Informe N3: Reconocimiento de Lpidos Muestra: Aceite de Oliva marca Banquete

Alumnas:

Silvana Abarza Lucila Vargas Daniela Zeballos

Curso:

382

Asignatura: Laboratorio de Bioqumica Grupo: N3

ndice
Pgina

1.- Resumen____________________________________________________ 2.- Introduccin__________________________________________________ 3.- Parte experimental_____________________________________________ 4.- Resultados___________________________________________________ 5.- Discusin____________________________________________________ 6.- Conclusiones y recomendaciones_________________________________ 7.- Tablas_______________________________________________________ 8.- Figuras______________________________________________________ 9.- Cromatogramas_______________________________________________ 10 Bibliografa___________________________________________________ 11 Apndice______________________________________________________ 12 Anexos _______________________________________________________

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Resumen

En el presente informe se da cuenta de lo realizado en el laboratorio de bioqumica, este consiste en analizar una muestra de aceite de oliva marca Banquete con el fin de determinar las propiedades de los lpidos mediante anlisis cualitativos y cuantitativos. Primero determinamos lpidos saponificables en la muestra, lo cual nos dio un resultado positivo ya que se pudo observar una buena separacin y distincin de las capas, glicerina ms agua en la capa inferior (capa clara), jabn en la capa del medio y en la capa superior el aceite que no reaccion (con NaOH) al procedimiento. Luego se tomo otra cantidad de aceite y se someti a un largo proceso, por el mtodo de esterificacin de acidos grasos con metanol-cido sulfrico, para extraer as los cidos grasos libres. De estos se recuperaron 30,13% Posteriormente se realiz la obtencin de esteres metlicos mediante dos mtodos: por esterificacin utilizando metanol-cido sulfrico y por transterificacin utilizando metanol-hidrxido de potasio 2N. En el primero se recuper 92,38% de esteres metlicos dando un rendimiento de la esterificacin con respecto al valor terico de 87,15 % Los acidos grasos recuperados anteriormente se llevaron a un anlisis por cromatografa de gases para determinar la composicin y los tipos de cidos grasos que se encontraban en la muestra de aceite de oliva banquete. Encontrando los siguientes cidos grasos: 1.- cido Linoleico 2.- cido Oleico 3.- cido Palmtico

Introduccin
-Lpidos: Los lpidos son biomolculas orgnicas formadas bsicamente por carbono e hidrgeno y generalmente tambin oxgeno; pero en porcentajes mucho ms bajos. Adems pueden contener tambin fsforo, nitrgeno y azufre. Es un grupo de sustancias muy heterogneas que slo tienen en comn estas dos caractersticas: 1. Son insolubles en agua 2. Son solubles en disolventes orgnicos, como ter, cloroformo, benceno, etc. Una caracterstica bsica de los lpidos, y de la que derivan sus principales propiedades biolgicas es la hidrofobicidad. La baja solubilidad de los lpidos se debe a que su estructura qumica es fundamentalmente hidrocarbonada (aliftica, alicclica o aromtica), con gran cantidad de enlaces C-H y C-C. La naturaleza de estos enlaces es 100% covalente y su momento dipolar es mnimo. El agua, al ser una molcula muy polar, con gran facilidad para formar puentes de hidrgeno, no es capaz de interaccionar con estas molculas. En presencia de molculas lipdicas, el agua adopta en torno a ellas una estructura muy ordenada que maximiza las interacciones entre las propias molculas de agua, forzando a la molcula hidrofbica al interior de una estructura en forma de jaula, que tambin reduce la movilidad del lpido. Todo ello supone una configuracin de baja entropa, que resulta energticamente desfavorable. Esta disminucin de entropa es mnima si las molculas lipdicas se agregan entre s, e interaccionan mediante fuerzas de corto alcance, como las fuerzas de Van der Waals. Este fenmeno recibe el nombre de efecto hidrofbico. Los lpidos son constituyentes importantes de la alimentacin (aceites, manteca, yema de huevo), representan una importante fuente de energa y de almacenamiento, funcionan como aislantes trmicos, componentes estructurales de membranas biolgicas, son precursores de hormonas (sexuales, corticales), cidos biliares, vitaminas etc. -cidos grasos: Los cidos grasos son molculas formadas por una larga cadena hidrocarbonada de tipo lineal, y con un nmero par de tomos de carbono. Tienen en un extremo de la cadena un grupo carboxilo (-COOH). Estos son los componentes orgnicos (pequeas molculas que se unen para formar largas cadenas) de los lpidos que proporcionan energa al cuerpo y permiten el desarrollo de tejidos. Se conocen unos 70 cidos grasos que se pueden clasificar en dos grupos: Los cidos grasos saturados slo tienen enlaces simples entre los tomos de carbono. Son ejemplos de este tipo de cidos el mirstico (14C);el palmtico (16C) y el esterico (18C) . Los cidos grasos insaturados tienen uno o varios enlaces dobles en su cadena y sus molculas presentan codos, con cambios de direccin en los lugares dnde aparece un doble enlace. Son ejemplos el olico (18C, un doble enlace) y el linoleco (18C y dos dobles enlaces).

