Qumica de Protenas

Laboratorio de Qumica Orgnica II

David Espinoza Pizarro

2013

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I. INTRODUCCIN TERICA: Las protenas son las macromolculas ms verstiles de cuantas existen en la materia viva: desempean un elevado nmero de funciones biolgicas diferentes. Cada protena est especializada en llevar a cabo una determinada funcin. Entre las funciones de las protenas cabe destacar las siguientes: catalticas, estructurales, de transporte, nutrientes y de reserva, contrctiles o mtiles, de defensa, reguladoras del metabolismo, y otras muchas que determinadas protenas desempean en organismos concretos. Las protenas son biomolculas de elevado peso molecular (macromolculas) y presentan una estructura qumica compleja. Sin embargo, cuando se someten a hidrlisis cida, se descomponen en una serie de compuestos orgnicos sencillos de bajo peso molecular: los -aminocidos. Existen 20 -aminocidos diferentes que forman parte de las protenas. En las molculas proteicas los sucesivos restos aminocidos se hallan unidos covalentemente entre s formando largos polmeros no ramificados. El tipo de enlace que los une recibe el nombre de enlace peptdico. Las cadenas de aminocidos de las protenas no son polmeros al azar, de longitud indefinida, cada una de ellas posee una determinada composicin qumica, un peso molecular y una secuencia ordenada de aminocidos. La conformacin tridimensional de una protena es un hecho biolgico de una gran complejidad: existen distintos niveles de plegamiento que se superponen unos a otros. Debido a ello, para sistematizar el conocimiento acerca de este fenmeno, se establecen una serie de niveles dentro de la estructura de la protena que se conocen como estructuras primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria. Se entiende por desnaturalizacin de una protena la prdida de la conformacin tridimensional nativa de la misma. La desnaturalizacin puede ser provocada por diferentes causas o agentes desnaturalizantes de tipo fsico o qumico. En nuestra prctica realizaremos ensayo de identificacin de protenas, formas de desnaturalizar las protenas y ensayos para identificar el funcionamiento de las protenas. A continuacin se muestra un esquema de lo desarrollado en la prctica con las imgenes obtenida de las mismas.

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II.

ESQUEMA DEL LABORATORIO a. Reaccin de Biuret y

Preparacin de la muestra

Albmina

Gelatina

Preparamos dos tubos de ensayo, uno con 2mL de solucin de albmina y otro con 2 mL de solucin de gelatina.

Imagen 1 **

Reaccin Biuret Agregar a cada tubo de ensayo, 4 mL de solucin de Biuret.

Reaccin Xantoproteica Agregar a cada tubo de ensayo, 2 mL de HNO3 concentrado.

Albmina

Gelatina

Albmina

Gelatina

Imagen 2**

Imagen 3**

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b. Desnaturalizacin de protenas
Preparacin de la muestra Albmina Preparamos dos tubos de ensayo, uno con 2mL de solucin de albmina y otro con 2 mL de solucin de gelatina. Gelatina

Imagen 4** Prueba de desnaturalizacin

A cada tubo de ensayo conteniendo albmina y gelatina, agregarle las siguientes soluciones:

Albmina

Gelatina

Albmina

Gelatina

Albmina

Gelatina

Resultado con 6 gotas de Etanol. Imagen 5**

Resultado con 6 gotas de HCl concentrado.

Resultado al calentar con agua hirviendo.

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c. Condiciones para el funcionamiento de las protenas:

(Efecto del pH Hidrlisis enzimtica de almidn)

Preparacin de la solucin a ensayar Preparacin de la solucin de enzima

Preparar 3 tubos con 1 mL de buffer pH 4, 7 y 10. Agregar a cada tubo 1 mL de solucin de almidn al 3%.

Preparar 3 tubos con 1 mL de buffer pH 4, 7 y 10. Agregar a cada tubo 1 mL de solucin de almidn al 3%.

Imagen 6**

Prueba de lugol

Mezclar los tubos y colocar inmediatamente 3 gotas de cada tubo a una placa de toque, luego de 10 min. Agregar una gota de Lugol.

Imagen 7** Buffer 4 Buffer 7 Buffer 10

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d. Condiciones para el funcionamiento de las protenas:

(Efecto de metales pesados Descomposicin de H2O2 con catalasa)

Preparacin de las muestras: Preparar 4 placas petri, cada una conteniendo:

PLACA A: 30 mL H2O + 1 trozo papa

PLACA B: 30 mL H2O2 al 30%

PLACA C: 30 mL HgCl2 + 1 trozo papa

PLACA D: 30 mL H2O2 al 30%

Imagen 8** Ensayo Dejar los trozos de papa remojndose por 10 min. Usando una pinza, transferir el trozo de papa de la placa A hacia la B, y el trozo de papa de la placa C haacia la placa D.

