ANTAGONISMO MICROBIANO CONTRA Phytophthora infestans (Mont) de Bary.

MICROBIAL ANTAGONISM AGAINST Phytophthora infestans (Mont) de Bary.

Hctor Lozoya-Saldaa1, Manuel H. Coyote-Palma2, Ronald Ferrera-Cerrato3 y M. Encarnacin Lara-Hernndez3
1 Fitotecnia, 2Parasitologa Agrcola. Universidad Autnoma Chapingo. 56230. Chapingo, Estado de Mxico. (lozoya@correo.chapingo.mx). 3Edafologa. Campus Montecillo. Colegio de Posgraduados. 56230. Montecillo, Estado de Mxico.

RESUMEN
Los suelos del Valle de Toluca son supresivos contra Phytophthora infestans, agente causal del tizn tardo de la papa (Solanum tuberosum L.) y del jitomate (Lycopersicon esculentum Mill.). Para explicar este fenmeno, se determin la efectividad antagnica de cepas bacterianas y de Trichoderma aisladas en el mismo Valle contra el oomiceto en follaje de papa. En hojas desprendidas todas las bacterias, individualmente y mezcladas, tuvieron efecto inhibitorio sobre la infeccin por P. infestans. En 2001, tanto en invernadero como en campo, la mezcla de las cepas de Pseudomonas (Ps) fue la ms efectiva en la supresin del patgeno. En siembra directa en campo, en 2002, la mezcla PsBurkholderia (Ps-Bu) indujo la mayor inhibicin del rea bajo la curva de progreso de la enfermedad, mientras que en maceta, tambin en campo, el mismo efecto fue ejercido por Ps-BuStreptomyces (Ps-Bu-St), asi como con la mezcla de Trichoderma. Los antagonistas ejercieron mejor su efecto en invernadero que en campo, y aunque como tratamientos nicos no lograron el mismo control que los fungicidas qumicos, es posible su uso en reas confinadas, o en regiones con menor presin de la enfermedad que el valle de Toluca, en combinacin con otras medidas de manejo de P. infestans. Palabras clave: Control biolgico, tizn tardo, papa.

ABSTRACT
The soils of the Toluca Valley are suppressive against Phytophthora infestans, the causal agent of late blight in potato (Solanum tuberosum L.) and tomato (Lycopersicon esculentum Mill.). To explain this phenomenon, the antagonistic effectiveness was determined of bacterial strains and of Trichoderma isolated in the same Valley against the oomycyte in potato foliage. In detached leaves, all of the bacteria, individually and mixed, had an inhibitory effect on the infection by P. infestans. In 2001, both in the greenhouse and in the field, the mixture of strains of Pseudomonas (Ps) was the most effective in suppressing the pathogen. In direct sowing in the field, in 2002, the mixture PsBurkholderia (Ps-Bu) induced the highest inhibition of the area under the disease progress curve, whereas in pots, also in the field, the same effect was exerted by Ps-Bu-Streptomyces (Ps-BuSt), as well as with the mixture of Trichoderma. The antagonists exerted their effect better in the greenhouse than in the field, and although as unique treatments they did not achieve the same control as the chemical fungicides, their use is possible in confined areas, or in regions with less pressure of the disease than in the Toluca Valley, in combination with other management measures of P. infestans. Key words: Biological control, late blight, potato.

INTRODUCCIN

INTRODUCTION

l tizn tardo de la papa, causado por Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, es el principal factor limitativo en la produccin de papa en reas productoras bajo condiciones de temporal (Niederhauser, 1956) o de riego por aspersin. No obstante, en el valle de Toluca se ha observado que cuando las variedades susceptibles son atacadas, la infeccin de tubrculo es limitada y no corresponde en severidad a la del follaje (Reddick, 1932; LozoyaSaldaa y Hernndez-Vilchis, 2001a), a pesar de la presencia del patgeno (Fernndez-Pava et al., 2004), lo que sugiere la posibilidad de la supresividad del suelo para dicho patgeno. Varios microorganismos

Recibido: Abril, 2005. Aprobado: Mayo, 2006. Publicado como ARTCULO en Agrociencia 40: 491-499. 2006.

otato late blight, caused by Phytophthora infestans (Mont.) de Bary, is the main limitative factor in potato production in areas under rainfall conditions (Niederhauser, 1956) or with sprinkle irrigation. However, in the Toluca Valley it has been observed that when the susceptible varieties are attacked, the infection of the tubers is limited and does not correspond in severity to that of the foliage (Reddick, 1932; Lozoya-Saldaa and Hernndez-Vilchis, 2001a) despite the presence of the pathogen (Fernndez-Pava et al., 2004), which suggests the possibility of suppressiveness of the soil for this pathogen. Various microorganisms have been identified as possible causes of the suppressive effect in vitro (personal communication4). As a follow up to these studies, the
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han sido identificados como posibles causantes del efecto supresivo in vitro (comunicacin personal4). En seguimiento de estos estudios, se plante el presente trabajo con el objetivo de cotejar dicha supresividad in vivo, en follaje de papa, bajo condiciones de cmara hmeda, invernadero y campo, y cuantificar su potencial para el control biolgico de P. infestans.

present work was carried out with the purpose of comparing this suppressiveness in vivo, in potato foliage, under conditions of moist chamber, greenhouse and the field, and to quantify its potential for the biological control of P. infestans.

