anti B en pacientes con hipoproteinemia, hipogammaglobulinemia, agammaglobulinemia, en este caso realizar solo prueba directa. 4. No agregar el suero al test. 5. Prueba realizada a nios menores de 5 meses (no tienen Acs, recin los estn formando), ancianos y pacientes desnutridos. Lo desarrollan recin entre los 3-6 meses de edad. Los ancianos pueden tener valores ms bajos o no detectables de anti A o anti B. B. Dependiente de los GR testigos: 1. Concentracin muy baja o muy elevada de los GR testigos. 2. Uso de GR viejos (ms de 5 das de conservacin en CPD-A). 3. Empleo de GR A2 en lugar de A1 u otras variantes. 4. Empleo de GR en salino no fresco (no del da). 5. Solucin salina mal preparada puede hemolizar los GR de prueba. NOTA: Los GR testigos deben ser muy bien clasificados, lavados, recontrolados, etiquetados y resuspendidos antes de su uso. C. Dependientes de la tcnica: 1. Leer apresuradamente y en forma breve. 2. Centrifugacin insuficiente en tiempo y/o velocidad cuando se clasifica en tubo. 3. No disponer de una buena fuente de luz.

II. REACCIONES FALSAS POSITIVAS.

A. Dependientes del suero a estudiar: 1. Presencia de crioaglutininas: cuando se presenta el problema en la prueba inversa, deben absorverse las crioaglutinas con GR O GR del paciente a 4C por 45-60 minutos. Luego se centrifuga y se obtienen glbulos sin crioaglutininas. 2. Que el paciente haya sido transfundido previo a la clasificacin. a) Determinacin en personas que han recibido sangre O: Siempre debe tomarse una muestra a toda persona con grupo desconocido que vaya a ser transfundida en una emergencia con sangre O, para tipificarla con anterioridad a la transfusin, sin embargo, la urgencia a veces impide la toma de muestra en forma oportuna, el problema se agrava cuando el paciente ha recibido transfusiones masivas de sangre. Al realizar la prueba inversa si el paciente era A o B se va a encontrar Acs adicionales correspondientes a los Acs de la sangre transfundida. En estos casos no se debe transfundir al paciente con sangre de su grupo sino que es conveniente administrarle GR O solamente; si el paciente de acuerdo a su diagnstico precisa sangre total deben ser neutralizadas las aglutininas de la sangre O antes de transfundirla al paciente (esto prcticamente no se emplea en la actualidad). Tambin pueden utilizarse GR con algn sustituto plasmtico. El empleo de lecti na, suero o protectina anti H va a evidenciar una doble poblacin celular. 3. Presencia de anti A1 en un grupo A2 o A2B En este caso es de utilidad el uso de lectina anti A 1 o suero B absorbido junto con lectina anti H. En algunas ocasiones es difcil diferenciar un A1B de un A2B. 4. Presencia de Acs irregulares o aloAcs en el suero del paciente. Se pueden evidenciar en la prueba inversa, esta no concuerda con la directa. En este caso el suero reacciona con Ags diferentes de los Ags A y B. Puede tratarse de algn Ac IgM del sistema Rho - Hro, anti M, anti N, anti P. Las especificidades ms comunes para tales aloanticuerpos son Pl, M y Lewis. Tambin puede tratarse de un Ac anti H, el cual puede aparecer en algunas personas A 1, B o A1 B, este Ac reacciona en fro. Es til en estos casos realizar pruebas adicionales, como un control de autoaglutinacin con un pool de clulas del grupo O. Una prueba del suero utilizando un panel de glbulos rojos servir para identificar, determinar la especificidad del anticuerpo. 5. Presencia de Hiperproteinemia: induce la formacin de pilas de monedas. 6. Paciente que haya recibido expansores plasmticos de alto P.M, inyeccin de material de contraste por va intravenosa o drogas que causen agregacin que se puede confundir con aglutinacin.

PRECAUCIONES EN LA CLASIFICACION ABO. 1. No emplear calor durante el procesamiento de las muestras. No emplear el aglutinoscopio lmpara caliente para las lecturas. 2. Leer e interpretar siempre la prueba directa independientemente de la inversa. 3. En los tiempos libres mantener los antisueros en refrigeracin (observar la apariencia, oscuridad y turbidez antes del uso). 4. Preocuparse de que los materiales estn siempre muy limpios. 5. Para clasificar a un paciente que presenta tendencia al rouleaux, se debe lavar 3 o mas veces los GR con solucin salina. Para la prueba inversa, se debe diluir al doble el suero del paciente con PBS o suero fisiolgico y hacer la prueba autloga. (Si esta es positiva se debe diluir ms). 6. Preparar diariamente la suspensin celular y refrigerar cuando no se use. 7. Si el paciente presenta hemolisinas, inactivar primero el suero a 56C por 30 minutos. 8. Realizar siempre la prueba autloga a todas las muestras. 9. Realizar investigacin de anticuerpos irregulares en todas las muestras. 10. Probar los GR del paciente con suero AB o albmina. 11. En pacientes con ciertas alteraciones hematolgicas (leucemias, linfomas, etc), en pacientes con cncer y en algunas embarazadas a veces se presentan problemas en la clasificacin, para lograr resultados correctos se recomienda el uso de lectinas, determinacin del estado secretor ABH, etc. antes de informar el grupo de la persona en estudio. 12. Registrar inmediatamente los resultados. Ventajas del mtodo en tubo sobre la lmina. 1. La lectura puede realizarse en cualquier momento. 2. No se producen falsos positivos por resecamiento. 3. Es ms sensible (centrifugacin). 4. Menores posibilidades de error: mayor orden en el trabajo, lectura tranquila. Desventajas. 1. Costo 2. Tiempo de reaccin que es mayor.

ESQUEMA DE LA PRUEBA DE CLASIFICACION ABO

GRUPO O-IV A-II B-III AB-I

ANTI A (-) + (-) +

ANTI B (-) (-) + +

ANTI AB (-) + + +

GR A + (-) + (-)

GR B + + (-) (- )

Si al clasificar Ud. una muestra, los resultados obtenidos no concuerdan con los del cuadro anterior, podra tratarse de una de las tantas causas de error enumeradas anteriormente. (Subgrupo, alguna interferencia por macromolculas extraas o propias, baja potencia de los antisueros, baja antigenicidad de los GR, etc.). En este caso, se debe repetir la clasificacin, realizar estudios adicionales o pedir nueva muestra, segn corresponda, para comprobar, afirmar e informar esa clasificacin.