Comit organizor

Prof(a). Vilma Llovera Ing. Agro. Nohants Rumbos Prof. Juan Barroyeta Prof(a). Irma F Agrela Prof(a). Mara Chacn Prof(a). Johanny Ruz Prof. Carlos Rodrguez Prof (a). Vianellys Hernndez Prof(a). Clara Nancy Gutirrez Prof(a). Sandra Abou Orm Saab Aux. Lab. Maira Bermdez Aux. Lab. Eustaquia Daz Sra. Ligia Padrino Ba. Marioxys Montero Ba. Valerie Gonzlez

TALLER MANEJO DE LA MUESTRA Y TECNICAS DE COLORACION EN MICROBIOGA INDICE

I.- PROGRAMA TERICO Responsable (s) -Verificacin de Inscripciones Comit Organizador Prof. Johanny Ruz y Ing Agro. Nohants Rumbos Lugar y Hora Saln Dorado 7:30-8:30 am Saln Dorado 8:30-9:00 am Pgina --

-Bienvenida Instituciones participantes: Departamento de Microbiologa Instituciones participantes: Sociedad Venezolana de Microbiologa, capitulo Aragua -Manejo de la muestra: bioseguridad y preservacin -Procesamiento de muestras y tcnicas de coloracin en el rea de micologa -Consideraciones acerca de la prctica de algunas tinciones en microbiolgica -Refrigerio -Preparacin de medios de cultivos y reactivos empleados en microbiologa II.- PROGRAMA PRCTICO

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5 Saln Dorado 9:00- 9:30 am Saln Dorado 9:30-10:00 am Saln Dorado 10:00-10:30 am Saln Dorado 10:30-11:00am Saln Dorado 11:0011:30am Laboratorios de Microbiologa 11:30 12:30 Prof(a). Vilma Llovera Prof. Juan Barroyeta Prof(a).Vianellys Hernndez Aux. Lab. Maira Bermdez Prof(a). Johanny Ruz Prof. Carlos Rodrguez Prof(a) Sandra Abou Orm S Prof(a). Mara Chacn Prof(a). Clara N Gutirrez Aux. Lab. Eustaquia Daz Laboratorio 1

Prof. Juan Barroyeta

Prof. Johanny Ruz y Prof. Carlos Rodrguez Prof. (a) Vilma Llovera Surez Comit Organizador Prof(a) Mara Chacn

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18 -24

-Tinciones en microbiolgica -Procesamiento de muestras y tcnicas de coloracin en el rea de micologa -Preparacin de medios de cultivos y reactivos empleados en microbiologa

Laboratorio 2

Laboratorio 3

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA, ESCUELA DE BIOANLISIS, FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD, SEDE ARAGUA UNIVERSIDAD DE CARABABO

El Departamento de Microbiologa de la Escuela de Bioanlisis, Sede Aragua dicta docencia efectiva para los estudiantes de las Escuelas de Bioanlisis, Medicina y Enfermera en los programas terico-prcticos de las asignaturas de Microbiologa Mdica, Inmunologa-Medicina, Inmunologa-Bioanlisis, Microbiologa I, Microbiologa II y Microbiologa para Enfermera y para el actual periodo lectivo atiene a un total de 1.178 estudiantes. Adems dentro del departamento se desarrollan actualmente ocho lneas de investigacin las cuales fueron aprobadas por el Consejo de Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad de Carabobo y se encuentran enmarcadas en las Necesidades de Investigacin sealadas por el Ministerio del Poder Popular para la Ciencia, Tecnologa e Industrias Intermedias por ser stas prioritarias para el desarrollo de la nacin. Estas lneas de investigacin han generado un nmero importante de trabajos de investigacin los cuales ya han sido publicados o estn en vas de publicacin as como tambin sus resultados han sido presentados en congresos de investigacin a nivel nacional e internacional. Cabe destacar, que actualmente en el Departamento de Microbiologa se realiza la Asesora y/o Tutora de 13 trabajos de investigacin (11 pregrado y 2 de postgrado). As mismo, en nuestro departamento funciona el Laboratorio de Diagnstico Micolgico el cual es un laboratorio especializado en el diagnstico de las enfermedades causadas por hongos y representa un laboratorio de referencia a nivel regional y que no slo ofrece sus servicios a las comunidades ubicadas en las zonas cercanas a nuestra casa de estudio sino tambin recibe pacientes procedentes de los diferentes estados de la regin central y atiende un promedio de 150 pacientes anuales. MISIN: Crear, planificar, programar, desarrollar y difundir conocimientos innovadores competitivos y socialmente pertinentes para la formacin tica, integral y actualizada de profesionales y tcnicos a nivel de pregrado y postgrado en el rea de la salud en general y de la Microbiologa en particular, que apoyen el progreso de la regin y del pas para la consolidacin del bienestar personal y colectivo de la sociedad dentro del contexto cientfico, tcnico y humanstico como centro de la Educacin Superior Universitaria. Planificar, ejecutar, coordinar, supervisar y evaluar los programas docentes adscritos al departamento. Planificar y desarrollar lneas de investigacin enmarcadas dentro de las reas de la Microbiologa de acuerdo con las necesidades de la regin y del pas.
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 Planificar y ejecutar actividades de extensin y servicio con la finalidad de ofrecer exmenes diagnsticos especiales a la comunidad regional y nacional. VISIN: Ser una dependencia de alto valor acadmico que desarrolle y coordine actividades de docencia en pregrado y postgrado, investigacin y extensin y servicio, dirigidas al logro de las metas y objetivos de los proyectos relacionados con el rea de la Microbiologa, cnsonas con las necesidades de la regin y del pas.

