INMOVILIZACION DE LIPASA CANDIDA RUGOSA EN SOPORTE DE QUITOSANO

ALI DAVID CIFUENTES DIANA MARITZA ROJAS

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE MANIZALES FACULTAD DE INGENIERIA Y ARQUITECTURA INGENIERIA QUIMICA Manizales, Enero de 2005

INMOVILIZACION DE LIPASA CANDIDA RUGOSA EN SOPORTE DE QUITOSANO

ALI DAVID CIFUENTES Cdigo 399514 alidavidc@hotmail.com Cel: 311-3069377 Linea de profundizacin en alimentos DIANA MARITZA ROJAS Cdigo 399052 dianam0729@latinmail.com Cel: 300-7791390 Lnea de profundizacin en alimentos

Trabajo para optar el ttulo de Ingeniero Qumico MODALIDAD Participacin en proyecto de investigacin: Produccin De Biodiesel A Partir De Aceite De Palma Y De Higuerilla Por Un Proceso De Reaccin-Separacin Por Enzimas Inmovilizadas. DIR ECTOR CARLOS EDUARDO ORREGO Ingeniero Qumico, Esp en Tecnologa de alimentos

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE MANIZALES FACULTAD DE INGENIERA Y ARQUITECTURA INGENIERA QUMICA Manizales, Enero de 2005

Nota de aceptacin ________________________________ ________________________________ ________________________________

________________________________ Presidente del Jurado

________________________________ Jurado ________________________________ Jurado

Manizales, da____mes___ao___

Ali David Cifuentes A mis padres por el esfuerzo hecho, a Dios, y a los que en una u otra forma me aportaron algn granito de arena en mi carrera.

Diana Maritza Rojas A DIOS, a mi madre y a mi hijo por tantos esfuerzos compartidos.

AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan sus agradecimientos a: Colciencias y Universidad Nacional de Colombia Sede Manizales por la financiacin de ste proyecto. Carlos Eduardo Orrego, director del trabajo de grado por su valioso apoyo humano e intelectual. Al talento humano pertenecientes a los laboratorios de Qumica y Anlisis instrumental de la Universidad Nacional de Colombia sede Manizales. Los profesores: Gloria Ins Giraldo, Carlos Ariel Cardona, Hctor Jairo Osorio por su orientacin pedaggica. Al personal administrativo de la Direccin de Investigaciones de Manizales, Universidad Nacional de Colombia Sede Manizales. El ingeniero Adamo Alexander Cardona, por su disposicin y colaboracin oportuna. Jorge Ariel Guapacha por su colaboracin incondicional. Dems personal asociado al proyecto por aportar conocimientos pertinentes al desarrollo del mismo.

RESUMEN Se llev a cabo la produccin de un sistema biocataltico con caractersticas fsico qumicas adecuadas, para ser aplicado en reacciones de hidrlisis y esterificacin. El soporte de inmovilizacin fue fabricado a partir de un hidrogel macroporoso de quitosano con concentracin de 3 % el cual se someti a un proceso de criogelificacin-crioconcentracin por un tiempo de 4-5 das, producindose en diferentes geometras. Finalmente se escogi la forma cilndrica ya que los pellets resultaron de fcil produccin, resistentes a la abrasin y a la agitacin. La humedad final de los soportes cilndricos fue de alrededor del 17% . Una solucin de glutaraldehido fue utilizada como activador del soporte utiizando el mtodo de brazo espaciador. El valor ptimo de carga enzimtica la produjo un tratamiento de activacin con glutaraldehido al 0.003 %, La inmovilizacin de lipasa cndida rugosa (CRL) fue llevada a cabo por inmersin del soporte activado en una solucin de la protena durante 15h. As se obtuvo una carga de 1.065 mg enzima/ g soporte seco, en promedio. La caracterizacin del soporte se llev a cabo por medio de espectroscopia de infrarrojo (FTIR) hallando un grado de D-acetilacin de 68.86%. La morfologa externa fue estudiada por microscopia de fuerza atmica en modo de contacto encontrndose un tamao medio de poro de 195 560 nm y rugosidades medias de 229 308 nm para el soporte obtenido a partir de la solucin del 3% de quitosano. La resistencia a la agitacin y la solubilidad-degradabilidad fue estudiada, encontrndose resistente a agitaciones hasta de 1100 rpm y soluble solo en soluciones de cido actico. El grado de hinchamiento se evalu para la hidrlisis encontrndose que el soporte se hincha en un 77.16 % al cabo de 96h. La caracterizacin del sistema biocataltico se llev a cabo por hidrlisis de aceite de oliva y mediante la esterificacin de cido oleico con n-butanol, presentndose una mayor actividad de la enzima inmovilizada con respecto a la enzima libre con valores de 14.79 U/mg y 9.69 U/mg respectivamente. Este trabajo forma parte del proyecto de investigacin Produccin de Biodiesel a partir de aceite de palma y de higuerilla por un proceso de reaccin-separacin por enzimas Inmovilizadas adscrito a Colciencias.

ABSTRACT The aim of this work was the production and characterization of an adequate catalytic system for hydrolisis and esterification reactions. As a support it was used different pellet shapes of a a macroporous dried hydrogel (ca 17% humidity, wet basis) obtained from a chitosan dispersion (3% wt) gelled at 20C, crioconcentrated at -20C and thawed at 20C. Easy way of production, good abrasion and agitation resistance was the principal reasons to choose the cylinders as the final shape of the pellet. Candida Rugosa Lipase CRL- was immobilized on the chitosan support after immersion contact for 15 h with an enzyme solution .Glutaraldehyde was used as activation agent or spaced arm in the lipase immobilization process. Activating glutaraldehyde solution (0.003% wt) yield higher enzymatic load on chitosan pellets (average value of 1.065 mg enzyme/ g of dried support). Support characterization included infrared spectroscopy FTIR- for deacetylation degree (68.86%) and atomic force microscopy contact mode- for roughness (between 229 and 308 nm) and pore size (149 to 226 nm). Agitation resistance and swelling in water and solubility in different media were also studied. Pellets had a good behavior in agitated environment until 1100 rpm; they were dissolved in acetic acid solutions. It was measured 77.6% of swelling after 96 h in contact with aqueous hydrolysis reaction media solutions Hydrolysis and esterification catalytic activity was made in olive oil hydrolysis and n-butanol - oleic acid reaction respectively. Supported lipase system showed higher enzymatic activity than free enzyme catalyzed reactions (14.79 U/mg y 9.69 U/mg forr hydrolysis and esterification respectively). This work is a part of a major research project called Produccin de Biodiesel a partir de aceite de palma y de higuerilla por un proceso de reaccin-separacin por enzimas Inmovilizadas with finantial support of Colciencias and Universidad Nacional Sede Manizales.

TABLA DE CONTENIDO

Pg. INTRODUCCIN 1. OBJETIVOS 1.1 GENERALES 1.2 ESPECFICOS 2. MARCO TEORICO 2.1 ANTECEDENTES 2.2 INMOVILIZACION 2.2.1 Clases De Inmovilizacin 2.2.1.1 Inmovilizacin por retencin fsica 2.2.1.1.1 Atrapamiento 2.2.1.1.2 Inclusin en membranas 2.2.1.2 Inmovilizacin por unin qumica 2.2.1.2.1 Unin a soportes 2.2.1.2.2 Adsorcin inica 2.2.1.2.3 Unin covalente 2.2.1.2.4 Inmovilizacin por reticulacin. 2.2.2 Efectos de la Inmovilizacin 2.3 LIPASAS EN REACCIONES 2.3.1 Clasificacin 2.3.2 Propiedades 2.3.3 Reaccin de transesterificacin 2.3.3.1 Produccin de biodiesel 2.4 ACTIVIDAD ENZIMTICA 2.5 SOPORTES DE INMOVIIZACION 2.5.1 Caractersticas de los soportes para inmovilizacin 2.6 QUITOSANO COMO SOPORTE DE INMOVILIZACIN 2.7 HIDROGELACION 2.8 CRIOGELIFICACION- CRIOCONCENTRACIN 3. MATERIALES Y METODOS 3.1 PRODUCCION DEL SOPORTE 3.1.1 Materiales y reactivos 3.1.2 Equipos de anlisis y proceso 3.1.3 Procedimiento de gelificacin 3.1.4 Procedimiento de secado convectivo 3.1.5 Procedimiento de secado por criogelificacin 3.2 PROTOCOLO DE INMOVILIZACIN 3.2.1 Materiales y reactivos 3.2.2 Enzima Utilizada 3.2.3 Equipos de anlisis y proceso 3.2.4 Procedimiento de activacion 13 14 14 14 15 15 16 18 18 19 19 20 20 21 22 23 25 27 27 27 29 29 30 31 31 33 37 38 40 40 40 40 40 41 41 41 42 42 42 43

3.2.5 Procedimiento de inmovilizacin 3.2.6 Procedimiento de anlisis de protena 3.3 CARACTERIZACION DEL SOPORTE Y EL BIOCATALIZADOR 3.3.1 Materiales y reactivos 3.3.2 Equipos de anlisis y proceso 3.3.3 Medida de grado de D- acetilacin 3.3.4 Medida de la resistencia 3.3.5 Medida de la solubilidad y la degradabilidad 3.3.6 Medida del hinchamiento (swelling) 3.3.7 Procedimiento de medicin de rango de poro 3.3.8 Medida de la actividad enzimtica del biocatalizador 3.3.8.1 Hidrlisis 3.3.8.2 Esterificacin 4. RESULTADOS Y DISCUSION 4.1 PRODUCCION DEL SOPORTE 4.2 PROTOCOLO DE INMOVILIZACIN 4.2.1 Carga enzimtica 4.3 CARACTERIZACION DEL SOPORTE Y EL BIOCATALIZADOR 4.3.1 Grado de D- acetilacin 4.3.2 Resistencia 4.3.3 Solubilidad y degradabilidad 4.3.4 Swelling 4.3.5 Medicin de rango de poro 4.3.6 Actividad enzimtica del biocatalizador 4.3.6.1 Hidrlisis 4.3.6.2 Esterificacin 5. CONCLUSIONES 6. RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFIA ANEXOS

43 43 43 44 44 44 45 45 45 46 46 46 47 48 48 58 58 61 61 64 65 66 67 70 70 72 76 79 81 87

LISTA DE SIMBOLOS Y ABREVIATURAS Ac AFM C CRL D-Ac EtOH FTIR GA G nm N-Ac SPM TPP U m UV Wd Ws(t) Wef cido Microscopia de fuerza atmica. Grado Centgrado Lipasa Candida Rugosa Grado de D-acetilacin Etanol Espectrofotometra de infrarrojo por transformada de Fourier. Glutaraldehido Grado de hinchamiento Nanmetro Grado de N-acetilacin Microscopia de barrido por sonda Tripolifosfato [mol/min] [mol/h] Micro metro Ultravioleta Peso de muestra seca Peso de la muestra hinchada en funcin del tiempo Peso de soporte hinchado en el equilibrio.

LISTA DE TABLAS

TABLA DE CONTENIDOS Tabla 1. Tipos de Soporte y enzimas utilizadas. Tabla 2. Comparacin entre distintas tcnicas de inmovilizacin. Tabla 3. Parmetros caractersticos para analizar enzimas Inmovilizadas. Tabla 4. Tamao Inicial y Final de esferas (Dimetro efectivo promedio). Tabla 5. Tamao inicial de lminas (longitudes en cm). Tabla 6. Tamao Final de lminas (longitudes en cm). Tabla 7. Tamao inicial y final de cilindros (Dimetro y longitud media). Tabla 8. Perdida de tamao para esferas (%). Tabla 9. Perdida de tamao para laminas (%). Tabla 10. Prdida de tamao para cilindros (%) Tabla 11. Porcentaje de prdida de peso debido al proceso de secado Tabla 12. Humedad final de esferas (%). Tabla 13. Humedad final de Laminas (%) Tabla 14. Humedad final de Cilindros (%) Tabla 15. Humedades finales al cabo de 5-6 das (%) Tabla 16. Anlisis de protena. Tabla 17. Curva patrn Tabla 18 Carga de protena Tabla 19. Tiempos de carga de enzima Tabla 20. Resultados de N-Ac y D-Ac Tabla 21. Resultados de absorbancia de grupos hidroxilo y amida. Tabla 22. Resistencia del soporte de inmovilizacin Tabla 23. Solubilidad en diferentes solventes Tabla 24. Rugosidad Media. Tabla 25. Porosidad media. Tabla 26. Gramos de cido oleico producido con el tiempo. Tabla 27. Actividad del biocatalizador en Hidrlisis. Tabla 28. Gramos de cido que reaccionan con el tiempo. Tabla 29. Actividad del biocatalizador en Esterificacin

Pg. 15 24 32 49 49 50 50 50 51 51 52 53 53 53 55 58 59 59 60 63 63 64 65 68 68 70 71 72 73

LISTA DE FIGURAS TABLA DE CONTENIDOS Figura 1. Mtodos de inmovilizacin por retencin fsica Figura 2. Mtodos de inmovilizacin por Unin qumica. Figura 3. Lipasa de naturaleza amfifilica. Figura 4. Migracin de la lipasa a la interfase Figura 5. Estructura qumica del quitosano Figura 6. Estructura qumica de la quitina Figura 7. Formacin de quitosano a partir de quitina Figura 8. Proceso de inmovilizacin sobre quitosano. Figura 9. Hidrogel de esferas de 1.8% Figura 10. Hidrogel de Lminas de 3% Figura 11. Hidrogel de cilindros de 3% Figura 12. Proceso combinado de secado. Figura 13. Esferas secas Figura 14. Laminas secas Figura 15. Cilindros secos. Figura 16. Comparacin del soporte convencional con biolgico. Figura 17. Soporte biolgico Figura 18. Soportes por hidrogelacin en fri Figura 19. Soporte producidos por uso de TPP. Figura 20. Espectros de quitosano puro pastilla de KCl Figura 21. Espectros de quitosano al 1.8% por lmina. Figura 22. Hinchamiento de muestras en hidrlisis a 25C Figura 23 Swelling a cada intervalo de tiempo Figura 24. Concentracin de quitosano de 1.8 % Figura 25. Concentracin de quitosano de 2.4 % Figura 26. Concentracin de quitosano de 3 % Figura 27. Micrografa de quitosano con Glutaraldehido de 0.003 % Figura 28. Micrografa de quitosano con Glutaraldehido de 0.01 % Figura 29. Hidrlisis del aceite de oliva (produccin del cido oleico). Figura 30. Actividad de Cndida rugosa en la reaccin de hidrlisis. Figura 31. Esterificacin del cido oleico y n-butanol. Figura 32. Actividad de Cndida rugosa en la reaccin de Esterificacin. Figura 33. Reutilizacin del sistema biocataltico (actividad) en hidrlisis Figura 34. Reutilizacin del sistema biocataltico en hidrlisis (porcentaje) Pg. 18 20 28 28 34 34 35 37 48 48 49 52 54 54 54 56 56 57 58 61 62 66 66 67 67 68 69 69 70 71 72 73 74 75

TABLA DE CONTENIDOS

LISTA DE ANEXOS

Anexo 1. Procedimiento de gelificacin Anexo 2. Procedimiento de secado Anexo 3. Procedimiento de enlace covalente Anexo 4. Mtodo de biuret Anexo 5. Hidrogeles de quitosano Anexo 6. Mtodos de secado Anexo 7. Espectros de infrarojo Anexo 8. Espectro de lipasa Anexo 9. Perfiles Lineales de AFM Anexo 10. Datos Experimentales

INTRODUCCIN Hoy por hoy las transformaciones qumicas de materias primas en productos elaborados no son una simple idea de aos atrs; la generacin de productos con alto valor agregado a bajos costos, pero al mismo tiempo atractivos ambientalmente, es la idea de muchas industrias que le apuntan a las reacciones en sntesis orgnica, siendo esta una de las reas que aporta elementos para mejorar la calidad de vida de este ltimo siglo y para la cual se usan crecientemente los catalizadores enzimticos como un aporte al mejoramiento de diferentes procesos industriales de sntesis. Es as como en algunas reacciones tales como esterificacin, transesterificacin, interesterificacin, alcoholisis, acidlisis, hidrlisis y glicerolisis aparecen las lipasas como catalizadores limpios y biolgicos que aumentan la productividad debido a su alta especificidad por el sustrato y por su actividad, si se compara con catalizadores orgnicos e inorgnicos. Las lipasas se utilizan en diversos campos que van desde la industria de detergentes, la de alimentos, la farmacutica, la cosmtica, la oleoqumica, la industria del papel, la sntesis orgnica, pesticidas, fungicidas y aplicaciones biomdicas, hasta la industria energtica; participando en esta ultima en la produccin de biodiesel por transesterificacin para contrarrestar el hecho del agotamiento del petrleo a nivel mundial. Las lipasas pueden ser obtenidas comercialmente de diferentes microorganismos tales como levaduras, mohos y de bacterias; se pueden utilizar tanto libres como inmovilizadas. Dentro de una gran gama de materiales de soportes de inmovilizacin una buena opcin es el quitosano (obtenido a partir de la deacetilacin de la quitina, el segundo polmero ms abundante en la tierra). Este material es biocompatible, no-txico y de remarcada afinidad con las protenas.

1. OBJETIVOS

1.1 GENERALES 9 Inmovilizar una lipasa en quitosano

1.2 ESPECFICOS 9 Producir el soporte de quitosano para la inmovilizacin. 9 Obtener un protocolo de inmovilizacin de la lipasa sobre el soporte 9 Caracterizar el soporte y el sistema biocataltico.

2. MARCO TEORICO 2.1 ANTECEDENTES Desde una perspectiva biotecnolgica existen muchas ventajas del empleo de enzimas en medios orgnicos: La facilidad de lograr alta solubilidad del sustrato y de modificar la selectividad propia de la enzima por el simple diseo del medio de reaccin, la mejora sustancial de la termoestabilidad de las enzimas y la posibilidad de recuperacin del producto por evaporacin del solvente de reaccin. La baja actividad de las enzimas generalmente observada en los solventes orgnicos se debe a que las enzimas son insolubles en tales medios y forman agregados en los cuales aproximadamente el 30%60% de sus sitios activos son inaccesibles para los sustratos [31, 65]. La inmovilizacin de enzimas sobre soportes artificiales se remonta hacia los aos 50s. Se han utilizado tcnicas de inclusin de enzimas en matrices polimricas, conexin por enlaces sobre materiales de soporte y la adsorcin sobre materiales inertes. Muchos mtodos han sido usados para inmovilizar lipasas, incluyendo la adsorcin o la precipitacin sobre materiales hidrofbicos [68], enlace covalente con grupos funcionales [53], atrapamiento en geles de polmeros [57], adsorcin en resinas de intercambio inico [52], microencapsulacin [4], y atrapamiento en solgel [29, 34]. La lipasa de C. cylindracea fue inmovilizada sobre un copolimero de divinil metil acrilato y sus derivados [69]. La lipasa inmovilizada tiene una resistencia mejorada a la desnaturalizacin trmica que la enzima nativa [50, 69]. Algunos estudios han llegado a la conclusin que el proceso de inmovilizacin incrementa la actividad enzimtica comparada con la que presentan las enzimas libres [42]. Con ello se contribuye al desarrollo de procesos continuos y adaptabilidad a una variedad de configuraciones y procesos especficos llevados en reactores. Un resumen de los diferentes tipos de soportes y lipasas utilizadas en algunos estudios anteriores se presenta en la tabla 1.

