universidad nacional de colombia

Sede Medell n

Manual de Laboratorio de

MICROBIOLOG IA GENERAL

Autores: Olga In es Montoya Campuzano Diana Maria Echeverry Arango

18 de septiembre de 2012

Cap tulo 1

MACROSCOPICA OBSERVACION Y MICROSCOPICA BACTERIANA

1.1. Objetivos

Aprender a identicar las diferentes caracter sticas macroscopicas de la colonia, aisladas durante la pr actica de ubicuidad. Reconocer la morfolog a celular bacteriana, sus diferentes agrupaciones y formas entre otros aspectos morfol ogicos de las bacterias. Diferenciar una preparaci on en fresco de una coloreada

1.2.

Introducci on

Una colonia es una agrupaci on de bacterias formada a partir de uno o de varios microorganismos sobre un medio de cultivo s olido, aunque, var a de tama no desde menos de un mm hasta 5 mm, y se pueden observar a simple vista. Para un estudio detallado de ellas se hace necesario tener en cuenta su medida, su forma, su textura y en algunos casos un color caracter stico; aunque, estas caracter sticas pueden variar de acuerdo al medio de cultivo en que se encuentren, siendo constante bajo condiciones controladas y depende de la especie bacteriana que la forme. En el caso del estudio morfol ogico de las bacterias, creciendo bajo condiciones normales se ha observado que se desarrollan con formas denidas como: esf ericas, ovaladas, en bast on o en espiral, las cuales son proporcionadas por la rigidez de la pared celular. De acuerdo a lo anterior, es importante realizar una correcta observaci on de estas caracter sticas, que se convierten en uno de los principales marcadores para la identicaci on inicial de los g eneros bacterianos. Teniendo en cuenta resaltar, que cada g enero posee unas caracter sticas particulares que permiten diferenciarlo de otros y que la caracterizaci on de un aislamiento debe incluir, otro tipo de marcadores como: los bioqu micos, los serol ogicos y los moleculares; para poder concluir al respecto del g enero y de la especie a estudiar. Del mismo modo, los rasgos de las colonias y la disposici on o agrupaci on bacteriana, son criterios taxon omicos que deben ser descritos correctamente para los aislamientos no identicados, como parte de la identicaci on primaria.

1.3.

Observaci on macrosc opica de la colonia bacteriana

Las caracter sticas macrosc opicas de las colonias, est an sujetas al medio de cultivo donde se inocula la muestra bacteriana. Debido, a que cada especie suele originar colonias de un tipo determinado, como son; el borde y la elevaci on de la misma. Adicionalmente, es importante apreciar la consistencia y la textura de la masa celular, pues tambi en son caracter sticas distintivas. Donde la consistencia va desde la colonia seca, que tocada con una asa se desplaza en la supercie del medio, hasta las colonias viscosas que se pegan al asa y se separan de la colonia formando un hilo(generalmente son bacterias con c apsulas gruesas). As , como tambi en la pigmentaci on de la colonia, la forma, el borde, la elevaci on y el aspecto de la supercie. Figura 1.1:

1.3.1.

Caracterizaci on del crecimiento en placas de Agar Nutritivo.

El an alisis de la morfolog a de las colonias aisladas, es necesario para la identicaci on de las especies encontradas en los diferentes ambientes. Y su descripci on se realiza sobre las colonias formadas (agrupamiento bacteriano originado por el crecimiento y es observable macrosc opicamente). Evalu andose de la siguiente manera. Figura 1.1: 1

Figura 1.1: Caracteristicas macrosco picas observadas en colonias bacterianas

1 Rojas Trivi no, A. 2003. Gu a pr actica de morfolog a y tinciones simples. Universidad de Pamplona, facultad de Ciencias Naturales y Tecnol ogicas. Pamplona. 5 p.