-Aceite de oliva: El aceite de oliva es un aceite vegetal de uso principalmente culinario que se extrae del fruto recin recolectado del olivo (Olea europaea) denominada oliva o aceituna. *Composicin de los aceites de oliva El rendimiento de aceite de la aceituna es muy alto, dependiendo de la variedad, el porcentaje puede oscilar entre un 25 y un 30% de aceite en cada aceituna. Las aceitunas poseen un glucsido que le proporciona un sabor amargo y que debe eliminarse mediante un macerado adecuado, en el caso del aceite de oliva este compuesto se elimina de forma natural durante el prensado en la almazara. De los componentes qumicos que posee el aceite son en su mayora cidos grasos, como son el cido oleico (casi un 75%), siendo el siguiente el cido palmtico, cido linoleico. El aceite de oliva posee una cantidad moderada de Vitamina E (principalmente -Tocoferol) y a pesar de poseer una baja cantidad de -Tocoferol el aceite de oliva es estable.[8] Los componentes menores del aceite no se eliminan debido a que rara vez es refinado: escualenos, esteroles, alcoholes triterpenoides, clorofila, carotenoides . No obstante se pueden resumir que existen en el aceite de oliva tres grandes grupos de sustancias, a saber:

Fraccin saponificable: comprende el 98-99 % en el total de su peso. Est formada por los triglicridos, cidos grasos libres y fosfolpidos. Esta fraccin est formada por un 75,5 % de cido oleico (C18:1), un 11,5 % de cido palmtico (C16:0) y por un 7,5 % de cido linolico (C18:2), adems de otros cidos grasos en concentracin de trazas, como cafico, margrico, esterico, etc. Fraccin insaponificable: constituye el 1,5 % en el total de su peso. Comprende los hidrocarburos como el hexenal, responsable del gusto herbceo de un aceite de aroma frutado, alcoholes, esteroles y tocoferoles. Otros componentes menores: -Polifenoles: relacionados con el sabor del aceite -Pigmentos cloroflicos y carotenoides: relacionados con el color que puede poseer el aceite. -Compuestos voltiles: responsables del aroma del aceite.

-Saponificacin: Saponificacin es una reaccin qumica entre un cido graso (o un lpido saponificable, portador de residuos de cidos grasos) y una base o lcali, en la que se obtiene como principal producto la sal de dicho cido y la base. Estos compuestos tienen la particularidad de ser antipticos, es decir tienen una parte polar y otra apolar (o no polar), con lo cual pueden interactuar con sustancias de propiedades dispares. Por ejemplo, los jabones son sales de cidos grasos y metales alcalinos que se obtienen mediante saponificacin.