MATERIALS

AND

METHODS

MATERIALES

MTODOS

Strains of P. infestans and of the antagonistic microorganisms The strains of Phytophthora infestans 98a 22/1 (A1); 98a 10/2 (A2) and 98b 1/1 (A1) used as inoculum in the laboratory and the greenhouse, were provided by the Programa Internacional Cooperativo del Tizn Tardo de la Papa (PICTIPAPA, A.C.), and were increased following Grnwald et al., 2001. The antagonistic bacterial microorganisms were provided by the rea de Microbiologa de Suelos of the Instituto de Recursos Naturales of the Colegio de Posgraduados, Montecillo, State of Mxico (Table 1). The strains of Trichoderma were obtained from the Valley of Toluca and from chinampas, isolating them from the rhizosphere, rhizoplane, caulosphere or phylosphere of the potato varieties Alpha (susceptible to P. infestans), Nortea and Rosita (resistant) in the ICAMEX/ INIFAP/PICTIPAPA Experimental Station, in Metepec (Toluca Valley) during the growing seasons of 1998 and 1999 (Alarcn, A. and Ferrera-Cerrato, R., personal communication). Activation and preservation of antagonistic microorganisms The selected bacterial strains were activated in plates of wateragar (WA) and those of the fungi in potato dextrose agar (PDA). The increases were obtained in nutritive broth of these same media, first in agitation, in 75 mL Erlenmeyer flasks placed in a horizontal incubator agitator (New Brunswick, Scientific-Edison) at 160 rpm at 28 C in darkness for 72 h. Next, 5 mL of a suspension of 109 colony formation units (CFU) were sown in a fermenter, consisting of 500 mL of liquid medium in Erlenmeyer flasks of 1000 mL connected in series with oxygenation from an aquarium pump, at room temperature and light of the laboratory. After five days, they were quantified with an average of 81.3106 CFU mL1. Evaluation of the antagonism in the laboratory with detached leaves Confrontations were made with two groups of antagonists, individual and mixed, against two types of inoculum of the pathogen, sporangia or zoospore, for a total of four assays, considering five leaflets of each leaf as experimental unit, in a completely randomized design with six replicates. Two assays were with the first six antagonists of the column to the left of Table 1 or Series A, of eight treatments (six individual confrontations, plus one of the mixture and a control without antagonists). Another two assays included 15 treatments (12 individual confrontations of the antagonists of the

Cepas de P. infestans y de los microorganismos antagnicos Las cepas de Phytophthora infestans 98a 22/1 (A1); 98a 10/2 (A2) y 98b 1/1 (A1) utilizadas como inculo en el laboratorio e invernadero, fueron proporcionadas por el Programa Internacional Cooperativo del Tizn Tardo de la Papa (PICTIPAPA, A. C.), y se incrementaron como se describe en Grnwald et al., 2001. Los microorganismos bacterianos antagnicos los proporcion el rea de Microbiologa de Suelos del Instituto de Recursos Naturales del Colegio de Posgraduados, Montecillo, Edo. de Mxico (Cuadro 1). Las cepas de Trichoderma se obtuvieron del valle de Toluca y de chinampas, aislndolas de la rizosfera, rizoplano, caulosfera o filosfera de las variedades de papa Alpha (susceptible a P. infestans), Nortea y Rosita (resistentes) en el Campo Experimental ICAMEX/INIFAP/ PICTIPAPA, en Metepec (valle de Toluca) durante los ciclos de cultivo de 1998 y 1999 (Alarcn, A. y Ferrera-Cerrato, R., comunicacin personal). Activacin y preservacin de microorganismos antagnicos Las cepas bacterianas seleccionadas se activaron en placas de agua-agar (AA) y las de los hongos en papa dextrosa agar (PDA). Los incrementos se obtuvieron en caldo nutritivo de estos mismos medios, primero en agitacin, en frascos Erlenmeyer de 75 mL colocados en un agitador incubador horizontal (New Brunswick, Scientific-Edison) a 160 rpm a 28 C en oscuridad por 72 h. Posteriormente, 5 mL de una suspensin de 109 unidades formadoras de colonias (UFC) se sembraron en un fermentador, consistente en 500 mL de medio lquido en matraces erlenmeyer de 1000 mL conectados en serie con oxigenacin de una bomba de pecera, a temperatura y luminosidad del ambiente interior del laboratorio. A los cinco das se cuantificaron en promedio 81.3106 UFC mL1. Evaluacin del antagonismo en laboratorio con hojas desprendidas Se hicieron enfrentamientos de dos grupos de antagonistas, individuales y en mezcla, contra dos tipos de inculo del patgeno, esporangio o zoospora, para un total de cuatro ensayos, considerando a cinco fololos de cada hoja como unidad experimental, en un diseo completamente al azar con seis repeticiones. Dos ensayos fueron con los primeros seis antagonistas de la columna de la
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Abato, Z. M.; Alarcn, A.; Ferrera-Cerrato, R.; Torres, L. J. M.