Forma: Puntiforme, circular, lamentosa, irregular, rizoide y lanceolada. Tama no: Grande (di ametro mayor a 1mm), mediano (di ametro aproximado a 1mm), peque no (di ametro inferior a 1mm), son denominadas colonias con punta de aller, o puntiformes. Cromog enesis o Pigmentaci on:una de las caracter sticas m as notables de los cultivos microbianos es la producci on de pigmento, el cual puede ser retenido dentro de las c elulas de manera que la masa celular se colorea, mientras que en otras especies, el pigmento es excretado colore andose el medio de cultivo. Elevaci on: la colonia pueden ser muy na, plana o aplastada (sin elevaci on),o gruesas (elevada),(convexa baja, convexa cupuliforme, mamelonada, pulvinada y umbilicada). Supercie:lisa, rugosa mate, brillante. Borde:De borde regular (continuo),de borde irregular (ondulado, lobulado, espinoso,dentado,lacerado,ondulado y lamentoso). Consistencia:Cremosa, viscosa, granulada. Pigmento: De diferente color. Pueden ser pigmentos solubles en agua y que decoloran el medio;piocianina (azul verdosa y factor de virulencia en P. aeruginosa), pigmentos uorescentes y pigmentos no difundibles connados a las colonias. A la luz transmitida:(observar a traves de la colonia) Opaca: no permite el paso de luz Trasl ucida: Deja pasar la luz sin permitir la completa visibilidad de los objetos observados a trav es de la colonia. Transparente: Deja pasar la luz permitiendo ver claramentelos objetos observados a trav es de la colonia. A la luz reejada:(observar la supercie de la colonia) Opaca Brillante La morfolog a de las colonias; son par ametros importantes en el proceso de identicaci on bacteriana, siendo estas caracter sticas, comunes entre cada g enero bacteriano. Sin embargo, la morfolog a puede alterarse por el tiempo de incubaci on, composici on del medio de cultivo (excesiva desecaci on o humedad), etc. Esta descripci on es tambi en aplicable a las levaduras, debido a que estas presentan crecimientos t picos bacterianos.

Investigue

1. Por qu e se incuban las cajas con las tapas hacia abajo? 2. Que es una colonia y Morfolog a colonial? 3. Que es el componente agar y de donde se obtiene? Cu ales son los nutrientes que toman los microorganismos del medio de cultivo? 4. Cita tres enfermedades contagiosas: medio de contagio, agente causal, da no producido en el ser humano. 5. Cita cuatro bacterias simbiontes con el ser humano y su funci on 6. Conclusiones 7. Bibliograa

1.4.

Observaci on microsc opica de las c elulas bacterianas.

Se pueden observar las caracter sticas microsc opicas bacterianas, a partir de preparados en fresco y/o coloreado. En el caso de las preparaciones en fresco, se puede observar la viabilidad, a trav es de su movilidad y su forma, ya sea; bacilar, redonda o en espiroqueta. Debido a que su protoplasma posee un ndice de refracci on cercano al del agua, son muy dif ciles de visualizar y de estudiar en su estado natural. Por lo que se requiere, cambiarles el ndice de refracci on, este se logra usando colorantes: b asicos, acidos o neutros. De acuerdo al tipo de colorante que se use, Se habla de coloraciones simples; que puede ser directa cuando se ti ne la estructura microbiana mientras el medio permanece sin colorear y simple indirecta en la cual se ti ne el entorno que rodea la estructura microbiana, mientras esta permanece sin te nir. Que se caracteriza por presentar un grupo crom oforo, que tiene como funci on te nir la estructura y un grupo auxocromo; el cual participa de la reacci on, para que se d e la coloraci on. Estos son compuestos org anicos que presentan anidad por determinadas estructuras. La cual est a basada en la carga positiva y/o negativa presente en el cromoforo. Con base a su carga, ellos se clasican en cati onicos (b asicos), ani onicos ( acidos) y neutros. Los colorantes b asicos son cati onicos, es decir, que est an cargados positivamente; lo que permite una fuerte anidad con componentes celulares cargados negativamente como los acidos nucleicos y polisac aridos acidos. Es aconsejable, utilizar este tipo de colorante para observar las estructuras celulares, Dado que en la pared celular de las bacterias existen compuestos con cargas negativas que, atraen y ligan el crom ogeno. El azul de metileno es uno de los m as utilizados, actuando sobre todas las c elulas bacterianas r apidamente y sin producir un color intenso que oscurezca los detalles de las c elulas; tambi en pueden ser utilizadas la safranina y el cristal violeta. Cuando se utiliza el m etodo de las coloraciones con base a colorantes b asicos, se requiere previamente que la muestra bacteriana, sea sometida al proceso de jaci on; en el cu al hay muerte celular debido a la coagulaci on del protoplasma, pero, se conserva su morfolog a celular. Previo a la jaci on se realiza un extendido o frotis. 2 Los colorantes acidos (ani onicos), est an cargados negativamente, por lo que va hacer repelido, por los componentes org anicos de las estructuras celulares; en su efecto, no penetran la c elula, sino; que ti ne el medio donde esta se encuentra. Este tipo de colorante se emplea para observar la forma celular. A este grupo pertenece la Nigrosina, (Tinta China) o el Eosinato Azul de Metileno. Los colorantes Neutros son sales en las que tanto el acido como la base tienen la capacidad de colorear, como el Rosa de Bengala que ti ne el n ucleo de un color y el citoplasma de otro.