SOCIEDAD VENEZOLANA DE MICROBIOLOGA CAPTULO ARAGUA La Sociedad Venezolana de Microbiologa (SVM) es una asociacin profesional multidisciplinaria autnoma, de carcter exclusivamente cientfico y tecnolgico, sin fin de lucro, con personalidad jurdica propia, que tiene por objeto fomentar y difundir la investigacin cientfica, tecnolgica, la enseanza y el aprendizaje, as como el asesoramiento en la microbiologa en Venezuela, en un contexto tico para contribuir al bienestar de los venezolanos y de la humanidad. DE DNDE NACE LA SOCIEDAD VENEZOLANA DE MICROBIOLOGA? La Sociedad Venezolana de Microbiologa (SVM) nace un 14 de Abril de 1953, cuando 16 profesionales especializados en diferentes ramas de la Microbiologa, se reunieron en el Instituto Nacional de Higiene, a fin de discutir la posibilidad de conformar una Sociedad que tuviera como objetivos agrupar a los profesionales especialistas en las diferentes reas de la microbiologa, que sera rgano consultivo tcnico de las instituciones que lo solicitasen y que tendra como prioridad levantar el espritu cientfico y contribuir al progreso de la enseanza de la Microbiologa en Venezuela. Actualmente la SOCIEDAD VENEZOLANA DE MICROBIOLOGIA tiene unos 500 miembros, distribuidos en toda la geografa nacional y 10 Captulos: Anzotegui, Aragua, Carabobo, Centro-Occidental, Falcn, Guayana, Mrida, Metropolitano, Sucre y Zulia, cada uno dirigido por una Junta Directiva Capitular y coordinados por la Junta Directiva Nacional. MISIN Fomentar y difundir la investigacin cientfica y tecnolgica; la enseanza y el aprendizaje, as como el asesoramiento Microbiolgico en Venezuela. Manteniendo un alto criterio tico en beneficio de la poblacin y el perfeccionamiento contino del profesional en sus aspectos cientficos, bioticos y humanistas, que contribuya al bienestar de los venezolanos y de la humanidad.
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VISIN Ser una Sociedad Cientfica con un elevado nivel de credibilidad ante la sociedad, referente para la comunidad nacional y sus autoridades, que cuente con tecnologa de avanzada a fin de garantizar un servicio de alta calidad en beneficio de la ciudadana. QUIENES PODRN PERTENECER A LA SVM? Podrn ser miembros asociados de la Sociedad Venezolana de Microbiologa los profesionales que se dediquen a cualquiera de las disciplinas microbiolgicas REQUISITOS PARA INSCRIPCIN Para ingresar como miembro asociado de la Sociedad Venezolana de Microbiologa, se requiere: a) Enve su curriculum vitae. b) Solicitud por escrito dirigida a la junta directiva del captulo. c) Respaldo de la solicitud con la firma de dos miembros titulares, los cuales se comprometern a acompaar al aspirante en la prxima reunin capitular para su presentacin. d) Una vez estudiada y aprobada la solicitud por la junta directiva capitular. El solicitante cancelar igualmente la cuota de inscripcin fijada peridicamente para la Asamblea Anual (equivalente a dos (2) unidades tributarias), la cual incluye la cuota anual del perodo en curso. Junta Directiva captulo Aragua Ing. Agro. Nohants Rumbos Presidenta Lcda. Ysvette Vsquez Vicepresidenta Ing. Agro. Nayesda Fragenes Secretaria General Lcdo. Claudio Medina Secretario de Finanzas Br. Valerie Gonzlez Secretaria de Actas Lcdo. Juan Barroyeta Secretario de Publicaciones Lcda. Carolina Mndez Secretaria de Rel. Interinstitucionales Informacin: e-mail: svmcapituloaragua@gmail.com; http://svmcaragua.blogspot.com/ http://www.svmicrobiologia.org/

MANEJO DE LA MUESTRA: BIOSEGURIDAD Y PRESERVACIN Prof. Juan Barroyeta jrbarroyeta@gmail.com En todo procedimiento analtico, la fase previa tiene una importancia capital para la calidad final de los resultados. Entre los factores cruciales de esta etapa, hay que sealar la obtencin de la muestra en condiciones apropiadas segn las especificaciones del laboratorio, su correcta rotulacin para evitar errores de identificacin, transporte y la conservacin adecuada del material recogido. La toma de muestra debe cumplir con cinco principios bsicos: 1. Que la muestra seas representativa del tejido afectado, preferiblemente del margen activo de la lesin. 2. Que la cantidad sea suficiente. 3. Que la contaminacin por flora comensal se reduzca al mnimo. 4. Siempre que sea posible realizar la obtencin por puncin y no por escobillado. 5. Que el transporte al laboratorio o rea de procesamiento sea rpido. Es imprescindible que la muestra para anlisis llegue al laboratorio con un papel de peticin perfectamente cumplimentado con los datos de filiacin y clnicos del paciente, sealando las caractersticas del proceso patolgico que est en estudio, indicando las enfermedades de base, los factores predisponentes de infeccin si existen, y los datos epidemiolgicos de inters como la profesin, los hbitos que comportan riesgo de infeccin, los viajes y otros. Asimismo, es muy importante conocer la medicacin prescrita al paciente, en particular antibiticos, citostticos y medicamentos de accin directa sobre la respuesta inmunitaria. En la solicitud debe figurar claramente el nombre del mdico que la ha efectuado y su telfono para poder consultarle personalmente cuando sea necesario. Hace algunos aos se recomendaba identificar las muestras de pacientes con sida, hepatitis y otros procesos patolgicas con riesgos de contagia para el personal del laboratorio. En la actualidad, no se recomienda usar esta estrategia dado que todo material biolgico debe ser considerado potencialmente contaminado y se deben manipular bajo las normas de precauciones universales (Tabla 1). TOMA DE MUESTRA Es importante que el personal que tomar o recibir la muestra contacte personalmente con el microbilogo para informarse y acordar el mtodo de recogida de las muestras. Es fundamental que la persona que efectu la toma de muestra conozca el mtodo de recogida, el volumen recomendable y la necesidad o no de introducir el material en un medio de transporte

Tabla 1. Normas de precauciones universales 1. No comer, fumar ni llevar ningn objeto a la boca en el laboratorio. 2. Utilizar siempre bata. Ponerse guantes siempre que se manipule material biolgico. 3. No pipetear con la boca. Usar propipetas o pipetas automticas. 4. Desechar el material, en particular el punzante, en recipientes adecuados. 5. Recoger y limpiar las superficies de trabajo al inicio y fin de la jornada, desinfectndolas cuidadosamente con alcohol isoproplico al 70 80% o glutaraldehdo al 1-2%. 6. Lavarse las manos despus de cada procedimiento y al final de la tarea aunque se hayan utilizado guantes. Fuente: Prats, M. (2006). Microbiologa clnica.

MATERIAL PARA LA TOMA DE MUESTRA Los frascos y tubos para recoger el material fluido y secreciones (orina, heces, exudado pleural, liquido asctico, entre otros) deben ser estriles y de cierre hermtico. Vase tabla 2.

TCNICA PARA EL MANEJO DE MUESTRAS EN EL LABORATORIO El mayor porcentaje de los accidentes de laboratorio y las infecciones conexas se debe a los errores humanos, las tcnicas de laboratorio incorrectas y el mal uso del equipo. Con el fin de evitar o reducir al mnimo los accidentes ms comunes provocados por esos factores es importante considerar una Manipulacin segura de muestras en el laboratorio, debido a que la recogida, transporte y manipulacin de muestras en el laboratorio entraan un riesgo de infeccin para el personal. Es por ello que se deben evaluar: los recipientes para las muestras, procedimientos y medidas para el transporte de muestras dentro de la instalacin, recepcin de las muestras y la apertura de los envases/embalaje RECIPIENTES PARA MUESTRAS Los recipientes para muestras pueden ser de vidrio o, preferiblemente, de plstico. Deben ser fuertes y no permitir fugas cuando la tapa o el tapn estn correctamente colocados. En el exterior del recipiente no debe quedar ningn material. Los recipientes han de estar correctamente rotulados para facilitar su identificacin. Los formularios de peticin de examen de la muestra no se colocarn alrededor de los recipientes, sino por separado, preferiblemente en sobres impermeables.
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Tabla 2. Recogida, transporte y almacenamiento de muestra para microbiologa Muestra clnica Volumen Recipiente frasco sin MT Temperatura 4C. Mx. 24h

Orina Bacterias, parasitos, Hongos y 10-20 mL virus Heces Bacterias y hongos 2-5 mL Parsitos Virus Esputo Exudado tico Exudado farngeo Bateras Virus Escamas cutneas, cabello y uas Material de Hongo raspado o cortado Lquido Cefalorraqudeo Bacterias y hongos 1-3 mL Virus 1 mL Lquidos Pleural/pericrdico 5-15 mL Asctico 5-15 mL Articular 1 mL Exudado vaginal/endocervical Bacterias, hongos Parsitos Absceso abdominal, 5-15 mL heptico, pancretico y peritoneal Sangre bacterias y hongos 10-20 mL (hemocultivo) Parsitos

Frasco con MT Cary-Blair Frasco con fijador (formol) Frasco sin MT. Frasco sin MT. Escobilln con MT Stuart Escobilln con MT Stuart Escobilln con MT Hanks Placa de Petri o frasco

TA. Mx. 24h TA 4C. Mx. 24h 4C. Mx. 24h TA. Mx. 2h TA. Mx. 24h 4C. Mx. 24h TA.

