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valuation des risques lis la prsence de mycotoxines dans les chanes alimentaires humaine et animale

Rapport final
Mars 2009

Coordination rdactionnelle Jean Marc Fremy Coordination ditoriale Carole Thomann

PREAMBULE
LAgence franaise de scurit sanitaire des aliments (Afssa) s'est saisie de l'valuation des risques lis la prsence de mycotoxines dans la chane alimentaire humaine et animale. En 1998, le Conseil Suprieur d'Hygine Publique de France (CSHPF) avait rdig un rapport qui faisait le point sur les mycotoxines. De nombreuses questions venant des industriels et des consommateurs mais galement des scientifiques sont rgulirement souleves sur la toxicit des mycotoxines. Si pour certaines de ces mycotoxines, les proprits toxicologiques commencent tre bien connues, pour d'autres, leur impact toxique est contest ou mal identifi. L'objectif de cette autosaisine de l'Afssa est de procder une revue des connaissances et d'approfondir plus particulirement certains aspects, notamment l'impact des mycotoxines sur l'alimentation et la sant animales. Un groupe de travail inter-comits a t charg de cette revue, focalise sur les mycotoxines ayant un impact sur la sant humaine et/ou animale. En se fondant sur les donnes bibliographiques rcentes et les dernires valuations ralises par diffrentes instances internationales, ce rapport dtaill prsente pour chaque mycotoxine : les mthodes d'analyse, les facteurs favorisant leur production partir du dveloppement des moisissures, leurs proprits toxicologiques, leurs effets sur la sant humaine et l'exposition de l'homme au travers des denres vgtales, animales et des produits finis, leurs effets sur la sant animale l'exposition des animaux au travers de leur alimentation et le transfert dans les produits animaux, les donnes de contamination des denres humaines et animales disponibles ainsi que la rglementation. Ce rapport dtaill inclut l'ensemble de la bibliographie analyse. En accord avec les Comits d'experts spcialiss "Rsidus et contaminants chimiques et physiques" et "Alimentation animale", il a t dcid de proposer une restitution de ce travail sur les mycotoxines en deux temps : un rapport prliminaire synthtique paru fin 2006 prsentant : - un tat actualis des connaissances sur chaque mycotoxine tudie incluant une estimation de lexposition alimentaire de la population franaise ; - des recommandations en termes de recherche destines amliorer nos connaissances sur les dangers de certaines de ces toxines et leur transfert dans les produits animaux ; - des recommandations, le cas chant, sur le bien-fond de mise en uvre de plans de surveillance et/ou de contrle et la mise au point de techniques analytiques plus sensibles ; ce rapport dtaill, dans lequel, outre tous les aspects du rapport prliminaire synthtique traits mais cette fois de faon dveloppe et actualise, est prsente une valuation de l'exposition des animaux aux mycotoxines au travers de leur alimentation.

Composition du groupe de travail


Prsidence : Pierre GALTIER Laboratoire Pharmacologie-Toxicologie INRA Toulouse

Membres du Comit d'experts spcialis "RESIDUS ET CONTAMINANTS CHIMIQUES ET PHYSIQUES" Pierre GALTIER Bruno LE BIZEC Jean-Charles LEBLANC Isabelle OSWALD Laboratoire Pharmacologie-Toxicologie, INRA Toulouse LABERCA, Ecole Nationale Vtrinaire Nantes PASER DERNS - AFSSA - Maisons-Alfort Laboratoire Pharmacologie-Toxicologie, INRA Toulouse

Membres du Comit d'experts spcialis "ALIMENTATION ANIMALE" Christine BUREL Michel ETIENNE Franois GROSJEAN Jean-Pierre JOUANY Bernard-Marie PARAGON Autres experts Sylviane DRAGACCI Jean-Marc FREMY Philippe GUERRE Virginie HOSSEN Franoise JANIN Dominique PARENT-MASSIN Daniel THOUVENOT Coordination scientifique Jean-Marc FREMY Sophie GALLOTTI Alexandra TARD Rdaction du produit de lexpertise La rdaction des chapitres a t organise en tches transversales confies des rdacteurs pour certains thmes spcifiques* et la coordination a t confie certains membres dont les noms sont mentionns en dbut de chapitre. UERPC DERNS - AFSSA - Maisons-Alfort UERPC DERNS - AFSSA - Maisons-Alfort PASER DERNS - AFSSA Maisons-Alfort LERQAP - AFSSA Maisons-Alfort UERPC DERNS - AFSSA - Maisons-Alfort Ecole Nationale Vtrinaire Toulouse LERQAP- Unit TOP - AFSSA Maisons-Alfort AFSSA DS - Maisons-Alfort Laboratoire de toxicologie alimentaire, Universit de Bretagne occidentale Brest Ecole suprieure de microbiologie et scurit alimentaire Brest Laboratoire dEtudes et de Recherches Avicoles et Porcines AFSSA Ploufragan UMR Systmes d'levage, nutrition animale et humaine, INRA Saint-Gilles Arvalis, Institut du Vgtal Paris Unit de recherche sur les herbivores, INRA - Clermont-Ferrand Ecole Nationale Vtrinaire Maisons-Alfort

*Christine BUREL (poissons), Sylviane DRAGACCI (mthodes analytiques), Michel ETIENNE (porcins), JeanMarc FREMY (effets des procds, mthodes analytiques, rglementation), Franois GROSJEAN (alimentation animale), Jean-Pierre JOUANY (ruminants), Pierre GALTIER (donnes toxicologiques), Philippe GUERRE (volailles), Bruno LE BIZEC (mthodes analytiques), Jean-Charles LEBLANC (exposition humaine), BernardMarie PARAGON (animaux de compagnie et de loisirs), Dominique PARENT-MASSIN (donnes toxicologiques), Isabelle OSWALD (donnes toxicologiques), Daniel THOUVENOT (facteurs influenant la toxinognse), Alexandra TARD (exposition animale).

Sigles
JECFA : Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives SCF : Scientific Committee of Food (Comit scientifique europen de l'alimentation humaine) AESA/EFSA : Autorit Europenne de Scurit des Aliments/European Food Safety Authority AFSSA : Agence Franaise de Scurit Sanitaire des Aliments CE : Commission Europenne DHT : Dose Hebdomadaire Tolrable DHTP : Dose Hebdomadaire Tolrable provisoire DJT : Dose Journalire Tolrable DMT : Dose Maximale Tolrable LOAEL : Dose minimale avec un effet nocif observ (Lowest observed adverse effect level) NOAEL : Dose sans effet nocif observ (No observed adverse effect level) NOEL : Dose sans effet observ (No observed effect level) DL50 : Dose ltale 50 : dose d'une substance qui entrane la mort de 50 % des animaux CIRC : Centre International de Recherche sur le Cancer (acronyme anglais IARC)
Classement tabli par le centre international de recherche sur le cancer (Prambule des monographies CIRC 19 janvier 1999) Groupe 1 : L'agent (le mlange) est cancrogne pour l'homme. Les circonstances d'exposition donnent lieu des expositions qui sont cancrognes pour l'homme. Groupe 2A : L'agent (le mlange) est probablement cancrogne pour l'homme. Les circonstances d'exposition donnent lieu des expositions qui sont probablement cancrognes pour l'homme. Groupe 2B : L'agent (le mlange) est peut-tre cancrogne pour l'homme. Les circonstances d'exposition donnent lieu des expositions qui sont peut-tre cancrognes pour l'homme. Groupe 3 : L'agent (le mlange, les circonstances d'exposition) ne peut tre class quant sa cancrognicit pour l'homme (les tudes ne peuvent pas tre interprtes en terme de prsence ou d'absence d'effet cancrogne en raison de limites qualitatives ou quantitatives importantes, ou aucune donne exprimentale de cancrognicit n'est disponible). Groupe 4 : L'agent (le mlange) n'est probablement pas cancrogne pour l'homme.

Aw : activit de l'eau g : gramme ng : nanogramme g : microgramme p.c. : poids corporel (homme, animal) p.v. : poids vif (animal) NEB : Nphropathie Endmique des Balkans (BEN en anglais) ELISA : Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay RIA : Radio Immuno Assay (dosage radio-immunologique) CPG ou GC : chromatographie en phase gazeuse (Gaz chromatography) SM ou MS : spectromtrie de masse (Mass spectrometry) UV : ultra-violets ECD : dtecteur capture dlectrons (electron capture detector) CCM : chromatographie sur couche mince CLHP ou LC : chromatographie liquide haute performance (Liquid chromatography) CIA : chromatographie dimmuno affinit LOQ : limite de quantification (limit of quantification) LOD : limite de dtection (limit of detection) ADN : acide dsoxyribonuclique ARNt : acide ribonuclique de transfert

Sommaire

INTRODUCTION --------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 8 LES AFLATOXINES --------------------------------------------------------------------------------------------------------- 13


Proprits physico-chimiques ----------------------------------------------------------------------------------- 13 Mthodes danalyse ----------------------------------------------------------------------------------------------- 14 Facteurs influenant la teneur en aflatoxines dans les denres ---------------------------------------- 15 Devenir et proprits toxicologiques --------------------------------------------------------------------------- 17 Exposition de l'homme aux aflatoxines par voie alimentaire --------------------------------------------- 23 Exposition animale et transfert dans les produits animaux----------------------------------------------- 24 Rglementation ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 42 Surveillance et contrle ------------------------------------------------------------------------------------------- 43 Conclusion et recommandations ------------------------------------------------------------------------------- 44 Proprits physico-chimiques ----------------------------------------------------------------------------------- 45 Mthodes danalyse ----------------------------------------------------------------------------------------------- 46 Facteurs influenant la teneur en ochratoxine A dans les denres ------------------------------------ 48 Devenir et proprits toxicologiques -------------------------------------------------------------------------- 51 Exposition de l'homme l'ochratoxine A par voie alimentaire------------------------------------------- 59 Exposition animale et transfert dans les produits animaux----------------------------------------------- 62 Rglementation ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 74 Surveillance et contrle ------------------------------------------------------------------------------------------- 75 Conclusion et recommandations ------------------------------------------------------------------------------- 75 Proprits physico-chimiques ----------------------------------------------------------------------------------- 77 Mthodes danalyse ----------------------------------------------------------------------------------------------- 79 Facteurs influenant la teneur en trichothcnes dans les denres ----------------------------------- 81 Devenir et proprits toxicologiques -------------------------------------------------------------------------- 84 Exposition de l'homme aux trichothcnes par voie alimentaire---------------------------------------- 97 Exposition animale et transfert dans les produits animaux----------------------------------------------- 99 Rglementation ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 122 Surveillance et contrle ------------------------------------------------------------------------------------------ 123 Conclusion et recommandations ------------------------------------------------------------------------------ 124 Proprits physico-chimiques ---------------------------------------------------------------------------------- 126 Mthodes danalyse ---------------------------------------------------------------------------------------------- 127 Facteurs influenant la teneur en zaralnone dans les denres ------------------------------------- 128 Devenir et proprits toxicologiques ------------------------------------------------------------------------- 129 Exposition de l'homme la zaralnone par voie alimentaire ----------------------------------------- 133 Exposition animale et transfert dans les produits animaux---------------------------------------------- 135 Rglementation ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 145 Surveillance et contrle ------------------------------------------------------------------------------------------ 146 Conclusion et recommandations ------------------------------------------------------------------------------ 146 Proprits physico-chimiques ---------------------------------------------------------------------------------- 148 Mthodes danalyse ---------------------------------------------------------------------------------------------- 149 Facteurs influenant la teneur en fumonisines dans les denres ------------------------------------- 150 Devenir et proprits toxicologiques ------------------------------------------------------------------------- 151 Exposition de l'homme aux fumonisines par voie alimentaire ------------------------------------------ 159

LES OCHRATOXINES------------------------------------------------------------------------------------------------------- 45

LES TRICHOTHECENES --------------------------------------------------------------------------------------------------- 77

LA ZEARALENONE -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 126

LES FUMONISINES -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 148

Exposition animale et transfert dans les produits animaux---------------------------------------------- 160 Rglementation ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 174 Surveillance et contrle ------------------------------------------------------------------------------------------ 175 Conclusion et recommandations ------------------------------------------------------------------------------ 175 Proprits physico-chimiques ---------------------------------------------------------------------------------- 178 Mthodes danalyse ---------------------------------------------------------------------------------------------- 178 Facteurs influenant la teneur en patuline dans les denres ------------------------------------------- 179 Devenir et proprits toxicologiques ------------------------------------------------------------------------- 181 Exposition de l'homme la patuline par voie alimentaire ----------------------------------------------- 186 Exposition animale et transfert dans les produits animaux---------------------------------------------- 187 Rglementation ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 188 Surveillance et contrle ------------------------------------------------------------------------------------------ 189 Conclusion et recommandations ------------------------------------------------------------------------------ 189 les toxines de Claviceps purpurea ---------------------------------------------------------------------------- 192 La citrinine----------------------------------------------------------------------------------------------------------- 197 Les toxines dAlternaria ------------------------------------------------------------------------------------------ 202 L'acide cyclopiazonique ------------------------------------------------------------------------------------------ 207 Les toxines trmorgnes d'Aspergillus et de Penicillium ------------------------------------------------ 212 Les sporidesmines ------------------------------------------------------------------------------------------------ 218 Les stachybotryotoxines ----------------------------------------------------------------------------------------- 221 Les toxines d'endophytes --------------------------------------------------------------------------------------- 225 Les phomopsines -------------------------------------------------------------------------------------------------- 230

LA PATULINE------------------------------------------------------------------------------------------------------178

LES AUTRES MYCOTOXINES-------------------------------------------------------------------------------------------- 190

CONCLUSIONS ET RECOMMANDATIONS GENERALES ----------------------------------------------------------- 235 ANNEXE 1 Analyses des mycotoxines dans les aliments -------------------------------------------- 244 ANNEXE 2 Exposition animale : mthodologie de calcul --------------------------------------------- 261

Introduction
Les mycotoxines sont des produits du mtabolisme secondaire de moisissures (champigons microscopiques) pouvant se dvelopper sur la plante au champ ou en cours de stockage et doues de potentialits toxiques lgard de lhomme et des animaux. Plus de 300 mtabolites secondaires ont t identifis mais seuls une trentaine possdent de relles proprits toxiques proccupantes. Ces toxines se retrouvent ltat de contaminants naturels de nombreuses denres dorigine vgtale, notamment les crales mais aussi les fruits, noix, amandes, grains, fourrages ainsi que les aliments composs et manufacturs contenant ces matires premires destins lalimentation humaine et animale. Les mycotoxines sont produites par des moisissures appartenant notamment aux genres Aspergillus, Penicillium et Fusarium (tableau 1). Tableau 1 : Mycotoxines et moisissures productrices associes retrouves en alimentation humaine et/ou animale Mycotoxines Principales moisissures productrices
Aflatoxines B1, B2, G1, G2 Ochratoxine A Patuline Mycotoxines Fumonisines B1, B2, B3 rglementes ou en cours de Trichothcnes (groupes A et B) rglementation Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. nomius Penicillium verrucosum, Aspergillus ochraceus, Aspergillus carbonarius Penicillium expansum, Aspergillus clavatus Byssochlamys nivea Fusarium verticillioides, F. proliferatum Fusarium langsethiae, F. sporotrichioides, F. poae, F. graminearum, F. culmorumF. crookwellense, tricinctum, F. acuminatum Fusarium graminearum, F. culmorum F. crookwellense. Claviceps purpurea, C. paspali, C. africana, C. fusiformis Aspergillus terreus, A. carneus, A. niveus Penicillium verrucosum, P. citrinum, P. expansum Alternaria alternata, Alternaria solani Aspergillus flavus, A. versicolor, A. tamarii Penicillium dont P. camemberti Aspergillus nidulans, A. versicolor, A. flavus Pithomyces chartarum Strachybotrys chartarum Neotyphodium coenophialum, N. lolii Phomopsis leptostromiformis Penicillium roquefortii, P. crustosum, P. puberrelum Aspergillus clavatus, A. fumigatus F.

Zaralnone Alcalodes dergot (dit ergot du seigle) Citrinine Toxines dAlternaria (alternariol, alternariol mthyl ther) Acide cyclopiazonique Strigmatocystine Autres mycotoxines Sporidesmines Stachybotryotoxines Toxines dendophytes (ergovaline, lolitrme B) Phomopsines Toxines trmorgnes

Les moisissures toxinognes Deux groupes de champignons (ou moisissures) toxinognes (producteurs de mycotoxines) peuvent tre distingus. Le premier groupe est constitu de champignons envahissant leur substrat et produisant la ou les mycotoxine(s) sur les plantes au niveau du champ: il sera question de toxines de champs . Lautre groupe rassemble ceux qui produisent les toxines aprs rcolte ; on les qualifiera de toxines de stockage . Ainsi, des champignons du sol ou des dbris de plantes peuvent dissminer leurs spores sur la plante ou les grains puis prolifrer pendant le stockage si les conditions le permettent. Des moisissures toxinognes peuvent se dvelopper sous tous les climats, sur tous les supports solides ou liquides ds linstant quil y a des lments nutritifs, de lhumidit (activit en eau Aw suprieure 0,6), do la grande varit des substrats alimentaires pouvant tre contamins. Les aliments concerns peuvent tre classs en deux grands groupes : les aliments et produits dorigine vgtale, et par transfert ceux dorigine animale. Parmi les produits et aliments dorigine vgtale, les crales et leurs produits drivs (y compris les produits de fermentation tels que les bires) prsentent un facteur de risque compte tenu de la frquence de contamination et de leur consommation importante en Europe quel que soit le rgime alimentaire. Les autres produits dorigine vgtale sont les fruits (y compris leur jus et leurs produits de fermentation tels que les vin et cidre et leurs drivs secs), les, les pices, le caf et le cacao et les jus et produits de fermentation). Des produits et aliments dorigine animaletels que le lait, le sang, les abats et tout ce qui en drive doivent retenir lattention, du fait quils peuvent contenir des traces de mycotoxines ou des mtabolites des mycotoxines contenues dans les aliments ingrs par les animaux dlevage. Plusieurs espces fongiques sont utilises depuis des sicles pour la prparation daliments en occident et en extrme-orient dans llaboration de condiments ou de produits comme les fromages et les salaisons et, de ce fait, doivent rpondre des critres stricts de scurit.. De nouvelles utilisations de micromyctes sont freines par la crainte de prsence de mycotoxines. Autrefois slectionnes sur la base de labsence de toxicit observable, elles sont aujourdhui passes au crible pour dtecter des gnes de toxinogense. Les mycotoxines Les mycotoxines peuvent tre classes en polyctoacides, terpnes, cyclopeptides et mtabolites azots selon leur origine biologique et leur structure. On peut aussi classer les mycotoxines plus simplement selon leurs principaux effets toxiques. On distingue parmi les groupes de mycotoxines considres comme importantes du point de vue agro-alimentaire et sanitaire les aflatoxines, les ochratoxines et lochratoxine A en particulier, la patuline, les fumonisines, la zaralnone et les trichothcnes et tout spcialement le doxynivalnol. Il convient de remarquer que dans un groupe structural de toxines, la toxicit peut varier considrablement dune toxine une autre et que le danger n'est pas toujours li la toxine elle-mme, mais peut aussi provenir de ses mtabolites. Les mycotoxines et le risque pour le consommateur La toxicit de ces contaminants naturels peut tre aigu ou chronique vis vis des organismes consommant des denres alimentaires contamines. Certaines mycotoxines ont une toxicit aigu trs marque (exposition unique une forte dose), mais il demeure exceptionnel en Europe dtre expos des doses toxiques en une seule ingestion daliments contamins, provoquant ainsi une mycotoxicose aigu. Historiquement, la mycotoxicose humaine la plus anciennement connue est lergotisme. Il sagit dune pathologie galement appele "feu de Saint-Antoine", "feu sacr" ou "mal des ardents". Elle est provoque par les toxines de Claviceps labores par lergot de seigle et se prsentait sous la forme de dlires, prostrations, douleurs violentes, abcs, gangrnes des extrmits aboutissant des infirmits graves et incurables. Des pidmies ont svi du 8me au 16me sicle en raison des conditions dalimentation misrables des populations, en particulier la consommation de farines contamines par les sclrotes de ces champignons. En France, le dernier pisode se serait produit en 1951 Pont Saint-Esprit, dans le Gard. Les effets chroniques (exposition rpte de faibles voire trs faibles doses) sont les plus redouts en raison des habitudes alimentaires et du pouvoir de rmanence de ces toxines.

Les effets toxiques sont de nature varie (tableau 2). Certaines toxines exercent un pouvoir hpatotoxique (aflatoxines), dautres se rvlent strogniques (zaralnone), immuno/hmatotoxiques (patuline, trichothcnes, fumonisines), dermoncrosantes (trichothcnes), nphrotoxiques (ochratoxine A) ou neurotoxiques (toxines trmorgnes). Certaines mycotoxines sont reconnues ou suspectes dtre cancrognes. Tableau 2 : Effets des principales mycotoxines et mcanismes daction cellulaires et molculaires identifis
Toxine Aflatoxine B1 + M1 Hpatotoxicit Gnotoxicit Cancrognicit Immunomodulation Nphrotoxicit Gnotoxicit Immunomodulation Neurotoxicit Mutagense in vitro Hmatotoxicit Immunomodulation Toxicit cutane Effets Mcanismes daction cellulaires et molculaires Formation dadduit lADN Peroxydation lipidique Bioactivation par des cytochromes P450 Conjugaison aux Glutathion-transfrases Impact sur la synthse des protines. Inhibition de la production dATP Dtoxification par les peptidases Inhibition indirecte denzymes

Ochratoxine A

Patuline

Trichothcnes (groupes A et B)

Induction de lapoptose sur progniteur hmatopotique et cellules immunitaires Impact sur la synthse des protines Altration des immunoglobulines Liaison aux rcepteurs strogniques Bioactivation par des dshydrognases Conjugaison aux glucuronyltransfrases Inhibition de la synthse de cramide Altration du rapport sphinganine/sphingosine Altration du cycle cellulaire

Zaralnone

Fertilit et Reproduction

Fumonisine B1

Lsion du systme nerveux central Hpatotoxicit Gnotoxicit Immunomodulation

Pour les consommateurs humains, un autre type de risque est indirect car induit par la prsence possible de rsidus dans les productions issues des animaux de rente exposs une alimentation contamine par les mycotoxines. Ces rsidus correspondent la toxine elle-mme et/ou des mtabolites bioforms conservant les proprits toxiques du compos parental. Les espces d'levage peuvent donc constituer un vecteur de ces toxines ou de leurs mtabolites dans des productions telles que les abats, le lait ou le sang. Cest le cas notamment de laflatoxine B1, dont le mtabolite laflatoxine M1 est retrouv dans le lait des mammifres lorsque ceux-ci ont ingr des aliments contamins par laflatoxine B1. Les mycotoxines sont gnralement thermostables et ne sont pas dtruites par les procds habituels de cuisson et de strilisation. Leur capacit se lier aux protines plasmatiques et leur lipophilie en font des toxiques capables de persister dans lorganisme en cas dexpositions rptes et rapproches. De plus, il est considrer la capacit que peut avoir une mme moisissure produire diffrentes mycotoxines. A linverse une mme mycotoxine pourra tre produite par plusieurs espces et genres de moisissures (voir tableau 1). Ainsi, plusieurs toxines dune mme famille structurale ou prsentant des structures diffrentes peuvent se retrouver dans le mme produit alimentaire et, a fortiori, dans une ration compose de divers ingrdients alimentaires : on parle alors de multicontamination. Cette situation naturelle pose des interrogations sur les interactions toxiques qui peuvent soprer et ainsi pourrait se traduire par un effet antagoniste ou encore additif ou synergique. Cet aspect toxicologique est peu document et ne sera voqu que pour certaines mycotoxines produites par les mmes moisissures.

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Les mycotoxines et le risque pour l'animal Les animaux monogastriques dlevage, porcs et volailles sont particulirement exposs aux mycotoxicoses du fait de limportance de la part des crales dans leur alimentation et de labsence du rservoir ruminal contenant des microorganismes capables de dgrader les toxines avant leur absorption intestinale. La sensibilit des volailles aux aflatoxines a t dailleurs lorigine de la dcouverte de ces toxines aprs un pisode brutal dhpatotoxicit ltale survenu en 1960 dans des levages de dindes en Grande-Bretagne. Ce fait a t lorigine de la mise en vidence de la relation moisissures-toxines-pathologies et du dveloppement de la mycotoxicologie moderne. De mme, de nombreux cas de nphropathie chez le porc signals quelques annes plus tard au Danemark ont conduit la dcouverte du caractre contaminant naturel de lochratoxine A dans lorge et de la qualification de son pouvoir toxique. En France, en dehors de cas sporadiques correspondant des accidents aigus observables dans diffrentes espces animales, lessentiel des problmes est li une contamination chronique par les fusariotoxines (trichothcnes, zaralnone, fumonisines) des aliments produits en France ou imports. Les problmes ponctuels dus limportation de matires premires contamines justifient des procdures de surveillance et de contrle. Enfin, le dveloppement des techniques de conservation des fourrages la ferme sous forme humide (ensilages1, balles rondes enrubannes) et lutilisation daliments humides comme les drches et les pulpes de betterave peuvent galement constituer un risque de dveloppement des moisissures et de prsence de mycotoxines Evaluation du risque mycotoxique Issues dune contamination gnralement reconnue comme dorigine vgtale, les mycotoxines constituent un problme trs actuel de qualit et de scurit sanitaire des aliments. Si la mise en place de rglementations est dj intervenue propos des aflatoxines et de l'ergot en alimentation humaine et animale, de lochratoxine A, de la patuline, du doxynivalnol, de la zaralnone et des fumonisines en alimentation humaine, elle est en prparation pour lochratoxine A, le doxynivalnol, la zaralnone et les fumonisines en alimentation animale. Le risque mycotoxique est dorigine naturelle, lhomme nen matrisant pas la survenue qui est lie aux conditions climatiques notamment. Le risque est pernicieux car la contamination fongique est difficilement contrlable et peut tre multiple en raison de la prsence possible de plusieurs mycotoxines dans le mme produit ou la mme ration alimentaire, comme indiqu plus haut. Le risque mycotoxique et les dfis environnementaux du XXIe sicle Lvolution constate au dbut du XXIe sicle des pratiques culturales comme lextension du mode de production biologique, lmergence de la production de biocarburants, lextension du non-labour et celles conscutives au changement climatique nest pas sans avoir un impact sur lvolution de lattention porte lvaluation du risque mycotoxique via la fois lalimentation humaine et lalimentation animale. Lun des principaux enjeux environnementaux passs en revue lors de la runion du Grenelle de lenvironnement doctobre 2007, est la diminution de lusage des pesticides. Parmi eux les fongicides sont majoritaires en terme de quantit et sont passs en livraisons de plus de 60 000 moins de 40 000 tonnes de 1999 20053. Le cas du mode de production biologique restreint le recours aux traitements fongicides mais requiert des pratiques agricoles vitant la contamination par les moisissures telles que la rotation des cultures, le travail du sol, lantcdent cultural, la faiblesse des apports azots et la non utilisation des rgulateurs de croissance. Les donnes disponibles de contamination de produits issus de lagriculture biologique par les mycotoxines, bien que limites, montrent des taux de contamination variables, sans quil puisse tre dgag de grandes diffrences avec ceux des produits issus de lagriculture conventionnelle. Cet aspect, ayant t trait dans un rapport de lAfssa en 2003, ne sera pas repris dans ce document2. Nanmoins, le souhait du triplement de la surface en agriculture biologique dici 2010 (1,8% des surfaces agricoles en 2005)3 est considrer (voir recommandations ). Sur la mme problmatique, en protection de lattaque des insectes (notamment la pyrale sur le mas) effectuant des lsions favorables la contamination par des moisissures et en alternative lusage des insecticides, peut soprer par lutte biologique.
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Bonnes pratiques de fabrication de l'ensilage pour une meilleure matrise des risques sanitaires. Rapport Afssa 2004. www.afssa.fr Evaluation nutritionnelle et sanitaire des aliments issus de lagriculture biologique. Rapport Afssa 2003. www.afssa.fr souce Agreste, Journal Le Monde du 25 octobre 2007, p.24

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Elle recourt lutilisation de trichogrammes, insectes parasitant les ufs de pyrale ou encore dun champignon entomopathogne du sol parasitant les larves de pyrale. Cette lutte peut soprer, pour les pays autorisant ce genre de pratiques par lutilisation de varits de mas trangniques contenant un gne de Bacillus thuringiensis (Bt) codant la synthse de protoxines (non toxiques pour lhomme et les vertbrs) qui, ingres par les insectes pyrale ou ssamie, sont transformes par leurs sucs digestifs en toxines bloquant leur appareil digestif. La question des avantages et inconvnients lis lusage du mas Bt ayant t tudie prcdemment et relate dans un rapport Afssa en 2004, ne sera pas reprise dans ce prsent document1. Lun des moyens pour limiter la modification du climat est la rduction des gaz effet de serre (GES). En signant le protocole de Kyoto, les pays europens se sont engags reduire leurs emissions de GES de 8% par rapport 1990 dici 2008-2012. En France, les transports reprsentent 26% des missions totales de GES. Ce secteur dpend 98% de la ressource fossile. La Commission Europenne considre ainsi que les biocarburants constituent les seuls substituts directs aux nergies fossiles disponibles chelle significative sans adaptation des moteurs et lun des seuls leviers avec la rduction de consommation- de rduction grande chelle dmissions de GES 2. La Directive 2003/30/CE3 relative la promotion des biocarburants a tabli des objectifs indicatifs dincorporation des biocarburants dans les carburants fossiles. Il est prvu une extention des surfaces ddies la production des matires premires - la betterave, le bl et le mas - pour la fabrication dthanol dans les prochaines annes. La fabrication de biothanol genrerait alors des co-produits (drches et pulpes) destination de lalimentation animale4. Enfin le 4me rapport du GIEC5 en 2007 tablit que pour lEurope les scnarios du climat indiquent un rchauffement siginficatif, plus grand en hiver pour le Nord et en t pour lEurope mridionale et centrale et quil est projet une augmentation au Nord et une diminution au Sud de la moyenne annuelle des prcipitations. Des consquences sont attendues en pratiques agricoles telles que des varits qui sont cultives principalement en Europe mridionale (mas, tournesol et soja) deviendront possibles plus au Nord et plus haute altitude au Sud mais que laugmentation de la survenue de certaines conditions extrmes (stress hydrique durant la floraison, pluies lensemencement ou la rcolte) affecterait le rendement de production. Ces scnarios et projections ne sont pas sans avoir de relation directe ou indirecte avec lvaluation du risque mycotoxique.