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Cuadro 1.Cepas de bacterias antagnicas a P. infestans seleccionadas para el presente estudio. Table 1. Strains of bacteria antagonistic to P. infestans selected for the present study. Procedencia Cepa A1 A18 A23 A38 A44 A46 P14 P15 P21 P54 P61 P98 Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas sp. sp. sp. sp. sp. sp. sp. sp. sp. sp. sp. sp. Variedad de papa Alpha Alpha Alpha Nortea Nortea Nortea Nortea Nortea Nortea Alpha Alpha Rosita Zona de aislamiento Tallo Tallo Tallo Tallo Hoja Hoja Rizoplano Rizoplano Rizoplano Tuberosfera Rizosfera Tuberosfera R5 R11 R16 R17 R19 R29 R33 R34 R35 R38 R44 R51 Cepa Pseudomonas sp Burkholderia Burkholderia Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas Steptomyces Burkholderia Streptomyces Burholderia Streptomyces Procedencia Variedad de papa Alpha Alpha Alpha Alpha Alpha Alpha Alpha Alpha Alpha Alpha Nortea Nortea Zona de aislamiento Rizoplano Rizoplano Rizoplano Rizoplano Rizoplano Rizoplano Rizoplano Rizoplano Rizoplano Rizoplano Rizoplano Rizoplano

izquierda del Cuadro 1 o Serie A, de ocho tratamientos (seis enfrentamientos individuales, ms uno de la mezcla y un testigo sin antagonistas).Otros dos ensayos incluyeron 15 tratamientos (12 enfrentamientos individuales de los antagonistas de la columna de la derecha del Cuadro 1, ms una mezcla de los seis primeros, RG1, y otra de los seis ltimos, RG2, y el testigo). Hojas de papa de la variedad Alpha, libres del patgeno, desprendidas de plantas cultivadas en invernadero, de dos meses de edad, se inocularon con aspersin al envs con 40 mL1 de 109 UFC mL1 de las cepas antagnicas. Una vez escurridas y secas, se asperjaron con 100 mL1 de una suspensin con 20103 esporangios mL1, o con zoosporas obtenidas a partir de igual cantidad de esporangios (160 000 mL1) de la mezcla de los tres aislamientos de P. infestans, como ensayo preliminar para identificar tipo de inculo del patgeno ms infectivo. Las hojas se incubaron en cajas Petri como cmara hmeda a temperatura ambiente (15-20 C) en luz difusa del interior del laboratorio, en agar-agua como cmaras hmedas. Siete das despus se evalu visualmente el porcentaje de infeccin respecto al total del rea foliar inoculada. Evaluacin de los antagonistas en condiciones de invernadero Este experimento tuvo seis tratamientos. 1) mezcla A (primeras seis cepas de la columna de la izquierda del Cuadro 1), 1010 UFC mL1; 2) mezcla P (las seis ltimas cepas de la columna de la izquierda del Cuadro 1), 1010 UFC mL1; 3) mezcla de Trichoderma, 50.3105 UFC mL1; 4) producto biolgico comercial BiopakF, 2 g L1 de agua (cuatro especies de Trichoderma, 20 de bacterias, cidos hmicos, extracto de algas y yuca); 5) mezcla de los fungicidas dimetomorf y metalaxil, 5 g L1 de cada uno; 6) testigo absoluto sin tratamiento. El diseo experimental fue completamente al azar con seis repeticiones, siendo una maceta con una planta la unidad experimental. Se hicieron cinco aspersiones al follaje, inicindose 30 das despus de la siembra (dds) con intervalos de siete d entre cada aplicacin. Conjuntamente las plantas fueron inoculadas en tres ocasiones (intervalo de 15 d, intercaladas entre las semanas 1, 3 y 5 de