Tabla 1. Tipos de soporte y enzimas utilizadas reportadas en la literatura TITULO DEL TRABAJO Ref SOPORTE LIPASA cndida antrtica

macro poros de 1. Inmobilized lipase-catalyzed 26 resina acrlica y slice production of alkyl esters of granulado restaurant grease as biodiesel. 2. Imaging the distribution and secondary structure of inmobilized 38 Macro poros de enzymes using infrared polimetilmetacrilato. microespectroscopy.

cndida antrtica

TITULO DEL TRABAJO 3. Inmobilization of pseudomonas cepacia lipase in a phyllosilicate sol-gel matrix effectiveness as a biocatalyst 4. Preparation of porous polyurethane particles and their use in enzyme immobilitation 5. Designer hydrogels for lipase immobilitation

Ref 27

SOPORTE Matriz de sol gel de silicato Particulas porosas de poliuretano

LIPASA pseudomonas cepacia cndida rugosa

64 25

Hidrogeles polimricos de porcine pancreas poliacrilamida 6. Catalytic membrane preparation Membrana de for enzymatic Hydrolysis reactions polipropileno, cndida antarctica y carried out in the membrane phase 61 nitrocelulosa, pancreatic porcine contactor celulosa y poliamidas 7. Immobilization, stability and silica (Merck), pellets esterification studies of a lipase 13 Bacillus sp. HP-20 . from a Bacillus sp 8. Lipase Immobilization into Porous Chitoxan Beads: Activities in Complejo de candida rugosa Aqueous and Organic Media and 15 quitosano. Lipase Localization 9. Waste edible oils and fats for Silicona, biodiesel production by lipase8 Materiales sol-gel de catalyzed transesterification silicato. 10. Production of biodiesel fuel from Pseudomonas triglycerides and alcohol using 6 Caolita porosa. fluorescens immobilized lipase 11. Preparation, characterization and Carboxipeptidasa y application of immobilized 62 Poliacrilamida. silica carboxypeptidase 12. Effect of chemical modification on the activity of lipases in organic 32 Rhizomucor Miehei, solvent cndida antarctica 14. Immobilization of a-Larabinofuranosidase on chitin and chitosan 2.2 INMOVILIZACION A partir de las observaciones de Berzelius en el ao de 1835 se detect la necesidad de utilizar sustancias que modificaran el proceso de elaboracin de vino, queso o pan positivamente, es as como aproximadamente 150 aos atrs se 55

quitosano

-Larabinofuranoxidase

llamo a dichas sustancias como fuerza cataltica. Los catalizadores son sustancias que afectan la velocidad de una reaccin, sin sufrir cambios, promoviendo un mecanismo diferente para la reaccin sin afectar el equilibrio. [17]. Los biocatalizadores son un ejemplo simple de lo anterior, tambin conocidos como catalizadores biolgicos enzimas, ribositas y anticuerpos catalticos-, han invadido el mercado mundial con variadas aplicaciones industriales. Las enzimas son biocatalizadores con actividad biolgica que en su mayora son de origen microbiano o pertenecen a enzimas extracelulares con excelentes propiedades en diferentes aspectos como: a) altamente catalticas frecuentemente de 108 -1011 veces mas rpidas que los catalizadores no enzimticos, manejando temperaturas suaves y presiones atmosfricas b) poseen un amplio rango de aplicaciones industriales c) son muchos mas especficos en cuanto al tipo de reaccin que catalizan (incluso estereoselectividad y regioespecificidad); por ello en aplicaciones industriales de las que hacen parte las enzimas han contribuido significativas transformaciones industriales [67]. En las reacciones catalizadas por enzimas la separacin de los sustratos y productos es difcil. Las enzimas no se pueden reutilizar y como son estructuras lbiles e inestables frente a factores fsicos como (calor, radiacin), qumicos (oxidacin, reduccin, disolventes orgnicos, iones metlicos, fuerza inica y pH) o biolgicos (protelisis, modificacin y degradacin enzimtica) disminuyen su actividad cataltica y solubilidad a medida que transcurre el tiempo [5]. Para garantizar la estabilidad termodinmica y/o cintica se han elaborado diversos mtodos. Uno de ellos corresponde a la seleccin de microorganismos extremfilos, que intervienen en intervalos de temperatura, acidez, basicidad, presin o salinidad nicos; adicionalmente se ha encontrado que la inmovilizacin es de gran utilidad para brindar estabilidad a las enzimas [5] La inmovilizacin se define como el proceso por el cual el movimiento de las enzimas, clulas, organelas u y otras especies se ve restringido total o parcialmente, dando lugar a una forma insoluble en el medio de reaccin, en donde se presenta una mayor estabilidad como resultado de este acoplamiento. La inmovilizacin de enzimas se refiere a enzimas unidas, insolubilizadas, soportadas o ligadas a una matriz, que se caracterizan por aspectos positivos tales como: 9 Aumento en estabilidad de la enzima. 9 Posible reutilizacin del sistema inmovilizado, por lo que disminuyen los costos del proceso. 9 Posibilidad de disear un reactor enzimtico de fcil manejo y control, adaptado a la aplicacin de enzimas inmovilizadas donde se permiten cargas elevadas de enzima y uso de procesos continuos. Estos sistemas

pueden incluir el reciclado, lo que permite la obtencin de productos con mayor pureza. Pero tambin implica factores que contrarrestan lo anterior, tales como: 9 La alteracin de la conformacin de la enzima respecto de su estado nativo. 9 La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir distintas fracciones de protenas inmovilizadas con diferente nmero de uniones al soporte. 9 Prdida de actividad de la enzima durante la inmovilizacin. 9 El sistema biocatalitico es ms caro que la enzima nativa [2] 2.2.1 Clases De Inmovilizacin 2.2.1.1 Inmovilizacin por retencin fsica

Este mtodo representa modificaciones fsicas del microentorno de la enzima tal y como su atrapamiento en la red espacial de una matriz polimrica o su inclusin en membranas. Un diagrama tpico de esta clase de tcnicas es mostrado en la figura 1. Figura 1. Mtodos de inmovilizacin por retencin fsica.

(Fuente: [2])

2.2.1.1.1 Atrapamiento Consiste en la retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores de una matriz slida porosa constituida generalmente por prepolmeros entrecruzables o polmeros de tipo poliacrilamida, colgeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano. El proceso de inmovilizacin se lleva a cabo mediante la suspensin de la enzima en una solucin del monmero. Posteriormente se inicia la polimerizacin por un cambio de temperatura o mediante la adicin de un reactivo qumico. El atrapamiento puede ser en geles (poliacrilamida) o en fibras (acetato de celulosa), que suelen ser ms resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en el segundo la enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sinttica. El atrapamiento, es simple desde el punto de vista experimental, requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos. Como ventaja adicional, la enzima no sufre ninguna alteracin en su estructura ya que la enzima no esta unida de ninguna forma y adems se pueden obtener sistemas multienzimaticos. De todas formas, el atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones de polimerizacin, as como la comprobacin de que la naturaleza qumica del proceso no altera los grupos reactivos de la protena [2] 2.2.1.1.2 Inclusin en membranas Se destacan dos tcnicas tales como: el microencapsulado que consiste en atrapar la enzima en membranas polimricas semipermeables esfricas y el reactor de membrana que consiste en confinar la enzima en una membrana que sirve de pared permeable selectiva al interior de un reactor. En la microencapsulacin las enzimas estn rodeadas de membranas semipermeables que permiten el paso de molculas de sustrato y producto, pero no de enzima. Estas membranas semipermeables pueden ser permanentes (originadas por polimerizacin interfacial) o no permanentes (generadas por surfactantes, tambin llamadas micelas reversas). Las microcpsulas obtenidas son de forma esfrica, con tamaos comprendidos entre 1 y 100 mm de dimetro. Mediante este mtodo se pueden encapsular simultneamente una gran variedad de enzimas, clulas o biomolculas, permitiendo que se lleven a cabo determinadas reacciones que suceden en mltiples pasos. Presentan una gran superficie de contacto entre la enzima y el sustrato para un volumen relativamente pequeo y la posibilidad de inmovilizar enzimas en una sola etapa [2].

2.2.1.2

Inmovilizacin por unin qumica

Las tcnicas a las que hacen mencin la inmovilizacin por unin qumica se basan en las interacciones que puedan generarse entre el soporte y la enzima, ya sea por interacciones inicas, por adsorcin fsica, enlace covalente, quelacin o unin metlica o los enlaces que se pueden generar entre enzimas como el reticulado (entrecruzamiento) [2,67]. Figura 2. Mtodos de inmovilizacin por Unin qumica.

(Fuente: [2]) 2.2.1.2.1 Unin a soportes Esta tcnica implica la unin de una enzima a un soporte insoluble; siendo esta tcnica la ms antigua de todas y de la que se dispone de ms informacin. La eleccin del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el comportamiento posterior del sistema biocatalitico. Se debe procurar que la inmovilizacin incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibicin, ample el intervalo de pH ptimo y reduzca las posibles contaminaciones microbianas. Adems el soporte debe tener resistencia mecnica adecuada a las condiciones de operacin del reactor y ser fcilmente separable del medio lquido para que pueda ser reutilizado [67]. Se han utilizado una gran variedad de materiales como soportes para la inmovilizacin de numerosas enzimas. Estos difieren en tamao, densidad, porosidad y forma, aunque generalmente los encontramos en forma de cilindro,

hojas, fibras y ms corrientemente en forma de esferas, una ampliacin del tema se puede ver en el aparte 2.5. 2.2.1.2.2 Adsorcin inica Muchos autores encuentran dentro de esta calificacin subdivisiones debido a las variantes que se pueden presentar, otros solo se limitan a unir las interacciones de tipo inico entre la enzima y el soporte en una sola clasificacin. En la adsorcin, la enzima se une a un soporte mediante interacciones inicas de tipo fuerzas de Van de Waals, por puentes de hidrgeno, interacciones hidrofbicas y otras. El contacto de la solucin acuosa de la enzima se puede realizar por procedimientos estticos, electrodeposicin, procesos en reactor o bao con agitacin, siendo en esta ltima en la que se obtiene una deposicin uniforme de la enzima. Los principales factores que influyen en la adsorcin implican el pH del medio ya que controla el nmero y la naturaleza de las cargas que presenta la superficie de la protena y del slido, si la fuerza inica aumenta se produce la desorcin de la enzima, ya que los iones inorgnicos se unen con ms fuerza al soporte que la protena, el dimetro de poro juega un papel importante ya que debe ser aproximadamente dos veces el tamao del eje mayor de la enzima, la presencia de iones que acten como cofactores de la enzima incrementa la carga enzimtica del derivado. Como principales ventajas implican 9 9 9 9 Preparacin sencilla. su bajo costo. No hay cambios de especificidad enzimtica. Los derivados son estables en medios de trabajo con bajo contenido en agua.

Los inconvenientes de la adsorcin son principalmente: 9 La optimizacin de las variables que controlan la adsorcin. 9 Los derivados obtenidos son poco estables desde el punto de vista mecnico. 9 La unin al soporte es dbil. Dentro de las variantes que algunos autores reportan consiste en emplear resinas de intercambio inico (mtodo de enlace inico), las cuales contienen grupos funcionales y contraiones mviles. Estos contraiones se pueden intercambiar reversiblemente por otros iones de la misma carga, sin que se produzcan cambios en la matriz insoluble. La fuerza de unin entre la enzima y el soporte es mucho

ms alta, los cambios conformacionales solo se producen en pequea extensin [67]. 2.2.1.2.3 Unin covalente La unin covalente de una enzima a un soporte es quiz el mtodo de inmovilizacin ms interesante desde el punto de vista industrial. La metodologa de la unin covalente se basa en la activacin de grupos qumicos del soporte para que reaccionen con nuclefilos de las protenas. De entre los 20 aminocidos diferentes que se encuentran en la estructura de las enzimas, los ms empleados para la formacin de enlaces con el soporte son principalmente la lisina, la cistena, la tirosina y la histidina, y en menor medida la metionina, el triptfano, la arginina y el cido asprtico y glutmico, el resto de aminocidos, debido a su carcter hidrfobo, no se encuentran expuestos hacia el exterior de la superficie proteica y no pueden intervenir en la unin covalente. Los ms involucrados son los del grupo amino (NH2) de la lisina o arginina, el grupo carboxilo (CO2H) del cido asprtico o el cido glutmico, el grupo hidroxilo (OH) de la serina o treonina, y el grupo sulfhidrilo (SH) de la cistena, estos aminocidos no deben de ser esenciales en la accin cataltica, con respecto a esto ltimo se han diseado varios mtodos que previenen la inactivacin enzimtica por reaccin con los residuos de aminocidos esenciales en los que se encuentran enlaces covalentes de enzima en presencia de un substrato o un inhibidor competitivo, por enlace de un complejo enzima-inhibidor formado mediante un enlace covalente reversible, uso de enzima soluble modificada qumicamente de forma que el enlace covalente a la matriz se lleve a cabo mediante los residuos nuevos incorporados o el uso del zimgeno precursor [67]. El enlace normalmente se forma entre el grupo funcional presente sobre la superficie del soporte y el grupo funcional perteneciente al aminocido residual sobre la superficie de la enzima, pero la mayora de los soportes no poseen grupos funcionales que reaccionen directamente con las enzimas, sino que tienen grupos hidroxilo, amino, amido o carboxilo que necesitan ser activados para poder proceder a el proceso de inmovilizacin. El bromo cianuro (BrCN) ha sido ampliamente utilizado como activante del grupo funcional hidroxilo en soportes de materiales polisacridos. En este mtodo, la enzima y el soporte estn unidos por medio de un enlace isourea. En el caso de la activacin de la carbodiimida, el material de soporte puede tener un grupo funcional carboxilo (CO2H), y la enzima y el soporte estn unidos por medio de un enlace peptdico. Si el material de soporte contiene un grupo funcional amino aromtico, puede ser diazotizado usando cido ntrico. Seguidamente, la adicin de pequeas cantidades de enzima conducen a la formacin del enlace diazo entre el grupo reactivo diazo sobre el soporte y el anillo de la estructura de un aminocido aromtico, como la tirosina [51].

Las reacciones de acoplamiento entre los grupos reactivos del soporte y los grupos reactivos de la enzima han sido ampliamente difundidas, entre ellos se encuentran la diatozotizacion como los ocurridos entre la celulosa y la tripsina, papaina o pepsina, la formacin de enlaces amida mediante inmovilizacin de agarosa con triacilglecerol lipasa, la alquilacin o arilacin sucedida entre metacrilato de polihidroxialquilo y la tripsina, la formacin de bases de Schiff entre quitosano y pepsina A, reacciones ugi, reacciones de amidinacin, intercambio tiol disulfuro, interacciones mercurio enzima, acoplamiento inducido por irradiacin gamma, para una amplia consulta de antecedentes se remite al lector a [67]. Este mtodo presenta las siguientes ventajas: 9 La manipulacin de los derivados inmovilizados es sencilla. 9 La carga de enzima permanece constante despus de la inmovilizacin. 9 Los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo, empaquetados, de lecho fluidizado o tanque agitado. 9 Una mayor resistencia a la desactivacin por el efecto de la temperatura, de los disolventes orgnicos o del pH, al tener estabilizada su estructura terciaria. En cambio la inmovilizacin por enlace covalente tambin presenta una serie de inconvenientes: 9 Es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad de superficie, ya que condiciona el nmero de uniones enzima-soporte y su geometra, que puede ser distorsionante y conducir a derivados inactivos. 9 El proceso de inmovilizacin puede alterar la estructura del centro activo. Para evitar esta posible alteracin, se realiza la inmovilizacin en presencia de un inhibidor que bloquee el centro activo. 9 La inmovilizacin covalente no es aconsejable en aquellas enzimas muy sensibles a cambios de pH, fuerza inica, etc. 2.2.1.2.4 Inmovilizacin por reticulacin. Tambin denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una tcnica que ha sido ampliamente utilizada en la estabilizacin de muchas enzimas, el mtodo consiste en uso de reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las molculas de enzima. Como reactivos bifuncionales (homobifuncionales o heteromultifuncionales) se pueden emplear dialdehdos, diiminosteres, diisocianatos, sales de bisdiazonio e, incluso, diaminas si estn activadas con carbodiimida. El resultado del reticulado son enzimas con enlaces intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura.

El co-reticulado como una subdivisin alterna permite eliminar las prdidas de actividad enzimtica debidas a efectos difusionales, mediante el entrecruzamiento de las enzimas con una protena sin actividad enzimtica y rica en residuos de lisina (por ejemplo, la albmina bovina). Un procedimiento mixto de inmovilizacin muy comn consiste en inmovilizar la enzima por adsorcin sobre una resina de intercambio inico o un soporte polimrico (con lo que se consigue una elevada carga enzimtica) y posteriormente aadir el reactivo bifuncional. Actualmente el mtodo ms novedoso de cross-linking consiste en la cristalizacin de enzimas y su posterior reticulado con glutaraldehido (Cross-Linked Enzyme Crystals o CLECs). El aumento de estabilidad se basa en la obtencin de un entramado cristalino, donde las molculas de enzima estn rodeadas exclusivamente por otras molculas de protena. De esta manera la propia enzima acta como soporte, y su estructura terciaria est estabilizada por las uniones covalentes intermoleculares. La estructura cristalina posee canales microscpicos (20-50) que permiten el paso de sustratos hasta el centro activo de la enzima donde se cataliza la reaccin. Estos cristales pueden soportar temperaturas elevadas y pH extremos, as como la accin de las proteasas. Esta tecnologa se ha utilizado en la obtencin de compuestos enatiomricamente puros y en la sntesis de pptidos [3]. Un resumen de algunas propiedades para las diferentes clases de Inmovilizacin pueden verse en la tabla 2, en la cual se diferencian varias caractersticas entre distintas tcnicas de inmovilizacin.