1.4.1.

Caracteristicas microscopicas de las c elulas bacterianas

Seg un su forma, las c elulas bacterianas dependen de la pared celular, que las provee de; rigidez y algo de elasticidad. indivudualmente las bacterias pueden aparecer como elementos elipsoidales, esf ericos, alargados (cil ndricos), o en espiral (helicoidales). cada una de est as formas es propia de una especie determinada, por eso las bacterias se clasican en: cocos, bacilos y espirales. Seg un su ordenamiento, las bacterias tienen un mecanismos, donde ellas pueden adoptar ciertas formas cuando est an en grupos. su ordenamiento puede obedecer a un factor gen etico, como sucede con las c elulas esf ericas o cocos, o bi en a un patr on caprichoso o al azar, como ocurre con las c elulas rectas, cilindricas o alargadas: los bacilos.

Cocos: son c elulas bacterianas, cuya forma habitual es esf erica, pero, ocasionalmente, aparecen formas elipsoidales o las que poseen un extremo alado con apariencia de lanza (lanceoladas), tambi en se
2 Un frotis es una delgada capa de muestra bacteriana homogeneizada con agua, que cubre un area de un portaobjetos, este debe ser secado al aire y jado por calor o qu micamente con alcohol. Es muy importante no excederse en esta etapa para que las bacterias no se deformen o se lisen y adem as, al no jarse estas muestras son lavadas en el proceso de tinci on.

encuentran algunas con formas ligeramente ovoides, con uno de sus lados c oncavos, que las asemeja a un ri n on o a un grano de caf e. Cuando se observan en forma individual. (Ver gura 1.2:)

Figura 1.2: Cocos dispuestos en f orma individual Cuando aparecen en agrupaciones se organizan en formas diferentes seg un la especie. Este tipo de ordenamiento obedece a un patr on gen etico, propio de cada especie. Seg un este patr on de ordenamiento, los cocos se clasican as :

Diplococos: se observan los cocos en pares con un solo plano de divisi on. Ejemplo: Diplococcus pneumoniae y Neisseria gonorrhoeae. (Ver gura 1.3:)

Figura 1.3: a. Esquema de la observacio n microsco pica de diplococos Gram positivos (Ejemplo : diplococcus pneumoniae), b. Observacio n microsco pica de diplococos Gram negativos (Ejemplo : N eisseria), c. Diplococos, divisio n por un plano f ormando pareja de cocos Estreptococos: agrupaci on bacteriana en la que se observa una c elula detr as de la otra, formando las o cadenas semejantes a un rosario, presentando un solo plano de divisi on. Ejemplo: Streptococcus lactis, Streptococcus pyogenes y Streptococcus mutans. (Figura 1.4:)