column on the right of Table 1, plus a mixture of the first six, RG1, and another of the last six, RG2, and the control). Potato leaves of the Alpha variety, free of the pathogen, detached from plants grown in the greenhouse, two months of age, were inoculated at the underleaf with 40 mL1 of 109 UFC mL1 of the antagonistic strains. Once drained and dry, they were sprayed with 100 mL1 of a suspension with 20103 sporangia mL1, or with zoospores obtained from the same amount of sporangia (160 000 mL1) of the mixture of three isolates of P. infestans, as a preliminary assay to identify the most ineffective type of inoculum of pathogen. The leaves were incubated in Petri plates as moist chamber at room temperature (15-20 C) in diffused light of the interior of the laboratory, in agar-agar as moist chambers. Seven days later, a visual evaluation was made of the percentage of infection with respect to the total of the inoculated foliar area. Evaluation of the antagonists under greenhouse conditions This experiment included six treatments: 1) mixture A (first six strains of the column to the left of Table 1), 1010 UFC mL1; 2) mixture P (the last six strains of the column to the left of Table 1), 1010 UFC mL1; 3) mixture of Trichoderma, 50.3105 UFC Ml1; 4) commercial product Biopack-F, 2 g L1 of water (four species of Trichoderma, 20 of bacteria, humic acids, extracts of algae and yucca); 5) mixture of the fungicides dimetomorf and metalaxyl, 5 g L1 of each; 6) absolute control without treatment. The experimental design was completely randomized with six replicates, with one pot containing one plant as the experimental unit. Five sprayings were applied to the foliage, beginning 30 days after planting (dap) with intervals of seven d between each application. All together, the plants were inoculated on three occasions (15 day interval, interspersed among weeks 1, 3 and 5 of the spraying of the treatments) with 20103 sporangia mL1 of the mixture of the three isolates of P. infestans. Relative humidity was higher than 90% and the temperature fluctuated from 15 to 25 C in natural light cycles (12 h light/ darkness). To quantify the number of sporangia produced by P.

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la aspersin de los tratamientos) con 20103 esporangios mL1 de la mezcla de los tres aislamientos de P. infestans. La humedad relativa fue superior a 90% y la temperatura fluctu de 15 a 25 C en ciclos naturales de luz (12 h luz/oscuridad). Para contabilizar el nmero de esporangios producidos por P. infestans, seis fololos de cada tratamiento con esporulacin evidente se agitaron en 30 mL1 de agua destilada estril por dos min, luego se hizo el conteo de esporangios en un hematocitmetro (French y Hebert, 1982). La severidad de la enfermedad se calcul mediante lecturas semanales de porcentaje de infeccin en el follaje, de acuerdo con la escala de Henfling (1987). Con esta variable se estim el rea Bajo la Curva de Progreso de la Enfermedad (ABCPE), mediante la frmula: ABCPE = [(Yi+1+ Yi/2) (ti+1ti)],

infestans, six leaflets of each treatment with evident sporulation were agitated in 30 mL1 of sterile distilled water for two min, then the sporangia count was made in a hematocytometer (French and Hebert, 1982). The severity of the disease was calculated through weekly readings of percentage of the infection in the foliage, according to the Henfling scale (1987). With this variable, the Area Under the Disease Progress Curve (AUDPC) was estimated, with the formula: ABDPC = [(Yi+1+ Yi/2) (ti+1ti)], where Yi is the reading of the infection and t is the lapse in days between readings (Fry, 1977). Both sporulation and severity were statistically analyzed with the S.A.S. statistical program. Evaluation of antagonism in the field

donde Yi es la lectura de infeccin y t es el lapso en das entre las lecturas (Fry, 1977). Tanto la esporulacin como la severidad se analizaron estadsticamente con el programa estadstico S.A.S. Evaluacin del antagonismo en el campo Durante los ciclos agrcolas de 2001 y 2002 se establecieron experimentos en el campo experimental del ICAMEX/PICTIPAPA/ INIFAP en Metepec, Toluca, Estado de Mxico, bajo condiciones naturales de infeccin. En ambos ciclos se utiliz papa de la variedad Alpha y el diseo experimental fue completamente al azar con diez repeticiones por tratamiento. La unidad experimental fue de diez plantas. 2001: se establecieron los mismos seis tratamientos que se utilizaron previamente en el invernadero (mezclas A, P y TR, Biopak F, dimetomorf-metalaxil y testigo sin proteccin). La agresividad del patgeno permiti cuatro aplicaciones de los tratamientos antes de acabar con el follaje. 2002: se incluyeron siete tratamientos: mezcla RG1; mezcla RG2, ambas a 1010 UFC mL1; mezcla TR, 50.3105 UFC mL1; BiopakF, 2g L1; dimetomorf, 5g L1; metalaxil, 4 mL/L1; y el testigo absoluto. La agresividad natural del patgeno slo permiti tres aplicaciones antes de matar a la planta. La nica variable cuantificada en ambos experimentos fue la severidad de la enfermedad, mediante las lecturas semanales de dao foliar (Henfling, 1987), con la estimacin posterior del rea bajo la curva de progreso de la enfermedad (ABCPE). No se evalu esporulacin porque la infeccin mltiple natural es por dispersin de esporangios por el viento, y no permite precisar el efecto de los tratamientos sobre esta variable. Tampoco se obtuvo rendimiento de tubrculo porque el patgeno, al destruir al follaje en las etapas tempranas de desarrollo, no permiti a la planta llegar a su etapa fenolgica de tuberizacin. Antagonistas en maceta-campo, 2002. En un tercer ensayo con el mismo diseo y tratamientos que en la siembra directa en campo, tambin en 2002, pero anticipando la epidemia, se sembraron tubrculos en macetas en invernadero, donde las plantas fueron mantenidas libres del ataque de P. infestans 42 d.