-Esterificacin: Esterificacin, es la reaccin entre un alcohol y un cido, en presencia de cido sulfrico como catalizador, y mediante la cual se obtienen un ster y agua. Es la reaccin inversa de la saponificacin. Un cido carboxlico y un alcohol forman un ster en una reaccin de esterificacin cuando se calientan juntos en presencia de un catalizador cido, generalmente el cido sulfrico. La esterificacin es una reaccin de sustitucin nuclefila en la que el agente nucleoflico es el alcohol, de manera que la molcula de agua se origina por unin del grupo hidrxido, -OH, del cido y el hidrgeno, H, del alcohol. La extensin de la esterificacin es mayor para un alcohol primario que para un alcohol secundario y para ste mayor que para un alcohol terciario. Como se trata de una reaccin reversible, la concentracin de ster se puede aumentar incrementando las concentraciones del cido o el alcohol, o disminuyendo la concentracin del agua formada mediante un agente deshidratante. -Transesterificacin: La transesterificacin permite transformar un ster en otro sin necesidad de pasar por el cido carboxlico correspondiente. Hay dos tipos de reacciones:

En medio cido: se utiliza un alcohol en medio cido. El grupo RO - del alcohol acta como nuclefilo y ataca al carbono del ster, desprendindose el grupo OR, formando un nuevo ster y un nuevo alcohol. En medio bsico: se utiliza un alcohol en medio bsico. El -O-H ataca al carbono del cido, formando una especie intermedia muy inestable. El grupo OR se separa, y se forma un cido carboxlico que es rpidamente atacado por el grupo EtO- formando el nuevo ster.

Cabe destacar que el proceso anlogo a la transesterificacin es la hidrlisis.

Parte experimental
Materiales: Saponificacin: Bao Mara- Mechero Gradillas con tubos de ensayo (3) Vaso de precipitado de 250 ml Aceite vegetal (100 ml) Solucin de Sudan III en gotario Solucin de NaOH 20% ter de petrleo o cloroformo

Esterificacin cidos grasos: Esteres metlicos: Metanol anhidro. cido sulfrico. Solucin saturada de cloruro de sodio Rojo de metilo, indicador ter de petrleo Sulfato de sodio anhidro. Nitrgeno. Metanol tcnico cido clorhdrico 4 N Solucin saturada de cloruro de sodio Naranja de metilo, indicador

Procedimiento Saponificacin: 1. Colocar en un tubo de ensayo 2cc de aceite vegetal y 2cc de una solucin de hidrxido sdico al 20%. 2. Agitar enrgicamente y colocar el tubo al bao Mara de 20 a 30 minutos. 3. Transcurrido este tiempo, se puede observar en el tubo tres capas: la inferior clara, que contiene la solucin de sosa sobrante junto con la glicerina formada; la superior amarilla de aceite no utilizado, y la intermedia, de aspecto grumoso, que es el jabn formado. Procedimiento Esterificacin cidos grasos: a) Se pesan aproximadamente 2,5 grs. De aceite vegetal, en matraz de reflujo. b) Se agregan 20 ml de solucin agua: metanol-hidrxido de sodio al 50% p/v y se agita. c) Se refluja durante 60 minutos. Se debe tomar las precauciones necesarias para tener la seguridad de que la reaccin de saponificacin es completa. d) Si fuese necesario determinar la materia insaponificable, se trasvasija a embudo de decantacin, el contenido del matraz de reflujo, para extraer dicha materia, de acuerdo al mtodo de extraccin de la materia insaponificable. e) A los jabones, que contienen o se han extrado la materia insaponificable, se agregan 50 ml de agua destilada y gotas del indicador naranja de metilo. f) Se acidifica con cido clorhdrico 4 N, poco a poco y con agitacin, hasta permanencia del color rosado. g) Se deja decantar, hasta separacin clara de dos fases. h) Luego se extraen los cidos grasos con 2x10 ml. de ter de petrleo, desechando la fase acuosa inferior. i) j) Se evapora el solvente en atmsfera de nitrgeno y a bao mara. Se verifican los cidos grasos con papel tornasol. Se enfra a temperatura ambiente y se pesa.