Objectif de ce document Ce document prsente une revue des connaissances disponibles sur les mycotoxines prsentant un risque pour la sant humaine et/ou animale. Chaque chapitre traite d'une mycotoxine ou d'une famille de mycotoxines, de ses proprits physicochimiques, toxicologiques, des facteurs de dveloppement de la (ou des) moisissure(s) toxinogne(s), des mthodes d'analyses, des effets sur la sant humaine et/ou animale au travers des donnes pidmiologiques, lorsqu'elles existent, des donnes de contamination des denres alimentaires et d'une estimation de l'exposition alimentaire de la population franaise mtropolitaine et des espces animales ainsi que d'un point rglementaire. Des recommandations sont effectues sur la conduite de travaux destins amliorer les connaissances sur les dangers de certaines de ces toxines et leur transfert dans les produits animaux, et le cas chant, sur le bien-fond de la mise en uvre de plans de surveillance et/ou de contrle ainsi que de la mise au point de techniques analytiques plus sensibles.

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OGM et alimentation : peut-on identifier et valuer des bnfices pour la sant ? Rapport Afssa, juin 2004 Communication de la Commission au Conseil et au Parlement Europen COM (2006)- 10 janvier 2007 Directive du Conseil et du Parlement Europen du 8 mai 2003 4 Livret Filire biothanol : Etat des lieux et perspectives , France betteraves/Passion crales, avril 2007 5 Groupement Intergouvernemental sur lEvolution du Climat (IPCC - Intergovernmental Panel on Climate Change), United Nations, Fouth Assessment report, chapter 12 Europe , Novembre 2007, Co-Prix Nobel de la Paix 2007

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chapitre 1

Les aflatoxines

coordination : Jean-Marc Fremy et Sylviane Dragacci

Introduction
Linvestigation mene lors de la "maladie X du dindon", qui a svi en 1960 en Angleterre, a permis de mettre en vidence la prsence dune toxine dans la nourriture de ces volailles, comportant des tourteaux darachide. Des tudes conduites sur la matire premire qui avait t contamine par une moisissure du genre Aspergillus aboutirent la caractrisation des aflatoxines (Asao et al, 1963). Ces travaux furent lorigine de la dcouverte des toxines de moisissures ou mycotoxines. Comme il est courant de complter ou dassurer la ration alimentaire du btail laitier par des tourteaux d'arachide ou un mlange de graines olagineuses, lventuel passage des aflatoxines dans le lait a t trs vite recherch. Ds 1963, il est dmontr que, chez les vaches laitires, l'aflatoxine B1 (AFB1), reprsentant majeur du groupe des aflatoxines, absorbe lors de l'ingestion de tourteaux contamins, est partiellement mtabolise en un driv, communment appel "Milk Aflatoxin 1" ou aflatoxine M1 (AFM1) (Allcroft et Carnaghan, 1963). Cela a fait entrevoir que les aflatoxines, et par extension des mycotoxines, peuvent atteindre l'alimentation de l'homme non seulement par voie directe "vgtal - homme" ou pseudo-directe "vgtal - produits vgtaux transforms - homme", mais aussi en empruntant un cheminement complexe le long des chanes alimentaires : vgtal alimentation animale - produits animaux et drivs - homme. Laflatoxine est reconne comme tant lun des plus puissants cancrognes dorigine naturelle.

1. Proprits physiques et chimiques


Les aflatoxines sont des molcules de faible poids molculaire (312 330), trs peu solubles dans leau, insolubles dans les solvants non polaires (Figure 1). Trs solubles dans les solvants organiques moyennement polaires (chloroforme et mthanol), elles sont assez facilement extraites. Sous lumire ultra-violette (UV longs), elles sont fluorescentes (bleue pour les AFB "blue" et verte pour les AFG "green", lAFM1 ayant une fluorescence bleu-mauve) (Asao et al, 1965). Figure 1 : Structure chimiques des aflatoxines B, G et M1
O O O
O

O
O O OH

OCH3
O

AFB1

O CH3

AFB2

OCH3

AFM1
O O O

O O

O O
O

OCH3

AFG1

OCH3

AFG2

AFB1 :

formule brute : C17H12O6

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AFB2 : AFG1: AFG2 : AFM1 :

Masse molaire : 312,3 g/mol formule brute : C17H14O6 Masse molaire : 314,3 g/mol formule brute : C17H12O7 Masse molaire : 328,3 g/mol formule brute : C17H14O7 Masse molaire : 330,3 g/mol formule brute : C17H12O7 Masse molaire : 328,3 g/mol

2. Mthodes danalyse (voir principes gnraux en Annexe 1)


Des procdures dchantillonnage spcifiques certaines matrices ont t labores. Dans les produits vgtaux, la qualit de lchantillonnage est primordiale compte tenu de leur contamination par les aflatoxines habituellement trs htrogne. Ainsi, dans le cadre des aliments pour animaux, la mthode AOAC 977.16 et les normes ISO 6497:2002 et pr NF EN ISO 6498 :1998 dcrivent des modes de prlvements permettant une rprsentativit du lot global par lchantillon. Concernant lalimentation humaine, le rglement (CE) n 401/2006 fixe les modes de prlvement d'chantillons et des mthodes d'analyse pour le contrle officiel des teneurs en mycotoxines des denres. Pour les produits laitiers, lchantillonnage est indiqu aussi au rglement (CE) n 401/2006. Les mthodes analytiques consacres aux aflatoxines peuvent tre classes selon trois technologies : celles strictement physico-chimiques ou immunologiques et celles combinant les deux principes. 2.1 Mthodes physico-chimiques Elles sont les premires approches dveloppes et bases sur des systmes chromatographiques pour la sparation et la dtection (qualitative ou semi quantitative) voire le dosage (quantitatif). La chromatographie sur couche mince (CCM) date des annes 1970. La caractrisation des signaux par simple lecture visuelle ou densitomtrique donne accs respectivement des informations semiquantitatives et quantitatives (mthodes AOAC 980.20 et 993.17). LAFB1 peut ainsi tre mesure des concentrations comprises au mieux entre 5 et 10 g/kg. Sur le mme principe, une mthode visant laflatoxine M1 (AFM1) dans le lait a t valide par lAOAC (980.21) et normalise (IDF/ISO 111:1982). Plus rcemment, une mthode consacre la recherche de lAFB1 dans laliment du btail a t publie (ISO 6651:2001). Le remplacement de la CCM par la chromatographie liquide haute performance (CLHP) a permis la fois dabaisser les limites de dtection des mthodes dun facteur 10 minimum et damliorer significativement la spcificit de la mesure. De nouvelles mthodes ont alors t valides pour le dosage des aflatoxines dans les grains (AOAC 990.33), lalimentation du btail (ISO 14718:1998 et ISO 17375:2006) et pour lanalyse plus cible de lAFM1 dans le lait (IDF 111A:1990). Lutilisation dun dtecteur fluorimtrique permet alors la quantification de lAFM1 partir de 0,015 g/L . 2.2 Mthodes immunochimiques Bases sur lutilisation danticorps anti-toxines, elles permettent le dpistage rapide des aflatoxines dans un grand nombre dchantillons sans quipement lourd. Les plupart de ces mthodes sont celles utilisant un marqueur enzymatique , ou dites Enzyme Immuno-Assay (EIA) et surtout EnzymeLinked Immuno Sorbent Assay (ELISA) . Cette dernire approche a t applique au dosage de lAFB1 dans les aliments et les grains et de lAFM1 dans le lait. Des kits commerciaux ont t valids par lAOAC comme par exemple celui rfrenc AOAC 989.06 ddi au dosage de lAFB1 dans les aliments pour animaux. En revanche, malgr la mise au point de mthodes ELISA pour la dosage de lAFM1 (Fremy et Chu, 1984) il convient de noter labsence ce jour de kit ELISA valid selon le protocole harmonis ISO/AOAC/IUPAC pour le dosage de lAFM1 dans les produits laitiers. Nanmoins, un guide ISO (14675) a t tabli donnant aux spcifications minimales que devrait respecter un kit ELISA pour lanalyse de cette aflatoxine dans les produits laitiers (IDF, 1999). Plus largement, lAOAC a dict des rgles pour la caractrisation des anticorps utiliss dans les mthodes immuno-chimiques (Fremy et Usleber, 2003). 2.3 Mthodes par chromatographie dimmuno-affinit (CIA) Utilisant les anticorps anti-toxines, la CIA sapplique la purification slective des aflatoxines partir dextraits alimentaires. Cette technologie, en combinaison avec les techniques de sparation et dtection-dosage (CCM ou CLHP) a permis damliorer la fois slectivit et limites de dtection. De

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telles techniques combines ont t appliques lAFB1, aussi bien pour lalimentation du btail (AOAC 2003.02), que pour lalimentation humaine (AOAC 991.31 ou Norme NF EN 12955 pour mas, arachides brutes et beurre d'arachide ; (AOAC 999.07 ou Norme NF EN 14123 pour cacahutes, pistaches, figues et paprika en poudre ; AOAC 2000.16 pour aliments pour bbs). Lextrait purifi est soumis ensuite une analyse CLHP. Dautres mthodes analytiques valides ont utilis cette combinaison CIA-CLHP et ont t appliques lAFM1 ; il sagit notamment de lIDF 171:1995 ISO 14501 pour la poudre de lait, et de lAOAC 2000.08 pour les laits liquides, les deux mthodes affichant des limites de quantification en de de la limite rglementaire fixe 0.05 g/L. Citons la mthode valide rfrence IDF 190.2003 ISO 14674 utilisant le principe de la CIA combin une dtection par CCM qui est applique galement lAFM1 dans les laits liquides et en poudre. 2.4 Evolution des mthodes Les donnes communiques par les laboratoires participant des essais circulaires organiss par les rseaux WHO/IARC et le FAPAS/CSL-UK permettent dtablir la tendance suivante : concernant lAFB1 dans le mas, lutilisation de la CCM a significativement recul entre 1978 (90% des techniques), 1989 (43%) et 2002 (7%) ; la CLHP linverse a vu son utilisation saccrotre considrablement (respectivement 5%, 36% et 77%). Enfin la technique ELISA, non applique en 1978, est reste entre 1989 et 2002 utilise par 7% des participants. Concernant la recherche de lAFM1 dans le lait, un recul de lusage de la CCM sest confirm (37% en 1989 4% en 2002), alors que la CLHP sest nettement impose (35% 89%) et lELISA stabilis (9%). Cette volution technologique a permis une amlioration de la performance des mthodes en particulier au regard de la prcision. Pour illustration, alors quen 1978 lindice de satisfaction indiquait 50% pour une teneur en AFB1 de 14,0 g/kg dans un chantillon de mas, lindice tait de 82% en 2002 pour des chantillons moins concentrs (6,8 g.kg-1). Le mme constat a t tabli pour lAFM1 dans le lait en poudre, avec un indice de satisfaction de 43% en 1989 pour une teneur de 0,49 g/kg contre 74% en 2002 pour une teneur de 0,26 g/kg (Honma et al., 2004).

3. Facteurs influenant la teneur dans les denres


Les aflatoxines B1, B2, G1 et G2 sont susceptibles dtre produites par certaines souches despces appartenant au genre Aspergillus telles que A. flavus pouvant produire les aflatoxines B1 et B2, A. parasiticus et A. nomius (rencontre rarement) pouvant produire, en plus, les aflatoxines G1 et G2. A. flavus est le principal agent de contamination du mas et des graines de coton, tandis quA. parasiticus est prsent surtout dans les graines darachide (Davis et Diener, 1983).

3.1 facteurs de dveloppement fongique et de production daflatoxines Les conditions les plus favorables pour un dveloppement dA. flavus et une production daflatoxines sont une activit en eau (AW) de 0,84-0,86 et une temprature comprise entre 25 et 40 oC (Christensen et al., 1973). Ces prolifrations fongiques et les productions d'aflatoxine ont lieu au champ et au cours du stockage. Au champ, les insectes attaquent la surface des grains facilitant laccs de la moisissure aux structures internes qui contiennent les nutriments et augmente le risque de contamination de la partie comestible. Un tel scnario ne concerne pas seulement les zones tropicales et les cultures darachide mais aussi les zones tempres et certaines cultures comme le mas, lors de saisons particulirement chaudes et sches. Un mas rcolt en 2003 (t caniculaire) dans un pays dEurope mridionale, a prsent une contamination par lAFB1, inhabituelle sous cette latitude et rvle par la prsence dAFM1 dans le lait de vache (RASFF, 2003). Un tel cas (mmes crale et pays) sest reproduit en 2005. Une enqute ralise aux Etats-Unis en 1988, qui tait galement une anne inhabituellement chaude et sche dans la zone septentrionale (7 tats du Middle West), a montr que 8% des mas rcolts dans cette zone contenaient des aflatoxines (Russell et al., 1991). A linverse des crales et des graines de protagineux ou dolagineux, la contamination des fourrages et des ensilages par les mycotoxines a t peu tudie. Ceci sexplique par la faible importance des changes commerciaux des fourrages qui sont principalement produits, conservs et consomms la ferme. La contamination des fourrages commence au champ et se poursuit au cours des tapes de rcolte, de schage, de manutention et de stockage. Une grande partie de linoculum fongique est apporte par la terre au moment de la rcolte, les poussires et les restes de vgtaux de la rcolte prcdente.

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Les moisissures nont pas toujours les conditions optimales pour se dvelopper et produire les mycotoxines. Cest le cas des fourrages conservs au sec et dans lesquels les moisissures ne peuvent que survivre sous forme de spores. Cest le cas aussi des fourrages pour lesquels Lacey (1975) a montr que les conditions de pH acide (pH 4) de lensilage ne sont pas favorables la croissance dA. flavus et donc la production dAFB1. Peu dtudes ont t ralises sur leffet des conservateurs densilage lgard du dveloppement des moisissures et de leurs productions de toxines. En laboratoire, des tudes ont montr que certains conservateurs (p-mthyl et p-propyl hydroxy-benzoate, acide benzoique, acide sorbique) peuvent activer in vitro la production daflatoxines (Bauer et al., 1983 ; Gareis et al., 1984 ; Sanchis et al., 1988). Par contre sur le terrain, lors de lensilage, selon la dose dacide sorbique employe, le dveloppement dA. flavus peut tre retard (concentration dacide sorbique = 0,05% dans lensilage) ou totalement inhib (concentration dacide sorbique = 0,1%) (Gareis et al., 1984). En revanche, lacide propionique na pas deffet sur la production dAFB1. Randby (1996),a montr quun conservateur homologu pour ses effets sur les profils fermentaires de lensilage (pH, concentration en acides gras courts, acide lactique, ammoniaque) nest pas forcment efficace contre un dveloppement fongique en surface ou sur le front dattaque du silo (. Ce critre est prendre en compte pour lautorisation des additifs densilage. Bien que les aflatoxines ne soient pas considres comme des mycotoxines majeures des fourrages conservs, elles ont pu tre dtectes dans certains foins ou ensilages (Le Bars, 1976 ; Kalac et Woolford, 1982 ; Whitlow et Hagler, 2002). La prsence dA. flavus a pu tre identifie dans des foins mal schs ayant chauff (Pelhate, 1987). Bien que la production daflatoxines nait pas t dmontre aprs la mise en silo, leur prsence dans le mas au moment de la rcolte entranera une contamination de lensilage de mas puisque ces toxines sont stables dans les conditions physicochimiques de conservation de lensilage. Par ailleurs, lexposition prolonge lair du front dattaque du silo peut favoriser le dveloppement dA. flavus et augmenter le niveau de toxines dans cette partie du fourrage qui est distribue aux animaux.

3.2. Impact des procds technologiques sur la teneur en toxine Les aflatoxines sont peu sensibles la plupart des traitements thermiques (strilisation, pasteurisation, conglation) ou de schage (dshydratation, lyophilisation), lexception de la torrfaction. Certains procds technologiques modifient la teneur initiale en aflatoxines dans la matire premire pour aboutir, selon la matrice et le procd, soit une quasi limination soit au contraire une concentration de la teneur en aflatoxines dans le produit fini ou laliment transform. Seules des tudes appropries et spcifiques chaque traitement de transformation permettent de connatre le taux de dilution ou de concentration au niveau du produit transform par rapport la teneur initiale en aflatoxines. Quelques cas de variation de la teneur en aflatoxines au cours de certains procds technologiques sont cits ci-aprs. 3.2.1 Mas Les procds de transformation du mas modifient la teneur initiale en AFB1. Avec la voie humide (amidonnerie) le gluten, le germe et lamidon contiennent ainsi respectivement 13 17%, 6 10% et 1% de la teneur initiale des grains (Bennett et Anderson, 1978). Avec la voie sche (semoulerie) les teneurs les plus hautes sont retrouves dans le germe et le son et la plus basse dans la farine (Scott, 1984). 3.2.2 Brasserie En brasserie, les tudes exprimentales (contaminations artificielles) partir du malt dorge, du mas, de sorgho et du bl montrent que, selon les tudes et les mlanges de crales utiliss, le procd rduit les niveaux daflatoxines dans la bire jusqu 5 27 % de la teneur initiale (Chu et al., 1975, Steiner et Lanzlinger, 1978).

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3.2.3 Graines olagineuses Le procd de torrfaction des arachides de bouche (cacahutes) est efficace pour rduire de 50 80% la teneur initiale en aflatoxines (Lutter et al., 1982). Lors du procd dextraction dhuile, les aflatoxines B et G se retrouvent majoritairement dans les tourteaux (tourteaux de soja, arachide, coton) et minoritairement dans lhuile brute. Les traitements ultrieurs de raffinage de lhuile liminent les traces daflatoxines. En ce qui concerne les tourteaux destins lalimentation animale, des procds de dtoxication base dammoniac associ ou non au formol permettent dliminer jusqu 95% de la teneur initiale en aflatoxine B1. Cette opration ne peut pas tre utilise comme procd de dcontamination pour un produit destin lalimentation humaine directe (Rglement 1881/2006). Nanmoins ce type de dcontamination peut avoir des consquences en alimentaion humaine : lorsque ces aliments ainsi traits sont administrs des vaches, la teneur en aflatoxine M1, mtabolite de lAFB1 excrte dans le lait (voir ci-aprs), est rduite par rapport celle du lait des vaches ayant recu les aliments non traits (Viroben et al., 1983 ; Fremy et Quillardet, 1985 ; Fremy et al., 1987 ; Hoogenboom et al., 2001). 3.2.4 Laits et produits laitiers LAFB1 absorbe par une vache laitire est excrte dans le lait sous forme d'AFM1 (voir 4.1). Linfluence des procds de transformation du lait en divers produits laitiers sur la teneur en AFM1 est dcrite dans la revue de Galvano et al. (1996b). Les procds de strilisation et de pasteurisation, mme suivis dune rfrigration, naffectent pas la teneur en AFM1 par rapport celle du lait cru. Lors du procd de schage, lAFM1 se retrouve en totalit dans la poudre, avec un facteur de concentration de 10 du fait de llimination de leau. Lors de lcrmage, 90% de la teneur initiale en AFM1 du lait reste dans le lait crm et 10% passe dans la crme. Lors du barattage lAFM1 se retrouve en quasi-totalit dans leau de barattage et de lavage (babeurre) et pas dans le beurre. Lors de la transformation du lait crm ou du babeurre en poudre, la totalit de lAFM1 se retrouve dans la poudre (Fremy et Dragacci, 1999). En technologie fromagre, une variabilit de rpartition de la teneur en AFM1 est observe selon la particularit du procd de caillage: Pour le caillage totalement lactique (type yaourt), lmission de lactosrum tant faible, la rpartition de la teneur en AFM1 entre yaourt et lactosrum est de 90/10. Durant la conservation rfrigre, une perte supplmentaire dune dizaine de % est estime (Govaris et al., 2002). Pour les caillages de type lactique-prsure, lAFM1 se rpartit entre le caill et le lactosrum, par exemple, pour le caillage mi-lactique - mi-prsure (fromages pte molle type Brie) : 50% dans le caill et 50% dans le lactosrum, pour le caillage 40% lactique 60% prsure : 40% dans le caill et 60% dans le srum. Dans le caill, la quantit initiale dAFM1 change peu mais peut voluer en terme de concentration selon les procds ultrieurs de prparation fromagre (pressage, affinage) (Fremy et Dragacci, 1999). Dans le lactosrum, comme pour le lait, un facteur de concentration en AFM1 de 10 sapplique lors de la fabrication de lactosrum en poudre. Lorsque le procd dultrafiltration est appliqu au lactosrum, lAFM1 montre une plus grande affinit pour la partie protique que pour le lactose ( Mendoca et Venacio, 2005).

4. Devenir et Proprits toxicologiques


Le JECFA a publi sa plus rcente valuation des risques dus aux aflatoxines B et G dans son 49e rapport (WHO Technical report series, 1998) et ceux dus lAflatoxine M1 dans son 56e rapport (WHO Technical report series, 2001). A cette occasion, il a examin les tudes effectues depuis lvaluation de lIARC en 1993. Les donnes et conclusions mentionnes dans cette section sont largement tires de ces rapports du JECFA et de lIARC. 4.1 toxicocintique 4.1.1 Chez les mammifres Les aflatoxines sont absorbes au niveau du duodnum (Kumagai, 1989). Chez les animaux monogastriques, labsorption pourrait reprsenter prs de 90% de la dose administre (Gregory et al.,

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1983). Aprs absorption, les aflatoxines sont vhicules dans lorganisme aprs fixation sur les protines plasmatiques. Cest le cas de lAFB1 lie lalbumine. La prsence de cet adduit dans le srum peut servir de bio-indicateur d'exposition (Chapot et Wild, 1991). Les aluminosilicates (Phillips et al., 1988) peuvent interagir avec laflatoxine en formant des complexes qui ne sont pas absorbs dans le tube digestif des animaux. De nombreuses publications montrent que ces produits et leurs apparents peuvent attnuer les effets toxiques des aflatoxines chez le btail (Guerre, 2000), ce qui explique lintrt des composs adsorbants en alimentation animale. Les proprits adsorbantes des charbons activs ont galement t observes, mais en raison de la coloration noire quils donnent aux aliments, ces composs sont essentiellement utiliss titre curatif (Galvano et al., 1996a). Enfin, les parois de bactries lactiques en particulier de propionibactries (Gratz et al., 2005) ainsi que les parois de la levure Saccharomyces cerevisiae possdent un effet adsorbant in vitro et ex vivo (Yiannikouris et al.,2006) saccompagnant dune diminution de la toxicit des aflatoxines in vivo (Stanley et al., 1993, Raju et Devegowda, 2000). Il convient toutefois de signaler que lutilisation de ligands en vue de dtoxifier des aliments contamins par des mycotoxines nest pas prvue en 2007 par la rglementation Europenne (Rglement CE 1831/2003). Les aflatoxines, en particulier lAFB1 qui a t la plus tudie, subissent un mtabolisme hpatique rapide se droulant en deux phases (Eaton et Gallagher, 1994) (voir Figure 2): - Une phase I de biotransformation qui met en jeu les enzymes mono-oxygnases cytochromes P450 (CYP). Les CYP2a5 et CYP3a interviennent chez la souris, alors que les CYP1A2 et 3A4 sont plutt impliqus chez les primates sub-humains. La voie dominante de lactivation in vivo de lAFB1 dans le foie humain se ferait par le CYP1A2 au travers des ractions doxydation formant par hydroxylation lAFM1 et par poxydation lAFB1 8,9poxyde. Le CYP3A4 dont laction serait moins prpondrante, se trouve impliqu dans la formation par hydroxylation de la 3-hydroxy-AFB1 (AFQ1) et plus modestement dans la synthse de lAFB1 8,9-poxyde. Dans cette phase deux autres mtabolisations enzymatiques de lAFB1 interviennent : une O-dmthylation pour former lAFP1 et une rduction de la fonction ctone en C1 (via une NADPH rductase) pour former laflatoxicol (AFOL). Les mtabolites AFM1, AFP1 et AFQ1 sont limins dans les urines des mammifres exposs lAFB1. Seule lAFM1 est limine dans le lait. La prsence de ces mtabolites dans les urines et de lAFM1 dans le lait et dans le srum, peut servir de bio-indicateur d'exposition (voir 5.3). - Une phase II du mtabolisme concerne le devenir de lAFB1 8,9-poxyde. Elle comprend la conjugaison de lAFB1 8,9-poxyde au glutathion par des glutathion S-transfrases (GST). Une conjugaison lacide glucuronique des mtabolites hydroxyls aboutit la formation de glucurono-conjugus. Elle comporte aussi lassociation de lAFB1 8,9-poxyde aux acides nucliques (ADN), engendrant la toxicit dont notamment la gnotoxicit et la cancrognicit (voir plus loin). Le site de formation dadduits l'ADN se situe en position N7 de la guanine (Cullen et Newberne, 1994). La prsence dadduits lADN dans les urines, montrant linitiation dun processus de rparation du gnome, conscutif son altration, peut tre aussi utilise comme indicateur dexposition(voir 5.4). Cette alternative de devenir de lAFB1 8,9-poxyde entre glucurono-conjugaison et association lADN, se traduit selon lespce animale et selon des situations particulires (dficit physiologique du foie, apport trs imortant en toxines, polymorphisme des GST) une variabilit de la sensibilit aux aflatoxines. 4.1.2 Chez les volailles Le mtabolisme et surtout la bioactivation hpatique de lAFB1 en AFB1-8,9-poxyde et en aflatoxicol joueraient un rle dterminant dans lapparition ultrieure de lsions hpatiques. Une forte bioactivation pourrait expliquer la plus grande sensibilit des canards aux aflatoxines alors que les cailles seraient plus rsistantes en raison de faibles capacits mtaboliques. Les voies mtaboliques de phase II se droulent de manire similaire ce qui est dcrit chez les mammifres : conjugaison de lpoxyde au glutathion, conjugaison lacide glucuronique des mtabolites hydroxyls. Si la rpartition entre espces aviaires des enzymes de phase II est moins tudie que celle de phase I, il semble que le niveau dexpression des GST soit dterminant pour expliquer les diffrences de sensibilits lAFB1 entre les espces doiseaux (Klein et al., 2002). 4.1.3 Chez les poissons Des tudes menes chez des espces aquatiques indiquent aussi des diffrences inter-espces dans le mtabolisme de laflatoxine dans lorganisme aprs ingestion.