During the agricultural cycles of 2001 and 2002, experiments were established in the ICAMEX/PICTIPAPA/INIFAP experimental Station in Metepec, Toluca, State of Mxico, under natural conditions of infection. In both cycles, potato of the Alpha variety was used, and the experimental design was completely randomized with ten replicates per treatment. The experimental unit was of ten plants. 2001: the same six treatments were established that were previously used in the greenhouse (mixtures A, P and TR, Biopak F, dimetomorf-metalaxyl and unprotected control). The aggressiveness of the pathogen allowed four applications of the treatments before the foliage was destroyed. 2002: seven treatments were included: mixture RG1; mixture RG2, both at 1010 UFC mL1; mixture TR, 50.3105 UFC mL1; Biopack F 2 gL1; dimetomorf, 5 g L1; metalaxil, 4 m L L1; and absolute control. The natural aggressiveness of the pathogen only allowed three applications before killing the plant. The only variable quantified in both experiments was the severity of the disease, through the weekly readings of foliar damage (Henfling, 1987), with the posterior estimation of the area under the disease progress curve (AUDPC). Sporulation was not evaluated, because the natural multiple infection is by dispersion of sporangia by the wind, and it does not allow definition of the effect of the treatments on this variable. Tuber yield was not obtained either, because the pathogen destroyed the foliage in the early stages of development and did not allow the plant to reach its phenological stage of tuberization. Antagonists in pot-field, 2002 In a third assay with the same design and treatments as in the direct planting in the field, also in 2002, but anticipating the epidemic, tubers were planted in pots in the greenhouse, where the plants were maintained free from the attack of P. infestans 42 d. During this period, they were sprayed on two occasions with the respective treatments as preventive protection. Later, they were taken to the field, without removing them from the pots, and were subjected to four more applications, given that, as in the direct planting experiment, the severity of the disease did not allow the later development of the plants. The foliar damage was quantified.

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Durante este perodo se les asperj en dos ocasiones con los tratamientos respectivos como proteccin preventiva. Posteriormente fueron llevadas al campo, sin sacarlas de las macetas, y se sometieron a cuatro aplicaciones ms, ya que, al igual que en el experimento de siembra directa, la severidad de la enfermedad no permiti el desarrollo posterior de las plantas. Se cuantific el dao foliar.

RESULTS

AND

DISCUSSION

Detached leaves There were significant differences (p0.05) among strains of Series A with respect to the percentage of the infection. The presence of the strains A38 and A23 (Pseudomonas isolated from stems of the potato varieties Alpha and Nortea, respectively) allowed infections by P. infestans lower than 50% with respect to the control, but there was no statistical difference with the treatment of the mixture (52% infection), although there was statistical difference with the rest of the treatments when inoculating with sporangia (Table 2). When the leaves were inoculated with zoospores of the pathogen, the antagonistic strain A44 (Pseudomonas sp. from leaves of the Nortea variety) exerted the highest inhibition, permitting only 21.74% infection, with statistical similarity with two strains and the mixture, but different from the control. Strain A38 was the most consistent in inhibiting the pathogen, independently of the type of inoculum, permitting only 17 and 26% infection (Table 2). The antagonistic effectiveness of the strains was greater when applied individually than in mixture. The inoculation of the blight with zoospores or with sporangia had little difference in favour of the latter with respect to infection, despite the fact that the absence of the cell wall of the zoospore makes it more fragile to the external medium (Stanghellini and Miller, 1997). Based on these results, and considering that in nature sporangia are the most common units of dispersion of Phytophthera (Ristaino and Gumpertz, 2000), the later assays in the greenhouse and in the field were only inoculated with these structures. The strains of Series R exerted a different degree of inhibition of the infection derived from the two types of inoculum. To inoculate with R16 sporangia permitted the lowest, followed by R34, R35 and R38, mixture RG1 and R29; although there were no significant differences among them, the abovementioned strains were statistically different from the control. When inoculated with zoospores, the best strains for inhibiting the pathogen were R5, mixture RG2 and the strain R11, followed by R51 and the mixture RG1 (Table 2). The mixture RG1 was the only one with an equal degree of inhibition when confronted with the two types of inoculum. Evaluation of the antagonists under greenhouse conditions The mixtures A, TR and P, and Biopak-F, were statistically equal in their effectiveness against the pathogen, although the maximum control was obtained