Procedimiento steres metlicos: a) Se pesan aproximadamente 0,5 grs. de cidos grasos de aceite vegetal, en matraz de reflujo. b) Se agregan 10 ml de metanol anhidro y 1 ml de cido sulfrico concentrado, gota a gota, con agitacin. c) Se lleva a ebullicin y se refluja durante 30 minutos, en placa elctrica a bao mara. d) Se enfra a temperatura ambiente y se transfiere a embudo de decantacin, agregando luego 30 ml de solucin saturada de cloruro de sodio. e) Se extraen los esteres metlicos con 2 x 10 ml. de ter de petrleo. f) Se lava el extracto de ter con porciones de agua destilada hasta que el agua de lavado de la reaccin de neutra, que se verifica con indicador rojo de metilo. g) Se seca el extracto etreo con sulfato de sodio anhidro, se filtra y se evapora el solvente sobre atmsfera de nitrgeno a bao mara. h) Se enfra a temperatura ambiente y se pesa. Cromatografa La muestra obtenida despus del proceso de esterificacion de acidos grasos y tambin la obtenida por transterificacin, fueron llevadas a cromatografa de gases para identificar los compuestos grasos de esta. Condiciones cromatograficas: Se uso la columna BPX- 70: 70% de ciano y 30% de polidimetilsiloxano Propano 150C x 2 min Paper: 10C/min T final: 210C El cyano es susceptible a daarse con oxgenos, humedad o HCl en comparacin a otras fases de silicona. Rango de temperatura de funcionamiento: subambient a 25 C. Los esteres metlicos sales de acuerdo a P.M en el caso de los cidos grasos saturados, y en los insaturados influye la polaridad. Los insaturados salen despus que los saturados del mismo peso molecular.

Resultados
En el primer procedimiento realizado, se verifico que el aceite que se tiene de muestra es saponificable. Debido a que una vez que se agrego el alcli (NaOH) y luego de esperar 30 minutos nos dio un resultado positivo, jabn Con respecto a los resultados obtenidos en las dems experiencias realizadas, como lo son: la esterificacion de cidos grasos con metanol-acido sulfrico, la obtencin de esteres metlicos por esterificacion usando metanol-cido y la transterificacin utilizando metanol-hidroxido de potasio 2N para la obtencin de esteres metlicos se ven reflejados en la tabla N1 presente en la seccin tablas de este informe.

Discusin
Con respecto a los rendimientos obtenidos experimentalmente se puede notar que el rendimiento del mtodo basado en esterificacin de los cidos grasos es mejor que el rendimiento observado en la recuperacin de los cidos grasos, lo que nos lleva a decir que es recomendable usar la esterificacin de los cidos grasos para luego verificar cuantitativamente los esteres en cromatografa gaseosa, que seria un buen mtodo y de exactitud mucho mayor que la de recuperacin de cidos grasos. De los componentes qumicos que posee el aceite de oliva son en su mayora cidos grasos, como son el cido oleico (casi un 75%), siendo el siguiente el cido palmtico, cido linoleico. Como se puede observar en el primer cromatograma aparecieron 3 peak, los cuales corresponden a los tres principales cidos grasos que contiene el aceite de oliva. Luego, en el siguiente cromatograma de transterificacion, aparecieron 5 compuestos, pero solo se consideran tres de ellos que grficamente son muy parecidos al anterior cromatograma. Como no hubo patrn para definir que acido graso apareci primero, segn lo averiguado el orden sera: 1.- cido Linoleico 2.- cido Oleico 3.- cido Palmtico Este orden viene dado por el grado de saturacin y la longitud de la cadena del resto acilo lo determinan esencialmente las propiedades de la grasa: cuanto ms corta e insaturada es la cadena del resto acilo, ms fluida y voltil es la grasa. Los cidos grasos insaturados tienen uno o varios enlaces dobles en su cadena y sus molculas presentan codos, con cambios de direccin en los lugares dnde aparece un doble enlace, lo que le da el grado de instauracin.

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El cido linoleico posee una configuracin (18:29,12 [donde el 18 es el nmero de tomos de carbono, el 2 nmero de dobles enlaces y las cifras sucesivas al delta la posicin de los dobles enlaces]) es el precursor de numerosos derivados, que se forman en reacciones de elongacin, de saturacin o ambas. As, el cido oleico se designa 18:1(9); el nmero 18 nos indica el nmero de carbonos, el 1 tras los dos puntos, el nmero de dobles enlaces y el 9 entre parntesis que este doble enlace comienza en el 9 carbono (est entre el 9 y el 10), contando desde el extremo COOH, El cido palmtico es un cido graso saturado de cadena larga, formado por diecisis tomos de carbono (C16:0). Es un slido blanco que se lica a unos 63,1 C. Su frmula qumica es CH3(CH2)14COOH.

