Universidad Andrs Bello Facultad de Ciencias Biolgicas Ingeniera en Biotecnologa Laboratorio de Ing.

Gentica y Biotecnologa Acucola BIT 220 Profesores: Cristina Navarro Valenzuela, Daniela Escobar Cantero

Aislamiento de RNA y determinacin de la expresin de mRNA de IGF-I en lenguado chileno a travs de RT-PCR

Integrantes: Belen Espaa Gabriela Jimnez Danna Morales Claudio Salas Fecha prctico: Martes 1 de octubre de 2013 Martes 15 de octubre de 2013

Fecha entrega informe: Martes 22 de octubre de 2013

I.

Introduccin

En el orden de los Pleuronectiformes se encuentran presentes las familias Bothidae y Paralichtyidae, esta ltima compuesta por 17 especies distribuidas en ambas costas de amrica, del cul se han descrito ocho especies para Chile siendo las de mayor relevancia econmica: Paralichthys adspersus, tambin denominado el lenguado chileno o de tres manchas y el Paralichthys microps o lenguado de ojos chicos. El primer lenguado antes descrito, tiene gran importancia comercial debido al crecimiento que este posee ya que en un perodo de 30 meses alcanza el kilo, siendo cultivados en estanques o jaulas sin presentar dificultades en el crecimiento. 1 El crecimiento en vertebrados est regulado principalmente en la va endocrina a nivel del eje hipotlamo-hipofisiario. La hormona que ms se asocia es la hormona del crecimiento o GH.2 La principal funcin de la GH es regular el crecimiento, a travs de la hipertrofia y/o hiperplasia celular. Esta regulacin puede ejercer una accin directa sobre un tejido o indirecta mediante IGFs (Insulin-like growth factors). La GH estimula en el hgado la produccin de somatomedinas, en mayor medida la C, la cual corresponde a IGF-I que produce un aumento en la sntesis de protenas en todas las clulas corporales al tiempo que estimula la divisin celular, adems promueve la movilizacin de lpidos, absorcin de sulfato en los cartlagos y promueve la sntesis de DNA. 2 La secrecin de los IGF estimulada por GH se produce a nivel de todos los tejidos, principalmente en el hgado, aunque depende del estado de nutricin del organismo ya que en estado de desnutricin la IGF-I se mantiene baja. El estudio de la hormona del crecimiento y en particular de IGF-I sera de importancia a nivel comercial debido a que puede aumentar el crecimiento del pez a nivel muscular estableciendo a su vez posibles marcadores moleculares que ayuden en mejoras econmicas para el pas. 3 Para la deteccin de IGF-I, se utiliza una tcnica llamada RT-PCR(reverse transcription polimerase chain reaction) aislando, en primera instancia, el RNA de un tejido en particular (rin, intestino, estmago, hgado, gnada y msculo) a travs del reactivo TRIzol, para luego obtener cDNA a travs de una reaccin mediada por una retrotranscriptasa y amplificarlo por PCR. De esta manera es posible estudiar la expresin de IGF-I. 4 II. Objetivos Realizar el aislamiento de RNA y preparacin de extracto proteico de una muestra de intestino del lenguado chileno (Paralichthys adspersus) utilizando el reactivo TRIzol. Realizar un RT-PCR para determinar la expresin del mRNA de IGF-I utilizando el RNA antes extrado.

IV.

Resultados

Muestra de Rion de Lenguado (Solea solea) a) Concentracin de RNA total: 2937 ng/l. b) Integridad de RNA total Anlisis de la integridad del RNA total a partir de RNA obtenido de distintas muestras de lenguado.

Figura 1: Electroforesis en gel de agarosa 1 % de muestras de RNA de distintos tejidos, utilizando 1,00 g de RNA de muestra de rin, corriendo a 100V .durante 30 min. Carril 1) gonada; 2) rion; 3) musculo blanco; 4) corazon; 5) hgado.

c) Evaluacin de la expresin de IGF-I en distintos tejidos de lenguado Anlisis de los niveles de expresin de IGF-I a partir de muestra de RNA, utilizando partidores leIGF-IR y leIGF-IF.

Imagen 2: Expresin de IGF-I mediante RT-PCR en distintos tejidos de pez lenguado.