Frasco sin MT. Frasco sin MT. Frasco sin MT. Frasco sin MT. Tubo sin MT. Escobilln con MT Stuart Siembra inmediata en MP

TA. Mx. 24h 4C. Mx. 72h 4C. Mx. 24h 4C. Mx. 24h 4C. Mx. 24h TA. Mx. 24h

Escobilln con MT para TA. Mx. 24h anaerobios

Virus

1-5 mL

Frasco con poliatenol sulfato sdico, SPS. Frotis de gota gruesa o extendidos de sangre con EDTA Tubo con heparina de litio 4C. Mx. 24h

TRANSPORTE DE MUESTRAS DENTRO DE LA INSTALACIN Para evitar fugas o derrames accidentales, deben utilizarse envases/embalajes secundarios (por ejemplo, cajas) equipados con gradillas, de modo que los recipientes que contienen las muestras se mantengan en posicin vertical. Los envases/embalajes secundarios pueden ser de metal o de plstico, pero deben poderse tratar en autoclave o ser resistentes a la accin de los desinfectantes qumicos; de preferencia, el cierre debe tener una junta que garantice la estanqueidad. Debern descontaminarse peridicamente. RECEPCIN DE LAS MUESTRAS Los laboratorios que reciban un elevado nmero de muestras deben destinar un local o zona especial con este propsito. APERTURA DE LOS ENVASES/EMBALAJES El personal que recibe y desempaqueta las muestras debe conocer los riesgos para la salud que entraa su actividad y debe estar capacitado para adoptar precauciones normalizadas, particularmente cuando manipule recipientes rotos o con fugas. Los recipientes primarios de las muestras deben abrirse en una cmara de seguridad biolgica. Se dispondr de desinfectantes. Estas medidas descritas han surgido por la aplicacin de seguridad biolgica desde hace ms de tres dcadas por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), con el objeto de alentar a los pases a aceptar y aplicar conceptos bsicos en materia de seguridad biolgica y a elaborar cdigos nacionales de prcticas para la manipulacin sin riesgo de microorganismos patgenos en los laboratorios que se encuentran dentro de sus fronteras nacionales. A partir de esta publicacin, muchos pases han seguido la orientacin especializada que se ofrece en el manual para elaborar esos cdigos de prcticas. Los recientes acontecimientos mundiales han puesto de manifiesto la existencia de nuevas amenazas para la salud pblica derivadas de la liberacin o el uso indebido deliberados de agentes y toxinas microbianos. Por consiguiente, es importante considerar la bioproteccin, es decir, la proteccin del material microbiolgico contra el robo, la prdida o la desviacin para evitar que esos agentes se puedan utilizar de forma indebida con el fin de atentar contra la salud pblica. La bioseguridad o Seguridad biolgica es el trmino utilizado para referirse a los principios, tcnicas y prcticas aplicadas con el fin de evitar la exposicin no intencional a patgenos y toxinas, o su liberacin accidental. Es, por tanto, legtimo pensar que dentro de este campo tiene tambin cabida la proteccin, contra otros elementos que no son estrictamente de origen biolgico,
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pero que si son capaces de constituir riesgo y agresin, nos referimos a las medidas de proteccin en el manejo de las siguientes situaciones: 1. Manejo de txicas. 2. Manejo de Energizantes. 3. Manejo de Cancergenos. 4. Manejo de Hormonas, Antibiticos y otros frmacos. 5. Descontaminacin y proteccin ambiental. En una visin lo ms amplia posible del problema de proteccin, tampoco pueden excluirse las medidas tendientes a eliminar el riesgo de factores fsicos, tales como: 1. Radiaciones no ionizantes (Luz ultravioleta, Infrarrojo, Microondas), Rayo Lser 2. Ultrasonido 3. Vibraciones 4. Ruidos 5. Quemaduras 6. Exposicin prolongada a altas o bajas temperaturas PRINCIPIOS DE BIOSEGURIDAD 1. Universalidad: las medidas deben involucrar a todos los pacientes de todos los servicios, independientemente de conocer o no su serologa. Todo el personal debe seguir las precauciones estndares rutinariamente para prevenir la exposicin de la piel y de las membranas mucosas, en todas las situaciones que puedan dar origen a accidentes, estando o no previsto el contacto con sangre o cualquier otro fluido corporal del paciente. Estas precauciones, deben ser aplicadas para TODAS las personas, independientemente de presentar o no patologas. 2. Uso de barreras: comprende el concepto de evitar la exposicin directa a sangre y otros fluidos orgnicos potencialmente contaminantes, mediante la utilizacin de materiales adecuados que se interpongan al contacto de los mismos. La utilizacin de barreras (ej. guantes) no evitan los accidentes de exposicin a estos fluidos, pero disminuyen las consecuencias de dicho accidente. 3. Medios de eliminacin de material contaminado: comprende el conjunto de dispositivos y procedimientos adecuados a travs de los cuales los materiales utilizados en la atencin de pacientes, son depositados y eliminados sin riesgo. Los objetivos especficos de Bioseguridad comprenden una serie de acciones tendientes al control del riesgo que encierran las actividades en las siguientes reas: 1. Manipulacin de microorganismos patgenos. 2. Usos de la tecnologa del ADN Recombinante. 3. Manipulacin del material infeccioso.
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4. Uso de frmacos, radiaciones y elementos qumicos de efecto daino en el hombre, probado o no bien definido. 5. Medidas de proteccin del ambiente. El pilar de la prctica de la bioseguridad es la evaluacin del riesgo. Aunque existen muchas herramientas para ayudar a evaluar el riesgo que comporta un procedimiento o un experimento determinado, el componente ms importante es el juicio profesional. Usualmente se hace referencia a los peligros relativos que entraan los microorganismos infecciosos, clasificados por grupos de riesgo segn la OMS. Esta clasificacin por grupos de riesgo se utilizar exclusivamente para el trabajo de laboratorio. GRUPO DE RIESGO 1 Riesgo individual y poblacional escaso o nulo. Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales. GRUPO DE RIESGO 2 Riesgo individual moderado, riesgo poblacional bajo. Agentes patgenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entraar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la poblacin, el ganado o el medio ambiente. La exposicin en el laboratorio puede provocar una infeccin grave, pero existen medidas preventivas y teraputicas eficaces y el riesgo de propagacin es limitado. GRUPO DE RIESGO 3 Riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo Agentes patgenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves, pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro. Existen medidas preventivas y teraputicas eficaces. GRUPO DE RIESGO 4 Riesgo individual y poblacional elevado Agentes patgenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se transmiten fcilmente de un individuo a otro, directa o indirectamente. Normalmente no existen medidas preventivas y teraputicas eficaces. REFERENCIAS Prats, M. (2006). Microbiologa clnica. Madrid: Panamericana. Somoza, N. y Tora M. (2009). Seguridad biolgica en la preservacin y el transporte de muestras biolgicas obtenidas en el mbito de las enfermedades respiratorias y destinadas a la investigacin. Archivo de Bronconeumonologa, 45 (4), 187195. Mazzali, R. (2003). Notas sobre bioseguridad, nivel 1 de bioseguridad. Revista de la Sociedad Venezolana de Microbiologa, 23 (1), 2-5.