Tabla 2. Comparacin entre distintas tcnicas de inmovilizacin

Propiedad Preparacin Fuerza del Enlace Enlace Adsorcin Cruzado Fsica Intermedio Simple Fuerte Dbil Enlace Inico Simple Quelacin Simple Enlace Atrapamiento Covalente Difcil Difcil Fuerte Alta Alta Alta Alta No Intermedia Bajo Intermedio Intermedia Alto Si

Intermedio Intermedio

Actividad Bajo Intermedio Alto Alto Enzimtica Regeneracin del Imposible Posible Posible Intermedio Soporte Costo de la Intermedio Bajo Bajo Intermedio Inmovilizacin Estabilidad Alto Bajo Intermedio Intermedio Proteccin de la enzima contra Algunas No No No ataque microbiano Veces

Fuente: [67]

2.2.2 Efectos de la Inmovilizacin La inmovilizacin altera significativamente el comportamiento de las enzimas, es as como la actividad de la preparacin es siempre diferente a la de la forma natural, es as como efectos de ndole conformacional, de particin o difusionales son los culpables de estos cambios que pueden afectar la estabilidad y la actividad enzimtica[3]. Generalmente se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas despus de su inmovilizacin ya que la existencia de uniones multipuntuales enzimasoporte, hacen que la estructura terciaria de la enzima adquiere una mayor rigidez y se haga ms resistente a la desactivacin trmica o qumica; la proteccin frente a las proteasas cuando se unen al soporte elimina su capacidad proteoltica, y evita su autlisis; se evita la agregacin intermolecular al mantener las molculas de enzima retenidas en una determinada regin del espacio y por ultimo la alteracin del microentorno ayuda a diferentes enzimas debida a la interaccin de la enzima con el soporte, es por ello , si una enzima sensible al oxgeno (como las nitrogenasas, hidrogenasas, etc.) se sita en la superficie de un soporte cargado, la fuerza inica efectiva en el microentorno de la enzima ser muy alta y, como consecuencia, la concentracin de oxgeno disuelto ser mucho menor en esa zona que en el medio de reaccin, en otros casos el soporte tiene un efecto tamponador de tal manera que mantiene el pH ptimo de la enzima en su microentorno, aunque en la disolucin se produzcan cambios importantes de pH. Por otra parte, en aquellas reacciones catalizadas por enzimas inmovilizadas en presencia de disolventes orgnicos, el agua ligada al soporte o su capacidad para retener agua, regula la actividad de la enzima, Cuanto mayor es el comportamiento hidrfilo del soporte, ms agua adsorbe y la enzima poseer la cantidad necesaria de agua en su microentorno para mantener su conformacin activa[3]. Tras una inmovilizacin, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso perderse por diversas razones; la unin al soporte se produce de tal forma que el paso del sustrato al centro activo est impedido, los grupos reactivos del soporte reaccionan con algn aminocido que forme parte del centro activo o que sea esencial para la actividad cataltica de la enzima, la inmovilizacin puede originar un cambio conformacional que da lugar a una forma inactiva o las condiciones experimentales del proceso causan la desnaturalizacin o desactivacin de la enzima[3]. Otros cambios que pueden originarse pueden ser debidos a efectos difusionales, electroestticos o de microentorno que originaran un aumento o disminucin de la actividad enzimtica. Los efectos difusionales se originan debido a la difusin de los sustratos hacia el centro activo de la enzima, los cuales pueden estar impedida por resistencias de tipo externo como la pelcula lquida estacionaria (capa de Nernst o de difusin) que rodea el soporte que origina un gradiente de concentracin a travs de la zona de difusin y resistencias de tipo interno ya que

los sustratos tienen que atravesar el interior del gel, microcpsula, fibra o poro del soporte donde se encuentra la enzima inmovilizada, esto ultimo se contrarresta en algunos casos disminuyendo el tamao del sistema biocataltico, aumentando la concentracin de sustrato, incrementando la agitacin o el flujo en el reactor[3]. Los efectos electrostticos entre el sustrato y el soporte, son importantes a tener en cuenta, de tal manera que, si tienen la misma carga existe una repulsin mutua, mientras que si las cargas son opuestas hay atraccin. El Impedimento estrico o de tamao de sustrato es otra de las variables importantes ya que en un principio, cualquier enzima puede ser inmovilizada sin que haya una prdida apreciable de su actividad, este hecho suele ser vlido en el caso de que el sustrato sea de bajo peso molecular, pero si se trata de sustratos con pesos moleculares elevados, la actividad de la enzima inmovilizada disminuye drsticamente. Este efecto estrico se puede evitar mediante una inmovilizacin covalente a travs de un brazo espaciador enzima-soporte ms largo[3]. Por ultimo los efectos en el microentorno tienen su efecto sobre la actividad enzimtica ya que la enzima inmovilizada se encuentra en un entorno diferente al habitual, especialmente cuando el soporte tiene grupos cargados elctricamente. El efecto observado suele ser un desplazamiento en el valor del pH ptimo de la catlisis enzimtica y, muchas veces, un ensanchamiento en el intervalo de pH en el cual la enzima puede actuar, es as como una enzima unida a un soporte cargado negativamente tendr en su microentorno una concentracin mayor de hidrogeniones que en el medio de reaccin. Como resultado, la enzima inmovilizada ser ms activa a un pH ms alcalino. La enzima sera ms activa a pH ms cidos si estuviera unida a un soporte cargado positivamente [3]. Como tal las enzimas pertenecen a diferentes clases, pero son las hidrolasas las que han sido utilizadas en mas de un 80 % de los proceso industriales que a su vez son el 42 % de los usos que se les dan a las enzimas, se destacan las proteasas, las isomerasas, carbohidratasas y lipasas que catalizan reacciones de hidrlisis y que actan sobre enlaces ester, peptdicos, ter y otros [5]. El estudio de lipasas ha sido de gran estudio y las tcnicas de inmovilizacin donde se usan polmeros hidroflicos han causado gran revolucin debido a sus innumerables aplicaciones de las cuales han sido objeto, dentro de ellas se encuentran: Sntesis orgnicas, aplicaciones farmacuticas, qumicas y biotecnolgicas. La microencapsulacin de enzimas es una tcnica que ha sido usada continuamente para la inmovilizacin, lo cual no solo se puede conjugar con el atrapamiento al interior del soporte, si no, que da facilidad para crear soportes en los cuales se puede atrapar exteriormente las enzimas conjugndolas con enlaces covalentes usando activantes de grupos reactivos determinados o mediante el uso de brazos espaciadores [58]. Al hablar de lipasas es de primordial importancia reconocer sus propiedades funcionales tales y como se mencionaron anteriormente, estas clases de enzimas

diferentes autores las han reportado como precursora de muchas sntesis a nivel orgnico y acuoso [45]. 2.3 LIPASAS EN REACCIONES

2.3.1 Clasificacin La clasificacin de enzimas segn la Enzyme Commission se basa en 4 dgitos que caracterizan las enzimas, para la triaciglicerol lipasa como comnmente es llamada las lipasas se asigno la clasificacin con numero 3.1.1.3 que pertenecen a la clase de hidrolasas y subclase de enlaces ester que catalizan reacciones de hidrlisis donde los triagliceroles se convierten en glicerol y cidos grasos libres:

(TRIGLICERIDO)

RCOOR + HOH RCOOH + ROH

(AGUA) (ACIDO GRASO)

(GLICEROL)

Su nombre sistmico corresponde a triaciglicerol acilhidrolasa [5] 2.3.2 Propiedades Las lipasas son catalizadores verstiles que se aplican dentro de un amplio rango de bioconversiones tales como hidrlisis, interesterifiacin, esterificacin, alcoholisis, acidolisis y aminolisis aplicndose en tecnologa de alimentos, aplicaciones biomdicas e industria qumica. Son de naturaleza amfifilica, es decir que se caracterizan por la presencia de una parte tanto hidroflica como hidrofbica en sus molculas (Figura 3); estas enzimas en una emulsin de aceite y agua, migran a la interfase en donde la parte de sus molculas hidrofbicas permanecen en contacto con la fase hidrofbica u oleosa y la parte hidroflica permanece en contacto con la fase acuosa (Figura 4).

Figura 3. Lipasa de naturaleza amfiflica (Fuente: [54])

(Fuente: [54]) Figura 4. Migracin de la lipasa a la interfase (Fuente: [54])

(Fuente: [54]). Las lipasas han sido estudiadas por muchos aos y se han producido de muchos microorganismos por el crecimiento va fermentativa. Son mucho mas abundantes en la flora microbiana comprendida entre bacterias y algunos hongos, adems de encontrarse en el pncreas de mamferos como cerdos y humanos y adems en plantas muy grandes del tipo Ricinus communis. Los principales microorganismos de los que se han producido son aspergillius, bacilus, cndida y Chromobacterium. Las lipasas se han utilizado en diferentes industrias tales como la de detergentes, por su capacidad para hidrolizar grasas; en la industria de alimentos en la cual las lipasas permiten alterar las propiedades de lpidos, jugos de frutas, en fermentacin vegetal y para el desarrollo de sabores de quesos; en la industria de pulpa y papel para remover el residuo hidrofbico de esta industria. Se utilizan adems en sntesis orgnica tal como en procesos de esterificacin y transesterificacin en la industria leo-qumica. En aplicaciones biomdicas ya que

poseen una excelente capacidad parar reacciones de regioselectividad especifica, en sntesis de agentes antitumorantes, alcaloides, antibiticos y vitaminas, en biosensores como diagnostico clnico. Tambin se usan en pesticidas, insecticidas, herbicidas y fungicidas[45]. Las reacciones tpicas en donde intervienen las lipasas corresponden a la hidrlisis del tipo de reaccin de triglicridos para formar glicerol y cidos libres, y la esterificacin de cidos y alcoholes para formar esteres; la reaccin de transesterificacin es tambin catalizada por las lipasas. 2.3.3 Reaccin de transesterificacin En la reaccin de transesterificacin un triglicrido y un alcohol forman un tri-ester y glicerol mediante uso de un catalizador. Es de importancia que en la reaccin haya cantidades limitadas de agua ya que se pueden presentar reacciones colaterales de formacin de jabn. [9]. 2.3.3.1 Produccin de biodiesel [9,37].

La nueva tendencia mundial apunta hacia la generacin de los denominados productos limpios con lo cual aparecen los biocombustibles basados en la transformacin de la biomasa, que, para el caso de la produccin de uno de los biocombustibles biolgicos mas importantes a nivel mundial como es el biodiesel corresponde a los aceites de origen animal o vegetal. La produccin de biodiesel se basa en la reaccin de transesterificacin de triglicridos. La idea de usar aceites y grasas de origen vegetal y animal no es algo nuevo. Desde 1900, cuando Rudolf Diesel hizo funcionar el prototipo de su motor diesel utilizando aceite de man, el concepto de usar aceites y grasas como una fuente renovable de combustibles ha sido reintroducido peridicamente. Pero la idea de usar un combustible biolgico se debe a los problemas que han generado los combustibles derivados del petrleo son muchos entre los que se encuentran las emisiones contaminantes. Actualmente la mayora de los procesos para producir Biodiesel son catalizados por bases. Se estudian tambin procesos catalizados por enzimas, siendo estas ltimas del tipo lipasas. Este ltimo proceso, las lipasas se usan como catalizador en la transesterificacin para la preparacin de monogliceridos. El proceso tiene diferentes ventajas, incluyendo la baja formacin de coproductos, la fcil separacin de los productos, las condiciones de reaccin moderadas y la formacin de esteres de cidos grasos como el segundo mayor producto.

Existen varias ventajas que conlleva el uso de lipasas como catalizador de la reaccin de transesterificacin. Entre ellas se encuentran la disminucin selectiva de las energas de activacin, la fcil recuperacin del glicerol formado, la mejora considerable de las velocidades de reaccin, la posibilidad de recirculacin del catalizador, la transesterificacin de triglicridos con un alto contenido de cidos grasos libres (insaturados), las bajas temperaturas de reaccin, los altos niveles de conversin a alquil steres, y la posibilidad de uso de alcoholes ramificados para la sntesis de steres con mejores propiedades de ignicin, entre otras. 2.4 ACTIVIDAD ENZIMATICA

Se define la unidad de actividad enzimtica (U) como la cantidad de enzima que cataliza la conversin de 1 mol de sustrato en un minuto. La actividad especfica es el nmero de unidades de enzima por miligramo de protena (U/mg prot) o por mililitro de disolucin (U/ml), en el caso de enzimas inmovilizadas diferentes autores reportan como (U/g-soporte). Cuando se usan enzimas en la industria, su actividad siempre debe ser expresada en una forma dada, y calculada en condiciones tales que se relacionen lo mas estrechamente posible con su aplicacin, en algunos casos es mas til expresar la actividad enzimtica en funcin de la velocidad de cambio de la velocidad u otro, en vez de en trminos mas convencionales como mol de producto formado por mg de enzima por segundo. Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha definido la unidad de actividad enzimtica como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato por segundo. Esta unidad se llama katal (kat). Como 1 mol son 106 moles y 1 minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal equivale a 60 x 106 U. Esta unidad es muy grande, de forma que se utilizan frecuentemente los submltiplos como el microkatal (kat, 10-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10-9 kat) [67]. Cuando se conoce el peso molecular de la enzima pura y el nmero de centros activos por molcula de enzima, las medidas de actividad enzimtica permiten calcular el nmero o frecuencia de recambio de la enzima, o sea, el nmero de reacciones elementales que realiza la enzima por cada centro activo y por unidad de tiempo.[67]. La actividad de las lipasas puede ser medida por diferentes mtodos entre los que se reportan la hidrlisis de aceite de oliva, p-Nitrofenil Palmitato medida por espectrofotometra o titulacin; adems puede usarse la esterificacin de cido butrico con diferentes alcoholes alifticos (C2 C10) y n-butanol con diferentes cidos carboxlicos (C2-C12) por los mismos mtodos [1,12, 15, 23, 24, 42].

2.5

SOPORTES DE INMOVIIZACION

Dentro de la tecnologa de la inmovilizacin y segn la sntesis biolgica que se desee realizar juegan un papel primordial, el soporte, la enzima y el mtodo de inmovilizacin. Al considerar un soporte para un enzima se deber pensar en factores tales como el pH, la temperatura, la fuerza inica, la presin, agitacin, la conjugacin de cofactores y el proceso de separacin del sustrato del producto [22]. Como se mencion anteriormente los soportes pueden variar de forma (lminas, tubos, cilindros, esferas), tamao, propiedades fsicas o qumicas, encontrndose una gran variedad de compuestos naturales o sintticos, orgnicos o inorgnicos clasificndose segn [3]: 9 Soportes inorgnicos: Naturales: (arcillas como la bentonita, piedra pmez, slice, etc.). Manufacturados: (xidos de metales y vidrio de tamao de poro controlado, vidrio no poroso, almina, cermicas, gel de slice, etc.) 9 Soportes orgnicos: Polmeros naturales: Polisacridos (celulosa, almidn, dextranos, agar-agar, agarosa, alginatos, quitina, quitosano, etc.); protenas fibrosas (colgeno, queratina, etc). Polmeros sintticos: Poliolefinas (como el poliestireno); polmeros acrlicos (poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.); Otros tipos (alcohol polivinlico, poliamidas, etc). Los polisacridos que se han utilizados como soportes varan desde micro esferas a lechos de alginato, dextrano, carrragenatos, agarosa, celulosa, quitosano, entre otros; todos ellos han sido utilizados con el fin de minimizar los problemas presentados en otras tcnicas de atrapamiento como: a) baja eficiencia b) uso de solventes orgnicos voltiles que contribuyen a problemas ambientales c) uso de solventes orgnicos que pueden alterar la estructura y funcionalidad de las protenas [67]. 2.5.1 Caractersticas de los soportes para inmovilizacin Aunque no existen soportes universales, hay algunos principios para su seleccin; dentro del proceso de aplicacin a gran escala se encuentran: (a) El material debe de estar disponible en abundancia y a un bajo precio, (b) el proceso de inmovilizacin tiene que ser simple y efectivo con la consideracin de retencin de

la actividad enzimtica, (c) la capacidad y eficiencia de las enzimas inmovilizadas tiene que ser alta y, (d) el diseo del reactor con respecto al mecanismo manejado del biocatalizador tiene que ser simple [11]. Adems de lo anterior un soporte ideal para una aplicacin dada es aquel que aumente la interaccin con el sustrato, disminuya la inhibicin por el producto, cambie el pH aparente ptimo hasta el valor deseado, frene el crecimiento microbiano y sea fcilmente recuperable para poder volverlo a utilizar . El soporte debe de ser estable en solucin y no debe de deteriorarse en las condiciones de reaccin, debe ser rgido mecnicamente y tener un grado de compactacin bajo en operaciones continuas a velocidades de flujo altas cuando se adapte a un diseo en reactores; en conclusin se deben de definir necesidades tcnicas y econmicas (costo, calidad, funcionalidad, y seguridad) para definir un buen catalizador en trminos de eficiencia e integracin del costo efectivo [10]. Muchos factores tienen influencia en la seleccin de un soporte particular. Los grupos hidroxilos del soporte juegan un papel muy importante ya que forman puentes de hidrgeno con las molculas de agua, por eso se crea un ambiente acuoso (hidroflico) con el soporte. Los soportes de polisacridos son susceptibles de desintegracin microbiana o fngica, y solventes orgnicos pueden causar un encogimiento del gel en los soportes usualmente utilizados para formar estos lechos [51]. Dentro de la manipulacin que se logra observar en el contexto enzima-soporte debern de manejarse caractersticas como algunos fenmenos de transporte (efectos de transferencia de masa), estabilidad operacional relacionada con el numero de ciclos si se hace referencia a un tanque agitado y un mtodo de inmovilizacin que se expresar en trminos de rendimiento; todo ello apuntando hacia unos datos de funcionamiento el cual se puede expresar como productividad (producto producido por unidad de enzima) o consumo de enzima por unidad de producto producido. Un resumen de los parmetros de importancia que se deben considerar en la inmovilizacin de enzimas se puede observar en la Tabla 3 [60].

Tabla 3. Parmetros caractersticos para analizar enzimas inmovilizadas CARACTERISTICAS PARMETROS DE IMPORTANCIA ENZIMA Propiedades bioqumicas: Masa molecular, grupos funcionales en superficie de protena, pureza. Parmetros cinticos: Actividad especfica, perfiles de pH y temperatura, parmetros cintico de actividad e inhibicin, Perfiles de estabilidad vs. pH y temperatura, solventes, contaminantes, impurezas.

SOPORTE

Caractersticas qumicas: bases qumicas y composicin, grupos funcionales, posibles cambios en su comportamiento, volumen accesibles de matriz, tamao de poro, estabilidad qumica del soporte. Propiedades mecnicas: dimetro particular, comportamiento de partculas a la compresin, resistencia al flujo, (para aplicaciones en lechos fijos), velocidad de sedimentacin (para lechos fluidizados), abrasin (para tanques agitados). Mtodo de inmovilizacin: Rendimiento de la enzima activa, atrapamiento de protena, parmetros cinticos intrnsicos, (Ej.: propiedades y efectos de transferencia de masa). Efectos de transferencia de masa: Diferentes concentraciones de soluto al interior y afuera de las partculas catalticas, difusin interna y externa (poros), con ello se obtiene la efectividad con relacin a la enzima libre, bajo condiciones de reaccin determinadas. Estabilidad: Estabilidad operacional (expresada como actividad que disminuye bajo ciertas Condiciones durante el proceso), estabilidad de almacenamiento. Rendimiento: Productividad (cantidad de producto formado por unidad de actividad o masa de enzima), consumo de la enzima(Ej.: unidades por Kg. de producto)

ENZIMA INMOVILIZADA

2.6

QUITOSANO COMO SOPORTE DE INMOVILIZACION

El quitosano esta siendo reportado para la inmovilizacin de enzimas, y en particular lipasas no solo porque su mtodo de obtencin como soporte es simple, y no toxico, sino porque brinda propiedades fsicas y qumicas de interaccin enzimas-soporte interesantes para llevar a cabo reacciones biolgicas con alto grado de eficiencia, actividad enzimtica y bajo costo [3].