Conclusin

Columna BPX-70 longitud 25mm, dimetro interno entre 0,25mm, espesor de la fase entre 0,25 um, fase estacionaria-cianopropilsilicona. Segn los catlogos Supelco y Chormpack las columnas CP. Sil 88, BPX-70, SP-2340 (entre otras) son similares. Por otra parte entendemos que el orden de salida de los componentes en el cromatograma no debe influir en su determinacin cuantitativa, siendo lo fundamental que la separacin de los componentes sea ntida, independientemente de la marca comercial de la columna utilizada. 70% de polidimetilsiloxano, 30% ciano, esta es una columna polar equivalente a SPB2330 Los esteres metlicos salen de acuerdo al grado de saturacin y la longitud de la cadena del resto acilo determinan esencialmente las propiedades de la grasa: cuanto ms corta e insaturada es la cadena del resto acilo, ms fluida y voltil es la grasa. Los cidos grasos insaturados son esenciales para el correcto funcionamiento de nuestro cuerpo y deben ser aportados en cantidades suficientes con los alimentos. Su falta se asocia con las enfermedades coronarias y un elevado nivel de colesterol.

Recomendaciones: - Contar con un equipo preparativo de tcnicas modernas y de mayor capacidad - Aumentar la seccin y/o la longitud de la columna - Utilizar trampas de condensacin con flujo turbulento de gas portador con gradiente de temperatura o condensadores electroestticos, para aumentar la eficiencia de la recuperacin. - Optimizar, adems de presin y temperatura otras condiciones cromatografas - Trabajar siempre con las mismas condiciones cromatograficas (patrn y muestras)

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Tablas

Tabla N1: Resultados de la experiencia. Proceso Obtencin de cidos grasos Obtencin de esteres metlicos Esterificacin Masa inicial 2,510 gr. 0,756 gr. 0,756 gr. Masa recuperada 0,756 gr. 0,6986 gr. 0,6986 gr. % Recuperacin 30,13% 92,38% 87,15%

Tabla N2: cidos grasos en la muestra usando tablas Lilia masson (% esteres metlicos)

cidos Grasos C16:0 Ac. Palmtico C16:0 Ac. Esterico C16:1 Ac. Palmitoleico C18:1 Ac. Oleico C18:2 n-6 Ac. Linoleico C18:3 n-3 Ac. Linolnico

Ac. Oliva 12,8 2,1 1,7 68,7 13,9 0,8

Ac. Maravilla 6,8 4,2 ---19,7 69,3 ----

Tabla N3: Datos de la columna utilizada

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Variable Largo (L) Fase estacionaria I.D. Espesor del film Temperatura inicial Tiempo inicial Rate Temperatura final Tiempo final

Valor medido 25 m BPX-70 0.25mm 0.25 nm 150 C 2,00 min 5,0 deg/min 210 C 5,0 min

Tabla N4: Datos de inyeccin de esteres metlicos obtenidos por esterificacin Esterificacin Inyeccin Temperatura inyector B Temperatura inyector A 1 ul 220C 250C

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Figuras

Figura N1: Reaccin de saponificacin

Figura N2: Reaccin de esterificacin

CH2-COO-R CH-COO-R! CH2-COO-R Grasa + 3 CH3OH

OH

R-COO-CH 3 CH2-OH CH-OH CH2-OH glicerol

R!-COO-CH3 R-COO-CH3 mezcla de steres Metlicos

metanol

Figura N3: Reaccin de transesterificacin

Figura N4: Aceite de oliva Banquete. Muestra.

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Cromatogramas

Cromatograma N1: Esterificacin

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Cromatograma N2: Transterificacin

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Bibliografa

1.- Retamales, J. (1980) Estudio comparativo de mtodos de obtencin de cidos grasos y esteres metilicos de cidos grasos a partir de aceites vegetales 2.- Lilia Masson (1985) materias grasas de consumo habitual y potencial en chile 3.- (2007) Reglamento Sanitario de los Alimentos 4.- Pgina web, www.wikipedia.org . LA ltima vez que esta pagina web se modifico fue el 8 de junio del ao 2010

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Apndice

Clculo de recuperacin de cidos grasos.