RESULTADOS

DISCUSIN

Hojas desprendidas Hubo diferencias significativas (p0.05) entre cepas de la serie A respecto al porcentaje de infeccin. La presencia de las cepas A38 y A23 (Pseudomonas aisladas de tallo de las variedades de papa Alpha y Nortea, respectivamente) permitieron infecciones por P. infestans inferiores a 50% respecto al testigo, pero no hubo diferencia estadstica con el tratamiento de la mezcla (52% de infeccin) aunque s con el resto de los tratamientos al inocular con esporangios (Cuadro 2). Al inocular las hojas con zoosporas del patgeno, la cepa antagnica A44 (Pseudomonas sp. proveniente de hoja de la variedad Nortea) ejerci la mayor inhibicin, permitiendo solamente 21.74% de infeccin, con similitud estadstica con dos cepas y la mezcla, pero diferente al testigo. La cepa A38 fue la mas consistente en inhibir al patgeno, independientemente del tipo de inculo, al permitir solo un 17 y un 26% de infeccin (Cuadro 2). La efectividad antagnica de las cepas fue mayor al aplicarse individualmente que en mezcla. La inoculacin del tizn con zoosporas o con esporangios tuvo poca diferencia a favor de stos ltimos en cuanto a infeccin, a pesar de que la ausencia de pared celular de la zoospora la hace mas frgil al medio externo (Stanghellini y Miller, 1997). Con base en estos resultados, y considerando que en la naturaleza los esporangios son las unidades mas comunes de dispersin de Phythophthora (Ristaino y Gumpertz, 2000), los ensayos posteriores en el invernadero y en el campo slo fueron inoculados con estas estructuras. Las cepas de la serie R ejercieron diferente grado de inhibicin de la infeccin derivada de los dos tipos de inculo. Inocular con esporangios R16 permiti la menor, seguida por R34, R35 y R38, mezcla RG1 y la R29; aunque no tuvieron diferencias significativas entre ellas, las cepas mencionadas si fueron estadsticamente diferentes al testigo. Al inocular con zoosporas, las mejores cepas para inhibir al patgeno fueron R5, mezcla RG2 y la cepa R11, seguidas por la R51 y la mezcla RG1 (Cuadro 2). La mezcla RG1 fue la nica con igual grado de inhibicin al enfrentarla a los dos tipos de inculo.

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Evaluacin de los antagonistas en condiciones de invernadero Las mezclas A, TR y P, y Biopak-F, fueron estadsticamente iguales en su efectividad contra el patgeno, aunque el mximo control se obtuvo con la mezcla de fungicidas (Cuadro 3). Los mejores tratamientos biolgicos contra esporulacin fueron la mezcla P y el producto Biopak F, ya que permitieron el menor nmero de esporangios y ninguno alcanz la esporulacin del testigo. Evaluacin de los antagonistas en campo. 2001 Los agroqumicos comerciales fueron los que mejor controlaron al patgeno bajo condiciones naturales, aunque an con ellos hubo infeccin, como se ha reportado previamente (Lozoya-Saldaa y HernndezVilchis, 2001b; Schwinn, 1983). El nico tratamiento biolgico estadsticamente diferente correspondi a la mezcla P, que en los primeros 37 dds mostr una tendencia ms estable en el control del tizn tardo en campo. Los otros tres biolgicos fueron estadsticamente iguales al del testigo sin proteccin, lo que demostr su ineficacia para controlar la enfermedad (Cuadro 3). El efecto antagnico de los microorganismos fue menor en campo que en el invernadero, pues en ste hubo inoculaciones limitadas y controladas en plantas protegidas del exterior, mientras que en el campo las infecciones son mltiples y continuas (Ristaino y Gumpertz, 2000). Adems, bajo condiciones naturales, generalmente el antagonismo se identifica ms en el suelo que en el follaje. Muchos antagonistas de este estudio fueron aislados de rizoplano. Antagonistas en campo. 2002 Siembra directa Se encontraron diferencias significativas entre tratamientos para el ABCPE (p0.05). La mezcla RG1 indujo la mayor supresin entre los biolgicos (ABCPE de 686). Los otros tres tratamientos permitieron mayor dao y no presentaron diferencias estadsticas entre ellos ubicndose en un grupo independiente (letras ab, Cuadro 4). Los fungicidas qumicos, aunque presentaron las medias ms bajas, permitieron enfermedad, lo que indica la agresividad del patgeno y la posible generacin de resistencia a los productos, mayormente al metalaxyl que es muy usado en Mxico (Sujkowski et al., 1995).