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Une tude toxicocintique mene chez le poisson chat (Ictalurus punctatus) a montr, aprs administration orale dAFB1 (250 g/kg p.v.), quelle est fortement lie aux protines plasmatiques (95%). Les concentrations des mtabolites sont maximales aprs 4 heures, allant de 596 g/L dans le plasma 40 g/kg dans le muscle et disparaissent rapidement aprs 24 heures : la concentration dans le plasma est de 32 g/L et infrieure 5 g/kg dans le muscle. Il est noter que lexcrtion rnale et biliaire compte pour moins de 5% de la dose administre indiquant une absorption incomplte. Chez ce modle poisson chat ces donnes de toxicocinetique indiquent laccumulation trs faible dAFB1 et de ses mtabolites dans les tissus (Plakas et al., 1991). A loppos, ltude de Larsson et al. (1992) a montr uneaccumulation plus leve chez la truite arcen ciel de cette toxine et de ses mtabolites dans le foie, le rein, les rosettes nasales, les caeca pyloriques, la mlanine uvale et lhumeur aqueuse des yeux. La rduction de lAFB1 en aflatoxicol (AFOL) par une AFB1-reductase NADPH-dpendante cytosolique est une voie mtabolique classique chez les poissons (Eaton et Ramsdell, 1991). A la diffrence des mtabolites hydroxyls (AFM1 et AFQ1), lAFOL conserve un potentiel mutagne en raison de loxydation microsomale redonnant de lAFB1 partir de laquelle de lAFB1 poxyde peut tre nouveau gnr (Bailey et al., 1994),. LAFOL peut galement tre excrt dans la bile aprs glucurono-conjugaison (Loveland et al., 1979). Ainsi, la production dAFOL reprsente une voie possible de dtoxification (glucuronoconjugu excrt) mais aussi une possible voie de retour vers lAFB1 poxyde. Des tudes ont compar, le mtabolisme de lAFB1 chez la truite arc-en-ciel et le poisson chat (Plakas et al., 1991). Chez ce dernier lAFB1 est faiblement oxyde dans les microsomes des hpatocytes : peu dAFB1 8,9-poxyde est produit et lAFB1 est rapidement rduite en AFOL, et la voie de dtoxification est privilgie. A loppos, les microsomes des hpatocytes de la truite activent cette toxine (production dAFB1 8,9-poxyde) un taux 6 fois plus lev, alors que la production dAFOL est 40-65 fois plus faible. Ces rsultats suggrent que le manque dactivation dAFB1, contribue la rsistance du poisson chat la toxicit et lhpatocarcinognicit de lAFB1 (Gallagher et Eaton, 1995).

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Figure 2 : Mtabolism me de laflat toxine B1 da ans le foie


(rapport de lIP PCS, Environme ental Health Crt tieria N11, WH HO, 1979, Fig.2)

4.2 toxic cit aigu Les tud des de toxicit t aigu mon ntrent une gr rande variab bilit dune es spce anima ale une aut tre : ainsi la DL50 varie de 0,3 3 mg/kg p.c. pour le can neton 9 mg g/kg p.c. pou ur la souris ( (Patterson et e Allcroft, C le can neton, ladministration de 100 g dAFB1 d entra ane en 12 heures la survenue s 1970). Chez dhmorragies et de e ncrose h patocytaire en rgion priportale. p U Une prolifra ation des ca analicules biliaires est constat e 48 72 he eures aprs ladministrati l ion. L'AFB1 est e la plus to oxique suivie e en ordre dcroiss sant par l'AFM1, l'AFG1, l'AFB2 et l'A AFG2. La toxicit aigu est gnrale ement fatale pour les animaux x avec observation lors de lautopsie dun foie dcolor et t augment de volume. Lorsque l'animal survit, on ob bserve un ict tre avec pr sence d'asc cite et dans le foie des h hpatocytes vacuols et une prolifration des canalic cules biliaire es. Les reins s prsenten nt des glom rulonphrite es et les poumons s sont congestionns. Les L signes comportemen c ntaux les plu us caractris stiques avan nt la mort sont une e dmarche chancelante, de la nervo osit et des spasmes mu usculaires (A Allcroft et Ca arnaghan, 1963). Chez le porc, des tudes expr rimentales d aflatoxicose aigus ont t conduite es (Cysewsk ki et al., 1968 ; Miller M et al., 1982) 1 : la ma anifestation clinique observe aprs administrati ion unique de d 1,2 1,98 mg dAFB1/kg p.v. p (sous for rme de toxine purifie ou u dun mlange daflatoxines) est un pisode hmorra agique svre e : les autop psies ont mon ntr des hm morragies internes massives (Meissonnier et

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al., 2005). Lhistologie rvle une forte atteinte hpatique et l'exploration des activits enzymatiques spcifiques du foie sur des prlvements sanguins confirme le tableau lsionnel. Les activits phosphatases alcalines, aspartate amino-transfrases et ornithine-carbamyl-transfrases sont augmentes et lactivit gamma-glutamyl-transfrase reste stable (Cysewski et al., 1968 ; Miller et al., 1982). Chez des porcs exposs une dose quotidienne de 0,2 mg dAFB1/kg p.v. pendant 5 jours. Les observations recueillies sont plus proches des manifestations d'une intoxication chronique que des manifestations aigus (Osuna et Edds, 1982a,b,c). Les tudes menes chez les poissons ont montr une grande diffrence inter-espces dans la sensibilit laflatoxine. Ainsi, le saumon coho (Onchorhynchus kisutch), la carpe indienne (Labeo rohita) et le poisson chat sont plus rsistants laflatoxine que la truite arc-en-ciel (Bauer et al., 1969, Hendricks, 1994, Gallagher et Eaton, 1995 ; Sahoo et Mukherjee, 2001b). En injection intrapritonale, la DL50 est obtenue une dose environ 15 fois plus leve chez la carpe que chez la truite (11,5 vs 0.81 mg/kg p.v.) (Sahoo et Mukherjee , 2001b) et la toxicit orale aigu est 20 fois plus leve chez la truite que chez le poisson chat (0,5 mg/kg daliment pour la truite et 10-15 mg/kg daliment chez le poisson chat) (Jantrarotai et Lovell, 1990). En effet, chez le poisson chat une toxicit sub-ltale na t observe qu partir dune dose de 10 mg/kg p.v., incluant une rduction de la croissance, une anmie et des ncroses hpatiques (Hendricks, 1994).

4.3 Toxicit chronique 4.3.1 gnotoxicit La gnotoxicit des aflatoxines a une grande variabilit entre les espces en raison de la proportion variable dAFB1 mtabolise en 8,9- poxyde hautement ractif par rapport aux AFM1 et AFQ1, bien moins toxiques (Cullen et Newberne, 1994). LAFB1-poxyde a une dure de vie courte, mais est hautement ractif et est considr comme le principal mtabolite gnotoxique par fixation lADN. La liaison covalente sur des sites critiques de lADN induit des mutations. Les mutations les plus tudies intressent le gne de suppression tumorale p53 et loncogne ras (Eaton et Gallagher, 1994). La variabilit de lactivit inter-espces et mme inter-individus dexpression des isoformes de GST serait elle aussi un facteur influenant la sensibilit lAFB1 : la glutathion-S-transfrase (GST) par formation dun conjugu limin par voie biliaire permet la dtoxication de lAFB1-poxyde enlimitant la formation dadduit lADN. Concernant les autres aflatoxines, les tudes exprimentales sont assez limites. La mtabolisation de lAFB2 par lintermdiaire dune conversion en AFB1 induit une liaison sur lADN, mais ne provoque pas de mutation gnique. Nanmoins le caractre mutagne de lAFB2 a t observ chez la bactrie. LAFG1 induit des altrations chromosomiques et est mutagne chez la bactrie. Les donnes exprimentales sur la mutagnicit et la gnotoxicit spcifiques de lAFG2 sont quasi inexistantes. LAFM1 est un agent gnotoxique, mais son caractre cancrogne apparat bien plus faible que celui de lAFB1 (voir suivant).

4.3.2 Pouvoir cancrogne Lorgane cible est le foie. Lors des tudes initiales entreprises chez lanimal expos sur une longue priode, la dose dAFB1 engendrant des tumeurs du foie varie selon les espces : de 10 30 g/kg daliment pour les poissons et les oiseaux, ou de 15 150 000 g/kg daliment pour les mammifres (Wogan, 1992), pouvant sexpliquer par des diffrences dans lquipement enzymatique du foie (voir paragraphe 4.1). De nombreuses tudes menes pendant les annes 70 et 80 avaient montr le caractre hautement cancrogne hpatique de lAFB1 (JECFA, WHO, 1999). LAFB1 possde le plus fort potentiel cancrogne de toutes les aflatoxines. Les diffrences dans la biotransformation dAFB1 sont un critre dterminant dans la variabilit de rponses entre les espces animales leffet carcinogne de lAFB1. Ainsi, la truite arc-en-ciel est extrmement sensible la toxicit et leffet hpatocarcinogne de lAFB1, alors que le saumon coho et le poisson chat le sont beaucoup moins (Hendricks, 1994 ; Gallagher et Eaton, 1995) : lepoxidation de lAFB1 est moindre chez le saumon coho que chez la truite et la liaison de lAFB1 lADN est 56 fois plus leve chez la truite arc-en-ciel que chez saumon coho aprs une injection intra-pritonale dAFB1 et 18 fois plus leve par ingestion orale dAFB1.

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Les autres voies mtaboliques et llimination dAFB1 sont similaires chez les deux espces, ce qui suggre que seule lpoxydation mdie de lAFB1 par les enzymes des cytochromes et sa liaison prfrentielle sur lADN contribuent la diffrence de cancrognicit observe. Le potentiel cancrogne exprimental de lAFM1 est 10 fois moindre que celui de lAFB1 mme chez des espces sensibles telles que la truite Arc en Ciel et le rat Fischer (JECFA, WHO, 2001). Le CIRC lors de son valuation en 1993 conclut quil y a une suffisante vidence de la cancrognicit de lAFB1 , une suffisante vidence de la cancrognicit en exprimentation animale et une inadquate vidence de la cancrognicit chez lhomme de lAFM1 , une suffisante vidence de la cancrognicit en exprimentation animale de lAFG1 , une vidence limite de la cancrognicit en exprimentation animale de lAFB2 , et une inadquate vidence de la cancrognicit de lAFG2. Le potentiel cancrogne peut tre influenc par dautres facteurs hpatotoxiques tels que lalcool, le tabac ou des agents infectieux. La cancerognicit hpatique relie lAFB1 est substantiellement plus leve chez les porteurs de virus de lhpatite B (HBV) ( 0,3 cas par an / 100 000 individus par ng dAFB1/kg de p.c. et par jour) que chez les non porteurs ( 0,01 cas par an / 100 000 individus par ng dAFB1/kg de p.c. et par jour) en se basant sur le dosage de lantigne de surface du virus dans le sang (HBsAg- et HBsAg+). Ainsi, une vaccination anti HBV pourrait diminuer le risque et affaiblir la prvalence de cancer hpatique pour les populations exposes la fois lHBV et lAFB1. Certaines observations montrent la possibilit quil en soit de mme pour lHCV (JECFA, WHO, 1999 et 2001). 4.3.3 immunotoxicit Les effets immunomodulateurs et immunotoxiques des aflatoxines ont t tudis in vitro et in vivo dans plusieurs espces animales y compris les poissons (Meissonnier et al., 2006 ; Ottinger et Kaatari, 2000). Les aflatoxines affectent la rponse inflammatoire. Elles inhibent plusieurs fonctions des macrophages telles que la phagocytose, la production de radicaux oxygns et la scrtion de cytokines, mais aussi le chimiotactisme des neutrophiles et lactivit des cellules Natural Killers (Bondy et Pestka, 2000). Concernant la rponse immunitaire spcifique, les effets des AFs sur la production danticorps sont variables dans les diffrentes espces animales. Une exposition prolonge des concentrations leves de toxines est gnralement ncessaire pour induire une rduction significative des concentrations d'anticorps plasmatiques. L'effet immunotoxique le plus marqu des aflatoxines sobserve sur l'immunit mdiation cellulaire (Marin et al., 2002 ; Theumer et al., 2003). En effet, les aflatoxines entranent une atrophie des organes lymphodes, une diminution de l'hypersensibilit retarde en rponse des mitognes, une altration de la prolifration lymphocytaire et une modification de la production de cytokines (Raisuddin et al., 1993, Otim et al., 2005, Meissonnier et al., 2006). Les effets immunosuppresseurs des aflatoxines conduisent, chez les animaux recevant une alimentation contamine, une augmentation de la sensibilit aux infections microbiennes (bactrienne, parasitaire et virale) et une diminution de lefficacit vaccinale (Oswald et al., 2005). Des tudes pidmiologiques menes sur des populations humaines exposes de faon chronique de fortes doses daflatoxines montrent que cette mycotoxine a des proprits hpatocarcinognes chez les adultes en particulier lorsquelle est associe l'infection par le virus de l'hpatite B. Chez les enfants, une altration de la croissance et des anomalies immunitaires ont galement t observes (Turner et al., 2003 ; Gong et al., 2004 ; Jiang et al., 2005) (voir 5.1.2).

4.3.4. autres effets LAFB1 affecte la reproduction. Exprimentalement chez la souris, lors dune intoxication chronique (0,05 g/kg p.c. pendant 14 jours), Sinha et Dharmshila (1994) ont observ des anomalies du nombre et de la morphologie des spermatozodes. Le porcelet expos aux aflatoxines pendant sa vie intrautrine montre la naissance dans le plasma, une diminution des taux de protines totales et dalbumine, une augmentation des triglycrides et du cholestrol ainsi que des transaminases plasmatiques.

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4.4 Valeur Toxicologique de Rfrence


En 1993, le CIRC a class lAFB1 dans le groupe 1, lAFM1 dans le groupe 2B et lAFG1 dans le groupe 3. Le JECFA et le SCF nont pas fix de dose journalire tolrable (DJT) pour les aflatoxines2. En effet, ces substances prsentant des effets cancrognes gnotoxiques sans seuil, la seule approche raliste est de rduire lexposition un niveau aussi faible que possible suivant le principe ALARA (As Low As Reasonnably Achievable). Cependant, en se fondant sur des donnes pidmiologiques, le JECFA (49e rapport, 1998), considre qu'en Europe, l'ingestion de 1 ng d'aflatoxines/kg p.c./j augmenterait l'incidence du cancer du foie de 0,013 cancer par an pour 100 000 personnes. Cette incidence globale est un indice composite calcul partir de deux incidences observes, l'une chez les populations HBsAg+ qui reprsenteraient 1 % de la population europenne (0,3 cancer par an pour 100 000 personnes par ng d'aflatoxines/kg p.c./j) et l'autre chez les personnes HbsAg- (0,01 cancer par an pour 100 000 personnes par ng d'aflatoxines/kg p.c./j).

5. Exposition humaine aux aflatoxines


5.1 Effets sur la sant humaine (donnes pidmiologiques) 5.1.1 Intoxication aigu Les effets se manifestent par une hpatite aigu, Les symptmes cliniques typiques mais non spcifiques incluent jaunisse, dpression, anorexie, et diarrhe. La mortalit a atteint 25% lors dintoxications en Inde (Krishnamachari et al., 1975). Deux syndromes humains dtiologie indfinies ont t relis lingestion daliments contamins par les aflatoxines car aucune autre cause n a pu tre identifie et parce que ces mycotoxines ont t trouves chez les patients : le Kwashiorkor et le syndrome de Reye. Le Kwashiorkor associe hypoalbuminmie et immunosuppression. Le syndrome de Reye associe encphalopathie et dgnrescence graisseuse des viscres. Nanmoins ces cas ayant t observs chez des populations en malnutrition, le mtabolisme des aflatoxines peut tre modifi (CAST, 2003). La dernire intoxication aigu reconnue sest droule davril septembre 2004 dans les provinces du centre et de lest du Kenya durant laquelle 341 cas ont t diagnostiqus conduisant 123 dcs (CDC, 2004). A la suite de cet pisode, lOMS a tenu un atelier de travail en 2005 sur la stratgie de sant publique adopter afin de prvenir lexposition aux aflatoxines. 5.1.2 Intoxication chronique La plupart des tudes pidmiologiques tendent montrer lexistence dune corrlation entre une exposition chronique laflatoxine via le rgime alimentaire et une prvalence du cancer primitif du foie. Nanmoins, cette relation est module par dautres facteurs qui influencent ce risque de cancer, notamment linfection virale lhpatite B (HBV). La majorit des tudes pidmiologiques tayant la relation aflatoxine - cancer du foie provient dAsie du Sud-Est, de Chine, dAfrique Occidentale et Equatoriale, rgions du globe o la prvalence de lHBV et de lAFB1 sont leves. En Amrique Latine, la prvalence du cancer primitif du foie et de l'infection lHBV est faible alors que lexposition lAFB1 est leve. La conduite de nouvelles tudes pidmiologiques dans les rgions dites risque a t recommande par le JECFA en intgrant pour certains pays des campagnes de vaccination anti-HBV. Lorsque ces tudes auront t ralises, une r-valuation des risques pour l'homme des aflatoxines pourra tre effectue. Chez les enfants dans certaines rgions africaines, une altration de la croissance et de quelques paramtres immunitaires a galement t observe (Turner et al., 2003 ; Gong et al., 2004 ; Jiang et al., 2005).

Cependant, en 1997, des valeurs indicatives calcules en utilisant des modles dextrapolation mathmatiques de quantification du risque (avec des facteurs de scurit de 2000 5000) ont t proposes par le Conseil suprieur d'hygine publique de France (CSHPF) telles que 0,15 ng/kg p.c./j pour lAFB1 ou 0,20 ng/kg p.c./j pour lAFM1.

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5.2 Exposition de la population Franaise Une tude de la ration alimentaire totale (EAT, 2004) a t entreprise en 2000, afin de connatre le niveau de consommation et dexposition de la population franaise gnrale et vgtarienne aux aflatoxines partir daliments prt consommer (Leblanc et al., 2005). Les rsultats montrent quaucun chantillon sur les 78 analyss en aflatoxines B1, B2, G1 et G2 ainsi quaucun des 70 analyss pour la recherche daflatoxine M1 na t retrouv un niveau suprieur aux limites de dtection, et donc celui des limites rglementaires communautaires en vigueur (CE, 2001). Le tableau 1 rcapitule les apports moyens et au 95me percentile de consommation pour diffrents types de populations franaises. Tableau 1 : Estimation des apports alimentaires moyens et des forts consommateurs (P95) pour diffrents types de population en aflatoxines B1,B2, G1 et G2 et en aflatoxine M1 (EAT, 2004)
Apport moyen (ng/kg p.c./j) Apport au P95 (ng/kg p.c./j) % d'individus pouvant dpasser la "limite maximale1" 0,01 3,4 16,2 2,6 23,0 Apport moyen (ng/kg p.c.j) AFM1 0,09 0,022 0,10 0,10 0 Apport au P95 (ng/kg p.c.j) % d'individus pouvant dpasser la "limite maximale1" 0 0,2 0 0 0

Type de population

Population gnrale

Adultes (15 ans et +) Enfants (3-14 ans)

AFB1, B2, G1 et G2 0,12 0,35 0,32 0,60 0,40 0,90 0,89 1,60 0,90 2,10

0,21 0,55 0,20 0,30 0

Ovolactovgtariens Population vgtarienne Lactovgtariens (15 ans et +) Vgtaliens

1 : limite maximale fixe par le JECFA et le SCF 1 ng/kg p.c./j

A titre de comparaison, la Tche europenne SCOOP europenne3 de 1997 a estim l'exposition moyenne de la population franaise laflatoxine B1 1,3 ng/kg p.c./j et laflatoxine M1 0,4 ng/kg p.c./j. Les aliments les plus contributeurs cette exposition sont, en raison de leur forte consommation, les crales et les produits craliers pour laflatoxine B1, et le lait et la poudre de lait pour laflatoxine M1. 5.3 Suivi de l'exposition humaine : biomarqueurs LAFM1 et lAFQ1 ont t retrouves dans les urines humaines et lAFM1 dans le lait maternel. Bien que la teneur de ces mtabolites, rapporte au niveau dexposition en AFB1 ne soit pas connue, le dosage de lAFM1 dans lurine (Zhu et al., 1987) et dans le lait maternel (Wild et al., 1987) au sein de populations humaines constitue un indicateur simple dexposition de ces populations. La mesure dadduits de lAFB1 lalbumine srique est un indicateur de lintoxication (Wild et al., 1992 et 1996). La dtection des adduits lADN dans les urines, montrant linitiation dun processus de rparation du gnome, conscutif son altration, peut tre aussi utilise comme indicateur quantitatif dexposition des populations aux aflatoxines. Mais de telles analyses sont difficiles mettre en uvre. Elles permettent nanmoins de complter le dosage de lAFM1 excrte et de confirmer lexposition aux aflatoxines par lalimentation.

6. Exposition animale :
6.1 Effets sur la sant animale et transfert dans les produits animaux 6.1.1 Les porcins Plusieurs cas daflatoxicose aigu survenus en levage ont t dcrits (Tableau 2). La mort des
3

SCOOP reports on Tasks 3.2.1. (1997). Risk Assessment of Aflatoxins by the population of EU members states

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animaux est le plus souvent survenue en quelques heures aprs un pisode hmorragique svre. Les autopsies ont montr des hmorragies internes massives et lexamen histologique du tissu hpatique une ncrose centrolobulaire importante. Des cas daflatoxicose chronique ont t observs dans des tats du sud des Etats-Unis ( corn belt ) pour des teneurs en aflatoxines de 1 3,5 mg/kg d'aliment consomm pendant un mois. Elles se traduisent par des diminutions de prise alimentaire et de gain de poids ds les premiers jours, une asthnie puis, pour les cas svres, coma et mort. Lautopsie rvle un foie ple ou dcolor, parfois cirrhotique. Lexamen histologique montre des hpatocytes gonfls et vacuols, une hyperplasie des canalicules biliaires, et une fibrose, voire une ncrose pour les cas svres (Meissonnier et al., 2005). Les effets dune exposition de longue dure des aliments contamins par les aflatoxines chez le porc ont galement t explors titre exprimental avec comme tableau clinique des diminutions de la prise alimentaire et du gain de poids ainsi que des lsions hpatiques (Tableau 2). Une tude toxicologique sur des porcelets de 10 15 kg, recevant pendant vingt huit jours une alimentation 1, 2, 3 et 4 mg dAFB1/kg daliment montre outre un gain de poids rduit, une altration des activits enzymatiques sriques marqueurs de lsions hpatiques dautant plus prcoces que les doses daflatoxines administres sont leves, avec chronologiquement une augmentation significative de laspartate amino-transferase puis des phosphatases alcalines (Harvey et al., 1988) . Laugmentation des gamma-glutamyl-transfrase na t observe que pour les animaux exposs aux fortes doses (3 et 4 mg/kg daflatoxines). Plusieurs travaux in vitro, ex vivo, et in vivo ont montr les effets des aflatoxines sur limmunit du porc avec pour consquence une augmentation de la sensibilit aux infections Treponema (Serpulina) hyodysenteriae et Erysipelothrix rhusiopathiae (Joens et al., 1981, Cysewski et al., 1978). Une diminution de la rponse vaccinale a galement t observe dans certaines tudes (Cysewski et al., 1978, Marin et al., 2002). 6.1.2 Les volailles Les aflatoxines ont t dcouvertes loccasion dun pisode toxique survenu dans des levages de dinde en 1960, en Angleterre (Turkey X disease). Comme dans la plupart des espces animales, la cible principale est le foie et les manifestations de lintoxication sont variables selon la dure dexposition et la dose, une forme aigu et une forme chronique pouvant tre observes. La toxicit des aflatoxines est galement trs diffrente selon lespce et lge des animaux, le caneton dun jour est le plus sensible, la caille la plus rsistante. Les formes aigus dintoxication ne sont en gnral pas observes dans les conditions dlevage. La forme chronique de lintoxication est la plus frquente. Elle fait suite lingestion daliments contamins pendant plusieurs semaines (minimum 1 semaine). Les manifestations cliniques observes sont domines par une diminution des performances (diminution du GMQ, chute de ponte) associe des hmorragies et des dfauts de pigmentation des carcasses. Les lsions hpatiques sont les plus caractristiques. Une hyperplasie nodulaire avec fibrose et prolifration des canalicules biliaires est observe chez le canard, la dinde, le poulet . Ces lsions sont observes pour des doses de lordre de 0,1 mg/kg daliment chez le canard, 0,3 0,5 mg/kg daliment chez la dinde et 0,5 2 mg/kg daliment chez le poulet. Lors dexposition prolonge pendant plusieurs semaines (souvent plus de 10), la fibrose hpatique saccompagne de tumeurs et une toxicit embryonnaire peut apparatre. Ces troubles sont accompagns de diffrentes altrations biochimiques et hmatologiques. On note une diminution des concentrations sriques en protines, cholestrol, triglycrides et une augmentation des concentrations en gammaglutamyl transfrases, phosphatases alcalines, sorbitol dshydrognases et transaminases. Enfin, une altration des dfenses immunitaires est observe mais qui varie avec la dose dexposition aux aflatoxines et le moment dexposition lagent infectieux (pendant ou aprs lexposition aux aflatoxines. Lors de diminution des performances zootechniques, lventuelle implication des mycotoxines sur les productions aviaires est souvent voque en labsence dautre cause explicative. Ce comportement est sans doute en partie li aux observations conduites par Hamilton (1984) chez le poulet en croissance. Cet auteur est le premier avoir dmontr une altration des performances des animaux lors dexposition de faibles doses. Lorsque le critre retenu pour parler dun impact sur la sant est un ralentissement de croissance, un niveau de 1250 g/kg daliment en aflatoxine est ncessaire. Si on se base sur la prsence daltrations hmatologiques et biochimiques des effets sont observables partir de 625 g/kg. Une analyse plus pousse de limpact des faibles contaminations sur lindice de

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conversion alimentaire (effet considr significatif 1% de variation) et sur la croissance (effet considr significatif 2% de variation) rvle quun aliment contamin hauteur de 30 g/kg entrane des pertes dans 30% des cas alors quun niveau de contamination de 6 g/kg occasionne des effets dans 2% des cas. Hamilton (1984) recommande que laliment pour poulet ne dpasse pas 10 g/kg daflatoxines. Transfert dans les produits animaux La persistance ltat rsiduel de lAFB1 et de ses mtabolites dans lorganisme semble variable selon les espces et selon les tudes. Ces variations ne sont pas toutes explicables par des diffrences de mtabolisme entre espces, il semble que les mthodes de dtection utilises ainsi que les procdures dextraction de la toxine et de ses mtabolites soient dterminantes. Les donnes disponibles dans la plupart des publications sont souvent insuffisantes pour rellement pouvoir comparer les mthodes entre elles. Il a t donc choisi de prsenter ici des rsultats parmi les plus probants dans un tableau de synthse (tableau 3). Le foie et les reins contiennent des quantits plus leves de toxines et/ou de mtabolites que les muscles, en dehors du gsier qui est directement expos. La caille semble un vecteur plus important de rsidus que les autres espces doiseaux. La poule serait un vecteur plus important de rsidus que le poulet, une excrtion dans les ufs tant galement possible, au moins lors dexposition des doses leves.