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PROCESAMIENTO DE MUESTRAS Y TCNICAS DE COLORACIN EN EL REA DE MICOLOGA Prof. Carlos Rodrguez leogod1985@hotmail.com Prof. Johanny Ruz nannyruiz@hotmail.com INTRODUCCIN El procesamiento de las muestras biolgicas, especialmente las que provienen del animal y el hombre para el diagnstico microbiolgico, bsicamente es sencillo, el personal encargado de cada rea debe tener conocimiento para realizar el procesamiento de la muestra de manera correcta. Este proceso consta de cinco fases: toma de muestra, montaje de examen directo y coloracin, aislamiento en cultivo, identificacin del microorganismo aislado y reporte de resultados. En esta oportunidad se dar especial atencin a la fase de procesamiento de las muestras y montaje directo en fresco. Previo a la toma de la muestra es pertinente realizar un interrogatorio al paciente para recabar datos socio-demogrficos y epidemiolgicos que contribuyan a orientar el diagnstico de laboratorio y confirmar o no el diagnstico clnico. Cada muestra biolgica tiene un procesamiento distinto, bsicamente se trabaja con muestra de heces, orina, sangre, esputo, lquidos, exudados, aspirados y tejidos (piel, uas, cuero cabelludo, etc.), particularmente, para tomar las muestras de piel y sus anexos es necesario realizar la limpieza del rea. Luego en la fase de montaje del examen directo en fresco es preciso tener conocimiento y destreza para lograr visualizar los microorganismos potencialmente patgenos y as emitir un resultado que en algunos casos es el diagnstico definitivo de una infeccin o enfermedad. Palabras clave: Procesamiento de muestra, examen directo, micologa. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA Para procesar los distintos tipos de muestras biolgicas dentro de un laboratorio clnico y/o de investigacin, se debe contar con un rea adecuada adems, de los equipos y materiales requeridos, entre otros: Centrfuga Mechero Pinzas de depilar Tijeras, cucharilla de Brocq u hojas de bistur Lminas portaobjetos y cubreobjetos Tinta Parker azul negra con solv X KOH (10 a 40%) Asa de platino Tubos de ensayos Hisopos estriles Aplicadores de madera Jeringas Nevera o refrigerador Autoclave o esterilizador
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Nevera o refrigerador Autoclave o esterilizador Estufa Bao de Mara OBTENCIN DE LA MUESTRA Para realizar una adecuada obtencin de muestra para el rea de microbiologa se deben tener consideraciones especficas dependiendo del rea a estudiar (Bacteriologa, Virologa o Micologa) y dependiendo del tipo de muestra. A continuacin daremos una breve descripcin para cada una: Muestra Obtencin Obtenidas por puncin Limpiar la zona de la puncin con alcohol, alcohol (sangre, aspirados de yodado u otro tipo de antisptico abscesos, lquido Aspirar con jeringa estril, (Aspirados de ndulos y cefalorraqudeo abscesos se pueden transportar en ella) colocarlos en (L.C.R.), lquido pleural, tubos secos o con anticoagulante segn sea el caso etc. Orina Preferiblemente la primera de la maana y de ser parciales las de tiempo de retencin, explicar al paciente la limpieza de genitales y descarte del primer chorro. Colectarla en envase estril Esputo Explicar al paciente expectorar la mayor porcin de moco posible y colectarlo en envase estril Exudados o cepillados Se colecta con hisopos estriles, secos o humedecidos de mucosas con solucin salina estril, colocarlo en gel de transporte o en tubo seco dependiendo del caso Heces Se recolecta en recipiente estril, porcin con mayor moco macroscpicamente o hisopo rectal si hay impedimento de evacuacin espontnea Escamas de piel Previa limpieza del rea seleccionada, obtencin por cinta adhesiva transparente (adherir la cinta sobre la piel, despegar y posterior colocarla en lmina portaobjeto con adhesivo en direccin a la lmina) o por raspado con hoja de bistur en el rea de mayor descamacin y recoleccin en envase estril Pelos Previa limpieza del rea seleccionada, depilar con pinzas o hacer raspado con hoja de bistur y colocarlo en envase estril Uas Previa limpieza del rea seleccionada, se corta la ua de inters y se toma el material o detrito que se ubica entre la ua y la piel Biopsias Muestra obtenida por personal mdico autorizado y por lo general es enviada al laboratorio ya en medio de conservacin
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ANTES DEL PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA 1. Comprobar que la identificacin de la muestra es la correcta 2. Registrar toda la informacin necesaria que pudiera contribuir a orientar el diagnstico (aspecto, color, olor, consistencia, presencia de cogulos, etc.), as como todo lo relacionado con su recogida, transporte y conservacin. 3. Durante el procesamiento, deben seguirse todas las medidas de seguridad necesarias, tanto para el personal como para la muestra. 4. El procesamiento debe llevarse a cabo tan pronto como sea posible para garantizar la viabilidad del patgeno, utilizando el medio de cultivo y la temperatura de incubacin ms adecuada. 5. El tipo de procesamiento y los medios utilizados dependen de las caractersticas de cada muestra. 6. Se deben identificar bien las lminas y placas con: fecha, nmero de secuencia o registro e iniciales del paciente MOTIVOS DE RECHAZO DE MUESTRAS La muestras de esputos con mayor contenido de saliva. Poca cantidad de muestra (dependiendo del tipo de muestra). Tiempo de toma de muestra prolongado. Mantenimiento de transporte inadecuado PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA Muestra Procesamiento Lquidas obtenidas por Los lquidos orgnicos (LCR, pleural, peritoneal, puncin (sangre, articular, etc.) deben concentrarse por centrifugacin aspirados de abscesos, (1.500-2.500 g durante 10 min) Lquido cefalorraqudeo Se debe separar el sobrenadante (no descartar) (L.C.R.), Liquido Se trabaja con el sedimento. pleural, etc. Orina Deben concentrarse por centrifugacin (1.500-2.500 g durante 10 min) Se debe separar el sobrenadante (no descartar) Se trabaja con el sedimento. Excepto que la turbidez de la orina sea abundante Esputo Exudados o cepillados de mucosas Heces Explicar al paciente expectorar la mayor porcin de moco posible y colectarlo en envase estril Se hace un extendido en la lmina porta objeto de la porcin mucosa Se hace un extendido en la lmina porta objeto de la porcin mucosa o se toca con aplicador de madera y el material se disuelve en una gota de solucin salina en la lmina portaobjeto
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Escamas de piel

Pelos

Uas

Biopsias

Las obtenidas por cinta adhesiva transparente despegar de la lmina portaobjeto y proceder a colocar el colorante Las obtenidas por raspado con hoja de bistur, se colocan sobre la lmina porta objeto se concentran en la porcin central de la lmina y se procede a la aplicacin del colorante y KOH al 10% Las escamas y pelos se colocan sobre la lmina porta objeto se concentran en la porcin central de la lmina y se procede a la aplicacin del colorante y KOH al 20% Las escamas de detrito obtenidas por raspado, se colocan sobre la lmina porta objeto se concentran en la porcin central de la lmina y se procede a la aplicacin del colorante y KOH al 40% Por lo general vienen adheridas a la lmina portaobjeto debido a lo delicado del corte, listas para la tincin.