III. Materiales y mtodos a) Extraccin de RNA a partir de tejido de intestino de lenguado. A 0.1 gramos de tejido se agreg 1 ml de TRIZOL reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), se homogeniz a 4C y se incub por 3 minutos a temperatura ambiente. Se adicion a la muestra 200 l de cloroformo, se agit durante 15 segundos y se incub por 3 minutos a temperatura ambiente. Se centrifug la muestra a 12000 rpm, por 15 minutos a 4C. Se extrajo la fase acuosa, se agreg 0.5 ml de isopropanol, se incub durante 10 minutos a temperatura ambiente y se centrifug a 12000 rpm durante 10 minutos a 4C. Se lav el precipitado adicionando 1 ml de etanol 75% v/v y se centrifug a 7500 rpm, durante 3 minutos a 4C. Se rescat el precipitado para, finalmente, resuspenderlo en 30 l de agua libre de nucleasas. Se almacen la extraccin a -80C.

b) Preparacin de extracto proteico. A 100 mg de tejido, se agreg 1 ml de Buffer de lisis 2X, 1 ml de agua destilada y 20 l de inhibidor de proteasas. Se centrifug la muestra a 14000 rpm durante 30 minutos a 4C. Recuperar sobrenadante y almacenar a -20C. Composicin 1 ml Tampn de lisis 2X: 100 mM Tris-HCL, pH 7.4, 300 mM NaCl, 2mM EDTA, 2% Nonidet P-40. c) Preparacin de muestra de RNA para anlisis de integridad total. Preparacin de volumen de RNA. Preparacin del volumen final de RNA a utilizar para la Electroforesis en gel de acrilamida y formulacin de cDNA. 2937 ng x 1g = 2,937 g l 1000 ng l 1,287 g __ 1 l 1 g X l X = 0,34 l => 0,34 l de RNA.

Preparacin gel de agarosa 1,0% 0,40 gr. de agarosa + 40ml de Buffer MOPS 1X + 1 l de bromuro de etidio. Buffer de corrida: MOPS 1X. Composicin Buffer MOPS: MOPS 0.1 M, pH 8.0, acetato de sodio 40mM y EDTA 5mM pH 8.0. A 0.34 l de RNA, se le agreg 2 l de Buffer de carga de RNA 6X y 9.66 l de agua libre de nucleasas. Se migr el RNA en gel de agarosa 1% (utilizando Buffer MOPS 1X) a 100V durante 30 minutos, utilizando Buffer MOPS 1X como tampn de corrida.

Composicin Buffer MOPS 1X gel: 0.1M, pH 8.0, acetato de sodio 40mM y EDTA 5mM, pH 8.0. Composicin Buffer de carga de RNA: glicerol 50%, EDTA 0.5M, pH 8.0, azul de bromofenol 0.25%, xylene cyanol 0.25%. d) Preparacin muestra de RNA para RT-PCR (formacin de cDNA). Se agreg a 0.34 l de RNA (1 g de RNA total), 1l de Buffer DNAsa 1X, 1 l de DNAsa I (1U/l) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) y agua libre de nucleasas, para completar un volumen final de 10l. Se incub a temperatura ambiente por 15 min. y luego se agreg 1 l de EDTA 25mM, (pH=8,0). Para finalizar se incub a 65C por 10 min. A la muestra obtenida, se le agreg 5 l de Buffer de transcripcin reversa de primera hebra 5X, 2 l de random primers (0,3g/l), 1.25 l de dNTPs 10mM y 6.7 l de agua libre de nucleasas. Calentar muestra durante 3 minutos a 75C y luego por 3 minutos a 42C. Finalmente, a la muestra se le agreg 2.5 l de DTT 0.1M, 0.5 l de inhibidor de RNAsa RNAseOUT (40U/l) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 0.5 l de transcriptasa reversa M-MLV (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) y 0.5 l de agua libre de nucleasas. Se incub la muestra durante 1 hora a 42C. Luego se incub durante 5 minutos a 95C. Se almacen a -20C.

Composicin Buffer DNAsa 10X: Tris-HCl 200mM, pH 8.4, MgCl2 20mM, KCl 500mM. Composicin Buffer de trascripcin revesa de primera hebra 5X: 250mM Tris-HCL, pH 8.3, KCl 375mM, MgCl2 15mM. e) PCR. A 2 l de la muestra anterior, se le adicion 7.5 l de GoTaq, 2 l de partidores y 3.5 l de agua desionizada. Programa PCR: Denaturacin inicial de la doble hebra de DNA a 94C durante 10 minutos. Denaturacin a 94C por 30 segundos, apareamiento a 60C por 30 segundos y extensin a 72C durante 30 segundos por 40 ciclos.

V.