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Tableau 2 Conditions dintoxication par les aflatoxines chez le porc et tableau clinique. Contamination alimentaire partir du contenu stomacal : AFB1 : 0,6 5 mg/kg AFB2 : 0,1 0,5 mg/kg AFB1> 20 mg/kg AFB2 > 2 mg/kg AFG1> 12 mg/kg AFG2> 1 mg/kg AFB1> 10 20 mg/kg AFB2 > 0,5 mg/kg AFG1> 10 20 mg/kg AFG2> 0,5 1 mg/kg 1,98 mg/kg poids administration unique, per os 1,2 mg/kg poids administration unique, per os Dure dexposition ration unique Auteur

Animaux

Aliments et toxines

Observations

Episodes daflatoxicose aigu 380 porcs Aliments avaris (truies, porcs Aflatoxines charcutiers)

Mortalit : 80 animaux en 3 jours Clinique : Hmorragie, trouble de lquilibre et digestifs, dcompensation svre et rapide Autopsie : Hmorragie interne, oedmes pulmonaire et hpatique, ncrose hpatique Mortalit : 8 animaux en 1 semaine

Ketterer al., 1982

et

17 porcs

Arachides moisies Aflatoxines Arachides moisies Aflatoxines

ration unique

Ketterer al., 1982 Ketterer al., 1982

et

60 porcs (3 mois)

4 jours

Mortalit : 8 animaux en 5 jours Foie : Statose hpatique, hyperplasie des hpatocytes, infiltration leucocytaire et centrolobulaire

et

Etudes exprimentales dintoxication aigu Porcelets AFB1 ou (11 21 kg) AFB1 57%, AFG1 37%, AFB2 3% Porcelets (12 - 15 kg) AFB1 81%, AFG1 19%

3 72 heures

24 72 heures

Clinique : diminution de la prise alimentaire et troubles musculaires Foie : ncrose hpatique, infiltration leucocytaire, hmorragie hpatique ; la svrit des lsions augmente avec le temps Foie : dgnrescence hpato-cellulaire, infiltration de leucocytes, statose, altration du contenu glycogno-lipidique

Cysewski al., 1968

et

Miller et al., 1982

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Animaux

Aliments et Toxines

Contamination Ration alimentaire : 0,8 mg/kg AFB1 + 0,2 mg/kg AFB2 AFB1 3 mg/kg AFB2 0,4 mg/kg AFG1 5 mg/kg AFG2 0,9 mg/kg OTA 0,1 mg/kg AF 2,5 3,5 mg/kg dans laliment

Dure exposition 1 mois environ

Observations Mortalit : 30 porcs dans le mois Clinique : Ictre gnralis Foie :statose hpatique, infiltration leucocytaire dans le foie, hyperplasie des hpatocytes Mortalit : 4 porcs Clinique : diminution de la prise alimentaire Foie : statose hpatique, hyperplasie des hpatocytes et canalicules biliaires Mortalit : 400 porcs dans le mois Clinique : anorexie, perte de poids, troubles digestifs et de lquilibre, dcompensation svre et rapide Foie : hypertrophie, ncrose et fibrose hpatique Clinique : diminution du gain de poids Histologie du foie : hpatocytes vacuols et anisocaryose dans les zones priportales ; prolifration des canalicules biliaires Clinique : diminution de la prise alimentaire et du gain de poids Foie : ncrose hpatique et prolifration des canalicules biliaires Clinique : diminution de la prise alimentaire et du gain de poids aggrave avec laugmentation des doses ; 3 et 4 ppm les animaux asthniques Foie : prcocit des lsions avec laugmentation des doses, statose/cholestase hpatique, infiltration leucocytaire, fibrose, ncrose, hyperplasie des canalicules biliaires

Auteur Hayes et al., 1978

Episodes daflatoxicose chronique Porcs Mas (levage de 250 AFB1 animaux) AFB2 71 porcs (3mois) Sorgho Aflatoxines Ochratoxine Mas Aflatoxines (non dtailles)

3 semaines

Ketterer al., 1982

et

600 porcs lengraissement

1 mois

Coppock al., 1989

et

Etudes exprimentales dintoxication chronique Porcs AFB1

0,14 mg/kg ; 0,28 mg/kg ou 0,41 mg/kg 0,4 mg/kg ; 0,75 mg/kg ou 1,5 mg/kg 1 mg/kg 2 mg/kg 3 mg/kg 4 mg/kg

Priode de croissance de 20 70 kg 66 jours

Duthie et al,, 1966 Southern al., 1979

Porcs (50 - 55 kg) Porcs (12 kg)

AFB1 74%, AFG1 19%, AFB2 7% AFB1 88%, AFG1 2%, AFB2 9%, AFG2 1%

et

28 jours

Harvey et al., 1988

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Tableau 3 : Conditions dintoxication par les aflatoxines chez les volailles


Espce Dinde Rgime 50 et 150 g/kg 11sem a Tissu foie reins gsier foie reins gsier foie muscle Canard 3 000g/kg 8j b foie muscle Poulet 3 000g/kg 8j b foie muscle Poule 3 000g/kg 8j b foie muscle Poule pondeuse Poule pondeuse 10 000g/kg 7j c 8 000ppb 7j d oeufs foie reins muscle oeufs foie oeufs foie foie Teneur 0,02-0,09 et 0,11-0,23 0,02-0,04 et 0,11-0,21 0,04-0,16 et 0,01-0,12 <0,01 <0,01 0,04-1,9 et 0,09-0,24 7,83 0,49 et 5,31 0,22 22,34 2,40 et 10,54 0,42 0,38 0,03 et <0,03 0,82 0,05 et 0,32 et 0,08 0,52 0,04 et 0,44 0,16 2,74 0,15 et 3,81 0,25 <0,03 et <0,03 0,21 0,09 et 0,14 et 0,05 0,15 0,09 et 0,10 0,01 1,54 0,36 et 0,93 0,04 <0,03 et <0,03 0,11 0,02 et 0,08 et 0,05 0,34 0,03 et 0,23 0,08 2,38 0,36 et 4,04 0,10 <0,03 et <0,03 0,14 0,04 et 0,11 0,04 0,28 0,10 et 0,38 0,11 0,49 0,28 et 0,20 0,09 0,32 0,18 et 0,10 0,04 et 0,05 0,02 0,08 0,03 0,24 0,07 et 0,25 0,09 4,13 1,95 <0,5 et < 0,01 0,26 et 0,02 1,52 et <0,1 Commentaire AFB1 + AFM1 AFB1 + AFM1 AFB1 (AFM1<0,01) AFB1 et AFM1 AFB1 et AFM1 AFB1 (AFM1<0,01) AFB1 libre et conjugue Mtabolites libres et conjugus AFB1 libre et conjugue Mtabolites libres et conjugus AFB1 libre et conjugue Mtabolites libres et conjugus. AFB1 libre et conjugue Mtabolites libres et conjugus AFB1 libre et conjugue Mtabolites libres et conjugus. AFB1 libre et conjugue Mtabolites libres et conjugus AFB1 libre et conjugue Mtabolites libres et conjugus AFB1 libre et conjugue Mtabolites libres et conjugus AFB1 et AF totales AFB1 et AF totales AFB1 et AF totales et AFM1 AF totales AFB1 et AF totales AFB1 AFB1 et AFM1 AFB1 et AFM1 AFB1 et AFM1 Ref Richard et al., 1986

50 et 150g/kg 11sem puis aliment indemne 1sem Caille 3 000g/kg 8j b

Bintvihok al., 2002

et

Qureshi et al., 1998 Trucksess et al, 1983a

Poule pondeuse Poulet


a

2 500g/kg 4sem 55g/kg 9j 4 448g/kg 9j

Zaghini et al. , 2005 Madden et Stahr, 1992

Des donnes sont disponibles 13 semaines, elles ne suggrent pas une accumulation b Des donnes sont disponibles 11 jours, elles ne suggrent pas une accumulation c Des donnes sont disponibles 14 jours, elles ne suggrent pas une accumulation d La distribution dun aliment indemne pendant 7 jours entrane une disparition quasi-totale de lAFB1 et de ses mtabolites

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Tableau 5 : Conditions dintoxication aigu par les aflatoxines chez les poissons et crevettes et tableau clinique. Animaux Aliments toxines et Contamination alimentaire Dure dexposition Observations Cancer : augmentation importante des cancers du foie Auteur Ashley et al. (1965) ; Sinnhuber et al. (1965) Lee et (1991) Sahoo Mukherjee (2001a)

Episodes daflatoxicose sur le terrain Truite arc-en-ciel AFB1 0,5 g/kg dans (Oncorhynchus (tourteau de laliment mykiss) coton naturellement contamin) Etudes exprimentales aigus Truite arc-en-ciel AFB1 0,5-1,0 mg/kg 10 jours (Oncorhynchus aliment mykiss) (50g) Carpe indienne AFB1 7,5-13,75 10 jours (Labeo rohita) mg/kg poids (35 g) administration par injections

Mortalit: 50% des truites (DL50)

al.

Carpe indienne (Labeo rohita) (35g) Poisson (Ictalurus punctatus) chat

AFB1

AFB1

1,25-2,50 mg/kg poids administration journalire par injections 10 mg/kg aliment

90 jours

Mortalit : aprs 48h, dose dpendante (20-60%) Clinique : diminution de la prise alimentaire, lthargie, perte dquilibre. Foie : ncrose, hmorragie Branchies : ncrose, hmorragie. Cerveau : congestion, mningite. Cur : dgnrescence, inflammation. Rein : ncrose, dgnrescence. Muqueuse intestinale : mue. Clinique : Cachexie, pigmentation sombre des cailles. Foie : lsions prnoplastiques Mortalit : augmentation forte de la mortalit Clinique : gain de poids rduit Autopsie : lsions modres de certain organes.

et

Sahoo Mukherjee (2001b)

et

70 jours

Jantrarotai et Lovell (1990)

30

Poisson chat (Ictalurus punctatus) (31g) Tilapia du Nil (Oreochromis niloticus) Tilapia du (Oreochromis niloticus) Tilapia du (Oreochromis niloticus) Walleye (Seter vitreus) Nile Nile

FB1 (mas naturellement contamin) AFB1

80-720 aliment 1,9 aliment 0,1-0,2 aliment

mg/kg

98 jours

mg/kg

Mortalit : forte mortalit partir de 320 mg/kg aliment Clinique : gain de poids diminu partir de 80 mg/kg aliment. Clinique : gain de poids rduit. Foie : lsions hpatiques Mortalit : 17% partir de 0,2 mg/kg aliment Clinique : gain de poids rduit partir de 0,1 mg/kg aliment Clinique : gain de poids rduit, hmatocrite rduite partir de 0,25 mg/kg aliment Foie : Ncroses hpatiques partir de 100 mg/kg aliment. Mortalit : 8% 100 ng/kg Clinique : Lthargie aprs 15 jours Foie : dgnrescence Mortalit : + 20% Clinique : gain de poids diminu (-46-59%) Hpatopancras : lsions Hmolymphe : changements biochimiques Rponse immunitaire : Fonction immunitaire affecte long terme (au moins 2 ans) partir de 0,5 mg/L, production et prolifration en Ig leve, populations des leucocytes affectes. Cancer : augmentation des cancers du foie (62-66%) partir de 0,08 mg/L, lincidence augmente avec la temprature dlevage. Cancer : augmentation des cancers du foie (62%).

Lumlertdacha et Lovell (1995) ChavezSanches et al. (1994) El-Banna et al. (1992) Tuan et (2002) al.

AFB1 AFB1

mg/kg

70 jours

0,25-100 mg/kg aliment 0,05-0,1 mg/kg aliment 30 jours

jaune vitreus

AFB1

Hussain et al. (1993) Bintvihok et al. (2003)

Crevette noire AFB1 0,005-0,02 tigre (Paneus mg/kg aliment monodon Fabricius) (3,5 mois) Etudes exprimentales dintoxications chroniques Truite arc-en-ciel AFB1 0,08-0,5 mg/L (Oncorhynchus par balnation mykiss) (embryons lors de lexposition)

10 jours

15-60 min dexposition et 9-24 mois de suivi des animaux

Hendricks et al. (1980) Bailey et al. (1988) Ottinger et Kaattari (2000), Bailey (1988) Bailey (1988) et al.

Truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) Saumon coho (Oncorhynchus kisutch)

AFB1

0,02 aliment

mg/kg

AFB1

0,5 mg/L par balnation (embryons lors de lexposition)

4 semaines dexposition et 1 an de suivi des animaux 15 min dexposition et 1 an de suivi des animaux

Cancer : augmentation des cancers du foie (9%).

et

al.

31

Saumon coho (Oncorhynchus kisutch) Carpe indienne (Labeo rohita) (30-50g)

AFB1

5 mg/kg aliment

AFB1

1,25-5,00 mg/kg poids administration unique par injection

4 semaines dexposition et 1 an de suivi des animaux 60-90 jours

Cancer : augmentation des cancers du foie (5%).

Bailey (1988)

et

al.

Poisson (Ictalurus punctatus) (31g)

chat

FB1 (mas naturellement contamin)

0,3-80 aliment

mg/kg

98 jours

Rponse immunitaire : Diminution de la rponse non spcifique (concentrations sriques en protines totales et en albumine rduites, augmentation du ratio A:G, activits bactricides du srum et des lysozymes et de phagocytose des neutrophiles rduites) et de la rponse spcifique (titre dagglutination bactrien contre Edwardsiella tarda et nombre danticorps rduits) ds 1,25 mg FB1/kg poids, augmentation de la mortalit aprs inoculation avec Edwardsiella tarda ou avec Aeromonas hydrophila. Rponse immunitaire : augmentation de la mortalit aprs inoculation avec Edwardsiella ictaluri partir de 80 mg/kg aliment, production danticorps rduite partir de 20 mg/kg aliment.

Sahoo Mukherjee (2001a) Sahoo Mukherjee (2001b) Sahoo Mukherjee (2003)

et et et

Lumlertdacha et Lovell (1995)

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6.1.3 Les ruminants Devenir des aflatoxines dans le rumen Laddition dAFB1 la concentration de 9,5 ng/mL dans le contenu ruminal ne modifie pas la digestion in vitro de la luzerne ni la production des acides gras volatils (Auerbach et al., 1998). En revanche, une diminution nette de la capacit digestive de lcosystme microbien ruminal a t observe in vitro aux concentrations en AFB1 de 1 g/mL (-50% de la quantit de luzerne digre) et de 10 g/mL (-67% de la quantit de luzerne digre) (Westlake et al., 1989). Les rsultats des tudes concernant la biodgradation de lAFB1 et leffet de la toxine sur lcosystme microbien ruminal divergent. Les essais conduits in vitro indiquent soit une disparition importante de lAFB1 pouvant atteindre 42% selon Engel et Hagemeister (1978), soit une dgradation trs faible voire nulle de la toxine au cours de la digestion ruminale (Mathur et al., 1976 ; Kiessling et al., 1984 ; Westlake et al., 1989). Des mtabolites de lAFB1 comme laflatoxicol et lAFM1 ont pu tre identifis in vivo dans le contenu ruminal (Trucksess et al., 1983b). Une tude ralise in vitro dans des conditions de simulation correcte du rumen et utilisant de la 14C-AFB1, a montr que seul laflatoxicol est produit par les microorganismes du rumen (Auerbach et al., 1998). La radioactivit de laflatoxicol ne reprsentait que 0,6% de la radioactivit initiale. Face ces donnes disparates sur la dgradation de lAFB1 dans le rumen, la sensibilit moindre des ruminants lAFB1, si elle existe, pourrait sexpliquer par la prsence dautres facteurs de dtoxication, au niveau du foie par exemplemais cette hypothse na pas encore t vrifie exprimentalement. Effet des aflatoxines sur ltat sanitaire des ruminants Chez les bovins adultes, des signes cliniques dintoxication apparaissent lors dun rgime prsentant une contamination de 1,5 2,23 mg dAFB1/kg daliment, et de plus de 50 mg/kg daliment chez les petits ruminants (Miller et Wilson, 1994). Les modifications des paramtres biologiques sanguins observes traduisent une altration des fonctions hpatiques. On observe alors une diminution des quantits daliments ingrs et une baisse significative de la production chez la vache laitire. Les effets immunosuppresseurs des aflatoxines affectent galement les ruminants, ce qui les rend plus sensibles aux infections et diminue la rsistance acquise par la vaccination. LAutorit Europenne de Scurit des Aliments (AESA-EFSA) atteste que la teneur rglementaire de 0,020 mg dAFB1/kg daliment (Directive 2002/32/EC) na aucun effet sur la sant des ruminants. Toutefois, lAutorit prcise quune exposition longue de concentrations faibles dAFB1, pourait conduire des fibroses hpatiques et des tumeurs du foie : ces conditions auraient t lorigine de la formation de carcinomes hpatiques chez des moutons levs en dehors de la zone europenne. Le Panel scientifique charg dvaluer les risques dus la prsence dAFB1 dans les ingrdients alimentaires des animaux indique quil nest pas possible de dfinir une dose sans effet (NOEL) partir des donnes scientifiques disponibles. Il note toutefois que la marge entre la dose toxique (> 1,5 mg/kg daliment complet) et la valeur haute des doses limites rglementaires (0,02 mg/kg daliment complet)) est suffisamment large pour viter tout risque de toxicit chez les animaux (AESA-EFSA, 2004). Effet des aflatoxines sur les performances zootechniques des animaux Selon Helferich (1984) et Helferich et al. (1986a, 1986b), la prsence dAFB1 une concentration de 60 300 g/kg daliment complet dans la ration de bovins ou de chvres laitires ne modifie pas la quantit daliment ingr par les animaux. En revanche, la dose de 600 g/kg daliment complet a significativement diminu la quantit daliment ingr par les bovins lengraissement. Applebaum et al. (1982) ont montr que la distribution dAFB1 pure raison de 13 mg/jour na pas modifi les quantits ingres par des vaches laitires, alors quune dose identique apporte sous forme dun extrait dA. parasiticus contenant un mlange daflatoxines les a significativement diminues. Ce rsultat indique quune multicontamination amplifie leffet ngatif des toxines sur lingestion des aliments par rapport une contamination unique. Lassociation dune diminution des quantits ingres une baisse de la valeur nutritionnelle des aliments conduit une rduction de la quantit de nutriments consomms. Si, comme cela est vraisemblable, la digestion ruminale et intestinale ainsi que labsorption digestive et le mtabolisme sont galement affects, la part de nutriments mis la disposition des ruminants serait donc rduite par la prsence daflatoxines. En consquence, la production animale sera affecte. Ainsi, Garret et

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al. (1968) ont montr que le gain de poids de bovins en croissance tait significativement diminu par un niveau dapport de 700 g dAFB1/kg daliment complet. Un effet toxique sur le foie a t observ au cours de cette exprimentation ds le niveau de 100 g/kg daliment complet. Le passage dune ration alimentaire contenant 120 g dAFB1/kg une ration ne contenant pas de toxine a amlior la production laitire des vaches de 25% (Guthrie, 1979). Masri et al. (1969) et Patterson et Anderson (1982) ont galement observ une diminution de la production laitire chez des vaches recevant des aliments contamins avec des aflatoxines. Les auteurs ont not une sensibilit lAFB1 variable selon les individus, la production laitire diminuant de manire significative pour certaines vaches alors quelle ntait pas modifie pour dautres. Il faut noter que les essais zootechniques ont t gnralement conduits sur un nombre rduit danimaux (< 10 par essai) et avec des teneurs en aflatoxines dpassant les concentrations rglementaires. Transfert des aflatoxines dans le lait Suite ladministration dune dose orale dAFB1, ses mtabolites sont rapidement retrouvs dans lurine et dans le lait, alors que la part excrte dans les fces est faible, ce qui confirme labsorption leve et rapide de lAFB1 par le tube digestif et son mtabolisme dans le foie. Les produits issus du mtabolisme de lAFB1 et de lAFB2 qui se retrouvent dans le lait sont lAFM1 et, un degr moindre, lAFM2. Ces mtabolites correspondent des formes hydroxyles de chacune des molcules parentes. Kiermeier (1973), Fremy et Quillardet (1985) et Whitlow et al. (2000) ont montr que les aflatoxines apparaissent dans le lait environ 12 heures aprs une administration orale dAFB1. La concentration dans le lait atteint un maximum en 24 48 heures et la clairance est trs rapide puisque les aflatoxines disparaissent du lait 4 jours aprs leur retrait des aliments (Fremy et Quillardet, 1985 ; Frobish et al., 1986). Ce rsultat confirme lextrme rapidit de labsorption et du mtabolisme des aflatoxines chez le ruminant. Le passage dans le lait constitue pour lanimal un moyen de se protger contre les toxines. Des tudes de transfert conduites chez des vaches produisant 10 20 litres de lait par jour ont mis en vidence des taux de transfert trs faibles : 0,5 0,6% (Harvey et al., 1991, Galvano et al., 1996b). A contrario, un taux de transfert lev de 6,2% a t mesur chez des vaches produisant plus de 40 litres de lait par jour (Veldman et al., 1992). La majorit des auteurs saccorde pour attribuer un taux de transfert moyen dans le lait de lordre de 1,7 % mais celui-ci peut varier lchelle dun troupeau de 1 6 % (Viroben et al., 1983 ; Fremy et Quillardet, 1985 ; Frobish et al., 1986 ; Van Egmond, 1989). Ce taux de transfert peut aussi varier entre individus, dun jour lautre ou dune traite lautre, puisquil dpend vraisemblablement de facteurs physiologiques et mtaboliques qui pouvant euxmmes tre affects par les toxines ou par dautres facteurs multiples. Ainsi, la nature du rgime, le niveau de contamination, ltat sanitaire de lanimal, la capacit de lindividu dtoxifier, le stade physiologique et le niveau de production interviennent vraisemblablement dans le dterminisme du transfert de lAFM1 dans le lait. Le tableau 4 simule des situations de production laitire (base dune vache de 650 kg) avec diffrents types de rgimes alimentaires franais (source INRA, Jouanny, communication personnelle) prenant en compte les teneurs maximales rglementaires de contamination en AFB1 pour estimer les teneurs en AFM1 qui en rsulte dans le lait.

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Nature du fourrage

Prod lait (kg/j)

Quantits d'aliments ingres* (kg/j) Fourrage Mas Grain 4,4 9,5 8,8 3,5 9,2 Tourteau de soja 2,3 2,8 4,4 0,78 0,80

Quantits AFB1 ingres** (g/j) Ration Totale 110,0 136,5 139,5 Concentrs

Taux de transfert***

AFM1 dans lait (g/j) (g/kg lait) 0,06 0,10 0,17 0,01 0,04

Ensilage de mas

30 40 50

15,3 15,0 14,7 17,4 16,8

33,5 61,5 66,0 21,4 50,0

1,7 3 6 1,7 3

1,8 4,09 8,37 0,35 1,50

Ensilage d'herbe

30 40

Tableau 4 : Simulations de la teneur en AFM1 du lait de vache issu de diffrentes rations alimentaires franaises selon le niveau de production pour une vache de 650 kg de p.v. (source
INRA, Jouany, communication personnelle)

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50 Foin 30 40 50 Pturage 30 40 50

16,5 16,3 16,0 15,8 19,9 18,8 18,2

12,5 8,0 12,6 11,0 1,2 7,2 12,8

0,82 0,19 0,73 2,3 0 0 0

66,5 40,9 66,6 66,5 6,0 36,0 64,0

6 1,7 3 6 1,7 3 6

3,99 0,69 2,00 4,00 0,10 1,10 3,84

0,08 0,02 0,05 0,08 0,01 0,03 0,08

* poids bruts corrigs pour une teneur en humidit de 12% de chaque ingrdient y compris les fourrages ** la valeur limite de concentration en AFB1 (5 g/kg daliment 12% dhumidit) (directive 2002/32/CE du 7 mai 2002) a t applique aux aliments potentiellement contaminables (tourteau de soja, mas grain, ensilage de mas). L'ensilage d'herbe, le foin et l'herbe pture ont t considrs comme exempts d'aflatoxine B1 *** le taux de transfert maximum a t appliqu : 6 % pour les animaux production de 50 kg/j (EFSA Journal, 2004), 3 % pour les animaux ayant une production de 40 kg/j et 1,7 % pour les animaux production de lait 30 kg/j (van Egmond,1989)

En considrant le scnario le plus dfavorable d'une vache forte productrice (produisant plus de 40 litres de lait par jour) ingrant une quantit importante daliments complmentaires contamins la limite maximale rglementaire de 5 g AFB1/kg et un ensilage de mas lui-mme contamin la mme teneur, avec un taux de transfert de l'AFB1 de 6 % dans le lait, il est possible de dpasser la teneur maximale de 0,05 g et de 0,025 g AFM1/L dans le lait destin lalimentation des adultes et des enfants, respectivement. Cette possibilit samenuise lorsque lon considre dautres rgimes alimentaires ( base d'herbe pture, d'ensilage d'herbe, ou de foin), faible probabilit dtre contamins, et des niveaux de production plus faibles, pour lesquels les taux de transfert sont dans la fourchette infrieure. Les laits de grand mlange commercialiss pour la consommation courante prsentent un risque moindre de contamination en AFM1 par rapport ceux prlevs sur des exploitations laitires individuelles, selon lAutorit Europenne de Scurit des Aliments (AESA-EFSA, 2004). Au vu de ces considrations, l'EFSA a estim que la rglementation sappliquant aux aliments complmentaires pour vaches laitires (5 g dAFB1/kg) est en cohrence avec la teneur limite rglementaire de 0,05 g dAFM1/L pour le lait destin au consommateur adulte (EFSA, 2004). Il faut toutefois rappeler que la teneur limite rglementaire est fixe 0,025 g dAFM1/kg pour les laits destins lalimentation infantile. Le nombre rduit de donnes concernant le taux de transfert de l'AFB1 dans le lait des ovins et des caprins laitiers, rend ce raisonnement difficilement extrapolable ces productions animales. Toutefois, le groupe dExperts Europens (EFSA, 2004) conclut que le lait de brebis contiendrait, en moyenne, davantage daflatoxine M1 que le lait de vache. Transfert des aflatoxines dans les tissus des ruminants Aucune trace dAFB1 ou dAFM1 na pu tre dtecte dans les muscles ou le gras de bovins en croissance (250 kg) ayant consomm des aliments contenant 600 g/kg dAFB1 pendant une priode continue de 155 ou 170 jours suivie dune priode de retrait de 2 semaines (Helferich et al., 1986b). Des lsions hpatiques lgres ont toutefois t mises en vidence chez 9 des 10 animaux traits avec la dose de 600 g/kg daliment complet. Un essai conduit sur vaches recevant des doses journalires de 535 g/kg daliment complet pendant 14 jours a donn des rsultats semblables (Hoversland et al., 1973). Des traces dAFB1 ont toutefois t dtectes dans le muscle cardiaque et dans les reins des animaux. Shreeve et al. (1979) ont confirm labsence dAFB1 et dAFM1 dans les muscles de vaches laitires ayant reu une ration alimentaire naturellement contamine en AFB1 la dose de 20 g/kg daliment complet pendant 7 ou 11 semaines. Le foie ne recelait pas de rsidu toxique alors que les reins contenaient de lAFM1.