MONTAJE DE EXAMEN DIRECTO CON SOLUCIN SALINA Para realizar el examen directo sobre la lmina portaobjeto se coloca una o mximo dos gotas de solucin salina fisiolgica estril luego se coloca la muestra y se tapa con un una laminilla o cubreobjeto Evitar que la preparacin se seque ya que se perdera el material biolgico, tiempo, reactivo y si se analiza bajo estas condiciones se corre el riego de reportar resultados errneos. De ser necesario, puede ser colocar en cmara hmeda hasta el momento del anlisis. MONTAJE DE EXAMEN DIRECTO CON KOH Y/O TINTA PARKER AZUL NEGRA Sobre la lmina portaobjeto se coloca una gota de KOH (% adecuado, 10 a 40%) y una gota del sedimento en el caso de los lquidos, de exudados o heces. La muestra de escamas tomadas sobre la lmina se recogen en el centro y luego se les aade una o dos gotas de KOH. Luego se coloca una gota pequea de tinta Parker azul negra con solv X sobre la laminilla o cubreobjeto, se gira con rapidez y se coloca sobre la lmina portaobjetos con la muestra con el KOH. Flamear la preparacin con el mechero para acelerar la accin del KOH. Tener en cuenta las precauciones ya citadas. MONTAJE DE EXAMEN DIRECTO CON KOH Puede utilizarse para examinar muestras clnicas con abundantes clulas y restos celulares. El KOH disuelve ms rpidamente los elementos celulares que los hongos (protegidos por la pared celular).
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 El efecto clarificador del KOH puede aumentarse calentando ligeramente la preparacin. Si no se utiliza con colorantes, las preparaciones deben estudiarse con un microscopio convencional con luz reducida para aumentar el contraste o con un microscopio de contraste de fases. REACTIVOS Solucin de KOH al 10%. Por ejemplo: (KOH 10 g, glicerol 20 ml, agua destilada 80 ml). Mezclar por agitacin. PROCEDIMIENTO GENERAL Se deposita el material a examinar en una lmina porta y se aade una gota de la solucin de KOH, se mezclan bien y se coloca el cubreobjetos. Tras un periodo de tiempo (5-10 min) para permitir el aclaramiento de la muestra por el KOH, la preparacin se examina al microscopio en objetivo de 10X y 40X. EXAMEN DIRECTO CON TINTA CHINA Es la tcnica ms ampliamente conocida como tincin negativa usada para poner de manifiesto la cpsula del hongo levaduriforme Cryptococcus neoformans. La cpsula aparece como un halo claro y ntido en torno a una levadura redonda, delimitado por las partculas de carbn en suspensin coloidal de la tinta china, exhibiendo un ntido contraste. La cantidad de tinta no debe ser ni excesiva ni escasa, ya que, en ambos casos, el riesgo de visualizar artefactos se incrementa. Es importante manipular con cuidado el frasco de tinta evitando todo contacto con la muestra clnica que pueda contaminarlo y as producir falsos positivos. REACTIVOS Tinta china de buena calidad (nigrosina, tinta Pelikan India Ink o Parker Black Ink, entre otras). PROCEDIMIENTO Depositar sobre una lmina portaobjeto limpia y desengrasada una gota de LCR y una de tinta china, mezclarlas bien evitando formar burbujas y colocar el cubreobjeto. El color de la preparacin deber ser marrn, no negro. La preparacin se examina al microscopio en objetivo de x10 y x40 La presencia de formas redondas rodeadas de un halo grande y transparente son sugestivas de C. neoformans. REFERENCIAS Arenas G, R. (2003). Micologa Mdica Ilustrada. 2 ed. Mc Graw-Hill. Mxico. Murray, PR., Rosenthal KS., Pfaller MA. (2006). Microbiologa Mdica. 5 ed. ELSEVIER. Espaa. Jawetz, E., Melnick, J., Adelberg, E., Brooks, G., Butel, J., y Ornston, N. (2001). Microbiologa Mdica. 17 ed. Editorial el Manual Moderno, S.A de C.V Mxico, D.F.
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CONSIDERACIONES ACERCA DE LA PRCTICA DE ALGUNAS TINCIONES EN MICROBIOLGICA Prof. (a) Vilma Llovera Surez vjllovera@gmail.com Esta reflexin acerca de la prctica de algunas tinciones en el rea de la microbiologa tiene por objeto razonar acerca de la prctica del proceso de colorear extendidos para hacer diagnstico en el rea de la microbiologa. Para ello, propongo: poner en prctica el pensamiento crtico repasando algunas preguntas que pueden servir de gua para apuntalar o no el diagnstico del clnico y, as, contribuir activamente con el paciente, en vez, de limitarnos a realizar el procedimiento de tincin de manera pasiva como si fuese slo una receta. El pensamiento crtico nos exige plantearnos: Por qu? y para qu? hacemos una tincin, Qu protocolo (receta) seguir o elegir para hacerla? Cuales condiciones de bioseguridad se necesita para preparar los reactivos s son necesarios? Existe un momento particular durante el curso del proceso infeccioso en el cual es til la tincin? Qu tipo de muestra se debe utilizar y la cantidad? Cul es el tipo de frotis/extendido apropiado para hacerla? Cmo fijar la muestra a la lmina portaobjeto? Cmo revisar el frotis y cuntos campos recorrer? Dnde vamos a buscar lo que nos piden investigar? Cmo se puede hallar lo que no se est buscando? Cundo descartarlas? Cmo descartar estas lminas coloreadas? La suerte favorece a las mentes lcidas. Albert Einstein. De dnde partir? Integrar la tica con el conocimiento terico y la experiencia prctica, TINCIN DE GRAM Fue desarrollada por el mdico patlogo dans Hans Christian Joachim Gram en 1882 (publicado en 1884), en respuesta a la necesidad de teir las bacterias para diferenciarlas del tejido infectado. Es la coloracin ms importante en el rea de la bacteriologa, ya que, permiti la primera clasificacin bioqumica de las bacterias en dos grandes grupos y, en la actualidad, en muchos casos, constituye la base para instalar un tratamiento antimicrobiano; que puede cambiar el curso de la infeccin y la enfermedad en un ser humano o animal. Est basada en la diferencia de la composicin de la pared celular de las bacterias, especficamente a la cantidad de peptidoglucanos (murena o mucopptidos) que poseen, lo cual permite a la bacteria teirse con uno u otro de dos colorantes (violeta /safranina) con ayuda de la solucin yodada. De manera que, aquellos organismos que se tien de color azul/violeta son llamados Gram positivos (G+) y los que se colorean de rosado con la safranina Gram negativos (G-) Existen algunas variantes en relacin con los colorantes y el alcohol a utilizar que deben tenerse en cuenta al poner en prctica esta tincin en el laboratorio; no se debe intercambiar reactivos entre estos.
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COLORANTE DE GRAM A. Cristal violeta de Hucker modificado Solucin A: Cristal violeta (certificado) 2 g Alcohol etlico 95% 20 mL Solucin B: Oxalato de Amonio 0,8 Agua destilada 80,0 mL Mezclar las soluciones A y B. Guardar 24 horas antes de usar. Filtrar a travs de papel directamente en la botella de colorante. B. Iodo de Gram Iodo 1g Ioduro de potasio 2g Agua destilada 300 mL Mezclar el iodo seco y el ioduro de potasio en un mortero. Aadir agua, pocos mililitros por vez y moler bien despus de cada adicin hasta lograr una solucin. Enjuagar la solucin en un frasco de vidrio color mbar con el resto del agua destilada. C. Decolorantes *Alcohol etlico 95%: el agente ms lento *Acetona: el agente ms rpido *Acetona-alcohol (1:1)l: intermedio (Alcohol etlico 95%, 100mL; acetona, 100mL) Con experiencia cualquiera de los tres da buenos resultados. D. Contra colorante Solucin stock Safranina O (certificada) Alcohol etlico Solucin de trabajo Solucin stock Agua destilada