Imagen 9** Placa A + B

Placa C + D

** Imgenes obtenidas del laboratorio de qumica Universidad Peruana Cayetano Heredia.

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III. RESULTADOS Y CUESTIONARIO: 1. EXPERIMENTO N 1: Reconocimiento de protenas. Tabla 1 Ensayo Protena: Albmina de huevo Coloracin violeta Cambio de estado, precipitado blanco amarillento Protena: Gelatina Coloracin violeta azulado. Coloracin levemente amarilla

Reaccin de Biuret

Reaccin Xantoproteica

2. EXPERIMENTO N 2: Desnaturalizacin de protenas. Tabla 2 Agente Solvente orgnico: etanol HCl Calor Protena: Albmina de huevo Leve turbidez Desnaturalizado Desnaturalizado Protena: Gelatina Leve turbidez Leve turbidez Leve turbidez

3. EXPERIMENTO N 3: Condiciones para el funcionamiento de las protenas. Efecto del pH. Hidrlisis enzimtica de almidn. Tabla 3 Intervalos de Tiempo Efecto del pH 0 minutos pH: 4 pH: 7 pH: 10 N.D. N.D. N.D. 10 minutos azul Rojizo Azul

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4. EXPERIMENTO N 4: Condiciones para el funcionamiento de las protenas. Efecto de metales pesados. Descomposicin de perxido de hidrogeno con catalasa. Tabla 4 Efecto del pH Placa A Placa C Placa B Presenta burbujeo constante --Placa D --No presenta burbujeo

5. Determinar cul es el efecto sobre las estructuras superiores de las protenas, de: Solventes orgnicos: La adicin de un solvente orgnico, a una solucin de protena en agua, disminuye la constante dielctrica del disolvente, desplaza tambin algunas de las molculas de agua asociadas con la protena, y reduce la concentracin del agua presente en la solucin. Los disolventes orgnicos interaccionan con el interior hidrofbico de las protenas y desorganizan la estructura terciaria, provocando su desnaturalizacin y precipitacin. cidos: Los iones H+ afectan a la envoltura acuosa de las protenas tambin afectan a la carga elctrica de los grupos cidos y bsicos de las cadenas laterales de los aminocidos. Esta alteracin de la carga superficial de las protenas elimina las interacciones electrostticas que estabilizan la estructura terciaria y a menudo provoca su precipitacin. La solubilidad de una protena es mnima en su punto isoelctrico, ya que su carga neta es cero y desaparece cualquier fuerza de repulsin electrosttica que pudiera dificultar la formacin de agregados. Calor: Causa un incremento en la energa de vibracin y rotacin que puede rebasar el delicado equilibrio de interacciones dbiles que estabilizan la conformacin plegada funcional.

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6. Analizar comparativamente, los resultados obtenidos para las pruebas realizadas sobre la albmina y la gelatina. A qu se deben las diferencias, si las hubieran, en dichos resultados? Protena: Albmina de huevo Coloracin violeta, evidenciando una reaccin positiva. Cambio de estado, precipitado blanco amarillento. Da positivo a la prueba por tener aminocidos portadores de grupos benceno. Protena: Gelatina Coloracin violeta-azulado. La gelatina tambin da positivo a la prueba Coloracin levemente amarilla. Da positivo a la prueba por tener aminocidos portadores de grupos benceno.

Ensayo

Reaccin de Biuret

Reaccin Xantoproteica

Agente Solvente orgnico: etanol

Protena: Albmina de huevo Leve turbidez Desnaturalizado. Con la adicin del cido se llega al punto isoelctrico y precipita la protena. Desnaturalizado. Desenvolvimiento de su forma esfrica.

Protena: Gelatina Leve turbidez Leve turbidez. Se llega a dar a cabo una hidrlisis parcial Leve turbidez.

HCl

Calor

Intervalos de Tiempo Efecto del pH 0 minutos 10 minutos

pH: 4

N.D.

Azul, la actividad de la enzima es reducida por estar prximo al pH de desactivacin 3.3 upH

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Rojizo, prueba de Lugol negativa. Accin comprobada de la enzima. Azul-rojizo. la actividad de la enzima es reducida por estar prximo al pH de desactivacin 9.5 upH

pH: 7

N.D.

pH: 10

N.D.