Cuadro 2. Infeccin por P. infestans en hojas desprendidas, con dos tipos de inculo, en presencia de bacterias antagonistas. Table 2. Infection by P. infestans in detached leaves, with two types of inoculum, in the presence of antagonistic bacteria. Tratamientos Cepas bacterianas Serie 2001 A1 A18 A23 A38 A44 A46 Mezcla a testigo Serie 2002 R5 R11 R16 R17 R19 R29 R33 R34 R35 R38 R44 R51 Mezcla RG1 Mezcla RG2 Testigo

Inoculacin con esporangios Severidad (%) de infeccin 69.57 a 65.22 a 43.48 ab 17.39 b 60.87 a 73.91 a 52.17 ab 100 a 73.91 86.96 26.09 65.22 47.83 43.48 60.87 34.78 34.78 39.13 56.52 52.17 43.48 60.87 100 a abc ab e abcd bcde cde abcd de de cde bcde bcde cde abcd

Inoculacin con zoosporas Severidad (%) de infeccin 69.57 73.91 43.48 26.09 21.74 60.87 43.48 100 a 30.43 34.78 52.17 60.87 47.83 60.87 56.52 60.87 52.17 52.17 73.91 43.48 43.48 30.43 100 a ab a abc bc c ab abc

c c bc abc bc abc abc abc bc bc ab bc bc c

Cifras con la misma letra no son estadsticamente diferentes (Tukey, p0.05).

with the mixture of fungicides (Table 3). The best biological treatments against sporulation were the mixture P and the product Biopak F, given that they allowed the least number of sporangia, and none achieved the sporulation of the control. Evaluation of the antagonists in the field, 2001 The commercial agrochemicals were those that best controlled the pathogen under natural conditions, although even with these there was infection, as has been previously reported (Lozoya-Saldaa and Hernndez-Vilchis, 2001b; Schwinn, 1983). The only biological treatment that was statistically different corresponded to the mixture P, which in the first 37 dap showed a more stable tendency in the control of late blight in the field. The other three biological treatments were statistically equal to the unprotected

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Cuadro 3. Progreso del tizn tardo por efecto de los tratamientos durante el ciclo agrcola 2001. Table 3. Progress of late blight from the effect of the treatments during the 2001 agricultural cycle. Invernadero Tratamientos ABCPE Mezcla A Mezcla P Mezcla TR BIOPAK F DIMET-MET Testigo

Cuadro 4. Progreso de la enfermedad por efecto de los tratamientos en el campo. Ciclo agrcola 2002. Table 4. Progress of the disease from the effect of the treatments in the field. 2002 agricultural cycle. Siembra Directa Tratamientos ABCPE Mezcla RG1 Mezcla RG2 Mezcla TR Biopak F Dimetomorf (Acrobat) Metalaxil (Ridomil Gold) Testigo absoluto 686 b 801.5 ab 803.25 ab 830.2 ab 16.10 c 20.65 c 907.2 a ABCPE 650.65 a 520.80 b 621.6 a 692.3 a 12.25 c 9.45 c 716.1 a Trasplante

Esporangios por mL1 59 37 49 37 12 76 500 500 667 000 333 500 a ab ab ab b a

Campo ABCPE 1700.3 a 1172.5 b 1570.8 a 1620.5 a 239.8 c 1698.2 a

448.58 a 313.25 c 373.33b c 366.33b c 104.42 c 770.0 a

Cifras con la misma letra no son estadsticamente diferentes, Tukey (p0.05). ABCPE = rea Bajo la Curva de Progreso de la Enfermedad. Unidades relativas al % de severidad en el tiempo.

Cifras con la misma letra no son estadsticamente diferentes, Tukey (p0.05). ABCPE = rea Bajo la Curva de Progreso de la Enfermedad.

Antagonistas en campo. 2002 En maceta La mezcla RG2 fue el tratamiento antagonista que mejor control la enfermedad, al permitir la menor expansin del rea bajo la curva de progreso de la enfermedad entre las mezclas de microorganismos, con diferencia estadstica respecto a los otros tres tratamientos biolgicos, que a su vez fueron estadsticamente iguales entre si y al testigo absoluto, aunque cabe sealar que ninguno de los anteriores super a los agroqumicos (Cuadro 4). La edad del hospedante ayud al control por los antagonistas e influy en el retraso del ataque del tizn tardo, pues las plantas llegaron sanas al campo en su fase intermedia de desarrollo, por lo que la epifita se retras. La relacin de la madurez del follaje y el ataque del tizn est ampliamente documentada (Visker, 2005). No se cuantific tuberizacin porque el confinamiento en maceta no reflejara el rendimiento de una siembra directa. Adems, con excepcin de los tratamientos con agroqumicos, la tuberizacin fue mnima por muerte prematura del follaje por el tizn en el resto de los tratamientos. La supresin de enfermedades mediante agentes de biocontrol se sustenta en las interacciones entre la planta, el patgeno, los agentes biocontroladores y el ambiente (Guetsky et al., 2002; Bao y Lazarovits, 2001). En nuestros estudios, la mayor inhibicin de P. infestans con los tratamientos biolgicos se observ en hojas desprendidas y despus en invernadero, mientras que en el campo no se tuvo el mismo efecto, que concuerda con Lindow et al. (1996), quienes indican que comnmente el control biolgico de enfermedades en el campo muchas veces es menor y mas variable que bajo