2,5 g 100,0 mL 10 mL 90 mL

E. Procedimiento de coloracin Cubrir el frotis con un chorro de la solucin de cristal violeta dejar reposar 1minuto. Lavar brevemente con agua corriente y drenar el exceso de agua. Inundar el frotis con solucin de iodo dejar reposar 1 minuto. Lavar brevemente con agua corriente y drenar el exceso de agua. Decolorar hasta que el solvente fluya incoloro del portaobjeto. Lavar brevemente Contracolorear con safranina 10 segundos. Lavar brevemente. Secar por absorcin o al aire, colocar una gota de aceite de inmersin y examinar con objetivo de 100X. Los microorganismos Gram positivos se vern azul/violeta y los Gram negativos rosa/rojo.
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COLORANTE DE GRAM PARA ACTINOMICETOS Y OTRAS BACTERIAS A. Solucin de anilina-violeta en cristales Anilina 40 mL Agua 1L Violeta cristalino, solucin alcohlica saturada 114 mL Agitar la anilina y el agua en un recipiente cerrado hasta que se mezclen. Filtrar a travs de cuatro capas de papel humedecido con agua. Agregar la solucin de violeta al filtardo. B. Iodo de Gram Iodo 1g Ioduro de potasio 2g Agua destilada 300 mL Mezclar el iodo seco y el ioduro de potasio en un mortero. Aadir agua, pocos mililitros por vez y moler bien despus de cada adicin hasta lograr una solucin. Enjuagar la solucin en un frasco de vidrio color mbar con el resto del agua destilada. C. Safranina Safranina, solucin alcohlica saturada (unos 2,5 g/100 mL de alcohol de 95%) Agua

10 mL 90 mL

D. Procedimiento de coloracin Colorear con cristal violeta durante 2 minutos. Lavar y secar Aplicar iodo Gram 1 minuto. Lavar y secar Decolorar con alcohol de 95% durante 30 segundos. Lavar Contracolorear con safranina 30 segundos y secar. Los microorganismos Gram positivos se vern azul/violeta y los Gram negativos rosa/rojo. TINCIN DE ZIELH NEELSEN Esta coloracin fue descrita por dos mdicos alemanes Franz Zielh, bacterilogo y Friedrich Neelsen, patlogo. Basada en la composicin de la pared de algunos microorganismos que contiene cidos miclicos (cidos grasos de cadena larga (50-90C) con mltiples uniones cruzadas, los cuales tienen la particularidad de hacerlas resistentes a la mezcla cido-alcohol por lo que retienen el colorante de Zielh, de manera que los denominados cido alcohol resistentes se colorean de color fucsia y el fondo se tien con el colorante de contraste azul. Las bacterias del gnero Micobacterium y los parsitos coccidios como Cryptosporidum sp son acido-alcohol resistentes. Otros gneros de bacterias como Nocardia, Streptomyces y Corinebacterium tienen cidos miclicos de cadena corta y son parcialmente acido alcohol resistentes. Esta tincin utiliza fucsina fenicada, hay dos procedimientos que emplean este compuesto: - Coloracin de Ziehl-Neelsen, que requiere el calentamiento de la muestra para
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fijar la fucsina a los lpidos de la pared celular. - Coloracin de Kinyoun, que aumenta la concentracin de fucsina bsica y de fenol, evitando el calentamiento. COLORACIN DE ZIEHL-NEELSEN. A. Solucin de fuscina fenicada de Zielh *Solucin A: fucsina bsica 3g alcohol etlico 95% 100mL tritura la fucsina bsica en un mortero hasta pulverizarla luego ir agregando el alcohol *Solucin B: Fenol fundido 5 mL Agua destilada 95 mL Mezclar 10 mL de la solucin A con 90 mL de la solucin B B. Solucin de Alcohol Acido: Decolorante Acido clorhdrico (conc) 3 mL Alcohol etlico 95% 97 mL C. Contracolorante Azul de metileno hidrosoluble Agua destilada

0,3 g 100 mL

D. Procedimiento de coloracin Cubrir con carbolfucsina calentar por 5 minutos hasta la emisin de vapores, manteniendo la lmina siempre cubierta con colorante y vapores. Lavar con agua corriente Decolorar en varias porciones sucesivas hasta que no aparezca ms color (2min o ms) Lavar con agua corriente. Contracolorear con azul de metileno 1 minuto. Lavar. Secar al aire. COLORACIN ACIDFILA DE KINYOUN PARA MICOBACTERIAS A. Carbolfucsina de Kinyoun Fucsina bsica 4 g, cristales de fenol 8 g, alcohol 95%, 20 mL; en agua destilada, 100 mL Disolver la fucsina en alcohol, aadir fenol y el agua. B. Decolorante 3 mL de HCl concentrado en 97 mL de alcohol etlico 95% C. Contracolorante Solucin stock de verde de malaquita
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Verde de malaquita 4g y 50 mL de alcohol 95% Solucin de trabajo de verde de malaquita Solucin stock de verde de malaquita 20 mL Agua destilada 180 mL D. Procedimiento de coloracin Cubrir con carbolfucsina por 3 minutos sin calentar, lavar con suavidad con agua corriente Decolorar con alcohol cido hasta que no aparezca ms color (2min) Contracolorear con verde de malaquita por 30 segundos. Lavar suavemente. Secar al aire. COLORANTE ACIDFILO DE KINYOUN PARA ACTINOMICETOS Las soluciones son las mismas ya descritas excepto que se usa azul de metileno 2,5% en alcohol etlico 95% como contracolorante. Teir con carbolfucsina 3 minutos, sin calor. Lavar. Decolorar 5 a 10 segundos con cido-alcohol. Cubrir con azul de metileno 30 segundos. Lavar con agua, escurrir y TINCIN DE GIEMSA Algunos microorganismos son diagnosticados en sangre perifrica y/o medula sea razn por la cual son tiles en microbiologa los colorantes de Romanoswki, mezcla de azul de metileno y eosina, el primero tie los componentes cidos como el ncleo y el ARN y el segundo la eosina tie los componentes bsicos, como la hemoglobina de rojo. La tincin popular Romanoswki es conocida como MayGruenewald-Giemsa. La coloracin de Giemsa es til en el diagnstico de infecciones causadas por microorganismos de diversos gneros como Histoplasma (hongo), Borrelia, Erlichia, Chlamydia (bacterias) y Plasmodium (parsitos). TINCIN DE GIEMSA Solucin madre de colorante de Giemsa Polvo de Giemsa (puro) 0,5 g Glicerol (c.p) 33 mL Alcohol metlico 33 mL