El quitosano (Figura 5) es un amino polisacrido (1-4)-2-amino-2-deoxi--Dglucano obtenido por D-acetilacin alcalina de la quitina (Figura 6) (1-4)-2acetamido-2-deoxy--D-glucano, polisacrido duro, inelstico y nitrogenado que se encuentra en las paredes de algunos hongos y en el exoesqueleto de artrpodos tales como insectos, escarabajos y crustceos. La produccin mundial de quitina es calculada en 150.000 toneladas provenientes de la industria de la fermentacin que emplea hongos y el resto de la industria pesquera. El quitosano es producido por D-acetilacin de la quitina al someterla a una solucin de NaOH al 40% a 120 C por 1-3 horas, produciendo quitosano D-acetilado (Figura 7). [24]

Figura 5. Estructura qumica del quitosano

(Fuente: [35])

Figura 6. Estructura qumica de la quitina.

(Fuente [35]).

Figura 7. Formacin de quitosano a partir de quitina

(Quitina)

(Fuente: [35])

(Quitosano)

El quitosano es un biopolmero biodegradable, biocompatible y muco adhesivo, el cual juega papel importante como material en muchos propsitos en la industria farmacutica, medica, alimentara, de sntesis orgnica y biolgica [4,5]. Este soporte proporciona ventajas como: su versatilidad y disponibilidad en diferentes formas (hojuelas, lechos porosos, geles, fibras y membranas), posee baja biodegradabilidad, bajo costo, fcil manejo, alta afinidad con protenas y no toxicidad [6], adems presenta propiedades fsicas, qumicas y biolgicas muy particulares debido a sus iones catinicos. Esta carga positiva atrae todo elemento cercano que tenga iones de carga negativa. Esta condicin singular permite aplicarla en un extenso abanico de aplicaciones [45]. Dentro de las aplicaciones de la quitina y el quitosano se encuentran la formacin de fibras (sistemas amida-LiCl, oxido de amina-agua), cosmticos (cremas, lociones), fotografa, piel artificial (neoformacin de rganos), comida y nutricin, oftalmologa (lentes de contacto), ingeniera ambiental (captura de metales a partir de corrientes de agua), industria del papel, bateras, farmacutica (liberacin de drogas), hidrogeles tales como quitosanopolieter, poli (etilen glicol) macromero- quitosano, quitosano-gelatina, tabletas de quitosano (adicin de lactosa), microencapsulados y microesferas de quitosano-oxido de polietileno, quitosanoalginato de calcio, estimulacin celular de plantas y animales, agente antibacterial y como atrapador de grasa [35]. El quitosano es insoluble en agua y diversos solventes orgnicos, soluble en diferentes cidos como cido actico, frmico y otros, los cuales protonan los grupos amino. Produce reacciones tpicas de aminas como las N-acetilaciones por

reacciones de Schiff, sus derivados son fcilmente obtenidos bajo condiciones suaves y pueden ser considerados como sustitutos de glucanos. A temperatura ambiente el quitosano forma aldiminas y cetiminas con aldehdos y cetonas, respectivamente. El N-carboximetil quitosano es obtenido a partir de cido glioxilico [35]. La degradacin del quitosano esta inversamente relacionada con el grado de cristalinidad el cual es controlado principalmente por el grado de D-acetilacin , es de notar que una alta D-acetilacin exhibe una velocidad de degradacin mas pequea [35], adems es de notar que el quitosano con D-Ac bajo 40-60 % permanece en solucin arriba de pH cerca de 9. Entre las propiedades fsicas y qumicas de este heteropolimero se destacan su distribucin de pesos moleculares entre 50 kDa a 2000 kDa caracterizados por HPLC y diferentes grados de D-acetilacin (DDA) entre 40 y 98 %, el cual se puede caracterizar por FTIR, RMN o Cromatografa de permeacin en gel, entre otros [17]. Diferentes autores reportan el uso de quitosano para membranas de gel con propiedades que pueden ser controladas por el grado de entrecruzamiento con el glutaraldehido [7,40] y para la inmovilizacin de protenas [9]. Los hidrogeles de quitosano han sido reportados como adecuados para la inmovilizacin de lipasas por enlaces inicos intermoleculares estables [7,36, 40,42, 49, 58]. De la informacin recolectada inicialmente (tabla 1) que reporta una amplia bibliografa, por las propiedades y condiciones del quitosano segn la literatura antes mencionada y experiencias sobre ste mismo material en la Universidad Nacional sede Manizales de la carrera de Ingeniera Qumica [51] indican que el quitosano es un material adecuado como soporte de inmovilizacin para enzimas. La inmovilizacin de enzimas sobre soporte de quitosano es un proceso en el que se confina o localiza a la enzima en una regin definida del espacio, para dar lugar a formas insolubles que retienen su actividad cataltica y que pueden ser reutilizadas repetidamente. Con ste fin existen diversos mtodos que a lo largo de los aos se han utilizado y perfeccionado como los son entrecruzamiento (cross-linking) que se ha utilizado en inmovilizaciones de diversos tipos de lipasas para aplicaciones en medio no acuoso [39]. La adsorcin es comnmente utilizada por ser un procedimiento sencillo, teniendo como desventaja una unin dbil, por lo que en algunos casos se utiliza como complemento con otro mtodo [13]; la unin covalente de una enzima a un soporte como el quitosano es quiz el mtodo de inmovilizacin ms interesante desde el punto de vista industrial. La metodologa de la unin covalente se basa en la activacin de grupos qumicos del soporte para que reaccionen con nuclefilos de las protenas [12] (Figura 8). Otros mtodos de inmovilizacin que se reportan mencionan que los hidrogeles de quitosano son un medio eficiente de encapsulacin de protenas en forma esfricas y rugosas [1].

Figura 8. Proceso de inmovilizacin sobre quitosano.

(Fuente: [45]) Los diferentes soportes de inmovilizacin para llevar a cabo distintas reacciones pueden tener variadas presentaciones, tanto hmedas como secas, donde las segundas son principalmente utilizadas, donde los contenidos de humedad bajos son deseables para el almacenaje y la estabilidad reactiva [18]. Los mtodos de secado que se reportan van desde tcnicas convectivas en las cuales los soportes en hmedo se secan a temperatura ambiente durante un largo periodo de tiempo [32], o se someten a temperaturas superiores a 97 C mediante flujos de vapor [18], hasta tcnicas de criogelificacin y liofilizacin en las cuales se manejan temperaturas de congelacin; estas ltimas son tcnicas eficientes que no destruyen la estructura y evidencian una baja degradacin de lipasa [12], Otros estudios tambin confirman la utilizacin de criogeles en esferas de polivinil alcohol por el mtodo de congelacin-descongelacin en un sistema de dos fases. Por la porosidad de los criogeles los biocatalizadores de alto peso molecular pueden penetrar las esferas, mostrando as un incremento en la estabilidad trmica de la lipasa al usarse repetidamente en sntesis de steres [56]. 2.7 HIDROGELACION

Un hidrogel es definido como redes de macromolculas hinchadas en agua o fluidos biolgicos. Estos se subdividen en tres clases dependiendo de la naturaleza de la red: a) redes entrecruzadas entre si b) redes entrecruzadas covalentemente c) redes formadas por interacciones secundarias, para el caso de quitosano algunos autores dividen la clasificacin en hidrogeles qumicos formados por enlaces covalentes irreversibles como las hidrogeles de quitosano

entrecruzados covalentemente e hidrogeles fsicos formados por enlaces reversibles como el tipo de interacciones inicas [7]. Los hidrogeles de quitosano entrecruzados covalentemente se dividen en tres tipo s dependiendo de su estructura: a) entrecruzados entre si b) redes polimricas hbridas (HPN) c) Redes polimricas semi totalmente interpenetradas (IPN). Dentro de las tres subdivisiones el principio general se basa en interacciones por enlace covalente, pero adems se encuentran otras que no se pueden excluir como puentes de hidrogeno e interacciones hidrofbicas, el principio fsico de estos se basa en tener el quitosano y un entrecruzador en un solvente apropiado que usualmente es agua. Se pueden adicionar otros polmeros para formar HPN o IPN. Se pueden usar otras molculas auxiliares para catalizar o iniciar la reaccin durante la preparacin de la red. Los entrecruzadores ms importantes son dialdehdos como glyoxal y en particular, el glutaraldehido.[7] Los hidrogeles de quitosano entrecruzados ionicamente se basan en el hecho de formar una estructura reversible entre el quitosano, que es un polmero policationico, y compuestos cargados negativamente formndose una red a travs de enlaces inicos entre cadenas polimricas. Las interacciones hidrofbicas se favorecen al disminuir el grado de DD del quitosano o los enlaces de hidrogeno entre las cadenas debido a una repulsin electrosttica despus de la neutralizacin del quitosano con el entrecruzador [7]. En concordancia con lo anterior las dispersiones de quitosano pueden ser obtenidas en medio acuoso cido, el cual protona los grupos amino, el polmero se carga positivamente. En el caso de adicin de base fuerte (NaOH) a tal dispersin se superan las fuerzas asociativas entre cadenas. El quitosano permanece en solucin hasta cuando el pH llega a 6.2 (quitosano con DD bajo permanece en solucin por arriba de pH cerca de 9). Superado se valor, se empieza la formacin de un tipo de gel hidratado como precipitado, esta precipitacin o formacin de hidrogel es debido a la neutralizacin de los grupos amino del quitosano y una consecuente remocin de fuerza electrostticas repulsivas entre cadenas, lo cual permite agrupar por puentes de hidrogeno e interacciones hidrofbicas entre cadenas 2.8 CRIOGELIFICACION (crioconcentracin)

Los criogeles son matrices de geles formados como resultado de tratamientos criognicos (enfriamiento, almacenamiento en fro por un tiempo definido y posterior descongelamiento), los cuales son soportes eficientes para la inmovilizacin de biomolculas y clulas. Su estructura nica de criogeles, en combinacin con su estabilidad osmtica, qumica y mecnica, los hacen matrices atractivas para cromatografa de nanoparticulas biolgicas.

El uso de criogeles como matrices para la inmovilizacin de biopolmeros (enzimas, polisacridos y cidos nucleicos) implica en su produccin la produccin de macroporos que permiten una adecuado difusin del sustrato. Los supermacroporos en camas continuas, tales como las columnas de criogeles desarrollados para la separacin de biopartculas, son perfectamente adecuados para birreactores de flujo pistn [36].

3. MATERIALES Y METODOS 3.1 PRODUCCION DEL SOPORTE Uno de los objetivos del presente trabajo consiste en producir un soporte con caractersticas adecuadas para los sistemas reaccionantes (hidrlisis y esterificacin). 3.1.1 Materiales y reactivos Quitosano cido actico glacial Etanol Hidrxido de sodio Tripolifosfato 3.1.2 Equipos de anlisis y proceso 9 PH metro Schoot Handy Lab 1 9 Balanza analtica Kern (precisin 0.1 mg) 9 Congelador Icasa 9 Vidriera en general 9 Calibrador Digital Sigma grado reactivo Merck- Grado Reactivo Grado tcnico 96% Carlo Erba Grado reactivo Grado tcnico - Disproalquimicos

3.1.3 Procedimiento de gelificacin

Para producir los hidrogeles de quitosano se recurri a una tcnica modificada de la literatura [42] que utiliza como solucin gelificante hidrxido de sodio-etanol a un pH adecuado que brinde una fuerza inica para la formacin del hidrogel.

La dispersin de quitosano se evalu en tres concentraciones 1.8, 2.4, y 3 %(w/v) en solucin de 1%(v/v) de cido actico. Las diferentes geometras evaluadas fueron esferas, lminas y cilindros, los cuales se prepararan depositando la mezcla anterior en la solucin gelificante, dejndolas en este por un tiempo prudencial hasta que el gel sea formado por completo, posteriormente se remueven las geometras y se acondicionan adecuadamente neutralizando el hidrogel con agua destilada hasta pH neutro (anexo 1). Tambin se evalu la adicin de glutaraldehido a concentraciones de 0.003 y 0.1 % (w/w) en soluciones de quitosano. Las esferas se produjeron por extrusin del quitosano por una aguja de calibre 21 G (0.8 mm), produciendo una gota que al caer en la solucin gelificante form la geometra esperada. En el caso de las lminas se produjeron aadiendo el gel en una rejilla metlica. Despus de gelificacin se hicieron cortes a tamaos adecuados. Los cilindros se elaboraron al extrur la solucin por una boquilla de forma circular (4.5 mm) produciendose as unos cilindros continuos (fideos). Posterior a la gelificacin se cortaron a las dimensiones adecuadas (anexo 1) 3.1.4 Procedimiento de secado convectivo Despus de producir el soporte y neutralizarlo, las geometras de diferentes concentraciones se sometieron a temperatura ambiente por ms de 24 horas y se evalu las perdidas de peso, las variaciones de las dimensiones y las humedades de equilibrio. Las dimensiones se midieron con calibrador digital (anexo 2). 3.1.5 Procedimiento de secado por criogelificacin (crioconcentracin) El trmino se gener por el uso de procedimientos criognicos en el cual se expone el hidrogel a un almacenamiento en fro y posterior descongelamiento, proceso en el cual se elimina el agua y se concentra la estructura del biopolmero. El soporte se obtuvo por exposiciones sucesivas a -20C seguidas de descongelamiento a temperatura ambiente por ms de 24 horas (anexo 2). Evalundose las perdidas de peso, las variaciones de las dimensiones y las humedades de equilibrio. Las dimensiones se midieron con calibrador digital. 3.2 PROTOCOLO DE INMOVILIZACION La produccin del sistema biocataltico correspondi a la inmovilizacin de la lipasa por enlace covalente a un soporte de quitosano.

3.2.1 Materiales y reactivos Quitosano cido actico glacial Etanol Aceite de Oliva Glutaraldehido Tripolifosfato Trizma base Solucin Buffer de fosfato Iso-octano Lipasa XX Split- Candida rugosa Carlo Erba- Grado Reactivo Proenzimas. Sigma grado reactivo Merck Grado tcnico 96% Tipo comercial 0.4 acidez BASF grado tcnico 50.8 % Grado tcnico 95.5 % Sigma Aldrich- Grado reactivo

3.2.2 Enzima Utilizada

Se us la enzima ENZECO LIPASE XX distribuida por proenzimas y producida por Enzyme Development Corporation EDC, a partir del microorganismo de Candida rugosa, que segn especificaciones tcnicas puede hidrolizar el 90 % o mas de triglicridos en cidos grasos. Actividad nominal: 15.000 unidades de lipasa Forma: Slido con sal finamente pulverizada como diluyente y un contenido mnimo de lactosa como vehculo. Solubilidad: Completamente soluble en agua 3.2.3 Equipos de anlisis y proceso

9 Espectrofotmetro Perkin Elmer Lambda 20 (rango 200-1100nm) 9 Plancha magntica digital Schoot Gerate GMBH 9 PH metro Schoot Handy Lab 1 9 Balanza analtica Kern (precisin 0.1 mg) 9 Vidriera en general

9 Micropipeta 5-50 microlitros 3.2.4 Procedimiento de activacin Para la inmovilizacin de la lipasa en el soporte de quitosano se recurri a un enlace covalente establecido entre el glutaraldehido y los grupos amino del quitosano el cual es uno de los grupos funcionales presente sobre la superficie del soporte y un aminocido residual en la estructura enzimtica. Inicialmente se prepar la solucin acuosa de glutaraldehido (0.003; 0.01; 0.1 % w/w) en la cual se deposit el soporte por aproximadamente 1.5 horas bajo agitacin suave (400 rpm T = 25C). 3.2.5 Procedimiento de Inmovilizacin El soporte activado se lav con agua desionizada y se sumergi en la solucin enzimtica 0.5% (w/v) (disuelta en fosfato de sodio pH 7.3) a temperatura ambiente. La enzima inicialmente se diluy y se centrifug por 2h, obtenindose un sobrenadante rico en protena tonel cual se hicieron los ensayos. Posteriormente se realizaron dos lavados con fosfato de sodio a pH 7.3 por dos minutos cada uno, luego se lav con 0.1 M tris HCl pH 8 por 2 h para bloquear los grupos remanentes de CHO. Finalmente el biocatalizador es almacenado en fosfato de sodio Buffer a 4C (anexo 3). Las soluciones residua les de fosfato se reciclaron para anlisis de carga de protena. 3.2.6 Procedimiento de anlisis de protena Para medir la cantidad de enzima atrapada por el soporte se uso las soluciones residuales del proceso de inmovilizacin por enlace covalente a las cuales se les adicion el reactivo de Biuret [66] formando una coloracin violcea debido a la reaccin entre sales de cobre y el nitrgeno de la enzima, la solucin se analiz por espectrofotometra UV a 540 nm (anexo 4). 3.3 CARACTERIZACION DEL SOPORTE Y EL SISTEMA BIOCATALTICO Producir un soporte de inmovilizacin o un sistema biocataltico implica el anlisis de las caractersticas fsicas y/o qumicas. A partir de estas propiedades se

puede conocer la interrelacin que se genera entre el medio adyacente tal como las mezclas reaccionantes de hidrlisis y/o esterificacin y el soporte cataltico. 3.3.1 Materiales y reactivos Quitosano cido actico glacial Etanol Hidrxido de sodio Tripolifosfato Hexano Isooctano Glicerina Sigma grado reactivo Merck Grado tcnico 96% Carlo Erba Grado reactivo Grado tcnico - 95.5% Grado Reactivo Carlo Erba Grado Reactivo Carlo Erba Grado Reactivo

3.3.2 Equipos de anlisis y proceso 9 Espectrofotmetro FTIR 9 Microscopio de barrido por sonda (SPM) 9 Plancha magntica digital Schoot Gerate GMBH 9 PH metro Schoot Handy Lab 1 9 Balanza analtica Kern (precisin 0.1 mg) 9 Vidriera en general 3.3.3 Medida de grado de D- acetilacin El anlisis de espectroscopia de infrarrojo se bas en la relacin que existe entre los grupos hidroxilo y amida del quitosano (derivado N-desacetilado de la quitina) los cuales absorben energa a determinadas longitudes de onda. Para el anlisis del grado de acetilacin del quitosano se us el mtodo propuesto por Garca y Canella [20] en el cual se prepara la muestra a analizar en lminas transparentes. Estas se realizan con una solucin de quitosano de 1.8 % en una solucin al 2% de cido actico y se filtr. Se evapor el solvente a 45C durante aproximadamente 20h, luego se neutraliz las lminas por inmersin en solucin

acuosa de NaOH al 5% por 16h, y se retir el exceso de base con agua destilada. El otro mtodo de anlisis manipulado trabaj con quitosano en polvo (3 mg) mezclndolo con 2 g de KCl, para formar una pastilla. Muestras con adicin de glutaraldehido (0.003, 0.01 y 0.1% w/w) y enzima de 0.5 %w/v tambin fueron analizadas. Los espectros de infrarrojo se realizaron en un espectrofotmetro Perkin Elmer BX II, analizando en el rango entre 4000-400 cm-1), resolucin de 4 cm -1, intervalo de 2 cm-1 en modo de transmitancia /absorbancia. El grado de D-acetilacin se encuentra por A1650 %DD = 100 - Ec. (1) A / 1.33 *100 3450 3.3.4 Medida de resistencia Se determin por inmersin del soporte seco a las tres concentraciones del quitosano en agua destilada, dejndolo en una placa agitadora a altas y bajas revoluciones (1110 rpm - 500 rpm 250 rpm) por 10 h, se determin la prdida de peso del soporte residual en forma cualitativa comparando el soporte al inicio y al final del proceso. 3.3.5 Medida de solubilidad y degradabilidad Se estableci por inmersin del soporte en diferentes solventes orgnicos por 72 horas, al final se cualific la solubilidad y degradabilidad. Igualmente se evalu la solubilidad en las mezclas de reaccin de transesterificacin, hidrlisis y esterificacin. Los diferentes medios fueron: n-hexano, Isooctano, etanol, agua, cido oleico, cido actico glacial y acuoso, hidrxido de sodio y glicerina. 3.3.6 Medida del swelling (hinchamiento)

Se determin por inmersin del soporte de inmovilizacin en la mezcla de hidrlisis a 25C, analizando los pesos del soporte despus de tres das, el valor de swelling fue calculado a partir de[ 70]:

G=

Ws f (t ) Wd We

Ec. ( 2).