Discusin

El xito de cualquier extraccin de RNA es totalmente dependiente de la eliminacin de toda posible contaminacin de RNAsas que degradan el RNA durante y despus de la extraccin, provocando bajos rendimientos de RNA de longitud completa. Las ribonucleasas son enzimas muy resistentes, de manera que son resistentes al calor, manteniendo incluso una considerable actividad tras un ligero calentamiento, son activas dentro de un amplio rango de pH, usualmente no requieren cofactores para su actividad. El contenido de RNAsas endgenas vara con el tejido que se estudia. A diferencia del DNA, el RNA es muy inestable una vez obtenido el tejido, por la presencia de las RNasas celulares y es por ello que una pequea contaminacin de RNasas, tanto endgena (del propio tejido) como exgena (del material utilizado, soluciones, manos, polvo, etc.), puede suponer un problema que se traducir en una mala purificacin del RNA total del tejido. 6 Despus de realizar la extraccin de RNA desde distintos tejidos del lenguado chileno (Paralichthys adspersus) , en nuestro caso particular correspondi a muestra de rin, debemos proceder con controles que nos ayuden a determinar que el material gentico extrado tenga una integridad y pureza adecuada suficiente para su uso posterior, como es el anlisis de expresin de un determinado gen de inters utilizando la transcriptasa reversa para la subsecuente obtencin de cDNA, material gentico que utilizamos de templado para la reaccin de deteccin de transcrito mediante PCR. Se obtuvo un rendimiento bastante bueno en el proceso de extraccin utilizando Trizol alcanzando una concentracin de casi 3 microgramos de RNA por microlitro, sin embargo no contamos con la informacin de la pureza de nuestra muestra que obtenemos de la relacin de sus absorbancias a 260 nm para cidos nucleicos y 280 nm para aminocidos (260/280) el cual nos podra haber dado un primer parmetro, posteriormente se analiz la integridad del RNA total que se extrajo esto utilizando partidores para RNA ribosomal en sus respectivas subunidades 28s y 18s, en la figura 1 observamos en el carril nmero 2, que corresponde a nuestra muestra, donde se ve un pequeo amplificado para el 18s y 28s demostrando q la muestra si tiene RNA pero que se ha degradado en gran medida debido al pobre patrn y mayoritario derrame de la muestra en el carril, esta razn explica tambin por qu no vemos amplificado en PCR para IGF 1 en la muestra de rin, ya que no se logr sintetizar cDNA a partir de una muestra con RNA degradado, esto nos indica que es de vital importancia un manejo ptimo de las muestras, tratndolas con inhibidores RNAsas y sumo cuidado en pasos crticos como la separacin de la fase soluble en el paso de extraccin, y tener precauciones especiales para trabajar con este tipo de tejido, el que junto con el pncreas y macrfagos, son conocidos por su alto contenido de RNasas. Por ello resulta crtica la congelacin del tejido o su rpida homogeneizacin en la solucin desnaturalizante. Una fuente potencialmente grande de contaminacin con RNasas son las manos por las clulas epidrmicas que se liberan continuamente. Es por ello obligado el uso de guantes tanto al realizar la extraccin como al preparar las soluciones. De fundamental importancia para una extraccin de RNA intacto con xito es la ejecucin de todas las fases tan rpidamente como sea posible, ya que esto

elimina riesgos de contaminacin. El problema principal de realizar la extraccin es que el RNA es un material gentico extremadamente sensible pues se desnaturaliza rpidamente, por lo que el trabajo en el laboratorio se tiene que realizar con extrema precaucin sobre todo en el uso de guantes para evitar el contacto de la muestra con las RNAsas procedentes de las manos de quien lo manipule, tambin para trabajar con tejidos como este, es normal que se realicen dos pasos de purificacin y no una como se hizo en este prctico.5 De haber obtenido un buen cDNA esperbamos ver el amplificado correspondiente al gen IGF I ya que al ser un individuo joven debe tener una presencia detectable de dicho transcrito, esta tcnica nos permite detectar la presencia de trascrito pero para un anlisis ms acabado necesitamos complementar con tcnicas que detecten la protena, como un western blot, ya que no siempre los mRNA son traducidos a protenas.

VI.

Conclusin

Se logr aislar RNA total a partir de muestra de rin que no resulto de buena integridad. Se logr detectar la expresin del receptor de la hormina de crecimiento (no nuestro grupo) mediante la tcnica de RT-PCR La importancia de los controles para obtener material genmico de buena calidad. La importancia de mantener la limpieza durante todo el proceso y mantener las ptimas condiciones de trabajo para obtener resultados confiables.

VII.
1

Bibliografa

Alfonso Silva & Marcia Oliva (2010) Revisin sobre aspectos biolgicos y de cultivo del lenguado chileno (Paralichthys adspersus), Latin american journal of aquatic research. ISSN 0718-560X
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