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6.1.4 Les carnivores domestiques. Si les animaux de compagnie et de loisirs ne diffrent pas fondamentalement des autres animaux domestiques quant aux circonstances et aux consquences du risque li aux mycotoxines, ils prsentent cependant une diffrence notoire : celle de la durabilit de laction toxique inhrente leur dsormais trs longue esprance de vie. Pour ces espces, cest tout autant limpact de consommation de faibles doses sur de trs longues priodes avec apparition de tumeurs hpatiques et dune susceptibilit accrue aux infections, que le risque ponctuel li des contaminations massives associs un tableau clinique plus explicite dhpatite ncrosante, quil savre particulirement pertinent de connatre. Bien avant que la maladie X du dindon soit identifie avec certitude comme tant la premire manifestation daflatoxicose animale dans la dcennie 1960, plusieurs pisodes mortels dhpatite dtiologie inconnue avaient t dcrits chez le chien sous le nom dhpatite X (Seibold, 1953 ; Newberne et al., 1955). La symptomatologie et lanatomopathologie trs proches entre ces 2 entits cliniques a conduit a posteriori attribuer les dsordres observs dans les levages canins une consommation probable dAFB1. La confirmation exprimentale en a t faite en 1960 par Newberne et al. Depuis lors plusieurs cas daflatoxicose naturelle ont t dcrits chez le chien (mais aucun chez le chat). La DL50 est estime entre 0,5 et 1,5 mg/kg p.c. chez le chien et entre 0,3 et 0,6 mg/kg p.c. chez le chat. Diffrentes enqutes pidmiologiques rcentes laissent penser que les carnivores domestiques (chiens et chats) pourraient tre potentiellement exposs au risque toxicologique li la prsence dAFB1 dans les aliments secs contenant des crales ou des tourteaux. Un chantillon de 35 aliments secs pour chiens et de 35 aliments secs pour chats disponibles sur le march britannique a fait lobjet dune recherche des diffrentes aflatoxines (seuil de dtection 0,5 g/kg). LAFB1 na t identifie que dans un seul aliment pour chats et un taux trs faible (2,1 g/kg) (Scudamore et al., 1997). Une enqute analogue conduite sur 19 chantillons daliments secs pour chiens et 16 daliments secs pour chats disponibles sur le march mexicain sous 12 marques diffrentes (Sharma et Marquez, 2001), a rvl au contraire une prsence quasi systmatique dAFB1 identifie dans 79% des aliments pour chiens et 100% des aliments pour chats ! Des niveaux levs ont t mesurs dans 3 aliments pour chats (46,1 ; 30,8 et 22,2 g/kg) et 2 aliments pour chiens (39,7 et 27 g/kg). Deux aliments (un pour chiens et un pour chats) totalisaient pour lensemble des aflatoxines des valeurs de 72,4 et 59,7 g/kg). Maia et Bastos de Sequeira (2002) ont ralis un travail comparable sur 45 chantillons daliments secs pour chiens et 25 chantillons daliments secs pour chats disponibles sur le march brsilien. Les conclusions en furent plus rassurantes : seulement trois aliments pour chiens et un aliment pour chats se sont rvls contenir de lAFB1 un niveau plus acceptable (respectivement : 17, 15, 25 et 16 g/kg). Deux enqutes rcentes ont t conduites sur des aliments pour chiens en Turquie. Gunsen et Yaroglu (2002) ont analys 18 aliments secs. Trois sur 18 ont prsent des valeurs suprieures 10 g/kg (dont un 20 g/kg). Basalan et al. (2004) ont analys 21 aliments secs pour chiens qui en moyenne dosaient 6,7 g/kg mais dont aucun ne prsentait de valeur suprieure 10 g/kg. En dcembre 2005, une socit amricaine, fabriquant des aliments secs pour chiens et chats, a procd au rappel de produits finis labors dans son unit de fabrication de Caroline du Sud, suite la survenue de mortalit sur des chiens (au moins 100 dcs selon luniversit de Cornell communication personnelle) conscutivement lutilisation de mas amricains rcolts fin 2005 et contamins par de lAFB1 (Muirhead, 2006). Selon le rapport de la FDA (cit par le JAVMA, 2006, 228(6), p. 829), 16 lots daliments ont rvl des taux dAFB1 suprieurs 20 ppb, un chantillon atteignant les taux record de 376 g/kg, voire de 598 g/kg selon Stenske et al. (2006). Cette contamination exceptionnelle a rsult de lutilisation de quatre livraisons de mas dont la contamination en AFB1 allait de 90 1851 g/kg. Dans les conditions naturelles, les aflatoxicoses sont gnralement des intoxications aigus (quelques jours) ou subaigus (quelques semaines), et plus rarement des intoxications suraigus (quelques heures) (Bastianello et al., 1987 ; Bailly et al., 1997). Comme dj voqus, les premiers cas dintoxication de chiens par les aflatoxines ont t rapports aux Etats-Unis dans la dcennie 1950 sous le nom dhpatite X. Il ne sest agi alors que dune suspicion a posteriori, aucune identification de lagent causal nayant pu tre faite. Cependant pour au moins un des pisodes (Newberne et al., 1955), lorigine alimentaire na pas fait de doute dans la

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mesure o les auteurs ont pu reproduire les symptmes et les lsions partir des aliments incrimins. En 1960, Newberne et al. relirent pour la premire fois les cas dhpatite X du Chien une possible contamination des aliments par de laflatoxine en reproduisant exprimentalement laffection. Plusieurs publications sont venues depuis lors confirmer que les chiens pouvaient ainsi constituer une cible privilgie suite la consommation le plus souvent de pain ou daliments secs moisis (Chaffee et al., 1969 ; Ketterer et al., 1975 ; Krishnamachari et al., 1975 ; Liggett et Colvin, 1986). Le descriptif des symptmes est chaque fois assez concordant et runit anorexie, vomissement, dpression puis ictre ; et lautopsie : hpatite ncrosante, hmorragies intestinales. Lvolution est le plus souvent mortelle. La confirmation est gnralement apporte par lidentification de laflatoxine soit dans les tissus (foie et reins), soit dans les aliments (de 0,3 0,5 mg/kg dans les cas subaigus ; 6 7 mg/kg dans les cas aigus), soit encore dans les vomissures (jusqu 100 mg/kg). Plus rcemment en France, il a t rapport sur un groupe de chiens appartenant un boulanger, une intoxication collective suraigu suite la consommation accidentelle et limite dans le temps de pte pain moisie fortement contamine par de laflatoxine B1 (15 mg/kg ) (Bailly et al., 1997). La symptomatologie a t dans ce cas domine par des manifestations convulsives, mais des lsions dhpatite ncrosante ont t retrouves chez un des animaux concerns dont leuthanasie a t demande par le propritaire. Entre 1975 et 2005, 11 pisodes daflatoxicose ont t rapports aux USA dont un en 1998 qui a touch 48 chiens (Stenske et al., 2006). Les dizaines danimaux concerns par le dernier pisode toxique dcrit aux USA en dcembre 2005 suite la consommation dun aliment industriel contamin par du mas ont reproduit le mme tableau symptomatique : lthargie, anorexie, vomissement, puis en moins de 4 jours, ictre, mlna, hmatmse. Lvolution a t le plus souvent mortelle avec un dysfonctionnement hpatique majeur marqu par une lvation considrable des transaminases, une hyperbilirubinmie et un temps de prothrombine fortement prolong. En dfinitive, si les cas dcrits dans la littrature, notamment les plus rcents, se rapportent plus des accidents toxicologiques ponctuels sans grande signification pidmiologique, il nen demeure pas moins que par sa sensibilit laction hpatotoxique des aflatoxines (ds 0,1 mg/kg daliment voire moins), lespce canine constitue une cible risque lors de lutilisation alimentaire de crales, de coproduits craliers ou de coproduits dolagineux trop fortement contamins par les aflatoxines. Le respect des teneurs maximales autorises (directive 2003/100/CE du 31 octobre 2003) fixant 10 g/kg la teneur maximale en aflatoxine B1 des aliments pour carnivores, offre une trs large scurit pour la sant du Chien et plus encore sans doute pour celle du Chat du fait de la part plus rduite des ingrdients risque dans son alimentation, aucun cas dintoxication nayant t rapport dans cette dernire espce. Les rsultats des analyses faites sur les aliments secs produits et commercialiss dans certains pays, ainsi que lpisode toxique rcent montrent que le risque potentiel est cependant rel et ncessite de la part des industriels une vigilance de tous les instants. 6.1.5 Les quids Diffrentes enqutes pidmiologiques rcentes laissent penser que les quids pourraient galement tre potentiellement exposs au risque toxicologique li la prsence dAFB1 dans les aliments. Deux enqutes rcentes ont t conduites sur des aliments pour chevaux en Turquie. Gunsen et Yaroglu (2002) ont analys 20 aliments composs. Deux dentre eux ont prsent des valeurs suprieures 10 g/kg. Basalan et al. (2004) ont galement analys 20 aliments composs pour chevaux qui en moyenne dosaient 2 g/kg mais dont aucun ne prsentait de valeur suprieure 10 g/kg. La sensibilit des quids face la consommation daliments contamins par les AFB est assez peu documente. Asquith (1985, cit par Vesonder et al., 1991) situe 54,8 g/kg le seuil de contamination le plus bas associ des manifestations cliniques. Quelques cas dintoxications naturelles sont rapports, confirmant ainsi lexposition de cette espce consommatrice traditionnelle de crales et de protagineux. Le remplacement dans une formule daliment industriel de riz (trop cher) par du tourteau darachide et du mas (moins chers mais de mdiocre conservation) avec pour consquence la prsence dun taux rsiduel dAFB (B1 + B2) de 400 g/kg a conduit a un pisode daflatoxicose subaigu avec une forte mortalit dans un effectif de chevaux (Angsubhakorn et al., 1981). Une autre intoxication naturelle a t dcrite aux USA en 1991 par Vesonder et al. (1991). Trois chevaux moururent dune hpatite ncrosante grave aprs avoir consomm du mas contamin par 130 g/kg dAFB (B1 + B2).

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Les diffrents tableaux cliniques rapports (ataxie, hyperthermie, anorexie, ictre, hmorragies) sont en tous points conformes celui observ lors dintoxications exprimentales conduites durant 39 jours sur des poneys (0,075 0,3 mg/kg pv) la mort survenant en 12 16 jours pour la dose la plus leve (Cysewski et al., 1982). Avec un apport de 2 mg/kg pv les signes rapports sont analogues mais la mortalit survient beaucoup plus rapidement (en 76 heures selon Bortell et al., 1983). Si les cas dcrits dans la littrature sont, pour la plupart, anciens, il nen demeure pas moins que tous soulignent la sensibilit particulire des quids laction hpatotoxique des aflatoxines (ds 54,8 g/kg daliment selon Asquith (1985) cit par Vesonder et al., (1991)). Cette espce constitue une cible risque lors de lutilisation de crales, de coproduits craliers ou de coproduits dolagineux trop fortement contamins par les aflatoxines pour la fabrication daliments composs notamment sur lexploitation. Le respect des normes maximales de contamination prvues par la rglementation (directive 2003/100/CE du 31 octobre 2003) fixant 10 g/kg la teneur maximale en aflatoxine B1 des aliments pour quids, offre une marge scurit certaine pour la sant de chevaux. Les rsultats des analyses faites sur les aliments produits et commercialiss dans certains pays montrent cependant quun risque potentiel existe, ncessitant de la part des industriels une grande vigilance.

6.1.6

Les poissons

Aflatoxicoses observes en levage (voir Tableau 5) Au dbut des annes 1960, lAFB1 a t rendue responsable dune forte incidence de cancers du foie dans les levages de truites arc-en-ciel (Onchorhynchus mykiss) aux USA. La cause tait un tourteau de coton contamin (Ashley et al., 1965 ; Sinnhuber et al., 1965) ayant conduit une concentration en AFB1 de 0,5 g/kg dans laliment. Cet pisode a veill lintrt des scientifiques pour la sensibilit des poissons, et notamment la truite, lAFB1. Les symptmes associes aux aflatoxicoses chez les poissons comprennent des branchies ples, une capacit de coagulation du sang diminue, une anmie et enfin des performances de croissance rduites. Ces effets peuvent passer inaperus, mais causer cependant une rduction des performances zootechniques et donc des pertes conomiques. Etudes exprimentales menes sur les poissons (voir Tableau 5) Les signes cliniques observs exprimentalement chez les poissons dpendent de la dose et de la dure dexposition. Une exposition chronique (1,25-2,25 mg/kg p.v. par injections intra-pritonales) entrane des lsions prnoplastiques au niveau du foie, accompagnes de modifications au niveau de certains organes tels que la rate, lintestin, les branchies et le pancras. En cas de toxicit aigu (7,5 -13,75 mg/kg p.v. par injection intra-pritonale), anorexie et mortalit sont observes. Les autres symptmes rpondant des doses leves dAFB1 sont des atteintes ncrotiques et vasculaires (hmorragies) du foie, des branchies, de lintestin et des gonades, mais galement des mningites, des congestions du cerveau, une dgnrescence et une raction inflammatoire au niveau du cur, une dgnrescence et une atteinte ncrotique des tubules du rein et une fonte de la muqueuse intestinale (Jantrarotai et al., 1990 ; Sahoo et Mukherjee., 2001b). Limportance des aflatoxicoses dpend de lge et de lespce des poissons (Tableau 5). Les alevins sont plus sensibles que les adultes et la truite arc-en-ciel est un des animaux les plus sensibles (DL50 : 0,81 mg/kg p.c.) alors que les espces deaux chaudes comme le poisson chat (DL50 : 11,5 mg/kg p.c.) sont moins sensibles aux aflatoxines (Jantrarotai et al., 1990). Mais mme si les poissons deaux chaudes ont une sensibilit moindre, 10 mg/kg dAFB1 environ dans laliment suffisent causer une diminution des performances de croissance et des lsions tissulaires chez le poisson chat (Jantrarotai et Lowell, 1990) et la carpe indienne (Sahoo et al., 2001a) et 0,1 mg/kg daliment chez le tilapia du Nil (Oreochromis niloticus) (El-Banna et al., 1992 ; Chavez-Sanches et al., 1994), Un effet immuno-modulateur de lAFB1 a galement t observ chez les espces de poissons tudies, mais des concentrations en aflatoxines trs variables selon les espces : partir de 0,02 mg AFB1/kg daliment chez la carpe indienne (Sahoo et Mukherjee, 2001a et b et 2003; Sahoo et al., 2001) ou partir de 20 mg/kg chez le poisson chat (Lumlertdacha et Lovell, 1995). Quant aux concentrations en AFB1 ncessaires pour induire un cancer hpatique, elles varient galement trs fortement selon les espces : 0,02 mg/kg pour la truite arc-en-ciel ou 5 mg/kg chez le saumon coho par exemple (Bailey et al., 1988). Chez les poissons, une exposition lAFB1 entrane une rduction de la capacit de phagocytose des macrophages chez le tilapia du Nil (El-Enbaawy et al., 1994), la suppression de lactivit bactricide

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du srum, de la fonction neutrophile, de la rponse humorale immune et des niveaux de globulines chez la carpe indienne (exposition chronique) (Sahoo et Mukherjee, 2001a), une rduction de la mmoire des cellules B chez les embryons de truite arc-en-ciel (Arkoosh et Kaatari, 1987) et enfin une suppression de la production dimmunoglobuline et de la prolifration des lymphocytes chez la truite arc-en-ciel adulte (Ottinger et Kaatari, 1998). Une injection intra-pritonale dAFB1 (1,25 mg/kg p.v.) chez la carpe indienne produit une lymphocytolyse massive dans les organes hmatopoietiques (Sahoo et al., 2001,Sahoo et Mukherjee, 2001a ). Une exposition embryonnaire lAFB1 rsulte en une dysfonction immune long terme (au minimum 2 ans), caractris par un taux lev de prolifration et de production dimmunoglobines et par un impact diffrentiel sur les populations de leucocytes. Il est suggr que lAFB1 provoque une rduction de la capacit des rponses immunorgulatrices des cellules B et T (Ottinger et Kaattari, 2000). Le potentiel immunosuppresseur a aussi t observ lors dexprimentations chez le rat : immunit cellulaire affecte lors dune intoxication sub-chronique et orale partir de 300 et 600 ng AFB1/kg p.c. et pouvoir phagocitaire perturb lors dune intoxication par inhalation (JECFA, WHO, 1998) Chez les crevettes, plusieurs tudes ont montr que lAFB1 peut causer une rduction des performances de croissance, une digestibilit des aliments diminue, des dsordres physiologiques et des altrations tissulaires, principalement au niveau de lhpato-pancras (Boonyaratpalin et al., 2001 ; Bintvihok et al., 2003 ). Toutefois les donnes sont contradictoires selon les tudes en ce qui concerne les doses efficaces. Dans un cas, 0,02 mg/kg dans laliment suffisent induire de la mortalit, des altrations tissulaires au niveau de lhpatopancras et des changements biochimiques de lhmolymphe (Bintvihok et al., 2003), alors quune autre tude (Boonyaratpalin et al., 2001) a montr que des doses de 0,05-0,1 mg/kg naffectent pas la croissance des crevettes juvniles (effet not 0,5-2,5 mg/kg), des doses de 0,5-1 mg/kg daliment naffectent pas le taux de survie (effet not 2,5 mg/kg). Risque dexposition des poissons laflatoxine B1 LAFB1 et lAFB2 peuvent contaminer des matires premires susceptibles dtre incorpores dans les aliments pour poissons, telles quelles ou aprs avoir t transformes. Certaines espces de poissons dlevage sont plus exposes que dautres du fait de leur type dalimentation. Ainsi, le poisson chat dlevage a un risque dexposition lev par le biais de son alimentation pouvant contenir jusqu 25% de tourteau de coton, matire premire typiquement contamine par des aflatoxines (Lovell, 1984). Lenvironnement de la crevette noire tigre thalandaise lexpose galement une alimentation pouvant contenir des aflatoxines, cause des conditions climatiques des pays de production favorisant leur biosynthse (Bintvihok et al., 2003). Transfert dans les tissus animaux Compte-tenu des donnes de toxicocintique (cf. toxicocintique), il existe un potentiel trs faible pour laccumulation dAFB1 et de ses mtabolites dans les tissus comestibles (muscles) de poissons chat ayant consomm de laliment contamin. En revanche, ltude de Larsson et al. (1992) chez la truite arc-en-ciel suggre une accumulation dans les tissus non comestibles, mais pas dans les muscles. Chez la crevette noire tigre thalandaise, aucune trace dAFB1 ou de ses mtabolites na t trouve dans le muscle aprs une ingestion de 20 g dAFB1/kg daliment pendant 10 jours (Bintvihok et al., 2003). Ces donnes suggrent un risque toxicologique faible pour le consommateur.

6.2. Exposition animale


La mthodologie gnrale est dcrite en annexe 2 6.2.1 Donnes de contamination A partir de donnes de diffrentes origines (voir annexe 2), 1232 valeurs de contamination ont t recueillies, rparties sur 67 types daliments. Cependant, de nombreuses valeurs sont inutilisables car effectues sur des aliments non dfinis clairement (composition inconnue) tels qu aliments complets , complments , ou aliments dont lintitul nest pas suffisamment prcis : fourrages bovins ou dshydrats , autres crales ou encore des analyses sur un mlange de produits : arachides et tourteaux darachides .

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Pour de nombreuses matires premires, on dispose de moins de 5 donnes, voire souvent dune seule donne, celles-ci nont pas t intgres dans le tableau 6a et dans le calcul de lexposition. Au total, une fois ces analyses retires, il reste 908 valeurs de contamination qui ont t regroupes pour former 13 groupes daliments. Tableau 6a : Rpartition des donnes de contamination en laflatoxine B1 par groupe de matires premires (n>= 5)
Nombre de donnes % < LOD 100,0 7 40 52,5 159 90,6 6 83,3 100,0 20 5 100,0 9 11,1 7 100,0 286 1,4 6 100,0 14 7,1 173 89,6 122 77,0 54 35,2 908 53,9 % > LOQ 0,0 27,5 8,8 0,0 0,0 0,0 22,2 0,0 97,9 0,0 92,9 5,8 15,6 51,9 41,5

bl corn gluten feed mas manioc pois sarrasin soluble de distillerie son tourteau darachide tourteau de colza tourteau de coton tourteau de palmiste tourteau de soja tourteau de tournesol Total

La limite de ces donnes tient au pourcentage important des valeurs non dtectes (ND) parmi les rsultats danalyses (53,9%). En effet, le traitement par lun ou lautre des scnarii tel que dfini dans la mthodologie gnrale de calcul de lexposition gnrale (cf annexe II) a une importance considrable compte-tenu du fait que cela va affecter la valeur de plus de 1 donne sur 2. 41.5% des valeurs sont quantifies et serviront lestimation selon le 2me scnario. Les deux estimations (minimale calcule et au 75me percentile des teneurs > LOQ, comme dcrit dans la mthodologie gnrale) sont compares aux limites maximales fixes pour les aliments complets par la Directive 2002/32/CE modifie par la Directive 2003/100 (voir tableau en annexe 2). 6.2.2 Calcul de lexposition

Les calculs de contamination des rations sont les suivants (les tableaux dtaills des rsultats sont en annexe 2 Exposition animale : Mthodologie gnrale ).: Pour les herbivores, ruminants (notamment bovins) Lexposition na pas t calcule ; en effet, les rgimes comportent pour une trs large part des matires premires pour lesquelles nous ne disposons pas ou pas suffisamment de donnes de contamination en laflatoxine B1: fourrages, pturages ou encore ensilages de mas pour ce qui concerne le rgime retenu (cf annexe 2 Exposition animale : Mthodologie gnrale ). - Pour les volailles (Tableau 6b) Tableau 6b : Calculs de contamination en laflatoxine B1 des rations destines aux volailles
contamination minimale calcule part de la en g/kg d'aliment ration (en %) 0.156 93.3 0.163 0.132 93.2 84.6 contamination des positifs Dir 2002/32/CE au p75 au p95 valeurs limites part de la en g/kg d'aliment ration (en %) (en g/kg) 0.448 5.237 53.3 10 0.387 4.377 43.2 20 0.274 3.031 29.6 20

Poulet standard

dmarrage croissance finition

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retrait dmarrage croissance finition-retrait Poule pondeuse dmarrage croissance repro-entretien pondeuse Dinde dmarrage croissance 1 croissance 2 finition 1 finition 2 finition 3 Pintade dmarrage croissance finition-retrait Canard Barbarie canard dmarrage canard croissance canard finition Canard prt gaver levage gavage Poulet label

0.097 0.163 0.144 0.158 0.168 0.149 0.155 0.159 0.172 0.156 0.158 0.145 0.135 0.096 0.195 0.160 0.164 0.127 0.113 0.093 0.140 0.158

84.0 96.4 96.7 96.8 94.1 94.3 95.0 88.9 88.0 84.8 89.4 87.9 87.5 81.2 93.8 86.3 87.4 92,1 93,2 89,3 95,0 98,0

0.202 0.624 0.638 0.611 0.544 0.485 0.472 0.568 0.420 0.289 0.291 0.369 0.198 0.180 0.792 0.806 0.892 0.390 0.365 0.295 0.563 1.225

2.349 5.487 4.374 4.072 4.646 3.649 3.378 4.334 6.371 4.882 4.590 4.296 2.930 2.394 6.625 5.497 5.643 3.685 2.819 1.886 4.180 4.704

23.9 65.2 60.6 57.4 56.2 47.7 45.5 54.0 57.1 41.8 40.5 42.9 26.6 22.9 81.1 76.3 82.4 42,1 36,2 27,4 55.0 98.0

20 10 20 20 10 20 20 20 10 20 20 20 20 20 10 20 20 10 20 20 10 20

La part de la ration (exprime en pourcentage) susceptible de contenir des aflatoxines utilise dans le calcul de lexposition varie selon les scenarii : - dans le cas de la contamination minimale calcule, elle correspond aux matires premires pour lesquelles on a des donnes (mme si elles sont ND), - dans le cas des scnarii contamination aux percentiles levs (p75 et p95)des teneurs positives, elle correspond aux matires premires pour lesquelles les teneurs sont suprieures la LOD. Aux 95me percentiles de contamination pour les volailles jeunes (valeur limite 10 g/kg daliment), la valeur de contamination de la ration calcule atteint la moiti de cette limite (pour une ration prise en compte variant de 42 81%). Dans les autres cas, la contamination par les aflatoxines des aliments pour les volailles, en France, se rvle largement infrieure aux limites imposes par la rglementation europenne. Pour les porcs (Tableau 6c)

Tableau 6c : Calculs de contamination en laflatoxine B1 des rations destines aux porcins


contamination minimale calcule Porcins 1er ge 2me ge croissance corpen finition corpen truies gestantes truies allaitantes part de la en g/kg d'aliment ration (en %) 0.092 64.0 0.095 63.5 0.167 68.8 0.149 79.0 0.170 63.3 0.128 54.6 contamination des positifs Dir 2002/32/CE au p75 au p95 valeurs limites part de la en g/kg d'aliment ration (en %) (en g/kg) 0.484 2.618 42.5 10.0 0.256 2.095 26.0 10.0 0.261 1.912 25.4 20.0 0.269 1.032 21.5 20.0 0.350 1.456 24.4 20.0 0.223 1.743 21.1 20.0

Comme pour les volailles, la contamination des aliments pour porcins par les aflatoxines en France se rvle largement infrieure la rglementation europenne pour lestimation moyenne et au p75. Lestimation au 95me percentile de contamination des valeurs positives atteint 20% de la valeur limite pour les jeunes porcs, alors que seuls 26 42% de la ration totale est prise en compte.

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Linterprtation de ces rsultats doit tre effectue avec prudence en raison du nombre limit de donnes disponibles pour des groupes entiers de matires premires. Ainsi, pour les jeunes porcins, le scnario minimal calcul tenant aussi compte des valeurs ND, ne prend en compte au maximum que 64% de la ration. Ces premires estimations ne peuvent tre que des approximations complter avec lobtention de donnes complmentaires.

7. Rglementation Dans le cadre du rglement 1881/2006/CE (abrogeant le rglement 466/2001/CE et ses modifications) portant fixation de teneurs maximales pour certains contaminants dans les denres alimentaires et de la directive 2002/32 (et ses modifications) sur les substances indsirables dans les aliments pour animaux, des teneurs maximales ont t fixes pour les aflatoxines (tableaux 7a et 7b ). Tableau 7a : Teneurs maximales en aflatoxines (en g/kg) en alimentation humaine
Aflatoxines

Matrice
Arachides (cacahutes) graines + fruits secs Crales + autres

Aflatoxine B1 Certaines pices Prparations base de crales pour enfants en bas ge Arachides (cacahutes) + autres graines + fruits secs Crales Certaines pices Lait Prparations pour enfants en bas ge

Teneur maximale en g/kg de 2, 5 ou 8 selon le produit et son stade de transformation 2 ou 5 selon le produit et son stade de transformation 5 0,1 de 4, 10 ou 15 selon le produit et son stade de transformation 4 ou 10 selon le produit et son stade de transformation 10 0,05 0,025

Aflatoxines B1+B2+G1+G2

Aflatoxine M1

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Tableau 7b : Teneurs maximales en aflatoxine B1 (en g/kg) en alimentation animale


Types daliments Toutes les matires premires des aliments pour animaux Aliments complets pour bovins, ovins et caprins lexception de : - aliments complets pour btail laitier - aliments complets pour veaux et agneaux Aliments complets pour porcs et volailles ( lexception des jeunes animaux) Autres aliments complets Aliments complmentaires pour bovins, ovins et caprins ( lexception des aliments complmentaires pour btail laitiers, veaux et agneaux) Aliments complmentaires pour porcs et volailles ( lexception des jeunes animaux) Autres aliments complmentaires Teneur maximale en g/kg (teneur en humidit de 12%)

20 20 5 10 20 10 20 20 5

8. Surveillance et contrle en France


Dans le cadre des plans de surveillance et de contrle des services de lEtat (Direction Gnrale de lAlimentation DGAL- et Direction Gnrale de la Concurrence, de la Consommation et de la Rpression des Fraudes- DGCCRF-), les aflatoxines sont recherches rgulirement chaque anne dans des centaines dchantillons. Les prlvements sont effectus aussi bien au moment de limportation que sur le march . Les lots non conformes la rglementation (voir teneurs limites au ci dessus) sont rejets limportation ou retirs du march . Bien que les denres prleves au sein des catgories daliments rglementes soient de nature et dorigine variables selon les annes, il peut nanmoins tre dgag les grandes tendances de conformit suivantes : Aflatoxines B et G Concernant les produits craliers (semoules et farines de bl, de mas, pains, biscottes, biscuits, riz, crales pour petit djeuner) parmi les dizaines dchantillons analyss annuellement, aucune non conformit na t releve, sauf en 2005 o une farine de mas biologique en provenance dEurope du sud savrait contenir 7,5 g dAFB1/kg. Ce lot, retir du march, conforte lmergence rcente de la possibilit, dj observe en 2003 lors de la canicule, de prsence d'AFB1 dans le mas originaire de la zone mridionale de lEurope. Pour les cas des prparations base de crales pour enfants en bas ge, aucune non conformit na t releve. Concernant les fruits secs et graines olagineuses (fruits coque tels que amandes, pistaches, noix, noisettes ; graines olagineuses telles que larachide ; fruits schs tels que figues, dattes, abricots, raisins), parmi les 200 350 prlvements annuels (361 en 2007 dont 115 chantillons de figues), 1012% des chantillons dpassent les limites rglementaires. Cette proportion de non conformit est dailleurs observe pour chacune des 3 sous-catgories: les fruits coques et arachides, les figues, et les autres fruits schs. Concernant les pices (piments doux et forts, poivre, muscade) parmi la trentaine de prlvements annuels, 1 2 chantillons se trouvent au-del de la limite rglementaire, celui de 2006 (un piment fort) prsentait une teneur moyenne de 20 g dAFB1/kg. Aflatoxine M1 Concernant le lait, parmi une centaine au moins de prlvements annuels, les rsultats des analyses montrent une conformit la teneur maximale rglementaire de 0,05 g/L. Laflatoxine M1 a t recherche plus spcifiquement entre 1995 et 2005 dans le lait et la poudre de lait destins aux adultes, ainsi que dans les laits infantiles. LAFM1 a t quantifie dans 10% des chantillons de lait infantile avec une contamination moyenne de 0,0019 g/L. La contamination des laits de consommation est de 0,0028 g/L en moyenne. Dans les deux types de lait, les limites rglementaires ne sont jamais dpasses. La poudre de lait est plus contamine (0,03 g/kg) mais sa dilution/reconstitution conduit une concentration dans la prparation finale voisine de celle du lait liquide (soit 0,003 g/kg) et donc conforme la rglementation.