7. En qu condiciones uno o varios de los agentes desnaturalizantes ensayados pueden provocar desnaturalizacin reversible? Explicar. Si se lleva a cabo en condiciones suaves (variaciones moderadas y graduales de temperatura o pH), es reversible: la protena puede recuperar su conformacin tridimensional nativa si se restituyen las condiciones iniciales. Este proceso recibe el nombre de renaturalizacin. 8. Averiguar otros procedimientos adicionales a los realizados en la prctica, para desnaturalizar protenas. Agentes Fsicos: Radiacines ultravioletas, radiaciones ionizantes, presin, friccin, ondas de radio frecuencia. Agentes Qumicos: Un aumento de la fuerza inica del medio (por adicin de sulfato amnico, urea o hidrocloruro de guanidinio, por ejemplo) tambin provoca una disminucin en el grado de hidratacin de los grupos inicos superficiales de la protena, ya que estos solutos (1) compiten por el agua y (2) rompen los puentes de hidrgeno o las interacciones electrostticas, de forma que las molculas proteicas se agregan y precipitan 9. Cul es el efecto del pH sobre el funcionamiento de las enzimas Qu condiciones de pH son ptimas para el funcionamiento de las enzimas?. Explicar. Sabiendo que las enzimas son protenas, cualquier cambio brusco de pH puede alterar el carcter inico de los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica, afectando as las propiedades catalticas de una enzima. A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalizacin de la enzima y en consecuencia su inactivacin. La fosfatasa cida es ms activa a pH 5,0, mientras que la fosfatasa alcalina lo es a pH 9,0. Muchas enzimas tienen mxima actividad cerca de la neutralidad en un rango de pH de 6 a 8. El pH per se no afecta la actividad enzimtica, sino la concentracin de protones. Los protones adems de alterar la estructura de la enzima y el substrato, pueden
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participar tambin en la reaccin como substrato o producto. En esos casos, la concentracin de protones afecta directamente la velocidad de la reaccin. ENZIMA Pepsina Tripsina Catalasa Arginasa Fumarasa Ribonucleasa pH OPTIMO 1,5 7,7 7,6 9,7 7,8 7,8

IV.

DISCUSINES: Para las discusiones se tiene como referencia los resultados descritos en las tablas del 1 al 4. En el ensayo de Biuret, tanto la gelatina como la albmina dieron positivos, ello corrobora lo descrito por Rocca (2003),donde describe que todas las molculas que contengas 2 o ms uniones peptdicas, por lo tanto todas las protenas y todos los pptidos no menores de 3 unidades, dan positiva a la reaccin de Biuret. El nombre se debe al compuesto biurea (NH2-CO-NH-CO-NH2) el cual da positiva la prueba. Adicionalmente, Stawnton (1967), indica que las sustancias que dan el color violeta tienen dos grupos CONH2 unidos directamente o por un carbono o nitrgeno. Los compuestos que contienen CH2NH2, -C(NH)NH2 Y CSNH2 en lugar de los grupos CONHH2. Las estructuras peptdicas se encuentran en protenas y sus derivados contienen enlaces peptdicos tambin dan positivo para la prueba de Buiret.

Q u e
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Quesada (2007) menciona que cuando una protena o un polipptido se hacen reaccionar con sulfato de cobre en solucin alcalina se produce un color caracterstico prpura o violeta; el color se debe a un complejo que resulta al unirse el cobre con los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Lo descrito por Quesada (2007) fue verificado en nuestra prctica. Para los ensayos de esta prctica se utiliz la albmina del huevo, Beyer (1987), menciona que el componente ms abundante de este tipo de albmina es la ovoalbumina, la cual se clasifica como fosfoglucoprotena por contener hidratos de carbono y fsforo que esterifican a las serinas de acuerdo con el contenido de estos 2 constituyentes, se separa en tres fracciones: A1, A2, A3. Una de sus principales caractersticas es que tiene grupos sulfhidrilo que la hacen muy reactiva y fcilmente desnaturalizable, adems durante el almacenamiento por un mecanismo de intercambio dedisulfuros y sulhidrilos se convierte en una forma msestable, la S-ovoalbmina, a la que se le atribuyen las reacciones de hipersensibilidad que presentan algunas personas despus de consumir huevos. La facilidad de desnaturalizar la albmina se pudo apreciar en la prctica de laboratorio, confirmando lo descrito por Beyer (1987). En la reaccin Xantoproteica, la coloracin amarilla se debe a la formacin de nitro derivados aromticos por reaccin del cido ntrico sobre los grupos bencnicos que poseen algunos aminocidos como la fenilalanina, la tirosina, y el triptfano. Por lo tanto, la dan positiva todas aquellas protenas que tengan aminocidos aromticos en su molcula. Rocca (2003).