Donde Wd es el peso del soporte seco, Ws es el peso del soporte hinchado como funcin del tiempo y We corresponde al valor del peso del soporte hinchado en el equilibrio, los cambios del grado de swelling contra el tiempo fueron estudiados. 3.3.7 Procedimiento de medicin de rango de poro Se preparan lminas de quitosano que se asemejan a la morfologa externa del soporte bajo las mismas condiciones del aparte 3.1 con el fin de obtener superficies lo mas planas posibles (diferencias entre pico y valle no mas grande de 3 m). [16, 46, 47] El tamao de poro se cuantific, en forma aproximada por la tcnica de microscopa de fuerza atmica (AFM) en modo de contacto a condiciones normales de temperatura (25C) usando un microscopio de barrido por sonda Park Scientific Instrument, Moel Autoprobe CP, para analizar la topografa generada en el proceso de criogelificacin (Crioconcentracin) con cantilevers (ultralever) y con punta de nitruro de silicio de constante de resorte 0.25 N/m y con un escner de capacidad de traslacin x,y,z de 100x100x3 m,. Se obtuvieron datos cuantitativos tales como rugosidad media, poro medio, poros detectados y poros por rea cuadrada a partir del uso del software (Imagemetrology SPIP Versin 3.3.3.0, Nov 25 2004). Se consideran microporos si el tamao de poro corresponde a <1.4 nm, mesoporos si 1.4 nm <poro<50 nm y macroporos si se habla de >50 nm. 3.3.8 Medida de la actividad enzimtica del biocatalizador La actividad enzimtica del sistema biocataltico se realiz mediante el seguimiento de una reaccin tipo ya sea hidrlisis de aceite de oliva y/o esterificacin de cido oleico con n-butanol. 3.3.8.1 Hidrlisis

Para este caso se utiliz la hidrlisis del aceite de oliva con bajo grado de acidez de marca comercial. Se monitore la aparicin del cido oleico bajo agitacin a una temperatura de 40 C y pH 7. El mtodo a seguir tiene una exactitud aproximada y se encuentra en la referencia [59].

Se prepar la mezcla de reaccin (Emulsin de aceite de oliva en Isooctano y mezcla tampn de pH 7); se somete a agitacin a 40C por un tiempo de 30 minutos. Al final de la reaccin se titul con una solucin de hidrxido de sodio 0.05 N utilizando como indicador fenolftaleina al 1%. La hidrlisis se repiti sin lipasa, con lipasa libre y lipasa inmovilizada. Una unidad (U) de actividad enzimtica fue definida como la cantidad de enzima necesaria para producir 1 mol de cidos grasos libres por minuto bajo las condiciones de prueba (40C, pH 7.4, 150 rpm). 3.3.8.2 Esterificacin

La enzima se acondiciona al igual que en la reaccin de hidrlisis por un periodo de 1 hora. El sistema reaccionante consisti en una mezcla equimolar de cido oleico (0.1 M) con n-butanol (0.1M) bajo agitacin y a 40C durante 8 horas, tiempo durante el cual se titul para conocer el consumo del cido oleico (Mtodo AOCS Cd 3d-63). La esterificacin se repiti sin lipasa, con lipasa libre e inmovilizada. La actividad de la enzima fue calculada a partir de la pendiente de una grafica de desaparicin de cido oleico contra el tiempo y es definida como mol de cido oleico consumido/ hora. por mg de enzima inmovilizada. El solvente utilizado en el sistema es el Isooctano, el mtodo se reporta en [23, 27].

4. RESULTADOS Y DISCUSIONES 4.1 PRODUCCION DEL SOPORTE La produccin del soporte de inmovilizacin se llev a cabo usando tres concentraciones diferentes de quitosano (1.8, 2.4 y 3%w/v); experimentalmente se encontr un comportamiento reolgico diferente, proporcionando mayor viscosidad a mayor concentracin, a su vez se produjeron tres tipos de geometras (lminas, esferas y cilindros). El mtodo de inyeccin utilizado para producir esferas requiri soluciones menos viscosas para mejorar la forma (Figura 9) ya que a medida que se aument la concentracin se obstruy el paso de la solucin por la aguja utilizada modificando la morfologa y produccin de las mismas. Las lminas y los cilindros producidos necesitarn una solucin mucho ms firme y compacta de quitosano por lo que fueron utilizadas las soluciones de mayor concentracin (Figura 10 y 11) para darle la forma adecuada y estabilidad a estas geometras. Figura 9. Hidrogel de esferas de 1.8%

Figura 10. Hidrogel de Lminas de 3%

Figura 11. Hidrogel de cilindros de 3%

Para una mejor ilustracin de los resultados anteriores se recomienda al lector dirigirse a los anexos correspondientes (anexo 5), donde se comparan los hidrogeles producidos entre concentracin de quitosano y su geometra. Los hidrogeles producidos fueron sometidos a dos mtodos de secado en el cual sus longitudes caractersticas variaron con respecto a su longitud inicial; en el caso de esferas se analiz su dimetro efectivo promedio, para las lminas se analiz los tres lados y para el caso de los cilindros el dimetro y la longitud. Los resultados promedio de los dimetros inicial y final se muestran el las tablas 4 a 7. Tabla 4. Tamao Inicial y Final de esferas (Dimetro efectivo promedio). Esferas Mtodo de secado Dimetro Inicial (mm) % w/v 1.8
2.91 2.91

Dimetro Final (mm) % w/v 1.8

2.49 1.35

2.4
3.92 3.92

3
4.36 4.36

2.4
2.88 1.16

3
3.27 2.03

Criogelificacin Conveccin

Tabla 5. Tamao inicial de laminas (longitudes en cm) Laminas Mtodo de L1 secado Criogelificacin 9,10 9,83 Conveccin 1.8
L2 9,46 9,68 H 4,70 4,72

Longitud Inicial % w/v 2.4

L1 9,94 10,12 L2 10,25 9,97 H 7,84 7,59 L1 9,64 9,81

3
L2 10,02 10,06 H 8,26 8,21

Referido a la dimensin circular de la esfera. Las esferas quedaron con dos dimensiones caractersticas despus de secar por criogelificacin (crioconcentracin) , una de ellas (dimensin plana) se gener debido a que una porcin de su superficie reposa durante un tiempo prolongado sobre la superficie (caja de Petri).

Tabla 6. Tamao Final de laminas (longitudes en cm). Laminas 1.8 Mtodo de L1 L2 secado Criogelificacin 7,551 8,311 Conveccin 3,892 4,377
H 2,357 1,113

Longitud Final % w/v 2.4

L1 8,326 3,613 L2 8,398 3,800 H 4,877 2,059 L1 8,301 3,806

3
L2 8,316 4,075 H 6,053 2,977

Tabla 7. Tamao inicial y final de cilindros (Dimetro y longitud media) Cilindros Mtodo de secado
Criogelificacin Conveccin

Tamao Inicial (mm) 1.8 Diam. Lon.

3.28 3.28

Tamao Final (mm) 3 1.8

Lon. Diam Lon.

% W/V 2.4
Diam Lon. Diam

%W/V 2.4
Diam Lon. Diam

3
Lon.

4.93 4.53 5.66 4.58 5.66 1.95 4.51 2.85 4.01 3.11 4.93 4.53 5.66 4.58 5.66 1.12 2.53 1.31 2.32 1.57

4.58 2.49

La prdida de tamao se atribuy a la eliminacin de agua de los hidrogeles y esta prdida se compara entre los mtodos de secado con respecto a la disminucin de la longitud caracterstica, como se puede analizar para las tres geometras el mtodo de criogelificacin conserv mucho ms las dimensiones caractersticas que por el mtodo de secado por conveccin, lo cual no slo convierte el soporte en un material de forma regular sino que mejora su estructura interna volvindola porosa, siendo conveniente para los propsitos de ste trabajo. El porcentaje de prdida se calcul como la razn entre la diferencia de longitud inicial y final, y la dimensin inicial. Los resultados se muestran en las tablas 8 a 10 para las diferentes geometras. Tabla 8. Perdida de tamao para esferas (%). Geometra Mtodo de secado Esferas* 1.8% w/v
17.13 53.74

2.4%w/v
23.78 68.9

3%w/v
25.21 53.89

*Referido al dimetro efectivo promedio

Criogelificacin Conveccin

Tabla 9. Perdida de tamao para laminas (%).

Geometra Mtodo de secado Criogelificacin Conveccin Lminas* 1.8% w/v 49,85 76,41 2.4% w/v 37,76 72,87 3% w/v 26,77 63,73

*Referido a la altura promedio de la lamina. Tabla 10. Prdida de tamao para cilindros (%) Geometra Mtodo de secado 1.8% w/v Diam. Long.
40.55 65.85 8.51 48.68

Cilindros 2.4%w/v Diam. Long.

37.08 71.08 29.15 59.01

3%w/v Diam. Long

32.1 65.72 19.08 56

Criogelificacin Conveccin

Los porcentajes de prdida de tamao reflejan que el mtodo de secado convectivo disminuy en mayor proporcin las longitudes ms importantes de cada geometra que el mtodo de secado por criogelificacin (crioconcentracin). Al analizar cada geometra se encuentra que en el caso de las esferas un aumento de concentracin de quitosano aument la perdida de tamao para el caso de la criogelificacin (crioconcentracin). Las lminas presentaron una relacin contraria, a mayor porcentaje menor perdida de tamao para los dos mtodos de secado. El dimetro del los cilindros disminuy ms que su longitud sin tener en cuenta las concentraciones de quitosano y el mtodo de secado. La criogelificacin (crioconcentracin) conserv mejor la forma debido a que durante el enfriamiento se forman cristales de hielo que nuclean a partir de la solucin y crecen a lo largo de la direccin de los gradientes trmicos conservando la estructura, la lixiviacin del agua y la concentracin de la estructura del biopolmero se genera en el proceso de descongelamiento, el proceso de secado convectivo es un proceso de transferencia de masa con el medio, en el que el agua se evapora generando cambios en las estructuras y modificando la gelificacin inicial. El proceso combinado de criogelificacin (crioconcentracin) por 48h y posterior secado ambiente fue probado (Figura 12).

Figura 12. Proceso combinado de secado.

El proceso de secado adems de generar estructuras de tamaos diferentes produce perdidas de peso durante el proceso de secado y humedades diferentes a las iniciales. El porcentaje de prdida de peso se cuantific al cabo de 48 horas para el caso de criogelificacin (crioconcentracin) y de 5 das para el caso de secado convectivo (Tabla 11). Tabla 11. Porcentaje de prdida de peso debido al proceso de secado Geometra Mtodo de secado 1.8
92.3 94.1

Esferas % w/v 2.4

91.9 93.4

Lminas % w/v 3 1.8 2.4

79.50 96.75

Cilindros % w/v 3
61.87 94.51

1.8
94.7 96

2.4
88.4 95.6

3
87.6 92

Criogelificacin Conveccin

85.05 83.68 92.1 97.31

La prdida de peso posee una relacin entre las humedades y la concentracin de quitosano, una mayor perdida de peso se gener al disminuir la concentracin. Los mtodos de secado generaron una prdida de peso superior al 50% lo que sugiere una alta velocidad de eliminacin de masa con el medio al que esta expuesto el soporte (-20C y 25C). El proceso de criogelificacin (crioconcentracin) es dependiente de la geometra, las lminas que poseen un mayor volumen en comparacin con las otras geometras presentaron menor perdida de peso. Las humedades finales al cabo de 48 h para el mtodo de secado por criogelificacin (crioconcentracin) y 5 das para el convectivo se reportan como prdida por desecacin en estufa corriente [21] a 100C (tabla 12 a 14). Aunque no se reporta la temperatura de desnaturalizacin para este material se hicieron ensayos de los soportes a diferentes temperaturas (100C, 120C y 150). La

resistencia trmica del soporte se estim en 100C debido a que a temperaturas superiores cambi de color. Tabla 12. Humedad finales de esferas (%). Mtodo de secado % w/v 1.8
12.90 10.92

2.4
15 14.41

3
16 14.51

Criogelificacin Conveccin

Tabla 13. Humedad finales de Laminas (%) Mtodo de secado % w/v 1.8
80.8 12.05

2.4
82.3 8.67

3
86.125 7.87

Criogelificacin Conveccin

Tabla 14. Humedad finales de Cilindros (%) Mtodo de secado % w/v 1.8
38.76 17.39

2.4
66.45 10.9

3
79 10.19

Criogelificacin Conveccin

Nota: Las humedades de las tablas 12, 13 y 14 corresponden a las humedades finales de equilibrio correspondientes a cada procedimiento. Las lminas secas por criogelificacin (crioconcentracin) presentaron mayor humedad final con respecto a las dems geometras, puesto que tenan mucha mas agua en su estructura en comparacin con las esferas y cilindros. A iguales condiciones se retuvo en las tres geometras mayor cantidad de agua en el soporte seco por criogelificacin (crioconcentracin) al utilizar una mayor concentracin de quitosano. El mtodo de secado convectivo redujo en mayor proporcin el tamao de los pellets, generando un soporte compacto y de color amarillo con humedades inferiores al 15 % y actividades de agua de 0.4-0.45 a 25C en contraste con la criogelificacin (crioconcentracin) que al cabo de 48 horas genera un soporte con un tamao similar al inicial, de textura blanda y de color blanco con humedades que varan entre 15 % y 80% con actividades de agua entre 0.5-0.95. Se sugiere que el proceso de secado por criogelificacin (crioconcentracin) debe ser prolongado variando de 48 Horas a 5-6 das con periodos iguales de

congelamiento-descongelamiento. Los resultados anteriores se muestran en las figuras 13 a15. Figura 13. Esferas secas.

Figura 14. Laminas secas.

Hidrogel

Criogelificacin (Crioconcentracin)

Secado Convectivo

Figura 15. Cilindros secos.

Hidrogel

Criogelificacin (Crioconcentracin)

Secado Convectivo

Al variar el tiempo de exposicin de los soportes de 48 horas a 5-6 das por el mtodo de criogelificacin (crioconcentracin) se encontr que disminuyeron las humedades finales entre 10-20 %. Los resultados se muestran en la tabla 15. Tabla 15. Humedades finales al cabo de 5-6 das (%) Geometra
Lminas Cilindros

1.8
10-20 14.68

% w/v 2.4
10-20 20.38

3
10-20 17

Para una mejor ilustracin de los resultados anteriores se recomienda al lector dirigirse a los anexos correspondientes (anexo 6), donde se compara cada geometra a diferentes niveles de quitosano y mtodos de secado. El mtodo de secado convectivo conserv mucho mejor la forma del soporte con respecto al inicial, pero el tamao fu mejor conservado por criogelificacin (crioconcentracin). En el caso de las esferas secadas a -20C se destruy la forma debido a que los cristales de hielo generados deformaron las estructuras esfricas, para el caso de las lminas y cilindros no se deformaron. Los mtodos de secado probados generaron estructuras muy diferentes entre si; el propsito del secado es obtener un soporte seco con estructuras porosas para inmovilizar lipasas por enlace covalente. El mtodo de criogelificacin proporcion este tipo de soporte, por lo cual se eligi para reproducir soportes en la inmovilizacin de lipasas. Con el mtodo de secado convectivo se generaron estructuras fuertes de color amarillo que no demuestran a simple vista una porosidad adecuada para los propsitos de inmovilizacin. Es de gran importancia un soporte poroso con caractersticas fsicas apropiadas en reacciones donde la agitacin es un parmetro significativo al igual que los fenmenos de transferencia de masa. Las esferas producidas por criogelificacin sufrieron una deformacin resultando inapropiadas para la inmovilizacin, puesto que se requeran formas regulares del sistema biocataltico. Los catalizadores buscados deben de proveer un tamao y dimensiones caractersticas para promover una buena actividad cataltica, resistencia a la abrasin, disminucin de la cada de presin (reactores de flujo pistn) y una distribucin de masa en el sistema reaccionante (sistemas agitados). Las lminas tuvieron una estructura fuerte y un tamao ideal, pero en la agitacin sufrieron fragilidad tal y como se comprob en ensayos preliminares desprendindose fragmentos de quitosano y formndose superficies redondas en sus aristas, algunos autores reportan iguales resultados [18].

Los cilindros proporcionaron un soporte ideal, fueron fciles de reproducir, tuvieron forma regular de tal manera que para estudios posteriores como procesos de simulacin son de gran utilidad, fueron resistentes a la abrasin y fuertes en sistemas agitados. Los tamaos generados (dimetro de 2-3 mm y altura de 4-4.5 mm) son similares a los catalizadores convencionales tipo zeolita sintticas [63] (dimetro de 3 mm y altura de 5 mm) (figura 16); en el proceso de descongelamiento se generaron cavidades en su interior en forma de capas que pueden aportar condiciones favorables para la transferencia de masa de los sistemas reaccionantes (figura 17). Figura 16. Comparacin del soporte convencional con biolgico.

Quitosano

Zeolita

Figura 17. Soporte biolgico.