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9. Conclusion - Recommandations
Le groupe des aflatoxines et son reprsentant principal laflatoxine B1 (tant en termes de teneur et de frquence dans les aliments risque que dimpact toxique) est le groupe de mycotoxines le mieux tudi et le plus rglement. Laflatoxine B1 est ce jour la seule mycotoxine identifie comme cancrogne avr chez lhomme. Par ailleurs, il a t mis en vidence que laflatoxine B1 tait retrouve sous la forme de son mtabolite M1 dans le lait. Les mesures rglementaires en vigueur dans lUnion Europenne sont parmi les plus svres. Mme si ces tudes et ces rglementations ont permis de diminuer le risque un niveau trs faible, ces mesures doivent tre poursuivies pour maintenir une matrise de ce risque un niveau faible. Plus prcisment, la conduite des plans de contrle visant contrler lapplication des mesures lgislatives prises au sein de lUnion europenne est maintenir et cela aussi bien au stade des matires premires vgtales, notamment fruits secs et arachides, quau stade des produits finis ou drivs tels que le lait. En ce domaine, la provenance des chantillons est une information dintrt maintenir pour linterprtation des donnes issues de ces plans. De plus il est recommand au niveau de la surveillance : un programme de surveillance orient sur le mas, en ciblant par exemple une rgion suivie sur plusieurs annes, ce qui permettrait de surveiller les teneurs en aflatoxines en fonction des conditions climatiques. En effet, lvolution climatique observe en Europe pourrait conduire des conditions de temprature et dhumidit davantage favorables la prolifration despces toxinognes et la possibilit de production daflatoxines dans certaines rgions mridionales de la France. au niveau de la prvention : les mesures rglementaires peuvent tre contraignantes pour certains acteurs professionnels notamment pour ceux des pays en voie de dveloppement qui abritent une grande part des zones "risque aflatoxines". De ce fait, ces mesures sont accompagner par ltablissement de guides de bonnes pratiques appliquer la production et la transformation. Cest laccent mis par certaines instances internationales dans leurs travaux actuels, lesquels doivent donc tre encourags. au niveau des connaissances relatives au devenir chez les animaux dlevage : il serait intressant de raliser des tudes de transfert dans les ufs et la viande chez les volailles, ainsi que dans le lait chez les petits ruminants. En outre, des tudes complmentaires chez les vaches fortes productrices viseront confirmer le taux de transfert dans le lait, ntant actuellement tabli qu partir dune seule tude.

Rfrences bibliographiques : voir document spcifique

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Chapitre 2

Lochratoxine A

Coordination : Dominique Parent Massin et Pierre Galtier

Introduction
Les ochratoxines sont des mtabolites de moisissures appartenant aux genres Aspergillus ou Penicillium. Leur prsence est lie au climat, particulirement lors de la rcolte, et aux conditions de stockage aprs rcolte. Parmi les 9 ochratoxines dcrites, seules l'ochratoxine A et trs rarement l'ochratoxine B ont t retrouves sur des produits vgtaux. Compte tenu de la prvalence et de la toxicit de lochratoxine A (OTA), seule cette dernire sera traite. L'ochratoxine A est produite sous les climats froids et temprs par Penicilium verrucosum et par Aspergillus carbonarius et en rgions chaudes et tropicales par Aspergillus ochraceus. Penicilium verrucosum, spcifiquement associ aux crales stockes, est trs commun en Europe du Nord et au Canada. Aspergillus ochraceus est le champignon le plus commun dans le caf vert et les pices. Il est galement retrouv sur les graines de cacao, le soja, les cacahutes, le riz et le mas. Quant Aspergillus carbonarius, il est susceptible entre autres de contaminer le raisin. Bien que les infections fongiques puissent avoir lieu avant et aprs rcolte, la synthse de l'ochratoxine A se fait surtout lors du stockage. Les denres alimentaires haut risque de contamination par l'ochratoxine sont les crales (mas, orge, bl, sorgho, avoine et riz). D'autres denres peuvent tre contamines comme les graines de cacao, le vin, le jus de raisin, la bire, des pices et la viande de porc. Les aliments pour animaux peuvent aussi tre contamins par l'ochratoxine A, les abats (sang, rognons) danimaux ayant consomm de tels aliments peuvent alors prsenter des rsidus dOTA. L'ochratoxine A est connue pour sa nphrotoxicit. Elle serait lun des facteurs potentiels lorigine de troubles rnaux chez lhomme connus sous le nom de Nphropathie Endmique des Balkans (NEB). Elle savre galement immunotoxique, tratogne et neurotoxique. Son pouvoir cancrogne est tabli chez l'animal, mais les preuves sont encore insuffisantes chez l'homme.

Proprits physiques et chimiques de lochratoxine A

L'OTA a t isole pour la premire fois partir d'Aspergillus ochraceus en 1965 par van der Merwe et al.. Par la suite, elle a t identifie comme contaminant du mas aux USA en 1969, puis dans l'ensemble du monde (Weindenburner, 2001). L'OTA est la N-[(5-chloro-3,4-dihydro-8-hydroxy-3-mthyl-1oxo-1H-2-benzopyran-7-yl)carbonyl]-L phnylalanine. Sa formule brute est C2OH18ClNO6. Son numro de CAS est 303-47-9 (figure 2). Diffrents drivs de l'OTA ont t identifis, notamment les ochratoxines B et C qui sont respectivement l'analogue dchlor et l'ester thylique de l'OTA (Weindenburner, 2001) (figures 1 et 2).

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Nom Ochratoxine A Ochratoxine B Ochratoxine C Ochratoxine Ochratoxine 4R-Hydroxyochratoxine A 4S-Hydroxyochratoxine A 10-Hydroxyochratoxine A Ochratoxine A ouverte

Abrviation OTA OTB OTC OT OT OTA-OH OTA-OH OTA-OH OP-OTA

R1 Phnylalanyl Phnylalanyl Phnylalanyl, thyl ester OH OH Phnylalanyl Phnylalanyl Phnylalanyl Phnylalanyl

R2 Cl H Cl Cl H Cl Cl Cl Cl

R3 H H H H H H OH H -

R4 H H H H H OH H H -

R5 H H H H H H H OH -

Figure 1 : Structure des diffrentes ochratoxines et de leurs mtabolites : gauche, ochratoxine et ses analogues (voir le tableau) ; droite, forme ouverte de lochratoxine A (OPOTA) L'OTA pure est un solide blanc cristallis, de masse molculaire de 403,8 g/mol (CIRC, 193). C'est un acide organique faible ayant un pKa de 7,1. A pH acide ou neutre, elle est soluble dans les solvants organiques polaires et trs peu soluble dans l'eau. A pH alcalin, elle devient soluble et stable dans une solution aqueuse de carbonate monosodique (0,1 M, pH 7,4) ainsi que dans les solutions alcalines aqueuses. Le spectre d'absorption UV de l'OTA varie en fonction du pH et de la polarit du solvant. L'OTA possde un maximum d'absorption 333 nm avec un coefficient d'extinction molaire de 5500/mol.cm dans le mthanol. Dans les mmes conditions, ce coefficient est de 6400 pour la 4(R)-OH-OTA, un mtabolite de l'OTA, alors que l'OT absorbe 338 nm avec un coefficient de 5600 et l'OTB absorbe 318 nm avec un coefficient de 6500. Dans le carbonate monosodique (0,1 M ; pH 7,4) l'OTA a un maximum d'absorption 378 nm avec un coefficient d'extinction de 14700. Sous excitation 340 nm, l'ochratoxine A est fluorescente, avec un maximum d'mission 428 nm sous sa forme non ionise et 467 nm sous sa forme ionise. En raison de sa structure, l'OTA se rvle stable au stockage.

Mthodes danalyse (voir principes gnraux en Annexe 1)

Le rglement (CE) n 401/2006 de la Commission du 23 fvrier 2006 fixe les modes de prlvement d'chantillons et des mthodes d'analyse pour le contrle officiel des teneurs en mycotoxines des denres alimentaires. De nombreux ouvrages, les rapports annuels de Association of Official Analytical Chemists (premier numro de chaque anne du J. of AOAC) et des articles de synthse traitent des mthodes analytiques consacrs aux mycotoxines en gnral et lOTA en particulier (Scott, 1991, 1993 et 1995 ; Betina, 1993 ; Lawrence et Scott, 1993 ; Chu, 1991 et 1992 ; Cole, 1986). Les innovations rcentes concernent principalement les techniques de purification et linstrumentation. Lapproche consistant en la purification par colonne dimmunoaffinit (CIA) et mesure par chromatographie liquide couple la fluorimtrie est devenue la mthode la plus rpandue. La chromatographie sur couche mince et la technique ELISA restent utilises bien que plus

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rarement, leurs performances tant significativement en retrait. Lintroduction gnralise de la spectromtrie de masse pour la mesure des rsidus et des contaminants npargnera pas lOTA tout au moins en approche de confirmation. De la mme manire, bien que non encore gnralises, les techniques sappuyant sur les bio-senseurs trouveront leur place en technique de dpistage. Les limites de quantification sont aujourdhui de lordre de 0,03 g/L pour le vin et la bire et de 0,3 0,6 g/kg pour la plupart des autres aliments. 2.1 Extraction Lextraction repose trs souvent sur lutilisation dun mlange de solvant - matrice dpendant impliquant solvants aqueux et organiques. Une mthode IUPAC/AOAC pour la mesure de lOTA dans lorge utilise un mlange chloroforme acide phosphorique (Battaglia et al., 1996). Pour le caf vert (AOAC, 1990) ou encore le vin (Zimmerli et Dick, 1995), le chloroforme a t utilis avec succs. Pour lextraction de lOTA dans le bl, des mlanges plus complexes ont t utiliss tels que tolune/HCl/MgCl2, CHCl3/ethanol/acide actique ou encore CH2Cl2/H3PO4. Pour des raisons de protection de lenvironnement, les solvants chlors sont progressivement remplacs. Le tertbutylmthylether (TBDME) a dj prouv son efficacit pour lextraction de lOTA dans les aliments pour bbs (Burdaspal, 1997). Des mlanges mthanol/eau ou encore actonitrile/eau ont galement t utiliss dans des mthodes plus rcemment valides (Entwisle, 2000). 2.2 Purification Lutilisation des colonnes dimmunoaffinit reprsente ltat de lart pour la purification dchantillons contenant de lOTA. Lchantillon peut tre appliqu directement sur la colonne dimmunoaffinit ; cest le cas des chantillons de vins ou de bire pour lesquels une dilution avec du polythylne glycol ou du NaHCO3 doit prcder lapplication (Visconti et al., 1999). Pour des chantillons plus complexes tels que le caf torrfi, une tape de SPE (silice greffe par des groupements phnyles) doit tre prvue en amont pour liminer la cafine, interfrence perturbant la rtention de lOTA sur la colonne. Les colonnes de silice pure sont galement utilises ; les solvants assurant llution sont composs de tolune/acide actique ou encore tolune/actone/acide formique. Enfin, des phases stationnaires reposant sur le principe de lempreinte molculaire (MIP) mergent actuellement , leur slectivit est quivalente celledes colonnes dimmunoaffinit anticorps polyclonaux. 2.3 Sparation et dtection Les immuno-essais, tout particulirement lELISA et la RIA, sont des techniques appliques en dpistage dans une minorit de laboratoires. Elles ont t utilises pour doser lOTA dans des chantillons de rein de porc ou de lait (Morgan et al., 1986 ; Rousseau et al., 1987 ; Valenta et al., 1993 ; Kuhn et al., 1995 ; Valenta et al., 1996). La chromatographie couche mince (CCM) est aujourdhui moins utilise que dans le pass pour dterminer la teneur en OTA dans les aliments, en raison de ses moindres performances en termes de spcificit et de sensibilit. La sparation est assure en phase normale sur phase stationnaire type silice, avec des phases mobiles composes de solvants organiques chlors (chloroforme) et dalcool (mthanol ou thanol), ou encore tolune/actate dthyle. Sous irradiation UV, lOTA est reconnaissable sa couleur bleu-vert qui devient violette par traitement avec une solution alcaline, NaOH, NaHCO3 ou NH4OH et. La confirmation dun chantillon suspect implique sa rextraction et la drivatisation de lextrait par BF3-CH3OH, ou HCl-CH3OH (Zimmerli et Dick, 1995) ou H2SO4-CH3OH (Takeda et al., 1991) c'est--dire la conversion de lOTA en son ester mthylique, avant dpt en CCM ou injection en HPLC. Cette approche est celle retenue dans la mthode AOAC ddie la recherche dOTA dans le mas et lorge (AOAC, 1997). Nanmoins, plusieurs auteurs soulignent les problmes rencontrs pour confirmer de faibles concentrations en OTA dans des chantillons biologiques en particulier le lait (Miraglia et al., 1995 ; Valenta et Goll, 1996). Une des techniques les plus utilises est la chromatographie liquide haute performance couple la dtection fluorimtrique (HPLC-FD). Lappariement dions a t utilis pour retenir lOTA notamment pour son analyse dans le lait : elle permet de retenir lOTA pH 7,5 en introduisant un contre-ion qui forme un complexe avec lochratoxine dissocie (Breitholz, 1991). A ce pH alcalin, un dplacement de labsorption de lOTA est observ de 330 nm 380 nm, associ une amlioration du signal. De trs faibles concentrations ont ainsi pu tre dtectes dans le lait (jusqu 0,02 ng.mL-1). Linconvnient majeur de cette approche rside dans la faible rptabilit associe aux temps de rtention de lOTA en fonction de la composition de la phase mobile. Le principe de la phase inverse est en pratique privilgi avec des phases stationnaires de type C18 et une phase mobile impliquant actonitrile ou

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mthanol associ de lacide actique ou phosphorique dilu. En effet, comme lOTA est un acide faible, il est ncessaire dacidifier la phase mobile de manire viter toute trane de pic et rtention aspcifique. Lactonitrile est gnralement prfr pour sa faible viscosit et sa meilleure efficacit de sparation. Reinhard et Zimmerli (1999) relatent lefficacit compare de plusieurs phases stationnaires en tudiant linfluence des conditions de pH et de temprature sur la rtention de lOTA. En terme de limite de performance, les mthodes HPLC-FD sont applicables pour le dosage de lOTA dans lorge, le bl, le son et le seigle, des concentrations au moins gales 10 g/kg (AOAC, 1992 ; Larsson et al., 1996). Dans les aliments pour bb, une limite de quantification de 0,008 g/kg a t obtenue par drivation post-colonne avec de lammoniac (Burdaspal, 1997 ; Zimmerli et Dick, 1995). Alors que le couplage GC-MS sest avr mal adapt lanalyse de lOTA, le couplage LC-MS a dmontr sa capacit rpondre aux attentes de la problmatique, non pas en amliorant la sensibilit mais en dlivrant des signaux plus spcifiques (Abramson, 1987 ; Rajakyla et al., 1987). Dans ce cas lutilisation dtalons internes de structure chimique identique (marqus au (2H) ou (13C)) devient possible, ce qui contribue lamlioration des performances quantitatives de la mthode. En particulier, le couplage HPLC - spectromtrie de masse bidimensionnelle avec interface lectrospray (LC-ESI-MS/MS) a dmontr son efficacit vis--vis de lHPLC-FL (Becker et al., 1998 ; Zllner et al., 2000 ; Leitner et al., 2002). Driffield et al. (2003) ont dvelopp une approche LC-MS/MS sur systme triple quadripolaire (ionisation lectrospray), intgrant lOTA et son mtabolite OT. Les limites de quantification ont t abaisses 1 g/kg pour des chantillons de foie de porc. Les intrts majeurs de la technique sont une simplification de la prparation de lchantillon, une automatisation de la mesure et du traitement du signal (dtection, identification et quantification) sans besoin dtape supplmentaire de confirmation, rendant compatible in fine la technique avec le haut dbit danalyse. Enfin, court terme la LC-MS devrait devenir la technique de rfrence, en raison de sa capacit sadresser tous les analytes quelles que soient leurs structures chimiques. 2.4 Mthodes de rfrence, essais interlaboratoires Pour la dtermination de lOTA dans les graines, des mthodes officielles sont disponibles ; elles sont plus rares voire inexistantes dans les denres dorigine animale. Plusieurs mthodes danalyse par CCM et HPLC ont t valides pour lochratoxine A travers des tudes collaboratives (AOAC International, 2000). Quelques mthodes HPLC ddies laliment (comme les grains) ont t standardises par le Comit Europen de Normalisation (CEN) (De Vreeze, 2003), lequel a galement fix des critres gnraux de performance (CEN, 1999). Des matriaux de rfrence certifis (European Commissions Joint Research Centre/Institute for Reference Materials et Measurements) ainsi que des solutions de rfrence calibres sont aujourdhui disponibles. Des tests daptitude internationaux sont organiss rgulirement par des organismes tels que le FAPAS (Food Analysis Performance Assessment Scheme). Dans ce cadre, une tude rcente (2003/2004) a clairement montr que la stratgie la plus communment retenue et applique par les laboratoires consiste en la combinaison dune tape de purification par colonne dimmunoaffinit suivie dune sparation par HPLC et dtection par fluorimtrie. Les rsultats rapports par le FAPAS dmontrent des scores de satisfaction atteignant 85 100 % pour des chantillons de crales supplments en ochratoxine A entre 6,4 et 23,4 g/kg. Ces rsultats traduisent bien le niveau de performance des mthodes utilises et la bonne matrise de leur application par les laboratoires.

Facteurs influenant la teneur en ochratoxine A dans les denres

3.1 Moisissures toxinognes D'abord dcrite comme mtabolite dAspergillus ochraceus (Van der Merwe et al., 1965), il a t montr depuis que l'OTA pouvait tre produite par d'autres espces d'Aspergillus (Ciegler, 1972; Hesseltime et al., 1972), en particulier A. carbonarius (Heenan et al., 1998 ; Moss, 1996 ; Varga et al., 1996). A. niger produirait galement de faibles taux d'OTA (Abarca et al.,1994, Tren et al., 1996). Accensi et al. (2004) ont recherch les espces dAspergillus prsentes dans les aliments pour animaux (153 chantillons de crales et lgumineuses et 147 chantillons d'aliments composs). 94,4 % des chantillons de lgumineuses et 89,9 % des aliments composs taient contamins par des Aspergillus contre seulement 53,3 % pour les crales. A. niger var. niger reprsentait 23 % des espces isoles et A. ochraceus, 7,3 %. Mais seulement 3 souches sur 52 d'A. niger et une souche sur 20 d'A. ochraceus taient productrices d'OTA. Par la suite, les sources les plus importantes se sont rvles tre des souches de Penicillium verrucosum (Scott et al., 1970, Krogh et al., 1973, Pitt, 1987) (anciennement nomm P. viridicatum).

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La formation d'OTA dpend du pouvoir toxinogne de la souche de moisissure, du type de substrat et de la localisation gographique. Les conditions de production de lOTA sont propres chaque moisissure et leurs matrises passent essentiellement par les bonnes pratiques de schage et de stockage des grains et des fruits au sec.

3.2 Conditions de toxinogense et voie de biosynthse La biosynthse de l'ochratoxine A par les diffrentes moisissures productrices n'est pas lucide, l'organisation des gnes codant pour cette mycotoxine est inconnue (Varga et al., 2003), mme si plusieurs polyktides synthases sont ncessaires la biosynthse de l'OTA dans A. ochraceus (O'Callaghan et al., 2003). La partie isocoumarine de l'OTA est probablement drive d'un squelette pentactone. Aspergillus ochraceus est dcrit comme tant msophile xrotolrant. Sa croissance est observe entre 8 et 37 C avec un optimum entre 24 et 31 C. Les conditions d'humidit les plus favorables sont toutefois de l'ordre dune Aw de 0,_5 0,95 . A. ochraceus est retrouv dans divers produits alimentaires dorigine vgtale peu hydrats comme les produits secs (haricots secs, graines de soja, pices, olives, fruits secs, noix de pcan, pistaches, cacahutes et noisettes) et dans les crales (riz, avoine, mas). A. ochraceus a aussi t retrouv dans des produits dorigine animale comme des fromages, salaisons, poissons ou viandes schs. Penicillium verrucosum crot lentement pour une faible activit en eau (Aw infrieur 0,80) et basse temprature, entre 0 et 31 C avec un optimum 20 C, ce qui explique une distribution confine aux zones tempres ou froides. Les supports potentiels de dveloppement de P. verrucosum sont les crales en Europe Centrale, du Nord et au Canada. Cette moisissure est pratiquement inconnue dans les rgions chaudes. La contamination est plus importante dans les pays d'Europe centrale, comme la Bulgarie (Petkova et Castegnaro, 1991). La croissance dA. carbonarius est ngligeable 10 C quelle que soit la valeur de lactivit de leau. Gnralement, sa croissance est plus importante 30C qu 37C. La croissance optimale est obtenue des tempratures comprises entre 25 et 35 C et une activit deau entre 0,93 et 0,985. La temprature optimale de production dOTA est de 15C alors qu' la temprature optimale de croissance du champignon peu dOTA est produite. LAw optimale pour la production dOTA est comprise entre 0,93 et 0,98. On peut aussi rencontrer lOTA dans les fourrages conservs tels que les ensilages, les balles rondes enrubannes ou les foins mal conservs (Scudamore et Livesey, 1998) qui constituent la base des rations alimentaires des ruminants. Elle est souvent associe une autre mycotoxine nphrotoxique, la citrinine (voir chapitre Autres mycotoxines).

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Effet des pratiques utilises lors de la production et du stockage et des procds technologiques

3.3.1 Crales En Europe, la prsence d'OTA dans les crales est due la croissance de P. verrucosum en condition humide lors du stockage. Les solutions pour viter la prsence dOTA dans le grain passent par le contrle du niveau dhumidit lors du remplissage du silo et au cours du stockage. Pendant la dure du stockage, la teneur en eau dpend du taux dhumidit la mise en silo et de la temprature du lot. Plus la temprature du lot est leve et plus le grain respire et libre de la vapeur deau. Or, d'une part, les grains sont habituellement rcolts chauds et, d'autre part, il peut s'tablir dans le silo un gradient de temprature selon son exposition au soleil. Il importe donc de maintenir la temprature aussi basse que possible. Selon le taux dhumidit du grain, cet objectif peut tre atteint par une ventilation adapte ou par le schage du grain. Dans le cas o le taux dhumidit des grains est suprieur 18%, il y a lieu de procder un schage. Le nettoyage (avant ou aprs stockage) devrait prcder toute commercialisation des grains. Cette opration conduit sparer des grains nettoys teneur plus faible en OTA et des issues de nettoyage, teneur plus leve en OTA (Osborne et al. 1996), commercialises sous diffrents noms pour lalimentation animale. Ces issues de nettoyage contiennent des graines trangres lespce cralire du lot, des petits grains et des grains casss de cette espce, des fragments de la plante tels que des pailles ou glumes et glumelles.

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La rpartition de lOTA dans les fractions cralires de meunerie a t peu tudie et les rsultats de la littrature sont contradictoires. Scudamore et al. (2003) et ITCF (1999) rapportent des teneurs dans les sons suprieures celles de la farine, alors que Chelkowski et al. (1981) observent des teneurs semblables. Ce dernier rsultat pourrait sexpliquer par une pntration des Penicillium diffrente dans le grain selon la nature soft /hard des bls (Osborne et al., 1996) 3.3.2 Bire Aprs inoculation pralable de lots dorge au moyen dune souche toxinogne de P. verrucosum, une tude du suivi du procd de brasserie a t conduite par Baxter et al. (2001) partir de grains naturellement contamins deux niveaux : 5,4 g et 52 g dOTA / kg, la premire contamination tant proche de la limite rglementaire propose dans lUE pour les crales. La bire ainsi produite, contenait moins dOTA que lorge. En terme de concentrations, cela quivaut en OTA de 2% 4% de celles du grain respectivement pour 5,4 g et 52 g dOTA / kg. Ce constat est en accord avec des tudes plus anciennes menes partir de grains supplments directement (1 10 mg/kg) en OTA (Gjertsen et al., 1973 ; Chu et al., 1975, Nip et al., 1975) et pour lesquels 13 32% tait restitu dans le produit final. Il est probable quune partie significative de lOTA soit dgrade durant le brassage sous laction denzymes protolytiques (la coupure de la liaison peptidique de lOTA la convertissant en OT non toxique) et quune autre partie de lOTA, du fait de sa faible solubilit dans leau reste dans le malt. Des teneurs rsiduelles dOTA ont t trouves dans les issues dorge malte (drches), les rendant impropres leur utilisation en alimentation animale (Baxter et al., 2001). 3.3.3 Caf Le caf vert est susceptible dtre contamin par lOTA. La torrfaction rduit la teneur en ochratoxine de faon variable selon les tudes. En effet, des tudes montrent une rduction de 80 90% par traitement 200C pendant 20 minutes (Levi et al., 1974 ; Gallaz et Stalder, 1976 ; Blanc et al., 1996). En revanche Nehad et al. (2005), nobtiennent qu une rduction de 31%, par traitement exprimental 180C pendant 10 minutes partir de caf vert contamin un niveau de 29,4 g/kg. Une rduction moyenne de 66,5 % des teneurs naturelles en OTA (0,64 8,05 g/kg) dans 36 chantillons de caf vert dorigines varies a t observe aprs torrfaction par Perez de Obanos et al. (2005). Le procd de solubilisation assure une rduction de 20% de la teneur rsiduelle aprs torrfaction, portant ainsi 13% la teneur rsiduelle en OTA dans la poudre de caf soluble par rapport celle du caf vert (Blanc et al., 1996). Lors de la ralisation du caf en boisson, la totalit de lOTA est extraite partir du caf soluble (Stegen et al., 1997). A partir des grains torrfis moulus, lampleur de lextraction est variable selon les procds de types expresso , moka et filtre avec respectivement 49%, 32% et 14% de rduction (Perez de Obanos et al., 2005), montrant une diminution lie la temprature et la nature de lextraction : percolation, dcoction ou infusion. 3.3.3 Raisin Dans les raisins, lochratoxine A est produite par les Aspergillus du groupe nigrii, particulirement Aspergillus carbonarius et A. niger. Ces moisissures ne sont pas pathognes pour la vigne. En revanche, les lsions faites aux fruits par les machines ou les insectes sont une cause de contamination et de dveloppement ultrieur de ces moisissures. Le jus de raisin est considr comme une source dexposition lOTA pour les enfants. Des valeurs comprises entre 1,16 et 2,32 g/L ont t rapportes (Majereus et al., 2000 ; Filali et al, 2001). Le niveau dOTA dans les vins europens varie entre 0,01 et 3,4 g/L. Il existe des rgions spcifiques de contamination des vignobles par lOTA . Ainsi, le bassin Mditerranen est le plus touch ; de plus, le vin rouge serait plus concern que le ros ou le blanc (Burdaspal et Legarda, 1999 ; Majerus et al., 2000 ; Markaki et al., 2001 ; Pietri et al., 2001). Parmi les drivs du raisin, cest dans les raisins secs que les niveaux les plus levs ont t rencontrs, ils peuvent dpasser 40 g/kg (MacDonald et al. 1999 ; MAFF, 1999). 3.3.4 Salaisons La consommation de produits carns contamins par les ochratoxines a t identifie comme une source possible dexposition humaine lOTA (JECFA, 2001). La mise en vidence de souches fongiques capables de produire de lOTA sur les produits de salaisonnerie (Escher et al., 1973, Tabuc et al., 2004), ainsi que la caractrisation directe de la toxine sur ce type daliments (Jimenez et al., 200 ; Chiavaro et al, 2002) posent le problme de leur contamination directe. Aprs contamination par des souches toxinognes, la production directe dOTA sur les produits de salaisonnerie semble

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toutefois trs faible, en dpit dune grande stabilit de la toxine (Escher et al., 1973 ; Bailly et al, 2005).