Masa inicial de aceite oliva y maravilla (m1): 2,510 gr. Masa de cidos grasos obtenidos (m2): 0,7562 gr.

% Ra = m2 x 100 m1

% Ra = 0,7562 x 100 2,510 % Ra = 30,13%

Clculo de recuperacin de esteres metilicos.

Masa inicial de aceite oliva y maravilla (m1): 0,7562 gr. Masa de cidos grasos obtenidos: 0,6986 gr.

% Em = m2 x 100 m1

% Em = 0,6986 x 100 0,7562 % Em = 92,38%

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Clculo de rendimiento de la esterificacin con respecto al valor terico.

% Rendimiento:

m2 x 100 1,06 * m1

% Rendimiento:

0,6986 1,06 x 0,7562

x 100

% Rendimiento:

87,15 %

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Anexo Segn el RSA: Prrafo I. Disposiciones Generales Artculo 247.- Aceites y grasas son los triglicridos de cidos grasos comercialmente puros, obtenidos de materias primas sanas y limpias, libres de productos nocivos derivados de su cultivo o manejo, o de los procesos de elaboracin. Artculo 248.- El contenido de humedad y materias voltiles, no deber ser mayor a 0,2% en los aceites comestibles y no ms de 0,5% en las mantecas o grasas. No debern contener ms de 0,25% de acidez libre, expresada como cido olico y no ms de 100 ppm de jabn. A la fecha de elaboracin, el lmite mximo de perxidos ser de 2,5 meq de oxgeno perxido/kg. de grasa y 10 meq de oxgeno perxido/kg. de grasa en su perodo de vida til y almacenados de acuerdo a lo indicado en la rotulacin. No debern presentar sus caractersticas organolpticas alteradas. Se exceptan de esta disposicin, respecto a la acidez libre, el aceite de oliva y la manteca de cacao, cuya acidez mxima ser de 1,5% expresada en cido olico y la manteca de cerdo y grasa bovina cuya acidez mxima ser 0,8% expresado en cido olico. Asimismo, se excepta de esta disposicin, respecto del ndice de perxido, el aceite de oliva extra virgen, cuyo lmite mximo ser de 20 meq. de oxgeno/k de aceite. Artculo 249.- No se consideran aptos para el consumo los alimentos grasos que estn rancios, alterados qumica y/o microbiolgicamente, que contengan materias extraas, restos de tejidos vegetales o animales, restos de solventes, aceites de origen mineral y aditivos no autorizados por el presente reglamento. Artculo 250.- La distribucin y comercializacin de los aceites, mantecas y grasas comestibles, deber realizarse en sus envases originales, prohibindose su fraccionamiento en el punto de venta. Esta exigencia se har efectiva 12 meses despus de la entrada en vigencia del presente reglamento. Prrafo II. De los Aceites y Mantecas o Grasas de Origen Vegetal Artculo 251.- Aceites comestibles de origen vegetal son los obtenidos de los siguientes frutos o sus partes o de semillas oleaginosas: algodn, crtamo, girasol o maravilla, grmen de maz, man o cacahuate, oliva, pepa de uva, raps o colza, ssamo o ajonjol, soja o soya, avellana chilena, arroz, pepa de tomate, germen de trigo, linaza, mosqueta y otros autorizados por el Ministerio de Salud, los que debern ser de consistencia fluida a la temperatura de 15-C. Artculo 252.- Los aceites no debern contener un porcentaje de cido ercico mayor de 5%. Artculo 253.- Mantecas o grasas comestibles de origen vegetal, son los alimentos grasos vegetales de consistencia slida o semislida a la temperatura de 15-C, obtenidas de los siguientes frutos, sus partes o semillas: cacao, coco, coco del Paraguay, babass, palma, palmiste y otros autorizados por el Ministerio de Salud.

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Artculo 254.- Las constantes fsicas y qumicas de los aceites y mantecas de origen vegetal debern corresponder a las indicadas en la tabla I. La composicin de cidos grasos determinados por cromatografa gas - lquido, sealadas en la tabla III, se considerarn como de referencia.

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