Los cilindros de quitosano a las tres concentraciones se les determinaron las humedades finales por el mtodo de Karl Fischer para verificar la exactitud del mtodo de secado por estufa (temperatura de 100C). La diferencia entre los

mtodos es de aproximadamente 5%, lo cual indica que la humedad eliminada por el secado en estufa se debe fundamentalmente a eliminacin de agua y no de otros compuestos. Para la elaboracin del soporte se ensayaron otras tcnicas de elaboracin que consistieron en hidrogelacin en fro, entrecruzamiento con glutaraldehido y gelificacin con Tripolifosfato (TPP) Los soportes por hidrogelacin en fro se generaron al congelar la solucin gelificante a -20C inmediatamente despus de introducir la solucin de quitosano en NaOH-etanol, el tratamiento de secado por criogelificacin (crioconcentracin) se realiz de igual forma. Los cilindros obtenidos poseen una estructura uniforme, una geometra de cilindro definida y un color blanco ms intenso (Figura 18). Figura 18. Soportes por hidrogelacin en fro

Los soportes por entrecruzamiento se generaron al adicionar 5 ml de glutaraldehido de concentracin (0.003 y 0.1%w/w) a una solucin de quitosano al 3%, la solucin estuvo en reposo por 30 minutos, segn algunos autores [33] al adicionar glutaraldehido se reduce el contenido de agua y consecuentemente el tamao de poro, modificando la superficie porosa. Los resultados cualitativos demostraron una estructura mucho mas firme al adicionar el glutaraldehido, ya que al adicionar un entrecruzador aument la rigidez y fragilidad del soporte. Los resultados de porosidad se muestran en el capitulo correspondiente a la caracterizacin del soporte (Numeral 4.3.5). Los soportes gelificados por Tripolifosfato implicaron el uso de una solucin inica distinta a la que se us (NaOH-EtOH), la tcnica reportada [42] implic la preparacin de una solucin de TPP en tris HCl a un pH de 7.2. Lminas y cilindros se probaron, generando estructuras que no gelificaron en su interior pero si en su exterior, adems el proceso de secado gener un soporte slido muy compacto y duro, pero arenoso, que no ofrece ninguna porosidad visual (Figura 19). Los hidrogeles de esferas generadas no presentaron estos problemas. El

uso de esta tcnica sugiere la inmovilizacin por retencin fsica bajo atrapamiento. Figura 19. Soporte producidos por uso de TPP (cilindros)

4.2 PROTOCOLO DE INMOVILIZACION 4.2.1 Carga enzimtica Como se mencion en el capitulo de produccin del soporte la geometra apropiada para la inmovilizacin correspondi a los cilindros secados por criogelificacin (crioconcentracin) los cuales se escogieron segn los argumentos mencionados anteriormente, el porcentaje de quitosano escogido fue de 3 % debido a que ofrece una estructura mas fuerte. Los porcentajes de dilucin (sal y lactosa) de la enzima XX Split proveda por proenzimas no son reportados, para el caso. Se realiz un anlisis de protena para la enzima adquirida, por el mtodo de Kjeldah (Nitrgeno Total) y el mtodo del cido Bisinconlico (mtodo colorimtrico), los resultados se reportan en la tabla 15. Tabla 16. Anlisis de protena. Anlisis Kjeldah (Nitrgeno Total) Mtodo Colorimetrico % protena 1.2 2.15

La enzima se centrifug para eliminar la mayor parte de la sal en la que se encontraba, eliminar residuos insolubles.

Para conocer la carga de protena en los soportes de quitosano se elabor una curva patrn siguiendo el mtodo colorimtrico de Biuret (anexo 4). Los resultados se muestran en la Tabla 16. Tabla 17. Curva patrn Longitud de Onda (nm) Concentracin (mg/L) 0 0.1 0.25 0.5 0.75 1.0 Absorbancia 0 0.0347 0.1253 0.2289 0.3508 0.4486

550

La curva de concentracin contra absorbancia es C = 5.6360e-2+3.9561e-2*A con R2= 0.9967. Tres concentraciones de glutaraldehido como activador del quitosano fueron probados para determinar la mayor carga de protena inicial por unidad de soporte dando los siguientes resultados. Tabla 18. Carga de protena Concentracin de Cantidad de protena* cargada glutaraldehido inicialmente %w/w (mg/g quitosano**) 0,003% 6.8935 0,01% 5.4573 0,10% 4.6065 * Valores iniciales de carga sin restar los lavados del soporte. **Soporte de Quitosano con humedad de equilibrio entre 15-20% Para el trabajo dentro del laboratorio se escogi la activacin con GA de concentracin de 0.003%, ya que gener una mayor cantidad de enzima cargada, adems se sugiri el trabajo con la misma debido a que resultados similares (ptimo de baja concentracin) fueron reportados por otros autores [58]. El tiempo de contacto inicialmente sugerido correspondi a 1 hora entre el soporte y la enzima, tiempo que no gener carga final de protena ya que toda la enzima cargada se perdi en los lavados. Un aumento del tiempo de contacto gener mejores resultados (Tabla 18) para que la enzima se uniera covalentemente al soporte. Se us una solucin buffer para conseguir una estabilidad adecuada de la enzima (estable entre pH de 4.0 a 7.5).

Tabla 19. tiempos de carga de enzima Cantidad de proteina* cargada finalmente (mg/g quitosano)* 0 0.951 1.057

Tiempo (h) 1 5 15 *g quitosano reportados en base seca

Un aumento del tiempo de contacto aument la carga de protena dentro del proceso de inmovilizacin. El proceso de inmovilizacin sugerido al utilizar la lipasa XX Split del microorganismo Candida rugosa y cilindros de quitosano seco por criogelificacin (crioconcentracin) es como sigue: 1. Tomar una cantidad de quitosano seco (3g) producido por los mtodos anteriormente mencionados. 2. Sumergir en 50 ml de solucin de glutaraldehido (0.003%) hasta que cubran totalmente los soportes. Agitar a una velocidad de 400 rpm por 1.5 h. 3. Filtrar la solucin anterior con un papel de filtro de poro grande y lavar con abundante agua desionizada. Retirar el exceso de humedad con papel absorbente. 4. Acondicionar la enzima en solucin buffer para obtener una solucin concentrada de enzima. En el caso de la enzima XX Split se diluy la enzima en una relacin enzima solvente (Na- Fosfato Buffer) de 3:5 y se agita por 10 minutos hasta solubilizar la mayor cantidad de sustrato, se centrifuga por dos horas a altas revoluciones y se retira la solucin sobrenadante, esta solucin se centrifuga nuevamente por 30 minutos hasta obtener una solucin transparente. 5. Sumergir los cilindros del paso 3 en 50 ml de la solucin enzimtica o ms hasta que los cilindros queden completamente cubiertos. Agitar a 400 rpm por 16 horas. 6. Hacer pasar la solucin por un papel de filtro de poro grande y almacenar la solucin residual para anlisis de protena.

7. Lavar dos veces los soportes con 50 ml de fosfato de sodio buffer o con igual volumen de enzima utilizada por 5 minutos y filtre. Almacene la solucin residual para anlisis de protena. 8. Sumerja los soportes en solucin de tris Hcl pH 8 y deje en reposo por 2 horas. 9. Lave los soporte con solucin de Na-fosfato buffer y djelos en esta para almacenarlos. Refrigere a 4C. Para una mejor ilustracin se muestra en un diagrama el procedimiento de inmovilizacin por enlace covalente sugerido (anexo 3). 4.3 CARACTERIZACION DEL SOPORTE Y EL SISTEMA BIOCATALTICO 4.3.1 Grado de D- acetilacin El grado de D-acetilacin del quitosano con el que se construyen los sistemas biocatalticos indica algunas propiedades del soporte tales como: biodegradabilidad, caractersticas de formacin del gel y posibles tratamientos anteriores del quitosano. Un alto grado de D-acetilacin es favorable al entrecruzamiento ya que necesita principalmente unidades reactivas desacetiladas [33]. Figura 20. Espectros de quitosano puro

El espectro en modo de absorbancia se realiz a una muestra de quitosano puro (hojuelas en bruto), muestra que fue macerada y pulverizada. La zona de identificacin de grupos funcionales ubicada entre 4000-1600 cm-1 en la cual se observan los grupos hidroxilo, el enlace caracterstico del quitosano; con un pico a 3415.65 cm-1, y con una absorbancia de 0.99. La absorbancia de otros grupos como los alargamientos y tensiones del grupo N-H que aparecen en la zona caracterstica del hidroxilo no se observan debido a lo ancho del pico del hidroxilo. El segundo grupo caracterstico del quitosano parcialmente desacetilado es la amida I que se presenta entre 1620 - 1700 cm-1, este grupo se muestra en el espectro a un pico en 1651.91 cm-1 con una absorbancia de 0.41. Figura 21. Espectros de quitosano al 1.8% por lmina.

La interaccin entre el cido y el quitosano en el momento de elaboracin de la lmina para el anlisis form un acetato de quitosano [43, 48], esta reaccin aporta un cambio de los picos de los grupos funcionales tal y como se observ en el espectro. Los grupos caractersticos como son el grupo hidroxilo y amida I se encontraron a 3302.94 cm-1 y 1652.42 cm-1 respectivamente, la presencia de enlaces N-H propios a 1590cm-1 que en ste caso se observ en un pico de 1588.20, se debi al grupo amina caracterstico del quitosano ya que este es proveniente de la quitina y se diferencian en stos grupos.

El anlisis del espectro de quitosano fue contrapuesto con el espectro de quitina; la comparacin hecha por el equipo es adecuada debido a que el quitosano proviene de la quitina. Se evalu el grado de D-acetilacin del quitosano con las dos tcnicas mencionadas, encontrando que por el mtodo de preparacin de muestra con lmina se presenta un % de D-acetilacin ( ecuacin 1) de 53% y utilizando el mtodo de pastilla con KCl es 68.86% (N-acetilacin de 31.14%) (Tabla 19). El valor reportado por el proveedor (Sigma Aldrich) correspondi a un grado de Dacetilacin superior al 75%, la diferencia encontrada supone la influencia de la molcula de agua que afect en algn nivel los espectros, enmascarando los grupos hidroxilo y amida; la muestra no tuvo ningn tratamiento de secado riguroso para el posterior anlisis. El grado de D-acetilacin del quitosano utilizado tuvo un valor alto que supone que el soporte producido tendr velocidades de degradacin bajas y ser favorable al entrecruzamiento con glutaraldehido ya que presenta una buena proporcin de unidades reactivas desacetiladas. Se sugiere el uso de espectroscopia Raman para evitar la interferencia del agua, en caso contrario el uso de FTIR sugiere que la muestra deber de ser tratada eliminando el agua presente. El mtodo de produccin de muestras por pastillas de KCl sugiere un procedimiento con menor contaminacin de la muestra y menor tratamiento fsico que interfieran en el proceso de anlisis ya que el producto es tomado en bruto. Tabla 20. Resultados de N-Ac y D-Ac Tcnica
Lamina Pastilla

A (1650)
1651.63 1680.88

valor
0.62 0.41

A (3450)
3336.54 3414.65

valor
0.99 0.99

N-Ac
0.47 0.31

D-Ac
0.53 0.69

Tabla 21. Resultados de absorbancia de grupos hidroxilo y amida. Tcnica

Lamina Lamina Lamina Lamina Pastilla Pastilla

Quitosano
1.8 % 1.8 % 1.8 % 1.8 % 1.8 % 1.8 %

Caracterstica Glutaraldehido
0.003 % W/W 0.003 % W/W 0.01 % W/W 0.01 % W/W 0.1 % W/W 0.1 % W/W

0.5 % p/v 0.5 % p/v 0.5 % p/v -

Enzima

A (~1650)
0.6 0.53 0.58 0.48 0.44 0.40

A (~3450)
0.99 0.98 0.98 1 1 1

Un aumento del contenido de glutaraldehido y de enzima afect la absorbancia de los grupos amida I (~1650) (tabla 20), una alta concentracin de glutaraldehido (0.1%) mostr un cambio en el pico del grupo amina, de un pico notorio a un hombro caracterstico debido a la interaccin entre el glutaraldehido y los grupos amino disponibles del quitosano (anexo 7). Los espectros de FTIR (anexos 7) con diferentes concentraciones de glutaraldehido muestran los grupos propios del quitosano sin sufrir una deformacin pronunciada, tales como: Grupos hidroxilo -OH (3450-3200) Grupos amida I (1700-1620) en la regin de huellas digitales Grupos amino -NH2 (~1590) Enlaces glucosidicos -C-O-C (~1150) Estiramiento y alargamientos de C-H (2900 -2700) Estos grupos vararon en poca proporcin al igual que en su absorbancia, los cambios generados en los espectros hacia la derecha se deben a la interaccin entre el quitosano y parte de los componentes que se aaden, as como la influencia de la concentracin de los mismos. En el espectro de la lipasa se ven las bandas caractersticas del hidroxilo (34503200 cm-1), los grupos carbonilos a 1645.85 cm-1 y enlaces glucosidicos a 1153.32 cm-1 (Anexo 9). 4.3.2 Resistencia Se determin una resistencia observada a la inmersin del soporte en agua destilada (100 ml) con agitacin. Adicionalmente las muestras se pesan para encontrar si existen prdidas de peso muy considerables. Cinco muestras del soporte seco fueron sumergidas, encontrndose lo siguientes resultados. Tabla 22. Resistencia del soporte de inmovilizacin Revoluciones (rpm) 1100 500 250 1.8 % resistente resistente resistente 2.4 % resistente resistente resistente 3% resistente resistente resistente

El soporte fu resistente a altas agitaciones ya que conserv todo su peso original, inicialmente se someti a un hinchamiento por un da y posterior agitacin, tambin a una agitacin directa sin hinchamiento previo, en los dos casos se

produjo un aumento del peso debido a la absorcin del agua, no se observ ningn desprendimiento de partculas. La utilizacin de este soporte en sistemas altamente agitados es favorable, se piensa que el soporte ayudar a aumentar la transferencia de masa y por consiguiente mejorar la reaccin. 4.3.3 Solubilidad y degradabilidad La quitina es un polisacrido altamente hidrofbico, insoluble en agua y en diferentes solventes orgnicos, el quitosano es el producto D-acetilado de la quitina es soluble en cidos diluidos tales como cido actico y frmico [35]. Tres cilindros secos de quitosano con glutaraldehido fueron sumergidos sin agitacin en diferentes solventes por un tiempo de 3 das observando cualitativamente su comportamiento. Los resultados se observan en la tabla 22. Tabla 23. Solubilidad en diferentes solventes Pruebas: Mezcla de reaccin de transesterificacin Mezcla de reaccin de hidrlisis Mezcla de reaccin de esterificacin Hexano solubilidad Insoluble Insoluble Insoluble Insoluble Hinchamiento No Si No No Si No No Si h se disolvi

cido actico glacial* soluble cido actico acuoso soluble Hidrxido de sodio acuoso Insoluble Glicerina Insoluble Isooctano Insoluble Agua Insoluble * A un tiempo de 24h se disolvi parcialmente, al cabo de48 totalmente.

El soporte cataltico es soluble en soluciones de cido actico e insoluble en los dems solventes. El soporte present un hinchamiento al sumergirlo en soluciones acuosas, comprobndose el estado hidroflico del soporte al absorber molculas de agua. La utilizacin del soporte en sistemas reaccionantes es favorable debido a su insolubilidad en mezclas tipo hidrlisis, esterificacin y transesterificacin lo cual es conveniente para esta clase de sistemas biocatalticos.

4.3.4 Swelling El swelling o hinchamiento es en un aumento del tamao de la malla de la red polimrica [70]. Cuatro muestras fueron sumergidas en la mezcla de reaccionante de hidrlisis a 25 C, el proceso de swelling se analiz durante 4 das encontrndose un aumento del peso contra el tiempo (Figura 22). Figura 22. Hinchamiento de muestras en hidrlisis a 25C
0,03
Peso de la muestra (gr)

0,025 0,02 0,015 0,01 0,005 0 20 40 60

Tiempo (h)

Hidrlisis 1 Hidrlisis1 Hidrlisis2 Hidrlisis2

80

100

120

Se tom un promedio de las cuatro muestras de quitosano, encontrndose un factor de swelling a cada tiempo Figura 23. Figura 23. Swelling a cada intervalo de tiempo
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 20 40 60
Tiempo (h)

G (%)

80

100

120

El grado de hinchamiento para los cilindros a concentracin de 3% de quitosano fue considerable, encontrndose que el soporte se hinch en un 77,16 % al cabo de 96 horas en la reaccin de hidrlisis bajo agitacin a 25 C.

4.3.5

Medicin de rango de poro

La morfologa observada para las tres concentraciones de quitosano secadas por criogelificacin (crioconcentracin) cualitativamente fue distinta (Figura 24 a 26). Las micrografas tomadas a las pelculas de quitosano corresponden a un tamao de 5m, y se muestran en escala de grises. Las zonas mas oscuras corresponden a superficies ms profundas, donde se encuentran los poros formados. Algunos perfiles lineales de las micrografas se observan en el grafico de la derecha. Figura 24. Concentracin de quitosano de 1.8 %

Figura 25. Concentracin de quitosano de 2.4 %

Figura 26. Concentracin de quitosano de 3 %

Las rugosidades reportadas para las anteriores micrografas correspondieron a valores medios entre 229 y 308 nm (tabla 23). Se puede tener una relacin entre la concentracin de quitosano y la rugosidad; la estructura de concentracin de quitosano de 1.8 % corresponde a una estructura mas rugosa y una de 3 % a una superficie menos rugosa. La rugosidad media muestra que el aumento de la concentracin de quitosano gener superficies ms homogneas en la cual el tamao de los poros muestran una tendencia a disminuir cuando se aumenta la concentracin, dicha relacin concuerda con la teora. Tabla 24. Rugosidad Media. 1.8 % 308 Rugosidad Media (nm) 2.4 % 245 3% 229

Los poros hallados en promedio correspondieron a valores entre 0.226 y 0.195 m (226 y 195 nm) lo cual supone macroporos dentro de las estructuras analizadas (tabla 24), el tamao de micro y mesoporos que puedan existir dentro de la superficie del soporte deber de ser analizada por estudios de porosimetra. Tabla 25. Porosidad media. Concentracin Poro medio Desviacin (%) (nm) estndar 1.8 195 805 2.4 149 535 3 226 560 Poros detectados 37 95 81 Poros/m2 1.48 3.80 3.24

Para una mejor visualizacin de la morfologa superficial, algunos perfiles lineales mostrados por el software del equipo se muestran como anexos (Anexo 9).

Entre las modificaciones que se realizaron en la produccin del soporte se halla la adicin de un entrecruzador como lo es el glutaraldehido que disminuy el contenido de agua en la pelcula y consecuentemente el tamao de poro y modific la superficie porosa, otros autores reportan iguales resultados [33], la figuras 27 y 28 muestran los resultados de la morfologa obtenida al adicionar el glutaraldehido en las dos concentraciones (0.003% - 0.1%) en una relacin (25:5 en volumen) de quitosano glutaraldehido. Figura 27. Micrografa de Quitosano con Glutaraldehido de 0.003 %

Figura 28. Micrografa de quitosano con Glutaraldehido de 0.1 %

Al aumentar el contenido de glutaraldehido la rugosidad del soporte se ve afectada disminuyendo de un valor de 410 nm (Figura 27) a un valor de 180 nm (Figura 28. ) lo cual supone un cambio en la morfologa de las superficies, debido al efecto del entrecruzador, formando estructuras mucho mas fuertes y uniformes al aumentar la concentracin de glutaraldehido. El tamao de los poros reportados fueron del orden de 471 1834 y 367756 respectivamente. El aumento de la concentracin de GA mostr una relacin con la disminucin de la rugosidad y el tamao de poro, generando estructuras mucho mas uniformes.