En el experimento 2, la albmina y la gelatina, dieron positivas al observarse la coagulacin, Beyer (1987), indica que esto es debido a la desnaturalizacin de las protenas por el efecto del calor debido a que la mayor parte de las protenas en solucin son inestables a temperaturas superiores a 60C observndose as al coagularselas alteraciones que sufre la molcula disminuyendo su solubilidad y precipitando en forma de agregados insolubles.

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En el experimento 3, usamos la saliva para obtener la enzima amilasa, Teijn (2001) nos brinda informacin sobre la -amilasa y nos describe que es una enzima proteica que se encuentra en la saliva humana y cataliza la degradacin del almidn, que es un polisacrido de reserva vegetal. Para el experimento 3 usamos solucin de almidn al 3%, ante ello Teijn (2001), describe al almidn indicando que est formado por dos tipos de molculas: la amilosa y la amilopectina, ambos polisacridos de glucosa. La amilosa se conforma por cadenas lineales de glucosas unidas por enlaces - C1C4, mientras que la amilopectina tiene, adems de estos ltimos enlaces, uniones C1 con C6, formando cadenas ramificadas. Sobre la forma de cmo acta la amilasa con el almidn, Teijn (2001) describe que la -amilasa rompe uniones C1-C4, tanto en la amilasa como en la amilopectina, dejando dextrinas lineales y ramificadas (oligosacridos) como productos. En el experimento 3, realizamos una solucin utilizando saliva humana y NaCl, con ello segn nuestra gua de prcticas destruimos el olor de la saliva. Adicional a ello Melo (2007) nos indica que la -amilasa contiene en los restos aminoacdicos de su sitio activo Cl- ,y por ello, al agregar NaCl, los aniones cloruro se unen al sitio activo aumentando la actividad enzimtica. Es decir, el cloro acta como cofactor de la enzima. En esta mismo experimento le adicionamos el efecto del pH, usando buffer de 4, 7 y 10 upH. Melo (2007) nos proporciona informacin sobre la influencia del pH en la actividad de las enzimas, indicando que las enzimas poseen grupos qumicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH; imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus aminocidos. Segn el pH del medio, estos grupos pueden tener carga elctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformacin de las protenas depende, en parte, de sus cargas elctricas, habr un pH en el cual la conformacin ser la ms adecuada para la actividad cataltica. Este es el llamado pH ptimo.

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En el experimento 4, pudimos observar el efecto de los metales en la desnaturalizacin de las protenas, para nuestro experimento a la enzima catalasa. Melo (2007), nos indica que los metales pesados tienen el efecto de precipitar protenas de sus soluciones creando enlaces (cross-linkings) entre los grupos amino libres y los grupos carboxilo libres.

Melo (2007) tambin nos indica que los metales, Hg2+, Cd2+, and Pb2+ tienen una alta toxicidad. Estos pueden causar serios daos a las protenas (especialmente enzimas) desnaturalizndolas. Como ejemplo aplicativo de la interaccin de los metales y las protenas, Melo (2007), nos dice que las victimas que han ingerido iones de mercurio o plomo (Hg2+ o Pb2+ ) se tratan con un antdoto de algn alimento rico en protenas. La protena se combina con los iones de mercurio y plomo minimizando la absorcin de tales iones. Los alimentos ms usados son leche y clara cruda de huevo. La protena que se precipita es removida inmediatamente del estmago mediante un lavado estomacal. Este mismo efecto vimos reflejado en el experimento4, donde el Hg2+ desnaturaliza (envenenamiento) a la enzima. V. RECOMENDACIONES Tener cuidado en la manipulacin de los reactivos del laboratorio, tanto los cidos concentrados como el HgCl2 son altamente txicos. Verificar el almacenamiento del H2O2, para prevenir la descomposicin del perxido y no realice su funcin al 100%.

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VI. CONCLUSIONES Se observaron las propiedades fsicas y qumicas de las protenas. Se desarrollaron reacciones de colorimetra para la identificacin de protenas. Se evalu el efecto del pH en la actividad enzimtica de la amilasa. Se verific el efecto de los metales pesados (Hg2+) en la desactivacin de las enzimas (catalasa) Se desarroll la descomposicin del perxido de hidrgeno por accin de la catalasa. VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Teijn J. Bioqumica estructural. 1a ed. Albacete: Tebar; 2003. Melo V. Bioqumica de los procesos metablicos. 2a ed. Barcelona: Revert; 2007. Rocca B. Bioqumica, tcnicas y mtodos. 1a ed. Madrid: Hlice; 2003. Quesada S. Bioqumica. 1a ed. Costa Rica: EUNED; 2007. Beyer M. Qumica Orgnica. 19a ed. Espaa: Revert; 1987.

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