Figura 1.4: a. Observacio n microsco pica, b. Estreptococos, divisio n sucesiva por un plano paralelo, f ormando cadenas de cocos 5

 T etradas: llamados tambi en tetracocos, se observan en grupos conformados, cada uno, por cuatro unidades celulares y presentan dos planos de divisi on perpendicular. Ejemplo: Micrococcus tetragenus (ver gura 1.5:)

Figura 1.5: a. Observacio n microsco pica, b. Divisio n por planos perpendiculares f ormando grupos de cuatro cocos Estalococos: se presentan agrupaciones bacterianas, en formas irregulares que recuerdan a los racimos de uvas y poseen los tres planos del espacio. Ejemplo: Staphylococcus aureus, Staphylococcus saccharolyticus y Staphylococcus epidermidis. (ver gura 1.6:)

Figura 1.6: a. Observacio n microsco pica, b. Divisio n en los tres planos del espacio, f ormando grupos irregulares de cocos, semejan racimos comparables con los de uvas Sarcinas: esta agrupaci on bacteriana, se ordena en forma bastante regular, donde aparecen ocho o m as unidades celulares, organizadas en forma de cubos. Los cocos con esta forma de agrupaci on, muestran divisiones sucesivas en los tres planos del espacio en forma perpendicular. Ejemplo: Sarcina ventriculi (ver gura 1.7:)

Figura 1.7: a. Observacio n microsco pica, b. Divisio n en los tres planos del espacio, f ormando agrupaciones regulares de ocho cocos, en f orma de cubos

Raramente todas las c elulas bacterianas, de una especie dada, est an ordenadas exactamente seg un el mismo patr on. El ordenamiento predominante es la caracter stica m as importante.

Bacilos: son formas bacterianas alargadas que pueden ser cortas, rectas o cilindricas; algunas veces pueden ser tan cortas y diciles de identicar, que suelen denominarse cocobacilos. si se observa detenidamente, se observa que los extremos de los bacilos pueden variar y esta caracter stica contribuye a su identicaci on. Existen bacilos cuyos extremos aparecen en forma de angulo recto, alados, redondeados y en algunas especies toman forma de mazo, semejantes al palo de bastos de la baraja espa nola. (Ver gura 1.8:)

Figura 1.8: Extremos de algunos bacilos La agrupaci on de los bacilos, casi nunca se agrupan; siendo muy diferente en este sentido a la de los cocos. Algunas especies, sin embargo, muestran tendencia a un ordenamiento de sus c elulas, que no obedece a un patr on gen etico, sino que depende de las etapas de desarrollo o de las condiciones del cultivo. Por eso algunos autores hablan de un ordenamiento o agrupaci on al azar. (Ve ase gura 1.9:)

Figura 1.9: Ordenamiento o agrupacio n al azar de los bacilos En algunas observaciones microsc opicas, pueden aparecer conformando parejas (algunos autores lo referencian como diplobacilos), en cadenas (tambi en son referenciados por algunos autores como estreptobacilos) o en grupos irregulares que forman verdaderas empalizadas, ovillos o rosetas y masas entrecruzadas de c elulas bacilares. (Ve ase gura 1.10:)

Figura 1.10: Observacio n microsco pica con aumento de 100 X Ordenamiento de los bacilos : a. en empalizada, b. en roseta, c. en cadenas. 7

Los taxonomistas han utilizado las formas individuales y algunas agrupaciones para darles un nombre determinado, por ejemplo: algunos bacilos cuyos extremos terminan en mazo, se les llama corineformes; porque as se presentan ciertos bacilos pertenecientes al g enero Corynebacterium.

1.5.