Preparacin Calentar el glicerol a 55 C, agregar lentamente el colorante en polvo agitando, mantener esa temperatura durante 1 a 2 horas. Enfriar y agregar el alcohol metlico. Mezclar. Dejar sedimentar toda la noche en campana de desecacin para prevenir absorcin de humedad. Repartir en frascos de 30 mL. Taponar fuertemente. Almacenar durante 2 semanas. Filtrar antes de usar.
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Solucin de trabajo 2 gotas de policromato por cada mL de agua. Procedimiento: Fijar la lamina del extendido con metanol. Dejar secar Colorear con policromato (giemsa) por 20 minutos. Lavar y dejar secar. REFERENCIAS: Brooks G., Carrol K., Morse S y Mieetzner T. Jawetz, Melnick y Adelbert. (2010). Microbiologa Mdica. 25 ed. Mc Graw-Hill. Chordi A (comp). (2006). Anlisis Microbiolgico del Agua: Laboratorio Virtual y casos prcticos. Curso Virtual. Universidad de Salamanca. Campos A. (2007). Pensamiento Crtico. Tcnicas para su desarrollo. Bogot. Cooperativa editorial Magisterio. Davis B, Dulbecco R, Eisen H, Ginsberg H. (1984). Tratado de Microbiologa. 3 ed. Salvat. Gutirrez J. Hans C.J. (1986). Gram. Mdico que marco poca con su famoso mtodo de coloracin. Esbozo histrico. Presentado en: I Congreso Venezolano de Patologa Clnica y IV Congreso Venezolano de Microbiologa. Laboratorios Bristol de Venezuela. Crocker J y Burnett. (2005). La ciencia del diagnstico del laboratorio. 2 ed. Mc Graw-Hill. Lennette y cols. (1982). Microbiologa Mdica.3ed. Buenos Aires. Editorial Panamericana. OMS. (2005). Manual de Bioseguridad en el Laboratorio. 3 ed. Ginebra.

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PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS EMPLEADOS EN MICROBIOLOGA Prof. (a) Mara Chacn zoiret.chacon@gmail.com MEDIOS DE CULTIVO Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos. CONSTITUYENTES HABITUALES DE UN MEDIO DE CULTIVO AGAR utilizado como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo. EXTRACTOS son concentrados en polvo, deshidratado, de parte de rganos o tejidos animales o vegetales para confeccionar el medio adecuado. PEPTONAS se obtienen por digestin enzimtica o qumica de protenas animales o vegetales. Son muy ricas en pptidos y aminocidos. FLUIDOS CORPORALES (sangre o plasma) Se aaden a los medios de cultivo porque contienen factores de crecimiento que facilitan el crecimiento de algunos microorganismos exigentes. SISTEMAS AMORTIGUADORES (fosfatos bisdicos y bipotsicos) se utilizan para mantener el pH del medio en un determinado valor. INDICADORES DE pH son indicadores cido-base con el objeto de detectar variaciones de pH. AGENTES REDUCTORES se aaden para crear condiciones que permitan el desarrollo de los grmenes microaerfilos o anaerobios. AGENTES SELECTIVOS son sustancias que se adicionan para convertir al medio de cultivo en selectivo. Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en: MEDIOS NATURALES O COMPLEJOS: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la adicin de minerales y otras sustancias. En ellos no se conocen todos los componentes, ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos. MEDIOS DEFINIDOS O SINTTICOS: son los medios que tienen una composicin qumica definida cuali y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigacin. De acuerdo al uso del medio de cultivo, stos se clasifican en: MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO: son medios lquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular. Permiten aumentar el nmero de microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o ms
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sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepcin de los que se quieren cultivar. MEDIOS SELECTIVOS: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios slidos y estn diseados para el aislamiento de microorganismos especficos. MEDIOS DIFERENCIALES: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los microorganismos. No contienen ningn tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar caractersticas fisiolgicas de los microorganismos. Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes bsicos, o por simple rehidratacin de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, adems de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles. Para su preparacin se deben tener en cuenta los siguientes aspectos: 1. Prepararlos slo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren productos de calidad y cuya reaccin sea lo ms cercana posible a pH neutro. 2. Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiolgica y fisicoqumica adecuada. 3. Utilizar material de vidrio bien lavado y enjuagado con agua destilada o desmineralizada con el propsito de eliminar totalmente eventuales residuos de otras sustancias. 4. Los recipientes destinados a la preparacin de medios de cultivo deben ser lo suficientemente grandes para que el medio de cultivo que se prepare pueda ser agitado con facilidad y concienzudamente. 5. Al medio de cultivo deshidratado y pesado se aade aproximadamente la mitad de la cantidad necesaria de agua y se agita suficientemente para conseguir una suspensin homognea. 6. Despus se incorpora la cantidad de agua restante, aprovechando esta adicin para desprender e incorporar al conjunto las partculas del medio de cultivo que hubieran quedado adheridas a la pared interna del recipiente. 7. Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilizacin. Nunca se deben exceder las condiciones sealadas por el fabricante. 8. Los medios de cultivo que no poseen agar ni gelatina se pueden disolver en agua fra o bajo ligero calentamiento. 9. Los medios de cultivo que poseen agar o gelatina deben ser calentados para conseguir su disolucin. 10. En el caso de los medios de cultivo que no deben ser sometidos a ulterior esterilizacin en autoclave es imprescindible prestar atencin a su disolucin completa.