control, which demonstrates their ineffectiveness for controlling the disease (Table 3). The antagonistic effect of the microorganisms was lower in the field than in the greenhouse, given that in the latter, there were limited and controlled inoculations in plants protected from the exterior, whereas in the field, the infections are multiple and continuous (Ristaino and Gumpertz, 2000). Furthermore, under natural conditions, the antagonism is identified more in the soil than in the foliage. Many antagonists of this study were isolated from the rhizoplane. Antagonists in the field, 2002 Direct planting Significant differences were found among treatments for the AUDPC (p0.05). The mixture RG1 induced the highest suppression among the biological treatments (AUDPC of 686). The other three treatments allowed greater damage and did not present statistical differences among each other, placing themselves in an independent group (letters ab, Table 4). The chemical fungicides, although they presented the lowest means, allowed disease, which indicates the aggressiveness of the pathogen and the possible generation of resistance to the products, especially to metalaxyl, which is frequently used in Mxico (Sujkowski et al., 1995). Antagonists in the field, 2002 In pots The mixture RG2 was the antagonist treatment that best controlled the disease, as it allowed the least expansion of the area under the disease progress curve

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condiciones controladas o de confinamiento. Una explicacin para esto en nuestro caso, fue que algunos antagonistas se aislaron del suelo y se aplicaron al follaje, en un ambiente desfavorable para ellos. Trichoderma, por ejemplo, es efectivo contra patgenos del suelo (Benhamou y Chet, 1993), pero no en follaje. No obstante, los antagonistas incluidos en el presente estudio podran ser una alternativa para reducir el uso de fungicidas en invernaderos, en combinacin con otras medidas, como el uso de variedades resistentes y reduccin de humedad en el ambiente (Berger et al., 1996; Guetsky et al., 2002).

CONCLUSIONES
Se demostr la actividad antagnica de los aislamientos bacterianos y fngicos sobre el desarrollo de la enfermedad causada por Phytophthora infestans en hojas desprendidas y en plantas de papa en invernadero, aunque no se evit la epifitia en el campo. Los antagonistas incluidos en el presente estudio tienen potencial para uso en ambientes controlados, o en regiones de menor presin de la enfermedad que el valle de Toluca, en combinacin con otras prcticas de manejo, para el control del tizn tardo de la papa.

LITERATURA CITADA
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among the mixtures of microorganisms, with statistical difference with respect to the other three biological treatments, which in turn were statistically equal among each other and the absolute control, although it should be pointed out that none of the above were superior to the agrochemicals (Table 4). The age of the host helped the control because of the antagonists, and influenced in the retardation of the attack of late blight, as the plants arrived healthy to the field in their intermediate development phase, thus the epiphyte was retarded. The relationship between the maturity of the foliage and the attack of the blight has been widely documented (Visker, 2005). Tuberization was not quantified because the confinement in pots would not reflect the yield of a direct planting. Furthermore, with the exception of the treatments with agrochemicals, tuberization was minimal due to the premature death of the foliage from the blight in the rest of the treatments. The suppression of diseases by means of biocontrol agents is based on the interactions among the plant, the pathogen, the biocontrol agents and the environment (Guetsky et al., 2002; Bao and Lazarovits, 2001). In our studies, the highest inhibition of P. infestans with the biological treatments was observed in detached leaves and then in the greenhouse, whereas in the field the same effect was not present, which coincides with Lindow et al. (1996), who indicate that biological disease control in the field is often lower and more variable than under controlled or confined conditions. One explanation for this in our case, was that some antagonists were isolated from the soil and applied to the foliage, in an environment that was unfavourable to them. Trichoderma, for example, is effective against pathogens in the soil (Benhamou and Chet, 1993), but not in foliage. However, the antagonists included in the present study could be an alternative for reducing the use of fungicides in greenhouses, in combination with other measures, such as the use of resistant varieties and the reduction of moisture in the environment (Berger et al., 1996; Guetsky et al., 2002.

CONCLUSIONS
The antagonistic activity of the bacterial and fungal isolations on the development of the disease caused by Phytophthora infestans was demonstrated on detached leaves and in potato plants in the greenhouse, although epiphytia was not prevented in the field. The antagonists included in the present study have potential for use in controlled environments, or in regions of lower pressure of the disease than in the Toluca Valley in combination with other management practices, for the control of potato late blight.

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