Materiales

Portaobjetos cubreobjeto Cultivos bacterianos que fueron aislados en la pr actica de ubicuidad. Mechero Frasco lavador Puente de coloraci on Bandeja Aceite de inmersi on Colorantes: Azul de metileno y nigrosina Pa nuelos desechables. Gasa. Microscopio.

Observaci on al microscopio de bacterias vivas y/o muertas, se utilizan dos m etodos: Montaje en h umedo y T ecnicas de tinci on, con colorante b asico y acido

1.5.1.

Montaje en h umedo:

Este m etodo se utiliza para las observaciones de la forma, la agrupaci on y movilidad de las bacterias vivas: cocos, bacilos, entre otros. Este montaje se puede hacer tomando la muestra de un medio de cultivo solido o de un medio liquido.

Procedimiento

Limpiar el portaobjetos con alcohol. Quitar el exceso de alcohol en el portaobjetos, con una toalla de papel y amear. Esterilizar el asa pas andola por la llama hasta ponerse al rojo vivo, antes y despu es del frotis. Dejar enfriar el asa, siempre cerca al mechero. Muestra en medio l quido Tomar con el asa est eril una gota del cultivo (in oculo). Depositar en el centro del portaobjetos limpio. Realizar un extendido homog eneo formando una espiral (frotis) Colocar lentamente un cubreobjeto, sobre la preparaci on sin que se forme burbuja. Observar al microscopio con objetivo de 40X 100X.

Muestra en medio s olido Depositar en un portaobjetos limpio una gota de soluci on salina o de agua destilada. Tomar con el asa est eril una colonia del cultivo.

Hacer una emulsi on con la gota. Realizar un frotis Cubrir la preparaci on con el cubreobjeto. Observar al microscopio con los objetivos de 40X 100X.

1.5.2.

T ecnica de tinci on con colorante b asico y acido

Las bacterias sin colorear tienen el mismo ndice de refracci on de la luz, por lo tanto, se observan transparentes al microscopio. Sin embargo, las preparaciones coloreadas permiten ver claramente sus formas, estructuras internas y externas y el tipo de agrupaci on. Los pasos a seguir en una preparaci on coloreada. (Ver gura 1.11:)

Figura 1.11: P asos para realizar una tincio n ba sica

Procedimiento

Tomar el portaobjetos limpio Esterilizar el asa Enfriar el asa en los extremos de la caja de petri. Proceder de acuerdo con el tipo de cultivo l quido o s olido Dejar secar la muestra si es posible cerca de una bombilla o a la llama del mechero (5 minutos) Tomar el portaobjetos con la muestra y pasarlo varias veces por la llama controlando la temperatura con el dorso de la mano, para evitar el sobre calentamiento y as jar la muestra sin desnaturalizarla.

Tinci on con colorante b asico

Cubrir completamente el extendido con un colorante b asico, durante un minuto Lavar con agua para eliminar el exceso de colorante. Dejar secar al aire. Observar al microscopio con los objetivos de 40X 100X.

Tinci on con colorante acido

Realizar un frotis. Colocar una gota del colorante acido sobre la emulsi on. Extender la emulsi on con un portaobjeto limpio, hasta obtener una pel cula na. ( Ver gura 1.12:)3 Dejar secar al ambiente. Observar al microscopio con los objetivos de 40X y 100X. .png Figura 1.12: P asos para realizar una tincio n ba sica Investigue 1. porque raz on el colorante acido ti ne la bacteria y el colorante b asico no. De ejemplos de otros colorantes que podr an utilizarse 2. Porque se debe utilizar el aceite de inmersi on, al observar al microsc opico una muestra bacteriana 3. Qu e es una tinci on simple y cuales son las ventajas y desventajas de la misma 4. Establecer diferencias entre una coloraci on b asica y una acida 5. Diferenciar al microscopio los dos tipos de observaci ones bacterianas 6. Conclusiones 7. Bibliograa
3 Nota: la muestra no se ja con la llama, ni se lava el exceso del colorante. Al observar, se debe bajar el condensador para reducir la intensidad de la luz.

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