4.3.6 Actividad enzimtica del biocatalizador 4.3.6.1 Hidrlisis

La actividad del biocatalizador se determin en la reaccin de hidrlisis de aceite de oliva; se realizaron tres ensayos de la reaccin: 1) Reaccin sin lipasa (blanco), con el fin de verificar si la reaccin es espontnea bajo las condiciones de ensayo 2) Reaccin con lipasa libre y 3) Reaccin con lipasa inmovilizada. El mtodo de seguimiento se llev a cabo por 30 minutos, titulando los cidos grasos libres generados (como cido oleico) con fenoftalena al 1 % (tabla 25). Tabla 26. Gramos de cido oleico producido con el tiempo Acido oleico (gr) Acido oleico(gr) Acido oleico (gr) Tiempo (lipasa inmovilizada) (lipasa libre) (rxn sla) 0 0,0113 0,0113 0,0113 10 0,041 0,0141 0,0113 20 0,0424 0,01695 0,0113 30 0,0466 0,028 0,0113 Figura 29. Hidrlisis del aceite de oliva (produccin del cido oleico).

0,05 0,04
Acido oleico (gr)

0,03 0,02 0,01 0 0 10 20

Tiempo (min)

Lipasa inmovilizada lipasa libre sin lipasa

30

40

La reaccin de hidrlisis no se llev a cabo espontneamente durante un tiempo de 30 minutos, es decir que cualquier cambio se atribuye a la accin de la enzima (Figura 29). La produccin de cido oleico (cido graso monoinsaturado que se encuentra en mayor proporcin en el aceite de oliva [44, 59]) con lipasa inmovilizada es mayor que la producida por la Candida rugosa en estado nativo

despus de los 30 minutos de la reaccin, se observ una produccin ms rpida del cido en los primeros minutos de la reaccin; El uso de lipasas inmovilizadas aument la velocidad de reaccin para la hidrlisis bajo las condiciones de ensayo (40C y 400 rpm) resultados similares fueron encontrados por Shao y Weng [12]. El comportamiento de la actividad cataltica muestra la relacin entre la cantidad de sustrato producido (mol) y la cantidad de enzima presente (tabla 26). Tabla 27. Actividad del biocatalizador en Hidrlisis TIEMPO (h) 0 10 20 30 Actividad (L. Inmovilizada) Actividad (L.libre) U/mg enzima U/mg enzima 0 0 14,79 12,5 7,75 12,5 5,87 25

Figura 30. Actividad de Candida rugosa en la reaccin de hidrlisis.

30 25
ACTIVIDAD (U/mg)

20 15 10 5 0 0 10 20
TIEMPO (min)

Lipasa inmovilizada Lipasa libre

30

40

El comportamiento para cada enzima fue diferente; la enzima inmovilizada present un mximo de 14.79U/mg de enzima a los 10 minutos de reaccin, siendo 1.2 veces mayor que la libre para este perodo, al cabo de los 30 minutos se present una prdida de actividad del sistema biocataltico. El comportamiento presentado es posible que se deba al proceso de hinchamiento que se gener en la reaccin de hidrlisis, presentando una subsiguiente lixiviacin enzimtica lo cual gener a su vez una disminucin de la actividad. Se sugiere que un hinchamiento previo en el sistema reaccionante debe ser realizado antes del proceso de inmovilizacin.

4.3.6.2 Esterificacin
La reaccin de esterificacin se llev a cabo por titulacin de los cidos grasos libres que desaparecen y siguiendo el mtodo sealado en [23, 27], dentro de un lapso de 8 horas, el procedimiento al igual que la hidrlisis se monitore por titulacin en las reacciones sin lipasa, con lipasa libre y lipasa inmovilizada. Los resultados de cido oleico que reaccion a travs del tiempo se pueden ver en la tabla 27. Tabla 28. Gramos de cido oleico en el tiempo Tiempo Acido oleico (gr (h) (rxn espontanea) 0,254 0 0,254 2h 0,251 4h 0,250 6h 0,247 8h cido Oleico (lipasa libre)) 0,254 0,254 0,252 0,250 0,244 Acido oleico (gr) (lipasa inmovilizada) 0,254 0,254 0,245 0,236 0,229

Figura 31. Esterificacin del cido oleico y n-butanol

Rxn espontanea Lipasa libre Lipasa inmovilizada

0,260 0,250 0,240 0,230 0,220 0 2 4 6

Acido olico (gr)

10

Tiempo (h)

Las enzimas inmovilizadas generaron una mayor contribucin a la reaccin de esterificacin en el que el cido oleico desaparece. El proceso de esterificacin sin catalizador se llev a cabo espontneamente bajo las condiciones de ensayo (40 y 400 rpm). La lipasa inmovilizada produjo una mayor reaccin del cido oleico que la reaccin sin catalizador al cabo de 8 horas, obtenindose una mayor conversin del ester.

Tabla 29. Actividad del biocatalizador en Esterificacin TIEMPO (h) 0 2 4 6 8 Actividad (L. Inmovilizada) Actividad (L.libre) U/mg enzima U/mg enzima 0 0 0 0 6.89 3.86 9.22 5.04 9.69 9.6

Figura 32. Actividad de Cndida rugosa en la reaccin de Esterificacin.

12 10
Actividad (U/mg)

8 6 4 2 0 0 2 4
Tiempo (h) LIBRE INMOVILIZADA

10

La actividad enzimtica del biocatalizador es 1.83 veces mayor que la actividad presentada por la enzima libre al cabo de 6 horas bajo las condiciones de ensayo. El biocatalizador y la enzima libre se encuentran cercanos al cabo de 8 horas, la enzima inmovilizada aument la velocidad de reaccin en la esterificacin de cido oleico y n-butanol bajo las condiciones de ensayo. El sistema biocataltico producido fue eficiente y activo para reacciones de hidrlisis y esterificacin, tal y como fue planteado en la hiptesis de la propuesta. Se cree que las condiciones favorables obtenidas por parte del sistema biocataltico fueron debidos a las siguientes propiedades del soporte: (i) El tratamiento del soporte con glutaraldehido (activacin) gener la introduccin de grupos reactivos CHO entrecruzando la matriz, aportando grupos reactivos para el enlace y estabilizando la estructura del gel (el soporte no se encogi significativamente en solventes como isooctano). (ii) El soporte sirve como una reserva de molculas de agua, por lo que la adicin de agua no fue requerida para ser introducida dentro del sistema reaccionante.

(iii) Los soportes (cilindros) producidos pueden ser usados dentro del sistema reaccionante hasta con agitacin intensa sin dao de su estructura. El soporte producido muestra una favorable tendencia a ser utilizado en procesos continuos, como reactores PFR. Ensayos de reutilizacin del soporte bajo condiciones continuas fueron probados para contrastar los resultados encontrados (Figura 33 y 34). Figura 33. Reutilizacin del biocatalizador (actividad) en hidrlisis
7 6 5
Actividad (U/mg)

4 3 2 1 0 0 2 4
Nmero de reciclos

Figura 34. Reutilizacin del biocatalizador (porcentaje) en hidrlisis

120
Porcentaje de actividad

100 80 60 40 20 0 0 2 4
Nmero de reciclos

El valor de actividad del biocatalizador se pierde con el tiempo de almacenamiento y la reutilizacin. El sistema biocataltico se reciclo ocho das despus de participar por primera vez en la reaccin de hidrlisis las figuras 33 y 34 se encuentran influenciadas por el almacenamiento y al mismo tiempo por el nmero de reciclos. Los primeros reciclos disminuyeron en mayor proporcin la actividad (ms del 50%), despus del cuarto reciclo la enzima no mostr ninguna actividad. La influencia del tiempo de almacenamiento fue notoria en el primer reciclo. Se cree que el factor que influenci la perdida de actividad fue debido al hinchamiento del soporte que pudo generarse en la reaccin de hidrlisis y una subsecuente lixiviacin as como tambin una posible desactivacin enzimtica. Los resultados de prdida de actividad con el nmero de reciclos y el swelling fueron reportados por Shao y Wen [12].

5. CONCLUSIONES El mtodo de secado convectivo redujo en mayor proporcin el tamao de los pellets, generando un soporte compacto y de color amarillo con humedades inferiores al 15 % y actividades de agua de 0.4-0.45 a 25C. La criogelificacin (crioconcentracin) gener un soporte de tamao similar al inicial, de textura blanda y de color blanco con humedades entre 15 % y 80% y actividades de agua entre 0.5-0.95. La resistencia trmica del soporte se estim en 100C debido a que a temperaturas superiores cambi de color, posiblemente se atribuy a la eliminacin de otros compuestos distintos del agua. Los valores de humedad final del mtodo de secado por estufa (a 100C) presentan una diferencia del 5% en promedio con respecto al mtodo del Kart Fischer. El mtodo de secado convectivo no gener una porosidad adecuada para los fines que se estaban buscando. La criogelificacin (crioconcentracin) no permiti obtener una geometra esfrica, mientras que fue viable para producir lminas y cilindros. El tiempo adecuado para obtener soportes con actividades de agua de 0.4-0.45 a 25C y humedades del 10-20 % fue de 5-6 das. Los cilindros de quitosano proporcionaron un buen soporte para la inmovilizacin de lipasas; por ser fciles de reproducir, tienen forma regular til en procesos de simulacin, son resistentes a la abrasin y fuertes en sistemas agitados. Las lminas bajo agitacin fuerte desprendieron fragmentos de quitosano formando superficies redondas en sus aristas. La enzima XX Split posee una concentracin 1.2 % de protena (Mtodo de Kjeldah) y 2.15 % (mtodo del cido bisinconilico), para la utilizacin de esta enzima en la inmovilizacin enzimtica se debe de concentrarla utilizando centrifugacin. Se encontr que de los tres niveles de glutaraldehido probados, la concentracin de 0.003 % gener los mejores resultados para la inmovilizacin de lipasa Cndida Rugosa (CRL) por un tiempo de 15 horas. La enzima XX Split present una posible solucin tampn en su estado nativo, ya que al solubilizarla en buffer de fosfato de sodio a 7.3 el pH baj hasta pH 5.63.

El grado de D-acetilacin del quitosano utilizado fue del 68.86% (mtodo de pastilla) y del 53 % (mtodo lmina) el cual exhibe propiedades caractersticas de este valor, tales como gelificacin a pH cercanos a la neutralidad y velocidades de degradacin ms pequeas. Se presume que hubo una interferencia de la humedad en las muestras. Un aumento del contenido de glutaraldehido y de enzima afect la absorbancia de los grupos amida I (~1650). Una alta concentracin de glutaraldehido (0.1%) mostr un cambio en el pico del grupo amina, de un pico notorio a un hombro caracterstico debido a la interaccin entre el glutaraldehido y los grupos amino disponibles del quitosano. El soporte de inmovilizacin (cilindros) fue resistente a la agitacin a revoluciones de 1100 rpm sin importar la concentracin de quitosano utilizada, la agitacin incrementa el hinchamiento del soporte en soluciones acuosas. El soporte cataltico es soluble en soluciones de cido actico e insoluble en los dems solventes probados. El grado de hinchamiento para los cilindros a concentracin de 3% de quitosano es considerable, encontrando que el soporte se hincha en un 77,16 % al cabo de 96 horas en la reaccin de hidrlisis bajo agitacin a 25 C. Las micrografias de AFM mostraron que la morfologa superficial observada para las tres concentraciones de quitosano secadas por criogelificacin (crioconcentracin) cualitativamente es distinta. Puede haber una relacin entre la concentracin de quitosano y la rugosidad; la estructura de 1.8 % corresponde a una estructura mas rugosa y la de 3 % a una superficie menos rugosa. El tamao de poro determinado por AFM utilizando software SPIP correspondi a valores entre 0.226 y 0.195 m (226 y 195 nm) en promedio, lo cual supone macroporos en promedio dentro de las estructuras analizadas. El aumento de la concentracin de GA muestra una relacin con la disminucin de la rugosidad y el tamao de poro, generando estructuras ms uniformes y fuertes. La reaccin de hidrlisis de aceite de oliva no se llev a cabo espontneamente durante un tiempo de 30 minutos. La enzima inmovilizada present un mximo de 14.79U/mg de enzima a los 10 minutos de reaccin, siendo 1.2 veces mayor que la libre para este periodo, al cabo de los 30 minutos se presento una prdida de actividad del biocatalizador. El comportamiento presentado es posible que se deba al proceso de hinchamiento que se gener en la reaccin de hidrlisis, presentando una subsiguiente lixiviacin enzimtica lo cual gener la disminucin de la actividad. El proceso de esterificacin de cido oleico y n-butanol sin catalizador se llev a cabo espontneamente bajo las condiciones de ensayo (40 y 400 rpm). La

Actividad enzimtica del biocatalizador es 1.83 veces mayor que la actividad presentada por la enzima libre al cabo de 6 horas bajo las condiciones de ensayo. El sistema biocataltico producido fue eficiente y activo para reacciones de hidrlisis y esterificacin. Se cree que las condiciones favorables obtenidas por parte del biocatalizador fueron debidos a las siguientes propiedades del soporte: (i) El tratamiento del soporte con glutaraldehido (activacin) gener la introduccin de grupos reactivos CHO entrecruzando la matriz, aportando grupos reactivos para el enlace y estabilizando la estructura del gel (el soporte no se encogi significativamente en solventes como isooctano). (ii) El soporte sirve como una reserva de molculas de agua, por lo que la adicin de agua no fue requerida para ser introducida dentro del sistema reaccionante. (iii) Los soportes (cilindros) producidos pueden ser usados dentro del sistema reaccionante hasta con agitacin intensa sin dao de su estructura. El soporte producido se adapta a las condiciones necesarias para ser utilizadas en procesos continuos (reactor PFR) y en medios orgnicos. Los primeros reciclos en la reaccin de hidrlisis disminuyen en mayor proporcin la actividad (ms del 50%), despus del cuarto reciclo la enzima no mostr ninguna actividad. El valor de actividad del biocatalizador se pierde con el tiempo de almacenamiento y la reutilizacin. Se cree que el factor que influenci la perdida de actividad se debi al hinchamiento del soporte que pudo generarse en la reaccin de hidrlisis y una posible desactivacin enzimtica. Segn los resultados de estabilidad del soporte y la actividad del sistema biocatalitico en medio orgnico se espera que este sea apropiado para la catlisis de sistemas orgnicos como la transesterificacin, especialmente para la produccin de Biodiesel.

6. RECOMENDACIONES Para la formacin de esferas como hidrogeles el uso de soluciones menos viscosas (concentracin de 1.8%) genera menos problemas; en el caso de laminas y cilindros las soluciones mas concentradas son ideales para ser utilizadas. Estudiar el efecto del tamao del pellet sobre la actividad enzimtica, ya que un soporte ms pequeo incrementa su rea superficial y aumenta la efectividad. El procedimiento de la gelificacin debe ser extendido trabajando a temperaturas mas bajas con el propsito de incrementar su capacidad de absorcin de enzima. Se recomienda para posteriores estudios utilizar el mtodo de secado por liofilizacin para compararlo con los resultados obtenidos por el mtodo de criogelificacin (crioconcentracin). Se propone utilizar un adecuado almacenamiento libre de humedad ya que el quitosano es biodegradable y puede generarse algn tipo de riesgo a la contaminacin por microorganismos. Medir la actividad del sistema biocataltico a diferentes tiempos de almacenamiento que impliquen varios meses para determinar el grado de actividad residual. Para utilizar adecuadamente la enzima XX Split se deber encontrar un mtodo de purificacin ms efectivo para que los componentes de la misma no influyan en posteriores anlisis. El uso de otras enzimas podr seguir el mismo protocolo generado siempre y cuando la enzima tenga alto grado de pureza y los grupos funcionales adecuados para ser ligada al soporte. En el caso de utilizar enzimas soportadas se recomienda la disolucin seguida de la centrifugacin para eliminar cualquier material insoluble y ser utilizada en la inmovilizacin por enlace covalente. Se sugiere que para un posterior trabajo se manejen blancos y se genere un anlisis mas profundo para escoger la concentracin de GA, en el cual se determine la real adicin por enlace covalente de la enzima, ya que el soporte podra llegar a absorber parte de la enzima segn los tratamiento generados por absorcin inica. Las muestras para FTIR debern de ser sometidas a un secado riguroso de tal manera que se pueda eliminar el agua que interfiere en la medida del grado de Dacetilacin. Algunos autores recomiendan secados de 16 h a 80 C [14].

Para encontrar valores mas confiables del grado de D-acetilacin se propone realizar varias muestras (diferentes replicas) y realizar un anlisis estadstico, debido a que los resultados para una misma muestra pueden variar entre si. Un estudio del grado de hinchamiento en medio orgnico y su comportamiento a diferentes temperaturas es necesario para definir en concreto el potencial de reutilizacin del sistema biocataltico. Se aconseja obtener micrografas por SEM y XPS con el objeto de comparar el cambio de la superficie del soporte cuando se inmoviliza la enzima en el quitosano. Se recomienda estudios de porosimetra para analizar el tamao de mesoporos que puedan existir dentro de la superficie del soporte. micro y

Se recomienda que en trabajos futuros se analicen variables como: la temperatura, pH, concentracin de solucin enzimtica a inmovilizar, medio de activacin de la enzima y el tiempo de acondicionamiento que permitan el adecuado desempeo de la enzima. Se aconseja realizar el anlisis de actividad de agua del soporte para el mejor desempeo de la enzima, y con ella equilibrar el sistema biocataltico que har parte del sistema reaccionante orgnico. Se aconseja realizar el estudio cintico del sistema reaccionante con el propsito de utilizar estos resultados en posteriores simulaciones. Es necesario encontrar un mtodo de reactivacin enzimtica, una vez se presente la desactivacin enzimtica. Se sugiere un hinchamiento previo en el sistema reaccionante antes del proceso de inmovilizacin. El uso de ste sistema biocataltico se recomienda para la produccin de Biodiesel, debido a que presenta buenas caractersticas para ser utilizado como catalizador, mostrando una favorable tendencia en procesos continuos como en reactores PFR. Se recomienda un anlisis ms preciso en los reciclos para sistemas orgnicos ya que se cree que el catalizador conservar ms la actividad puesto que en stos sistemas no ocurre un hinchamiento considerable.