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11. Puede reconocerse que ha alcanzado la disolucin completa cuando, al agitar, no se adhiere a la pared interna del recipiente partcula alguna de agar y la solucin, viscosa, resbala libremente. ESTERILIZACIN DEL MEDIO DE CULTIVO Antes de su esterilizacin, es conveniente repartir el medio de cultivo en porciones ms pequeas, por ejemplo, en los recipientes definitivos o en los que ulteriormente se lleve a cabo el trabajo (excepto placas de Petri). Si las normas de preparacin no indican otra cosa, la esterilizacin se lleva a cabo en autoclave, a 121 C, durante 15 min. Temperaturas ms altas y calentamientos ms prolongados de lo previsto, perjudican la calidad del medio de cultivo. VERTIDO EN PLACAS Para evitar la formacin de gotitas de condensacin de agua en la tapa de las placas de Petri, debe agregarse en ellas el medio de cultivo a una temperatura de 45-55C. Previamente hay que remover bien el medio de cultivo haciendo oscilar en sentido circular su recipiente, para asegura la distribucin uniforme de dicho medio. Las burbujas de aire en la superficie de la placa se eliminan abanicando brevemente la superficie con la llama no luminosa del mechero de Bunsen. TUBOS DE AGAR INCLINADO Los tubos de ensayo, con tapa de baquelita o con tapa de algodn, llenos con medio de cultivo esterilizado, todava lquido, se colocan en una posicin inclinada, de tal forma que se genere una capa de aproximadamente 3 cm. Y una superficie inclinada de iguales dimensiones. El medio se deja solidificar en la posicin inclinada. ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo las condiciones que seale el fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25C), con poca humedad y protegidos de la luz solar directa. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor. Los medios de cultivo deshidratados son higroscpicos. Cuando los envases de estos medios de cultivo deshidratados son abiertos para su uso inicial, se debe tener la precaucin de cerrarlos tan pronto como sea posible y mantenerlos bien cerrados para prevenir la entrada de humedad. La absorcin de agua produce cambios de pH, formacin de grumos, decoloraciones del polvo, etc., lo cual indica que deben ser descartados porque pueden haber sufrido cambios qumicos o estar contaminados. Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado, puede almacenarse a temperatura ambiente por un periodo mximo de 2 semanas protegido de la luz, o por periodos mayores a 12 -15C. Sin embargo, almacenados bajo refrigeracin entre 2 y 8C se prolonga la vida til de los
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mismos, (nunca por debajo de 0C porque se destruye la estructura del gel). Por lo general, es posible su conservacin durante 1 a 2 semanas a temperatura ambiente. Los medios de cultivo se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratacin y cuando se usa tapn de algodn, se debe colocar por encima una envoltura de papel (Craft). Otro punto importante a tomar en cuenta, es que cada lote de medio de cultivo preparado debe pasar por un riguroso proceso de control de calidad, en donde se determinan sus propiedades fisicoqumicas (apariencia, pH, etc.) y microbiolgicas (esterilidad y promocin de crecimiento) verificando que cumplan con los requisitos de calidad establecidos y por ende demostrar que son aptos para su uso. Posibles defectos en la preparacin y manipulacin de los medios de cultivo Almacenamiento de los Conservacin en atmsfera excesivamente medios de cultivo hmeda deshidratados El envase permaneci abierto demasiado tiempo El envase no fue adecuadamente cerrado despus de su uso El medio de cultivo deshidratado est muy pasado de la fecha de vencimiento Desviacin del valor de pH Agua NO neutra. Envase mal cerrado Medio de cultivo sobrecalentado durante su preparacin El medio de cultivo deshidratado est muy pasado de la fecha de vencimiento Turbidez, precipitacin Turbidez en el medio que provoque observaciones deficientes, son consideradas defecto Agua insuficientemente desionizada Recipientes sucios pH incorrecto o desajustados Sobrecalentamiento durante la preparacin Ocasionado por el material de muestra Perdida de agua por evaporacin en el medio de cultivo preparado Punto de solidificacin Excesiva proporcin del medio de cultivo demasiado elevado deshidratado Agar inadecuado Escasa estabilidad del gel Insuficiente proporcin del medio de cultivo deshidratado No se disolvi completamente el medio de
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Desviacin del color

Medios de cultivo (listos para su uso) contaminados

Crecimiento demasiado pobre de grmenes

Crecimiento demasiado intenso de grmenes

Colonias inconcretas o desledas

cultivo deshidratado Medio de cultivo sobrecalentado durante su preparacin, en los casos de pH demasiado bajos No se agit lo suficiente el medio, en su recipiente de preparacin, cuando fue vertido a las placas. En caso de cultivos confeccionados por el usuario, cantidad de agar escaso o inadecuado Valor errneo de pH, en el caso de medios que contengan indicador de pH Sobrecalentamiento del medio de cultivo durante su preparacin, lo que da lugar a: Medio de cultivo oscuro, pigmentos alterados, azcar caramelizado El recipiente donde se prepar no estaba lo suficientemente limpio Esterilizacin insuficiente Contaminacin accidental posterior a la esterilizacin, debido a impericia en el vertido de placas, uso de tubos o placas no estriles o contaminadas Residuos de sustancias inhibidoras de crecimiento en los recipientes de preparacin de cultivos, en el agua de preparacin, en el material de ensayo Grmenes alterados en el material de ensayo pH incorrecto Medios de cultivo sobrecalentados durante su preparacin En el caso de medios de cultivo basales: aditivos defectuosamente dosificados En el caso de medios de cultivo mezclados: adicin de la muestra efectuada a temperatura demasiado elevada Medios de cultivo sobrecalentados durante su preparacin, con la consiguiente destruccin de sustancias inhibidoras selectivas En el caso de medios de cultivo basales: aditivos defectuosamente dosificados Medio de cultivo sembrado con demasiado material de ensayo Superficie del medio de cultivo demasiado hmeda
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Crecimiento atpico

Superficie del medio de cultivo sembrado con demasiado material de ensayo Medios de cultivo sobrecalentados durante su preparacin, con la consiguiente destruccin de sustancias inhibidoras selectivas Medio de cultivo errneo, o defectuosamente preparado El medio de cultivo deshidratado est muy pasado de la fecha de vencimiento El medio de cultivo utilizado ha permanecido almacenado durante tiempo excesivo, envejeciendo o deteriorndose Condiciones de cultivo no conforme con las normas Residuos de sustancias extraas: en los recipientes de preparacin o de cultivo (por ejemplo, detergentes), en el agua o material de ensayo

REACTIVOS QUMICOS Un reactivo es, en qumica, toda sustancia que interacta con otra en una reaccin qumica que da lugar a otras sustancias de propiedades, caractersticas y conformacin distinta, denominadas productos de reaccin o simplemente productos. Por tratarse de compuestos qumicos, los reactivos se pueden clasificar segn muchas variables: propiedades fsico-qumicas, reactividad en reacciones qumicas, caractersticas del uso del reactivo. Sin embargo, por tratarse del concepto de reactivo la clasificacin ms adecuada en este caso sera la de caractersticas de su uso, segn la cual se clasifican en el uso al que estn destinados los reactivos. Esta clasificacin viene dada en el envase del reactivo y depende del tratamiento que se le haya dado, de su riqueza, de su pureza que determina el uso qumico que se le va a poder dar, teniendo en cuenta la precisin, exactitud y error absoluto que se ha de tener en la operacin qumica a realizar. Se utilizan diferentes mtodos para preparar reactivos, dependiendo de si son reactivos slidos o lquidos. PREPARACIN DE REACTIVOS LQUIDO Para preparar un reactivo hay que contar con el protocolo y asegurarse de tener todos los detalles relativos a la elaboracin del reactivo, por ejemplo, el grado de agua u otro disolvente requerido.

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Buscar todos los implementos necesarios para preparar el reactivo. Esto incluye material de vidrio de tamao adecuado para contener la cantidad de los reactivos a preparar, los compuestos qumicos necesarios e instrumentos de medida, por ejemplo, balanza, cilindros, pipetas, vasos precipitados. Completar cada paso del proceso de mezclar el reactivo antes de pasar a la siguiente etapa del proceso. Muchos reactivos requieren de un calentador y/o un agitador magntico para ayudar a disolver los productos qumicos. Realizar la dilucin final del reactivo hasta el final para obtener la concentracin correcta. A menudo, las concentraciones de los reactivos son tan bajas que se debe preparar una solucin de mayor concentracin que luego se dluye a una menor concentracin antes de que est terminada. Etiquetar los frascos con el nombre del reactivo, la concentracin y la fecha en que se prepar. REFERENCIAS Davis B, Dulbecco R, Eisen H, Ginsberg H. (1984).Tratado de Microbiologa. 3 ed. Salvat. Manual de medios de cultivo MERCK. 1994 Reactivos. Guas multimedia del Gamm. Universitat de Valencia. Documento en lnea: http://www.uv.es/gammmm/Subsitio%20Operaciones/2%20REACTIVOS.htm

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