4
4.1

Devenir et Proprits toxicologiques de l'ochratoxine A


Toxicocintique

Les facteurs affectant labsorption, la distribution, le mtabolisme (hydrolyse et hydroxylation) et lexcrtion de lOTA chez plusieurs espces animales ont t revus par Kuiper-Goodman et Scott (1989) et par Galtier (1991). 4.1.1 Absorption LOTA est d'abord absorbe dans lestomac en raison de ses proprits acides (pKa = 7,1) mais labsorption est aussi possible au niveau de lsophage. Le groupement hydroxyle joue un rle important dans la mesure o pour un faible pH, la forme non ionise favorise labsorption de lOTA (Marquardt et Frohlich, 1992). Nanmoins, le site majeur dabsorption de lOTA est lintestin grle avec une absorption maximale au niveau du jjunum proximal (Kuiper-Goodman et Scott,1989 ; Marquardt et Frohlich, 1992). Elle est hydrolyse en OT non toxique par la carboxypeptidase A et la chymotrypsine ainsi que par les flores microbiennes (rumen des polygastriques et gros intestin chez toutes les espces). Dans le cas des ruminants o cette dtoxification survient avant labsorption, elle rduit le risque de contamination par lOTA des produits et notamment du lait, issus de ces animaux. Au niveau hpatique, lOTA est transforme en des mtabolites mineurs comme les 4R- et 4Shydroxy-ochratoxine A (4-OH-OTA) et la 10-hydroxyochratoxine A. Les formes isomres de 4-OHOTA sont considres comme des mtabolites de dtoxification partielle. 4.1.2 Biotransformation (voir figure 3) LOTA est hydrolyse en OT par la carboxypeptidase A et la chymotrypsine dans les compartiments fermentaires prstomacaux des ruminants et du gros intestin des monogastriques. Les microsomes hpatiques de lhomme, du rat, du cochon et du lapin, incubs avec lOTA produisent des mtabolites mineurs comme les 4R- et 4S-hydroxyochratoxine A (4-OH-OTA) (Stormer et al, 1981) ; en plus de ces deux mtabolites, la 10-hydroxyochratoxine A est retrouve dans les microsomes de lapin (Stormer et al, 1983). Les formes isomres de 4-OH-OTA sont considres comme des mtabolites de dtoxification (Omar et al, 1996), bien que Creppy et al., (1983) aient rapport que la 4R-OH-OTA est aussi toxique que lOTA. Un autre mtabolite de lOTA a t identifi. Il sagit de lOP-OTA (forme ouverte dOTA) dont le pouvoir toxique a t dmontr par voie intraveineuse (Xiao et al, 1996 ; Li et al, 2000) . Il existe galement des formes conjugues dOTA chez la souris (Roth et al., 1988). Ainsi, une tude a identifi in vitro une forme conjugue entre lOTA et le glutathion (Dai et al, 2002).

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O O H3 C

OH H N C COOH H O CH2 Cl

OH COOH H H2N C COOH CH 2

carboxypeptidases
O H3 C Cl

(cosystmes microbiens)

ochratoxine A
Cytochromes P450

ochratoxine

phenylalanine

O O HOH2C

OH H N C COOH H O CH2 Cl O H3 C

OH H N C COOH H O CH 2 Cl O H3 C

OH H N C COOH H CH2

O H OH Cl

HO H

10 hydroxy-ochratoxine A

4R hydroxy-ochratoxine A

4S hydroxy-ochratoxine A

Figure 3 : Voies mtaboliques de lOTA 4.1.3 Distribution La liaison de forte affinit de lOTA aux protines plasmatiques contribue au prolongement de son temps de demi-vie plasmatique. L'OTA sous forme de di-anion possde deux sites de liaison lalbumine srique humaine dont une de haute affinit (sub-domaine IIA) (Ilivech et al., 2002). Il a t montr que des protines de faible poids molculaire (20 KDa) se lient plus spcifiquement lOTA que lalbumine, et quelles peuvent facilement traverser le glomrule permettant laccumulation de lOTA dans le rein (Stojkovic et al., 1984) . Laltration du cycle entrohpatique de lOTA chez la souris et le rat par la cholestyramine, une rsine liant les acides biliaires dans le tractus gastro-intestinal, entrane une diminution des concentrations plasmatiques dOTA (Kerkadi et al., 1998, 1999). LOTA existe sous forme de traces dans les rythrocytes (Galtier, 1978). La distribution dans les tissus de rat, porc, poulet et chvre suit lordre suivant : rein > foie > muscle > tissu adipeux (KuiperGoodman et Scott, 1989). De l'OTA a t retrouve dans le sang de cordon ombilical de femmes enceintes dmontrant ainsi un passage transplacentaire chez la femme (Jonsyn et al., 1995) . Une grande diffrence existe entre les temps de demi-vie plasmatiques de lOTA selon les espces. Par voie orale, il est de 35,5 jours chez lhomme (Studer-Rohr et al., 2000) et chez les animaux : 21 25 jours chez le singe rhsus, 3 5 jours chez le porc, 3,2 jours chez le veau pr-ruminant, 2 5 jours chez le rat, 1 1,6 jours chez la souris, 8,2 heures chez le lapin, 6,7 heures chez la caille, 4,1 heures chez les poulets, et 0,7 heures chez la carpe (Hagelberg et al., 1989). 4.1.4 Excrtion Lexcrtion biliaire et la filtration glomrulaire jouent un rle trs important dans la clairance plasmatique (Hagelberg et al., 1989) et dans le mtabolisme de lOTA (Li et al., 1997, 2000). Cette toxine est limine trs lentement de lorganisme, alors que ses mtabolites sont limins beaucoup plus rapidement (Li et al., 2000). En gnral, lOTA, lOt et lOTB sont excrtes dans les urines chez le rat alors que lOTA-OH est excrte dans la bile (Li et al.,1997). La rabsorption de lOTA au niveau des tubules rnaux via des transporteurs anioniques favorise son retour dans le plasma et son accumulation rnale (Dahlmann et al., 1998).

4.2 Toxicologie gnrale 4.2.1 Toxicit aigu

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La DL50 est de 30,3 mg/kg p.c. chez les rats mles alors quelle est de 21.4 mg/kg p.c. pour les rats femelles. Les rats nouveau-ns sont considrablement plus sensibles que les rats adultes. Le chien et le porc sont les espces les plus sensibles, la souris et le rat sont les moins sensibles. Chez les rats, la DL50 par voie intraveineuse est de 12,7 mg/kg p.c., de 12,6 mg/kg p.c. par voie intrapritonale et de 21,4 30,3 mg/kg p.c. par voie orale. Ladministration orale simultane de phnylalanine, partie non isocoumarinique de lOTA, raison de 100 mg/kg p.c. chez la souris, diminue la DL50 orale de 46 mg/kg p.c. 71 mg/kg p.c. et les analogues structuraux de la phnylalanine ont le mme effet (Moroi et al., 1985, Baudrimont et al., 2001). Chez le rat, 48h aprs ladministration orale dune dose unique dOTA (0,17 ou 22 mg/kg p.c.), des hmorragies multifocales dans de nombreux organes, des thrombi de fibrine dans la rate, dans le plexus chorode du cerveau (Belmadini et al., 1999), le foie, le rein et le cur sont constats. Ces lsions suggrent une coagulation intra-vasculaire dissmine qui serait due lactivation des systmes intrinsques et extrinsques de coagulation. Les autres modifications sont une ncrose hpatique et lymphode, une entrite avec une atrophie des villosits affectant plus svrement le jjunum ainsi quune nphrite. Les lsions myocardiques sont relier au choc et lischmie (Albassam et al., 1987). 4.2.2 Toxicit subaigu et chronique Des rats mles Wistar sevrs, exposs par voie orale pendant deux semaines, une alimentation contenant respectivement 0 ; 2,4 ; 4,8 ; 9,6 et 24 mg/kg d'OTA montrent aux deux doses les plus leves, des retards de croissance, une diminution de la consommation alimentaire et une augmentation de lurmie. A la dose la plus leve, le poids relatif des reins est augment. Des lsions dgnratives sur lensemble du systme tubulaire et une diminution du volume durine mis sont observes quelles que soient les doses. Une osinophilie et une caryomgalie des cellules du tube contourn proximal sont notes toutes les doses (Munro et al., 1974). Au cours de la mme tude (Munro et al., 1974), des rats mles et femelles Fischer ont reu de lOTA des teneurs de 0, 1, 4 ou 16 mg/kg dans laliment, 5 jours par semaine, avec 12 administrations au total rparties sur 16 jours. Tous les rats ayant reu 16 mg/kg dOTA ont eu de la diarrhe et des coulements nasaux, et sont morts avant la fin de ltude. Pour toutes les doses dOTA suprieures 1 mg/kg, il y a eu une augmentation du poids des reins, du cur et du cerveau, une atrophie du thymus, une ncrose de lestomac et des surrnales hyperplasiques et hmorragiques. Toujours chez le rat, des rsultats similaires sont obtenus aprs administration intra-pritonale d'OTA 0, 0.75 et 2 mg/kg p.c./j pendant 5 7 jours. On note une diminution du poids corporel, une augmentation du flux urinaire, une protinurie, une glucosurie et une altration du transport urinaire des substances organiques. Laugmentation de la protinurie serait due une interfrence avec la rabsorption des protines par les cellules des tubes contourns (Berndt et Hayes, 1979). Chez des rats exposs pendant 13 semaines des doses orales de 21, 70 et 210 g/kg raison de 5 administrations par semaine, Rached et al (2007) ont observ une prolifration des cellules du cortex rnal aux deux plus fortes doses. Labsence deffet la plus faible exposition a conduit ces auteurs retenir une NOEL de 21 g/kg/j chez le rat. Enfin, la prolifration cellulaire observe fournit des arguments en faveur dun mcanisme pigntique seuil. De nombreuses tudes de toxicit subaigus et chroniques ont t conduites chez le porc, la volaille ou les animaux de compagnie, leurs rsultats sont rapports dans les chaptres correspondants. 4.2.3 Gnotoxicit Les premires valuations de la gnotoxicit de lOTA utilisant des modles bactriens ont donn des rsultats ngatifs (Bendele et al., 1985 ; Kuiper-Goodman et Scott, 1989). En revanche, dautres tudes ont montr que le test dAmes de mutagense, ou le mme le test de bioluminescence bactrienne (Sun et Stahr, 1993) nest positif quavec lOTA pralablement mtabolise en prsence de culture hpatocytaire (Hennig et al., 1991) ou de microsomes hpatiques (Obrecht et al., 1999). L'OTA est gnotoxique dans le test de rparation de lADN chez Escherichia coli (Malaveille et al., 1991 ; Malaveille et al., 1994), elle augmente le taux dchanges de chromatides surs (Follmann et al., 1995) et elle induit la formation de micronoyaux dans les cultures de cellules de vsicules sminales ovines (Degen et al., 1997). En 1985, Creppy et al. ont montr que lOTA induit des cassures mono-brin de lADN dans diffrents tissus ou cellules de souris in vivo et in vitro. Le traitement de souris et de rats par lOTA induit la

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formation dadduits lADN dans la rate, le foie et le rein selon un effet dose-dpendant. Le nombre dadduits lADN est surtout trs lev dans les reins et la vessie des souris traites (PfohlLeszkowicz, 1991 ; Obrecht-Pflumio et al., 1996 ; Petkova-Bocharova et al., 1998). Les adduits lADN ont aussi t observs dans plusieurs types de cultures cellulaires traites avec lOTA : cellules rnales de singe (Grosse et al., 1995), cellules pithliales bronchiques humaines (Grosse et al., 1995) et cellules pithliales porcines vsicales (Dorrenhaus et Follmann, 1997). Dautres tudes contredisent le principe de la formation de mtabolites ractifs (Gautier et al., 2001) et supportent le rle du stress oxydatif (Pfohl-Leszkowicz et al., 1993 ; Gillman et al., 1999) et la formation dhydroperoxydes (Omar et al., 1990). Enfin, des tudes ont conclu que lOTA nest pas mutagne dans le test dAmes (Follmann et Lucas, 2003) et ninduit pas la formation dadduits lADN chez des rats traits avec 2 mg/kg p.c. pendant 2 semaines (Mally et al., 2004). Additionnellement, dans une tude mene par Turesky (2005) chez des rats mles, des adduits l ADN nont pas t dtects. Considrant les rsultats ngatifs de telles tudes, il est actuellement admis que les effets de lOTA mesurs au cours dtudes in vivo et in vitro tels que toxicit rnale rgio-spcifique, lsions de lADN ou effets gnotoxiques, seraient attribuables un stress oxydatif cellulaire. 4.2.4 Pouvoir cancrogne L'OTA est cancrogne chez le rongeur avec induction de tumeurs rnales, hpatiques, mammaires et testiculaires (Schwartz, 2002). Les lsions tumorales retrouves au niveau rnal prdominent, ce qui est probablement une consquence du fait que la cible primaire de lOTA est lpithlium des tubules proximaux au niveau du cortex interne et de la mdulla externe (Kuiper-Goodman et Scott, 1989 ; Krogh, 1992). LOTA est cancrogne chez la souris avec une dose TD50 (tumorigenic dose rate 50) de 4500 g/kg p.c./j, et chez le rat avec une TD50 de 74 g/kg p.c./j, montrant que le rat est beaucoup plus sensible aux effets cancrognes de lOTA (Kuiper-Goodman et Scott, 1989). Chez lhomme, une corrlation positive entre lexposition lOTA et la NEB ainsi quentre la distribution gographique de la NEB et lincidence leve des cancers de l'pithlium urothlial a t montre (Nikolov et al, 1996). Les concentrations sriques dOTA mesures sont plus leves chez les patients atteints de la NEB et/ou du cancer de lpithlium urothlial que chez les sujets non malades. LOTA est classe dans le groupe 2B par le CIRC (1993) comme tant un cancrogne possible chez lhomme 4.2.5 Embryotoxicit et tratognicit Des souris CBA gestantes ont reu, par gavage une suspension de mas contamin par de lOTA des doses de 0, 1, 2 ou 4 mg/kg p.c. les 8me et 9me jours de gestation ou 4 mg/kg p.c. 2 jours avant laccouplement et aux jours 2, 4, 6, 7, 10 et 14 de gestation. A J19, une mortalit prnatale de lordre de 20% a t observe dans les groupes ayant reu 4 mg/kg p.c. J7, J8 et J9. Des anomalies du systme nerveux central, des yeux et du squelette axial doses-dpendantes ont t enregistres chez les ftus J8 et J9. Les malformations les plus importantes et les plus communes sont celles affectant les structures crnio-faciales. Elles sont lies une aplasie et une dysplasie des structures suprieures de la face et se manifestent par des exencphalies, microcphalies, anophtalmies et microphtalmies (Arora et Frolen, 1981 ; Singh et Hood, 1985). Chez le rat, aprs deux administrations orales de 2,5 mg/kg p.c. dOTA aux 8me et au 9me jours de gestation, une augmentation du nombre de rsorptions ftales, une diminution du nombre moyen de ftus par femelle et une baisse du poids moyen des ftus et du placenta ont t observes. De plus, une proportion statistiquement leve de ftus prsentent des hmorragies superficielles et profondes ainsi que de la closomie, ce qui prouve le caractre tratogne de lOTA (Mor et Galtier, 1974).

4.3

Toxicit d'organes

4.3.1 Nphrotoxicit Mcanismes daction nphrotoxique

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LOTA est un puissant inhibiteur de lactivit de la phosphonolpyruvate carboxykinase (PEPCK) rnale in vivo (Meisner et Meisner, 1981), et en consquence de la noglucogense rnale. En outre, elle diminue lactivit respiratoire et de capture du Ca2+ par la mitochondrie, alors que la concentration calcique intracytosolique reste leve (Aleo et al, 1991). Une augmentation de lactivit de la pompe Ca2+ ATP-dpendante au niveau du reticulum endoplasmique du cortex rnal a t observe in vivo, ce qui permettrait de restaurer lhomostasie calcique cytoplasmique (Rahimtula et Chong, 1991 ; Chong et Rahimtula, 1992). Cette augmentation de lactivit de la pompe Ca2+ est incompatible avec lhypothse d'une peroxydation lipidique qui inhibe cette activit (Chong et Rahimtula, 1992). LOTA a plusieurs sites daction tout au long du nphron. Elle nagit pas majoritairement sur le tube proximal comme les autres nphrotoxines ; en revanche, il semble que les parties postproximales du nphron constituent la cible principale lors dune exposition aigu (Gekle et al., 1993). Filtration glomrulaire Une exposition chronique lOTA entrane une rduction du dbit sanguin rnal et par voie de consquence une diminution de la filtration glomrulaire (Gekle et Silbernagl, 1996) alors qu une exposition aigu na pas deffet mesurable sur ces paramtres hmodynamiques rnaux (Gekle et Silbernagl, 1996). Par ailleurs, la suite dune augmentation de la rsistance artriolaire effrente, probablement mdie par langiotensine II, la pression capillaire glomrulaire slve conduisant un endommagement du glomrule (Gekle et Silbernagl, 1993). Tubule proximal Le tubule proximal est surtout affect lors dune exposition chronique lOTA, laquelle dgrade les fonctions du tube proximal entranant une glucosurie et une enzymurie (Gekle et Silbernagl, 1993 ; Dahlmann et al., 1998). La rabsorption des protines filtres par endocytose peut aussi devenir dfaillante, conduisant une protinurie (Gekle et al., 1994). Lexcrtion rnale de lOTA dans les urines se fait principalement par scrtion tubulaire, vraisemblablement par un systme de transport danions organiques (Sokol et al., 1988), ce qui peut entraner laccumulation de lOTA et le dveloppement de la nphrotoxicit. Or, une exposition chronique des concentrations nanomolaires dOTA rduit lactivit des transporteurs danions, et la scrtion propre de lOTA augmentant ainsi sa toxicit (Sauvant et al., 1998). Une multitude de transporteurs responsables du transport sang-lumire nphrotique ont t identifis au cours de ces dernires annes : hOAT1 (human organic anion transporter) (Tsuda et al., 1999) et hOAT (Cha et al., 2001) situs sur la membrane baso-latrale du tube proximal, hOAT4 sur la membrane apicale responsable de labsorption et de lefflux de lOTA (Babu et al., 2002), oatp2 (organic anion transporting polypeptide) et mOAT2 (Kobayashi et al., 2002) au niveau rnal et hpatique, OAT-K1 et OAT-K2 sur la membrane de la bordure en brosse du tube proximal et du tube collecteur (Takeuchi et al., 2001). La rabsorption pH-dpendante de la toxine par un cotransporteur H+-dipeptide, ou bien pH-indpendante mdie par OAT-K1, et/ou par diffusion passive, rduit son limination et augmente la toxicit (Zingerle et al., 1997 ; Dahlmann et al., 1998). Plusieurs substrats, comme laspartame (Baudrimont et al., 1995 ; Tsuda et al., 1999 ; Baudrimont et al., 2001), prviennent la nphrotoxicit de lOTA en inhibant la rabsorption et favorisant ainsi son excrtion. Les parties post-proximales du nphron Lexposition aigu lOTA est responsable de la dtrioration des fonctions tubulaires postproximales. Elle conduit une augmentation de lexcrtion du NaCl et une rduction de lexcrtion de K+ et H+. A la suite d'une exposition prolonge, une polyurie se manifeste en raison de la diminution de la fonction de concentration des urines (Gekle et al., 1993). Des concentrations nanomolaires dOTA ont un effet mitogne sur les cellules rnales (Gekle et al., 1993 ; Gekle et Silbernagl, 1996). Linhibition de la synthse protique ne semble pas expliquer cet effet puisque des concentrations de lordre de 10-5 M sont ncessaires dans ce cas (Gekle et al., 1993). De fortes doses dOTA conduisent des mcanismes daction non spcifiques, notamment linhibition de la synthse protique (Creppy et al., 1984), la peroxydation lipidique (Rahimtula et al., 1988) et linhibition de la respiration mitochondriale (Aleo et al., 1991). Dans la plupart des cas, le mcanisme sous-jacent semble tre diffrent selon les concentrations (Gekle et al., 1998) (tableau 4) (Benesic et al., 2000).

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Tableau 1 : Diffrents effets de lOTA sur le tube proximal et le tube collecteur (Gekle et al., 1998).
Tubule proximal Inhibition non comptitive du systme de transport des anions organiques Inhibition du systme de transport des cations organiques Prolifration cellulaire et hypertrophie Diminution de la rabsorption des protines Tube collecteur Blocage des canaux ioniques de la membrane plasmatique et de lchange Cl-/HCO3- 57 Altrations de lhomostasie du pH et du Cl , et du transport transpithlial des lectrolytes et H+ 57,77 77 Activation de ERK1/2 77 Ddiffrentiation cellulaire Diminution de la viabilit cellulaire Membrane plasmatique permable Inhibition de la synthse dADN Inhibition de la synthse protique Inhibition de la prolifration cellulaire Dtachement cellulaire et diminution gnrale du transport

Faible dose

Forte dose

Diminution de la viabilit cellulaire Membrane plasmatique permable Inhibition de la synthse dADN Inhibition de la synthse protique Inhibition de la prolifration cellulaire Dtachement cellulaire et diminution gnrale du transport

4.3.2 Hpatotoxicit Ladministration de 1,25 mg/kg p.c./j dOTA par voie orale pendant 8 semaines des rats sevrs entrane une augmentation de la quantit de glucose hpatique et une diminution des glucides et du glycogne total (Suzuki et al., 1975). Lactivit des enzymes glycolytiques est rduite, alors que celle des enzymes de la noglucognse augmentent. Leffet diabtogne de lOTA serait d une inhibition de la synthse de linsuline ou une inhibition de son relargage par les cellules pancratiques, une diminution de la glycolyse et de la glycogense et une augmentation de la noglucogense et de la glycognolyse (Subramanian et al., 1989). Le premier mcanisme daction dcrit concerne le mtabolisme de la phnylalanine (Phe). Il a t tabli que lOTA inhibe la synthse des protines chez plusieurs organismes procaryotes et eucaryotes in vivo et in vitro (Rchenthaler et al., 1984 ; Dirheimer et Creppy, 1991), cet effet tant d au groupement Phe de la toxine. Linhibition de la synthse protique seffectue au niveau posttranscriptionnel ; la comptition entre lOTA et la phnylalanyl-ARNt-synthtase empche llongation du peptide et par suite la traduction (Creppy et al., 1979). Par ailleurs, lOTA inhibe aussi la synthse de lADN et de lARN (Creppy et al., 1979 ; Meisner et Meisner, 1981 ; Creppy et al., 1983). Cependant, linteraction de lOTA avec la phnylalanyl-ARNt-synthtase nest observe que pour des concentrations millimolaires dOTA. McMasters et Vedani (1998) suggrent que ce mcanisme n'induit probablement pas de risque toxique du fait que les concentrations retrouves chez lhomme sont de lordre du nanomolaire. Un autre mcanisme de toxicit propos est la peroxydation lipidique induite in vitro par lOTA dans des microsomes rnaux et hpatiques (Rahimtula et al., 1988 ; Omar et al., 1990) ou chez le rat trait avec 6 mg/kg p.v. dOTA in vivo (Rahimtula et al., 1988). In vitro, lOTA induit une peroxydation lipidique dans les microsomes en prsence de NADPH, dascorbate et du fer comme co-facteur (Omar et al., 1990 ; Stormer et Hoiby, 1996). Le complexe OTA-Fe produit un radical hydroxyl toxique en prsence de NADPH-cytochrome P450 rductase (Hasinoff et al., 1990). De plus, les radicaux superoxydes et le peroxyde dhydrogne sont vraisemblablement impliqus dans les lsions rnales induites par lOTA mais leur rle direct est controvers (Baudrimont et al., 1994). En outre, les cytochromes P450 biotransforment lOTA en mtabolites qui stimulent la peroxydation lipidique (Aleo et al., 1991 ; De Groene et al., 1996 ; Castegnaro et al., 1998 ; Pfohl-Leszkowicz, 1998), ce qui peut perturber lhomostasie calcique (Khan et al., 1989 ; Hoehler et al., 1996) et induire la mort cellulaire par apoptose (Petrik et al., 2003). La peroxydation lipidique semble tre la consquence de linhibition de la synthse protique, qui peut rduire les systmes enzymatiques responsables de la dtoxification des radicaux oxygns (Baudrimont et al., 1997).