Anexo 1. Procedimiento de gelificacin

TABLA DE CONTENIDOS

Solucin Inicial
(disolucin

Ac. Actico 1 % Quitosano 3 %

Mtodo de Inyeccin

Solucin Inica (3 horas) Lavado (ph Neutro) Secado

NaoH (0.5 N) EtOh (26 %)

Agua destilada

Anexo 2. Procedimiento de secado

Hidrogel

Secado Convectivo

Secado criogelificacin (Crioconcentracin) Temperatura -17 C Exposicin 24 h

Temperatura 25 C Exposicin ambiente 5 das

Temperatura 25C Exposicin 1 h Temperatura -17C Exposicin 24 h Temperatura 25C Exposicin 1 h Temperatura -17C Exposicin 3-5dias

Anexo 3. Procedimiento de enlace covalente

Hidrogel seco

Enlace Con Entrecruzador (tiempo 1.5 h)

Glutaraldehido 0.003 % w/w

Filtracin

Enlace covalente con lipasa (Tiempo 15 h) Lavado 1

Lipasa 0.5 %p/v Na- Fosfato buffer pH 7.3 Na- Fosfato buffer pH 7.4 Na- Fosfato buffer pH 7.4 Tris Hcl pH 8

Lavado 2

Bloqueo de CHO (Tiempo 2h)

Lavado y almacenamiento (T = 4 C)

Na- Fosfato buffer pH 7.4

Anexo 4. Mtodo de biuret A continuacin se menciona el procedimiento de carga de protena analizado por mtodo calorimtrico en espectrofotmetro UV a 550 nm. Paso 1. Preparacin de solucin de Biuret. Se disuelven 1.5 g de CuSO4.5H2O y 6 gramos de NaKC4H4O6 en 500 ml de agua destilada. Luego se adiciona 300 ml al 10 % de NaOH con agitacin constante. Diluya 1 a 1 con agua destilada y deje en reposo en lugar oscuro en una botella de polietileno. Paso 2. Curva de calibracin. La curva de calibracin se realiza con un patrn de protena (solucin de albmina conocido x mg /ml) a diferentes concentraciones con agua destilada que totalicen 2 ml, a lo anterior adicionar 4 ml de solucin de biuret. Se rotulan y se dejan en reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o por 10 minutos a 30 C para el desarrollo del color. Paso 3. Anlisis de muestras. A una muestra de 2 ml adicionar 4 ml de solucin de biuret y se lee el porcentaje de transmitancia a 550 nm. Tener en cuenta que la curva de calibracin le permite construir una grfica que es una recta con pendiente K con lo que la concentracin de muestras desconocidas es fcilmente identificable a partir de la ecuacin 2 C=A/K Ecuacin 1 Donde A es la absorbancia de la muestra problema y K la pendiente de la recta originada a partir de la curva de calibracin.

Anexo 5. Hidrogeles de quitosano

Hidrogeles de esferas a diferentes concentraciones (2.4 % y 3%)

Hidrogeles de laminas a diferentes concentraciones (1.8 y 2,4 %)

Hidrogeles de cilindros a diferentes concentraciones (1.8 y 2,4 %)

ANEXO 6. Mtodos de secado

Esferas secas a 2.4% (Criogelificacin (Crioconcentracin) y convectivo)

Esferas secas a 3% (Criogelificacin (Crioconcentracin) y convectivo)

Laminas secas a 2.4% (Criogelificacin (Crioconcentracin) y convectivo)

Laminas secas a 1.8 % (Criogelificacin (Crioconcentracin) y convectivo)

Cilindros secos a 2.4% (Criogelificacin (Crioconcentracin) y convectivo)

Cilindros secos a 1.8% (Criogelificacin (Crioconcentracin) y convectivo).

Anexo 7. Espectros de infrarojo

Lamina de quitosano de 1,8 % combinada con glutaraldehido a 0.003 % w/w y 0.5 % p/v.

Lamina de quitosano de 1,8 % combinada con glutaraldehido a 0.003 % w/w

Lamina de quitosano de 1,8 % combinada con glutaraldehido a 0.01 % w/w y 0.5 % p/v.

Pastilla de quitosano de 1,8 % combinada con glutaraldehido a 0.01 % w/w y 0.5 % p/v.

Lamina de quitosano de 1,8 % combinada con glutaraldehido a 0.01 % w/w

Pastilla de quitosano de 1,8 % combinada con glutaraldehido a 0.1 % w/w

Pastilla de quitosano de 1,8 % combinada con glutaraldehido a 0.1 % w/w y 0.5 %p/v

Anexo 8. Espectro de lipasa

Espectro de lipasa en transmitancia

Espectro de lipasa en absorbancia

Anexo 9. Perfiles Lineales de AFM

Laminas de concentracion de quitosano de 1.8 %

Laminas de concentracion de quitosano 2.4 %

Laminas de concentracion de quitosano 3 % lamina de 5 m

Laminas de concentracion de quitosano 3 % lamina de 2 m

Anexo 10. Datos Experimentales

Dimensiones iniciales y finales de las laminas

LC1
Dimensiones Iniciales L1 8,51 11,07 9,79 8,64 10,53 9,59 7,45 10,18 10 L2 9,25 9,66 10,33 9,27 9,26 9,86 9,04 11,2 11,67 H 8,71 4,59 6,64 5,78 4,28 4,41 6,68 4,93 3,31 Dimensiones Finales L1 9,1 7,25 7,36 8,37 9,51 9,14 8,25 8,45 6,63 L2 7,7 8,86 9,66 8,03 9,81 8,13 9,19 9,24 8,81 H 3,58 1,51 1,81 3,15 1,18 1,46 1,94 1,58 2,74

Dimensiones Iniciales 10,8 11,92 6,93 10,08 10,69 8,14 9,87 10,64 7,61 9,72 11,43 8,12 10,79 10,76 7,81 8,7 9,06 8,66 10,12 10,56 7,59 10,84 10,7 8,64 10,36 10,87 8,67 8,39 10,61 10,54 10,36 10,01 9,36 10,34 9,55 9,7 11,23 11,3 7,53 8,33 8,22 7,77 7,68 7,89 8

LC2

Dimensiones Finales 8,49 8,03 5,38 7,36 7,71 4,37 7,73 9,63 5,02 7,9 7,93 4,67 7,76 8,27 5,45 5,99 9 6,1 7,64 7,32 4,7 7,95 8,3 5,33 9,04 6,96 8,77 8,64 8,65 7,73 8,69 8,23 8,58 6,78 8,17 8,19 6,95 7,54 4,28 4,23 5,21 5,19 4,79 4,33 5,68

Dimensiones Iniciales 8,55 9,72 8,17 8,55 11,75 10,51 9,23 10 9,54 8,96 12,17 9,28

LC3

Dimensiones Finales 8,58 7,35 7,14 8,7 9,42 6,81 10,81 9,69 6,39 9,32 8,59 5,86

9,9 8,49 9,45 9,01 9,32 9,04 8,15 9,29 8,66 7,56 7,86 7,33 8,47

12,03 9,53 9,04 8,45 8,69 7,33 10,47 7,97 9,67 8,94 8,19 9,65 8,15

9,81 9,04 10,45 9,11 7,85 10,01 10,98 7,78 10,15 8,52 7,14 9,44 8,01

9,16 6,49 10,47 9,59 7,13 7,79 8,84 8,2 7,42 7,34 7,25 8,73 9,21

7,83 7,86 8,14 7,52 7,42 8,87 7,52 9,91 7,91 8,14 7,42 8,1 8,25

5,94 9 7,54 5,96 5,78 8,22 7,46 6,84 6,38 7,11 5,79 6,06 6,72

Dimensiones Iniciales 9,96 11,52 6,37 12,34 10,07 4,12 9,88 9,15 3,45 9,09 10,59 6,13 9,19 9,9 7,45 9,97 9,17 4,53 9,33 8,11 5,21 9,33 13,26 3,07 9,88 11,12 6,71

LA1

Dimensiones Finales 3,4 3,98 0,89 3,93 3,6 1,74 3,78 3,9 2,12 3,55 3,64 1,95 3,04 3,55 1,79 2,67 3,75 1,61 11,81 4,96 0,13 3,65 4,37 1,38 3,87 3,96 0,89

Dimensiones Iniciales 7,67 9,4 7,3 11,23 8,42 7,86 9,96 9,46 7,23 11,7 10,56 7,48 9,82 9,88 8,68 9,34 9,79 7,59 8,97 10,12 7,77 9,46 9,96 7 9,43 9,33 9,92 10,18 11,5 10,92 8,61 10,02 9,59 8,82 9,67 9,48 9,46 10,44 8,92 6,56 6,97 7,57 8,15 8,28 7,94

LA2

Dimensiones Finales 4,1 3,52 2,37 3,43 2,76 2,71 5,01 4,28 2,21 3,64 4,05 2,41 3,42 4,06 1,91 2,78 3,13 2,55 3,58 3,55 2,26 3,23 3,67 2,45 3,26 3,71 3,08 3,4 3,02 3,07 2,82 2,95 2,99 3,47 3,27 3,06 3,13 4,14 2,59 2,18 2,07 1,91 1,8 2,51 3,07

LA3

Dimensiones Iniciales 9,3 8,58 9,44 8,64 10,5 9,77 10 8,39 9,02 11,74 8,93 10,83 10,34 6,74 8,86 8,29 9,49 11,54 8,76 8,51 8,54 10,24 8,54 8,92 10,13 10,56 10,07 8,9 8,32 8,35 8,3 8,59 LC1 LC2 LC3 LA1 LA2 LA3 10,97 8,44 8,91 10,2 9,56 11,95 8,5 8,6 9,71 8,28 7,52 8,11 8,76 8,82 7,75 8,29 8,15 7,3

Dimensiones Finales 3,76 3,05 3,55 3,07 3,43 3,18 3,17 4,37 2,87 4,12 4,54 2,55 3,06 2,95 3,69 2,82 3,09 3,56 4,08 3,22 3,15 3,02 2,94 3,86 3,75 3,01 3,53 3,14 3,28 4,71 3,11 3,7 4,35 3,14 3,5 4,17 4,32 3,56 3,84 5,01 3,68 3,78 3,04 3 3,12 2,56 2,74 2,39 2,24 2,79 2,75

Lminas de concentracin de quitosano de (crioconcentracin). Lminas de concentracin de quitosano de (crioconcentracin). Lminas de concentracin de quitosano de (crioconcentracin). Lminas de concentracin de quitosano de Lminas de concentracin de quitosano de Lminas de concentracin de quitosano de

1.8 % secadas por criogelificacin 2.4 % secadas por criogelificacin 3 % secadas por criogelificacin 1.8 % secadas convectivamente. 2.4 % secadas convectivamente 3 % secadas convectivamente

Dimensiones iniciales y finales de las esferas

DIMENSIONES INICIALES 1,80% 2,40% 3% 2,96 4 4,41 2,84 3,7 4,52 2,98 3,98 4,44 2,88 3,96 4,5 2,83 4,1 4,1 2,94 3,99 4,3 3,99 4,49 3,7 4,1 3,99 4,48 4,12 4,45 3,71 4,4 3,97 4,49 3,7 4,4 3,99 4,51 4,1 3,97 4,44

3,98 3,95 3,96 3,88 3,6 EC1 10%=40 Dim.delgada Diametro 0,52 3,54 0,39 2,08 1,18 2,18 1,42 2,89 1,8 2,52 1,28 2,15 1,26 2,94 0,74 2,78 1,64 2,52 0,9 2,91 0,63 2,15 0,97 2,56 1,31 2,36 1,63 2,51 1,14 2,73 1,65 2,37 1,35 2,19 1,37 1,92 0,63 2,1 1,29 2,13 1,35 2,55 1,6 2,53 1,85 2,67 1,36 2,39 1,39 2,36 1,44 2,03 2,25 2,17 1,63 2,71 1,66 2,51 1,3 2,34 0,84 3,46 1,6 3,6 1,36 2,33 1,74 2,33 0,65 3,14 1,55 2,13 1,73 2,24 0,93 2,01 1,39 2,39 EC2 10%=22 Dim.delgada Diametro 1,63 3,87 1,3 3,25 1,48 2,95 1,42 2,94 1,86 2,82 1,67 2,56 1,9 3,24 1,43 3,27 1,47 2,87 1,47 3,35 1,79 3,21 2,08 3,05 1,77 2,42 1,41 3,01 1,87 2,4 1,78 2,91 1,65 2,8 1,36 3,08 2,05 2,44 1,4 2,83 1,3 2,57 1,79 3,8

4,44 4,2 4,1 4,31 4,5 EC3 10% =10 Dim.corta Diametro 2,41 2,87 2,66 3,09 2,18 3,61 1,75 3,12 2,73 3,28 2,22 3,1 2,27 3,6 1,48 3,3 1,49 2,78 2,92 3,9

1,49

1,96 EA2 Dimetro 1,11 1,4 1,3 1,26 1,6 1 1,13 1,12 1,03 1,27 1,63 0,84 0,95 1,02 0,96 1,03 1,02 1,34 1,16 1,65 1,43 1,06 1,4 1,51 EA3 Dimetro 1,81 1,81 1,93 1,94 2,2 2,13 1,9 2,03 2,53 1,85

EA1 Dim. Dimetro pequea 0,54 1,41 0,79 1,34 0,58 1,33 0,68 1,45 0,51 1,48 0,8 1,19 0,59 1,23 0,41 1,49 0,69 1,47 0,6 1,49 0,58 1,48 0,73 1,4 0,6 1,2 0,8 1,34 0,58 1,9 0,68 1,55 0,51 1,51 0,74 1,41 0,54 1,54 0,47 1,23 0,65 1,29 0,77 1,33 0,87 1,09 0,65 1,19 0,89 1,22 0,73 1,27 0,72 1,26 0,77 1,31 0,37 1,28 0,31 1,52 0,65 1,25 0,74 1,08 0,46 1,44 0,69 1,39 0,8 1,16 0,61 1,56 0,69 1,38 0,64 1,16 0,7 1,14 0,67 1,14 0,74 1,3

Dim. corta 1,1 1,26 1,24 1,12 0,95 0,71 0,88 0,92 0,93 1,2 1,48 0,82 0,89 0,88 0,67 0,89 0,75 0,89 0,95 1,52 1,08 0,69 0,87 1,5

Dim. larga 1,36 2,9 2,81 4,43 1,6 1,8 1,12 1,8 1,73 2,52 3,08 2,29 2,66 1,28 1,86 2,54 2,17 2,16 1,59 2,61 3,95 2,26 1,4 3,21

Dim. corta 1,77 1,61 1,44 1,54 1,47 1,54 1,48 1,43 1,64 1,36

Dim. larga 3,36 3,87 3,77 4,84 4,75 5,62 4,53 5,21 4,59 4,67

EC1 EC2 EC3 EA1 EA2 EA3

Esferas de concentracin de quitosano de (crioconcentracin). Esferas de concentracin de quitosano de (crioconcentracin). Esferas de concentracin de quitosano de (crioconcentracin). Esferas de concentracin de quitosano de Esferas de concentracin de quitosano de Esferas de concentracin de quitosano de

1.8 % secadas por criogelificacin 2.4 % secadas por criogelificacin 3 % secadas por criogelificacin 1.8 % secadas convectivamente. 2.4 % secadas convectivamente 3 % secadas convectivamente

Dimensiones iniciales y finales de los cilindros

1,80% Dimetro 3,21 3,75 3,28 3,12 3,19 3,37 3,36 3,04 3,19 2,40% Dimetro 5,29 4,08 4,28 4,73 4,26 3% Dimetro 4,54 4,64 5,16 4,6 3,97

Longitud 4,88 4,48 5,07 4,84 5,37 4,99 5,22 4,36 5,14

Longitud 5,04 4,96 6,2 5,78 6,35

Longitud 5,62 5,97 5,73 6,12 4,89

CA1 Dimetro longitud 1 2,59 1,28 2,77 1,2 2,43 1,119 2,35 0,95 3,35 1,18 2,42 1,24 2,11 0,97 2,4 1,06 2,8 1,22 2,58 1,2 2,59 1,37 2,67 1,1 3,07 1,26 2,24 1,1 2,21 1,02 2,48 1,09 2,51 0,95 2,6 1,24 2,44 0,93 2,06 1,15 2,25

CA2 Dimetro longitud 1,23 2,62 1,25 3,16 1,21 2,45 1,23 2,44 1,37 2,6 1,31 2,45 1,6 2,56 1,24 2,34 1,56 2,28 1,35 2,13 1,4 1,88 1,43 2,44 1,19 2,2 1,5 1,92 1,12 2,42 1,27 1,92 1,21 2,36 1,15 1,96 1,17 2,07 1,35 2,2 1,4 2,3

CA3 Dimetro longitud 1,6 1,86 1,54 1,66 1,42 2,91 1,1 3,16 1,71 2,25 1,39 2,91 1,55 2,61 1,97 2,84 1,92 2,34 1,48 2,17 1,57 2,74

1 1,13 0,92 1,27 1,16

2,95 2,34 2,79 2,06 2,62

CC1 Dimetro longitud 2,27 2,18 1,8 1,84 2,12 1,93 2 1,81 1,82 2,3 1,6 1,63 2,4 2,26 2,02 1,75 2,2 2,1 1,72 2,3 1,38 1,37 2,8 1,98 2 1,53 1,94 1,94 2 2,1 2,06 2,02 1,18 2,08 1,83 1,74 1,79 1,8 4,55 4,08 4,77 4,79 4,73 4,82 4,9 5,39 3,84 4,9 3,77 3,39 3,69 4,41 3,76 3,4 4,07 4,06 4,98 4,81 4,37 3,61 5,2 5,37 4,61 4,46 4,15 3,78 4,33 4,96 4,56 4,37 5,52 4,73 5,38 3,96 5 5,83

CC2 Dimetro longitud 3,1 1,88 1,8 3,1 2,46 3,17 2,9 3,03 3,26 2,36 2,36 3,31 2,23 3,22 2,88 3,04 3,16 2,76 2,98 2,79 2,93 2,78 2,21 2,86 3,25 3,45 3,05 3,72 3,06 2,74 2,88 2,65 2,79 2,62 3,43 4,5 3,47 3,72 3,37 3,26 3,85 3,33 4,13 4,52 3,96 3,33 4,83 4,58 4,7 5,16 4,83 4,39 3,79 3,28 5,37 4,44 4,03 5,13 1,8 3,85 4,79 4,11 3,52 3,55 3,47 3,2 4,08 4,88

CC3 Dimetro longitud 2,72 2,7 3,35 2,75 2,85 3,74 3,16 3,31 3,16 3,59 3,12 3,23 2,85 3,06 2,82 3,11 3,08 3,27 3,86 3,08 3,23 4,48 5,32 4,49 5,73 4,18 4,71 3,94 4,2 5,43 4,58 4,09 4,69 5,02 4,89 5,15 3,77 3,74 4,18 4,57 4,17 4,233

CC1 CC2 CC3 CA1 CA2 CA3

Cilindros de concentracin de quitosano de 1.8 % secadas por criogelificacin (crioconcentracin). Cilindros de concentracin de quitosano de 2.4 % secadas por criogelificacin (crioconcentracin). Cilindros de concentracin de quitosano de 3 % secadas por criogelificacin (crioconcentracin). Cilindros de concentracin de quitosano de 1.8 % secadas convectivamente. Cilindros de concentracin de quitosano de 2.4 % secadas convectivamente Cilindros de concentracin de quitosano de 3 % secadas convectivamente

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