57

4.3.3 Immunotoxicit Au niveau immunitaire lun des effets les plus notables de lOTA est la diminution de la taille des organes lymphodes (Bondy et Pestka, 2000 ; Al-Anati et Petzinger, 2006a). Une rduction de la taille du thymus, de la rate et des plaques de Peyer a t dcrite chez plusieurs espces ainsi que, chez le poulet, une diminution de la bourse de Fabricius (Singh et al., 1990; Stoev et al., 2000a). Cependant, on ignore si cela est d un mcanisme ncrotique ou apoptotique ; in vitro, lOTA induit lapoptose des lymphocytes humains et bovins (Assaf et al., 2004a ; Lioi et al., 2004) ainsi que celle des splnocytes murins (Atroshi et al., 2000). L'OTA peut induire l'apoptose dans les lymphocytes humains priphriques humains et dans une ligne leucmique lymphocytaire, Kit 225. Une chute du potentiel mitochondrial entranant la permabilisation de la mitochondrie serait responsable de la sortie du cytochrome c permettant la formation de lapoptosome et le clivage par la suite de la procaspase-9 en caspase-9 active (fragment p35). Cette dernire va ensuite cliver la caspase-3 effectrice qui, son tour, clivera la caspase-9 gnrant un autre fragment, le p37, lui permettant ainsi davoir une activit catalytique maximale (Assaf et al., 2004a). LOTA agit galement sur les cellules de la moelle osseuse. Une hypocellularit globale ainsi quune diminution des cellules souches pluripotentes (CFU-S) et des progniteurs hmatopotiques a t dcrite par Boorman et al. (1984) chez la souris et par Froquet et al. (2003) chez lhomme. De plus, lOTA entrane une diminution du nombre de globules blancs chez le poulet avec une lymphopnie svre et un degr moindre une monocytopnie (Ayed et al., 1991, Chang et al., 1979; Dwivedi et Burns, 1984b). Chez la souris, d'autres tudes ont montr une diminution du nombre de lymphocytes, de neutrophiles et dosinophiles sans modification du nombre total de globules blancs (Mller et al., 1995). Chez le porc en croissance, lOTA augmente le nombre de cellules sanguines totales mais diminue le pourcentage de lymphocytes (Mller et al., 1999). Chez les rongeurs nouveaux-ns, on observe galement une diminution du pourcentage de cellules splniques CD4+ et CD8+ (Thuvander et al., 1996c) et des CD4+ matures, ainsi quune augmentation des lymphocytes non matures CD4+/CD8+ (Thuvander et al., 1996b). En plus de modifier le nombre de cellules immunitaires prsentes dans des tissus, lOTA module la fonction de ces cellules. L'OTA altre la capacit de phagocytose des htrophiles aviaires (Chang et Hamilton, 1980), des macrophages porcins et murins (Harvey et al., 1994 ; Mller et al., 1999) et dune ligne macrophagique humaine (Mller et al., 2003). Une diminution de lactivit des cellules NK a t galement observe chez la souris et le rat Wistar, de mme quune diminution de la production dIFN (Luster et al., 1987 ; Alvarez et al., 2004). Cependant, dans d'autres tudes aucun effet sur l'activit des cellules NK murines n'a t observ (Thuvander et al., 1995, 1996a,c ; Dortant et al., 2001). La mort cellulaire, par apoptose ou ncrose, conduit galement une rduction du nombre de cellules productrices danticorps dans les organes lymphodes et une diminution des niveaux sriques dimmunoglobulines et danticorps spcifiques (Al-Anati et Petzinger, 2006a). Chez plusieurs espces, lexposition lOTA entrane une diminution des anticorps spcifiques vis--vis de diffrents antignes, notamment vis vis de Brucella abortus et Escherichia coli chez la souris (Prior et Sisodia, 1982 ; Mller et al., 1995), des globules rouges de moutons chez la souris et le poussin (Haubeck et al., 1981; Creppy et al., 1983 ; Thuvander et al., 1995 ; Verma et al., 2004), vis vis de lantigne viral PR8 chez le rat nouveau n (Thuvander et al., 1996c), ou du vaccin de la maladie de Newcastle chez le poulet (Stoev et al., 2000a ; Santin et al., 2002). Les concentrations en immunoglobulines IgM et IgG ne sont diminues chez les souris BALB/c immunises avec les globules rouges de moutons que lors dexposition lOTA ou son mtabolite 4R-OH-OTA, mais pas lOTA- (Creppy et al., 1983). Une rduction d'IgG, dIgA, et dIgM est galement observe dans les tissus lymphodes et les srums de poulet (Dwivedi et Burns, 1984a) et dans la bourse de Fabricius dembryons de poussin (Harvey et al. 1987) sans aucune modulation des IgM. Chez le veau, une exposition orale lOTA ne module pas les concentrations en IgA, IgM, IgG1, et IgG2 spcifiques de bactries environnementales et dantignes viraux (Patterson et al., 1981). Ce rsultat sexplique probablement par la rsistance des bovins l'exposition orale d'OTA due sa dtoxification par les micro-organismes du rumen (Galtier et Alvinerie, 1976). La diminution de la rponse anticorps par lOTA peut tre lorigine des checs de vaccination dcrits chez les poulets recevant le vaccin contre la maladie de Newcastle (Stoev et al., 2000a ; Santin et al., 2002). Cette diminution de la rponse anticorps pourrait galement contribuer laugmentation de la

58

sensibilit aux infections observe chez les dindes et les poulets de chair qui aprs une ochratoxicose dveloppent une inflammation des sacs ariens due Escherichia coli (Hamilton et al., 1982). De mme, chez les poulets infects exprimentalement avec une bactrie (E. coli O78) ou un parasite (Eimeria tenella) et nourri avec un aliment contamin par lOTA les altrations histologiques observes sur les organes immunitaires sont plus svres que chez les animaux non exposs la toxine (Kumar et al., 2004 ; Stoev et al., 2002b). Lexposition des souris lOTA rduit galement leur taux de survie aprs infection exprimentale par Pasteurella multocida (Mller et al., 1995). Enfin, chez le porc, l'ingestion d'aliment contamin par l'ochratoxine A, entraine lapparition dinfection par Salmonella Cholerae suis, Brachyspira hyodysenteriae et Campylobacter coli (Stoev et al., 2000b). Les effets de lOTA sur la synthse des cytokines sont moins bien connus. Sur la synthse dIL-2, certaines publications montrent une induction, (Marin et al., 1996), une diminution (Harvey et al., 1992; Lea et al 1989) ou une absence de rponse (Thuvander et al., 1995, 1996a). Les effets de lOTA sur les cytokines inflammatoires (TNF-, IL-6 et IL-1) sont plus constants et montrent gnralement une augmentation de leur synthse (Weidenbach et Petzinger, 2000 ; Heller et al., 2002; Huttunen et al., 2004; Al-Anati et al., 2005). Ces cytokines pourraient tre lorigine de la diminution de la taille des organes lymphodes et des dpltions cellulaires prcdemment dcrites. Une autre tude montre cependant que la synthse par les macrophages de TNF- et dIL-6 est rduite chez des souris exposes la toxine pendant une longue priode (17 semaines). La cytotoxicit cellulaire de lOTA sur une longue priode pourrait expliquer cette contradiction.

4.4

Valeurs toxicologiques de rfrence

LOTA a t classe dans le groupe 2B (peut-tre cancrogne pour lhomme) par le CIRC (1993). Le Comit Scientifique europen de lAlimentation Humaine (SCF, 1998), considrant le caractre cancrogne probable de l'OTA, sans que les donnes disponibles permettent d'identifier le mcanisme d'action qui induirait des tumeurs du tubule rnal chez le rat, a estim qu'il convenait de rduire l'exposition alimentaire une valeur de l'ordre de 5 ng/kg p.c./j. Cependant le SCF ne prcise pas clairement si cette valeur doit tre utilise comme une dose journalire tolrable (DJT). Aprs des valuations en 1991 et 1996, le JECFA a confirm en 2001 la Dose Hebdomadaire Tolrable Provisoire (DHTP) pour lhomme de 100 ng/kg de poids corporel par semaine (soit 14 ng/kg p.c./j). Le JECFA a considr que des effets nphrotoxiques prcdaient lapparition de tumeurs rnales et a donc fix la DHTP en se fondant sur des effets nphrotoxiques chez le porc observs dans une tude de toxicit subchronique (90 jours) o la plus petite dose identifie est gale 0,008 mg/kg p.c./j. Un facteur de scurit de 500 a t appliqu cette valeur. LAutorit Europenne de Scurit des Aliments (EFSA) a revu la hausse en 2006 la DHT de lOTA 120 ng/kg p.c./sem (EFSA, 2006), en se fondant sur les arguments suivants : - Chez lhomme, certaines donnes pidmiologiques ont suggr que lOTA pourrait tre implique dans la pathogense de certaines affections rnales, voire dans lapparition de tumeurs rnales rares dans certaines rgions endmiques de la pninsule balkanique. Ces donnes pidmiologiques demeurent nanmoins incompltes et ne justifient en aucun cas la classification de lOTA parmi les agents responsables de cancers rnaux chez lhomme. - Des donnes issues du programme de recherche europen OTA Risk assessment QL12001-016114 montrent que les effets de lOTA mesurs au cours de diverses tudes in vivo et in vitro (toxicit rnale rgio-spcifique, lsions de lADN et effets gnotoxiques) sont trs probablement attribuables un stress oxydatif cellulaire. - Lutilisation de mthodologies nouvelles en chimie analytique na pas russi dmontrer que lOTA provoquait des adduits identifiables lADN. En raison du manque darguments en faveur de lexistence de ce type dadduits spcifiques lADN, les experts de lEFSA ont dcid de caractriser le danger en dfinissant une dose hebdomadaire tolrable (DHT). Une dose minimale avec effet nocif observ (LOAEL) de 8 g/kg de poids corporel par jour pour les marqueurs prcoces de toxicit rnale chez le porc (espce animale la plus sensible) et un facteur de scurit de 450 (afin de prendre en compte les incertitudes dextrapolation des rsultats

59

exprimentaux de lanimal lhomme et la variabilit inter-espces), ont permis de dterminer cette DHT de 120 ng/kg de poids corporel pour lOTA.

Exposition humaine lochratoxine A

5.1 Effets sur la sant humaine (donnes pidmiologiques) Dans plusieurs localits situes sur les bords d'affluents du Danube, en Bulgarie, Roumanie, Bosnie, Serbie, et Croatie, une incidence inhabituelle d'insuffisance rnale chronique a t dcrite depuis 1956, concernant 10% 30% de la population rurale des deux sexes. Cette nphropathie endmique, dite Nphropathie Endmique des Balkans (NEB), runit tous les critres d'une nphropathie tubulointerstitielle chronique. Les signes cliniques sont ceux dune insuffisance rnale progressive prcde par une anmie trs marque (Godin et al., 1997 ; Tatu et al., 1998). Le tableau clinique comporte une protinurie tubulaire, une acidose tubulaire, une hyperuricmie et une hyperuricosurie, une diminution du volume des reins avec souvent des images de ncrose papillaire (Godin et al., 1997). L'volution insidieuse aboutit en 2 10 ans l'insuffisance rnale terminale, sans hypertension artrielle. La survenue de tumeurs bnignes et surtout malignes de l'uretre, du bassinet et de la vessie est signale dans un tiers des cas, avec une prvalence de 100 200 fois plus leve dans les villages affects que dans les non affects (Godin et al., 1997 ; Tatu et al., 1998). Les patients, ainsi que des sujets vivant dans les rgions endmiques, prsentent une diminution du nombre des lymphocytes B, une osinophilie et une augmentation de la proportion des lymphocytes CD3+, CD8+, CD16+ et CD56+ cytotoxiques (Tatu et al., 1998). L'tiologie de cette nphropathie trs particulire diverge en plusieurs pistes. L'analogie avec la nphropathie par abus d'analgsique (Bach, 1991), et plus rcemment avec la nphropathie due aux herbes chinoises (Fillastre et al., 1997 ; Tatu et al., 1998 ; Arlt et al., 2001) dans lesquelles l'atteinte rnale est associe un fort pourcentage de cancers de l'pithlium urothlial, a renforc l'ide d'une toxine. Des autres investigations ont montr une forte contamination des denres alimentaires par lOTA dans les rgions endmiques de la Bulgarie et de la Yougoslavie, des concentrations sriques dOTA trs leves (de lordre de 2 50 ng/ml) (Petkova-Bocharova et Castegnaro, 1991 ; Radic et al., 1997) ainsi que des adduits lADN dans des tumeurs du tractus urinaire chez les sujets habitant les rgions endmiques (Nikolov et al., 1996; Radic et al., 1997). Dautres facteurs ont aussi t impliqus comme la proximit des villages endmiques avec des gisements de charbon qui auraient contamin leau des puits par des hydrocarbures aromatiques polycycliques (pyrne, anthracne) et des amines aromatiques (aniline, naphtylamine) (Tatu et al., 1998). Enfin une tude de Grollman et al. (2007) avance lhypothse de lintoxication chronique lacide aristolochique contenu dans des herbes (Aristolochia sp.) soit contaminant des crales soit utilises pour leur vertu mdicinale, comme facteur tiologique pour la NEB.

5.2

Exposition de la population franaise

Une tude de la ration alimentaire totale (EAT) a t entreprise en 2000, afin de connatre le niveau dexposition lOTA de la population franaise gnrale et vgtarienne partir daliments "prts consommer". Les apports ont t estims partir de 343 donnes de contamination dont 321 taient infrieures la limite de dtection. Le tableau 2 rcapitule les apports moyens et au 95me percentile de consommation pour diffrents types de population (Leblanc et al., 2005). Les aliments les plus contributeurs lexposition de la population franaise lochratoxine A sont les crales, le caf, le vin, les fruits secs, la bire, le chocolat et les pices. Les donnes de contamination relies la consommation montrent que les forts consommateurs franais sont exposs 3,5 ng/kg p.c./j (20% de la DJT) pour les adultes et 7,8 ng/kg p.c./j (45% de la DJT) pour les enfants.

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Tableau 2 : Estimation des apports alimentaires moyens et des forts consommateurs (P95) pour diffrents types de population en OTA (EAT, 20044)
Apport moyen (ng/kg p.c./j) 2,2 2,1 2,2 2,4 2,7 % d'individus Apport au % de la pouvant * P95 DJT dpasser la (ng/kg p.c./j) pour P95 * DJT 3,5 20 0 7,8 45 0 3,7 22 0 3,7 22 0 8,5 50 0

Type de population Population gnrale Population vgtarienne (15 ans et +)


*

Adultes (15 ans et +) Enfants (3-14 ans) Ovolactovgtariens Lactovgtariens Vgtaliens

L'AESA a fix une DHT de 120 ng/kg p.c./semaine, soit 18 ng/kg p.c./j

A titre de comparaison, la Tche SCOOP europenne5 ralise en 2002 (tableau 3) avec des donnes de contamination recueillies entre 1997 et 1999 confirme les niveaux d'exposition observs dans le cadre de l'tude de l'alimentation totale. Tableau 3 : Exposition alimentaire de la population franaise lochratoxine A (Tche SCOOP, 2002)
Type de population Tous consommateurs Adultes (15 65 ans) Enfants (2 14 ans)
* * **

Exposition moyenne % de la DJT fixe (ng/kg p.c./j) par le JECFA*


2,5 2,3 3,4 18 16 24

% de la DJT fixe par l'AESA**


15 14 20

Le JECFA a fix une DHTP de 100 ng/kg p.c./sem, soit 14 ng/kg p.c./j L'AESA a fix une DHT de 120 ng/kg p.c./semaine, soit 18 ng/kg p.c./j

Ces tudes sur lexposition alimentaire des consommateurs franais lOTA ont rvl que lexposition hebdomadaire actuelle est, en fait, comprise entre 15 et 60 ng dOTA par kg de poids corporel par semaine, ce rsultat englobant les forts consommateurs daliments contenant de lOTA. Ce taux dexposition est infrieur la DHT de 120 ng/kg de poids corporel obtenue par lEFSA. Cependant, il est souligner que les calculs dexposition ne prennent pas en compte les nourrissons, et de ce fait que des donnes supplmentaires seraient ncessaires afin dvaluer les taux dexposition de cette population de consommateurs avec prise en compte de leurs prfrences alimentaires.

5.3 Biomarqueurs dexposition chez lHomme Deux indicateurs simples, facilement utilisables dans le cadre dune enqute pidmiologique, peuvent permettre dvaluer lexposition individuelle lOTA en population humaine, il sagit des concentrations srique et urinaire en OTA. Leur limitation majeure est que lon ne connat pas avec certitude la fentre temporelle dexposition laquelle ils se rapportent, ni limportance de la variabilit intra-individuelle par rapport la variabilit inter-individuelle, qui de plus est variable dune population tudie une autre. En raison de ces incertitudes, il est prfrable dutiliser la terminologie d"indicateur dexposition" et non pas de "bio-marqueur" ou de "marqueur biologique dexposition". Jusquici, lOTA srique a t utilise comme lindicateur unique dans la mesure de lexposition lOTA chez lhomme, probablement pour des raisons historiques, savoir la disponibilit dune mthode analytique (Zimmerli et Dick, 1995), le dbut de caractrisation de ses proprits toxico4
5

Etude de l'alimentation totale franaise. Mycotoxines, minraux et lments traces. (2004). Rapport INRA/DGAL. Coordinateur Jean-Charles Leblanc. SCOOP report on Tasks 3.2.7. (2002). Assessment of dietary intake of ochratoxin A by the population of EU members states

61

cintiques (Studer-Rohr et al., 2001), ou encore le souci de comparer tous nouveaux rsultats ceux prcdemment publis. La teneur urinaire en OTA, quoique moins tudie, moins utilise et moins importante que dans le sang (problme des limites de dtection et de quantification), prsente lavantage que lurine est une matrice plus facile prlever, assurant en principe une bonne acceptabilit par les populations. En outre, une meilleure corrlation a t observe entre les teneurs en OTA dans les aliments et lurine quavec lOTA plasmatique (Gilbert et al., 2001). Les tableaux 4a et 4b prsentent les rsultats rcents de dosages de lOTA dans des chantillons de plasma, de srum et durines obtenus dans diffrentes populations ne souffrant pas de nphropathie. Tableau 4a : Teneurs en OTA plasmatique ou srique (ng/ml) dans la population gnrale de quelques pays.
Pays Canada Croatie Croatie France GrandeBretagne Italie Liban Maroc Norvge Sude Suisse Tunisie N 144 249 983 60 50 137 250 309 206 200 368 62 LOD (LOQ) (ng/ml) 0,15 0,20 0,20 0,10 0,01 0,10 (0.12) 0,10 0,01 0,01 0,01 (0,10) > LOD (%) 100 59 48 18 100 97 27 60 100 100 100 100 min - max (ng/ml) 0,29 - 2,37 n.d. - 15,9 non indiqus n.d. - 11,8 0,40 - 3,11 0,12 - 2,84 n.d. - 0,87 n.d. - 6,59 0,06 - 6,02 0,12 - 8,06 moyenne E.T. (ng/ml) 0,88 0,35 0,39 0,30 1,17 1,55 1,09 0,34 0,50 0,30 (F) 0,64 0,45 (H) 0,17 0,01 0,29 0,18 0,11 0,21 0,17 i 0,24 (F) i 0,30 (H) 0,53 1,00 Rfrence Scott et al., 1998 Pereica et al., 1999 Pereica et al., 2001 Eko-Bongue et al., 1994 Gilbert et al., 2001 MAFF, 1999 Palli et al., 1999 Assaf et al., 2004b Filali et al., 2002 Thuvandeter et al., 2001 Thuvandeter et al., 2001 Zimmerli et Dick, 1995 Grosso et al., 2003

LOD : limite de dtection ; LOQ : limite de quantification ; E.T. : cart-type ; F : femmes ; H : hommes, nd : non dtect.

Tableau 4b : Teneurs en OTA urinaire (ng/ml) dans quelques populations


Pays Bulgarie GrandeBretagne Hongrie Italie N 31 50 88 38 LOD (LOQ) (ng/ml) 0,005 0,010 0,005 0,005 > LOD (%) 13 93 61 58 min - max (ng/ml) 0,017 - 0,041 0,007 - 0,058 0,006 - 0,065 0,012 - 0,046 moyenne E.T (ng/ml) 0,0210,003 0.013 Rfrence Castegnaro et al. 1991 Gilbert et al., 2001 MAFF, 1999 Fazekas et al., 2005 Pascale et Visconti, 2001

LOD : limite de dtection ; LOQ : limite de quantification ; E.T. : cart-type .

LOTA est galement retrouve dans le lait de femme (Pfohl-Leszkowicz et Manderville, 2007). Les niveaux sont variables, compris entre 0,01 et 10 ng/mL pour les enqutes menes en Europe. Certaines contaminations plus leves ont t releves : jusqu 337 ng/mL en Sierra Leone. Ces donnes montrent que le nourrisson peut tre expos lOTA par le lait maternel. Ces lments doivent tre pris en compte dans lvaluation de lexposition du nourrisson lOTA et la caractrisation du risque pour le nourrisson.

62

6
6.1

Exposition animale
Effets sur la sant animale et transfert dans les tissus animaux

6.1.1 les porcins La premire description chez le porc de lsions rnales attribues la consommation dun aliment moisi est due Larsen en 1928. Cette pathologie, dnomme par la suite MPN (mycotoxic porcine nephropathy), a t mise en vidence dans de nombreux pays et associe notamment la prsence dOTA dans les aliments pour porc et notamment les produits craliers. Des enqutes ont rvl la prsence de rsidus dOTA dans les reins de porcs au Danemark (Krogh, 1976; Buchmann et Hald, 1985), en Sude (Hult, 1991; Hult et al., 1992) en Norvge (Langseth and Bergsj, 1992), en Pologne (Goliski et al., 1984, 1985, Kotowski et al., 1993), en Bulgarie (Stoev, 1999), en Allemagne (Dieber et Kfer, 1999), en Espagne (Canela et al., 1994), en France (Dragacci et al., 1999) et au Canada (Marquardt et al., 1988; Ominski et al., 1996). A titre exprimental, la DL50 a t tablie entre 1 et 6 mg/kg de poids vif chez le porc (Krogh, 1991; Marquart et Frohlich, 1992). Effets sur les performances des porcs La consommation daliment par le porc nest gnralement pas affecte pour une teneur infrieure 1 mg/kg mais elle est diminue lorsque la teneur dpasse 1,4 mg dOTA/kg (Madsen et al, 1982b), et (Tableau 5). Au del de ces valeurs, la baisse de consommation est dautant plus importante que le niveau de contamination en OTA de laliment est lev (Tapia et Seawright, 1984; Szczech et al., 1973).

Tableau 5 : Effets de lOTA sur les performances zootechniques des porcs


Auteurs Malagutti et al , 2005 Lusky et al , 1995 Lusky et al , 1998 Tesch et Lusky, 1993 Stoev et al , 2001 Stoev et al , 2002 Krogh et al , 1976a Krogh et al , 1979 Madsen et al , 1982a Madsen et al , 1982b Madsen et al , 1983 Harvey et al , 1989 Harvey et al , 1994 Harvey et al , 1992 Krogh et al , 1974 Tapia et Seawright, 1984
1

Poids initial 41 kg 70 kg 60 kg 25 kg 10-12 kg 12-14 kg 20 kg 20 kg 20 kg 20 kg 50 kg 16 kg 18 kg 20 kg 20 kg 14 kg

Dure 170 kg 2S 3M 4S 3M 6 et 12 M 90 kg 24 M 6S 2 S 90 kg 90 kg 4S 1M 35 J 90 kg 13 J

mg OTA/kg aliment 0,025 0,09 0,1 0,15-0,58 0,13-0,31-0,79 0,8 1 1 1,4 0,02 1,9 0,27-1,67-1,72-1,99 2 2,5 2,5 0,2-1-4 2, 4, 8, 16

Consommation = = = rationne rationne rationne si >1,4 rationne 20% 34% rationne 0, 10, 25, 50%

Vitesse de croissance = 100 kg puis de 13% = = = faible 6% 6% 90 kg puis 1% 7% si >1,4 15-34-43-25% 11% 25% 39% 6-4-17% 7-47-87-120%

Efficit alimentaire = 100 kg puis de 15%

6% 5% 90 kg puis 1% 5% si >1,4 13-36-42-24% 27% 7% 7% 5-5-16% 12-43-85-141%

J, jour; S, semaine; M, mois.

Tout comme la consommation, la vitesse de croissance des porcs est diminue par la prsence dOTA dans laliment. Cet effet se manifeste ds le taux de 1 mg dOTA/kg daliment (Krogh et al., 1976a, 1979), voire des niveaux de contamination plus faibles (Madsen et al., 1983; Stoev et al., 2001, 2002). A partir de la mme teneur de 1 mg/kg dans laliment, lOTA rduit aussi lefficacit alimentaire, et cette rduction saccentue lorsque la teneur en toxine augmente (Tapia et Seawright, 1984). Symptmes cliniques, paramtres urinaires et sanguins Symptmes cliniques LOTA peut provoquer une polydipsie et une polyurie chez le porc (Cook et al., 1986). Ces symptmes restent limits aux faibles niveaux de contamination (Stoev et al., 2001) et sont durables puisquils persistent au cours des 2 ans durant lesquels des porcs ingrent 25 50 g dOTA/kg de poids vif (Krogh et al., 1979). Dautres symptmes se manifestent aux doses plus leves: vomissements, anorexie, diarrhe grave, puis mort en quelques jours de porcs ingrant quotidiennement 0,6 2 mg dOTA/kg p.c. (Szczech et al., 1973). Paramtres urinaires La capacit de rsorption tubulaire du glucose est diminue chez des porcs exposs un aliment contamin par 0,8 mg dOTA/kg (Krogh et al., 1974, 1976a). Une glycosurie (Krogh et al., 1974,

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1976a, 1979; Stoev et al., 2000, 2001; Tapia et Seawright, 1984), une protinurie et une faible augmentation de lalbumine urinaire sont galement constates (Krogh et al., 1976a, 1979; Stoev et al., 1998, 2000; Tapia et Seawright, 1984). La quantit de protines excrtes augmente avec la dure dexposition et le taux dOTA dans laliment (Krogh et al., 1974). La capacit des porcs concentrer lurine aprs 24 h de jene hydrique est diminue ds 1 mg dOTA/kg daliment (Krogh et al., 1974, 1976a, 1979; Stoev et al., 1998, 2000, 2001). Lexcrtion dlectrolytes, notamment du potassium (Krogh et al., 1974, Stoev et al., 1997) et du sodium (Stoev et al, 1997), de nitrites et de bilirubine (Stoev et al., 2000) augmentent, ainsi que le pH de lurine (Stoev et al, 1998, 2001), tandis que son osmolarit diminue (Krogh et al., 1974). La densit de lurine est abaisse (Krogh et al., 1974; Stoev et al, 2000), mme aprs le retrait de laliment contamin pendant un mois (Stoev et al., 2001). Lexcrtion tubulaire maximale de lacide para-amino-hippurique et le rapport entre ce paramtre et la clairance de linuline diminuent, rvlant une dgradation du fonctionnement des tubules proximaux (Krogh et al., 1974, 1976a, 1979, 1988). Les concentrations en lactate dshydrognase, en isocitrate dshydrognases lactique et citrique et en glutamyl-oxaloactique dshydrognase sont augmentes de faon transitoire (Szczech et al., 1973). Lexcrtion urinaire en enzymes localises dans la bordure en brosse des tubules proximaux comme la leucine aminopeptidase (LAP) ou la gamma-glutamyl transpeptidase, est augmente (Krogh et al., 1974; Stoev et al., 1998, 2000, 2001). Paramtres sanguins Lusky et al. (1994, 1995), Krogh et al. (1974) et Sandor et al. (1991) ne constatent pas daltration des teneurs en mtabolites sanguins chez des porcs exposs, mme pendant une longue dure, des aliments renfermant au maximum 0,4 mg dOTA/kg. Mais ds le taux de 1 mg dOTA/kg, la cratininmie (Harvey et al., 1989, 1992, 1994; Krogh et al., 1974, 1976a, 1979; Stoev et al., 1997, 2000; Tapia et Seawright, 1984), lurmie (Krogh et al., 1974; Stoev et al., 2000, 2001) et la concentration en protines sriques (Harvey et al., 1992, 1994; Stoev et al., 1998) sont augmentes. Stoev et al. (2001) trouvent cependant une baisse de la protinmie chez des porcs recevant un aliment contamin simultanment par de lOTA (0,18 puis 0,79 mg/kg) et de lacide pnicillique (3 puis 9 mg /kg). La glycmie (Stoev et al., 1997, 2000, 2001) et la cholestrolmie (Harvey et al., 1994,1989; Stoev et al., 1998, 2000) sont diminues. Dans ltude de Stoev et al. (2000), la cratinmie est seule augmente lorsque laliment apporte 1 mg dOTA/kg, alors que les autres paramtres sanguins sont galement affects au taux de 3 mg dOTA/kg. Stoev et al (2001) en concluent que la cratinine, et dans une moindre mesure lurmie, sont les critres sanguins indicateurs prcoces (ds un mois) les plus sensibles des lsions rnales provoques par lintoxication des porcs par lOTA; leur niveau demeure lev un mois aprs que laliment contamin ait t retir, contrairement la glycmie et la protinmie qui retrouvent le niveau des tmoins. Immunit Certaines tudes montrent que lOTA peut affecter la fonction immunitaire et la sensibilit aux infections des porcs. Un aliment renfermant 2,5 mg dOTA/kg rduit la fois lhypersensibilit cutane des basophiles aprs injection de tuberculine, lactivit des macrophages, la phagocytose des rythrocytes de porc, la prolifration lymphocytaire induite par la phytohmagglutinine, ainsi que la production dIL-2 aprs stimulation par la concanavaline A (Harvey et al., 1992, 1994). Des porcs immuniss avec Pasteurella subissant un challenge Pasteurella sont davantage malades sils ingrent lOTA. Aprs immunisation contre la salmonellose, la rponse humorale est diminue lorsque les porcs consomment un aliment ayant 1 mg dOTA/kg (Stoev et al., 2000). Lsions rnales A lautopsie, laspect morphologique des reins de porcs consommant 0,02 mg dOTA/kg de poids vif ne parat pas modifi (Sndor et al., 1991). Par contre, aux doses plus leves, les reins deviennent ples et hypertrophis (Krogh et al., 1976a; Rutqvist et al., 1978; Cook et al., 1986). Des marbrures (Stoev et al, 2000, 2001) et des ptchies (Harvey et al, 1989) se dveloppent la surface des reins et leur poids relatif augmente (Harvey et al., 1989, 1994; Krogh et al, 1979). Ces anomalies sont dautant plus marques que la dure dexposition lOTA augmente (Elling, 1983) ou que le taux de la mycotoxine dans laliment est lev (Krogh et al.,1974; Tapia et Seawright, 1984), et elles persistent un mois aprs le retrait de laliment contamin (Stoev et al., 2001). Dans quelques tudes, lexamen histologique des porcs exposs un rgime renfermant 1 doses pendant une dure plus longue (Krogh Mais la plupart des travaux rvlent des des reins ne rvle aucune ou peu de lsions chez mg dOTA/kg pendant 4 semaines, ou de plus faibles et al.,1976b; Sandor et al., 1991 ; Lusky et al., 1994). altrations histologiques et ultrastucturales rnales

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saggravant lorsque le niveau de contamination et la dure dexposition augmentent avec dgnrescence des tubules contourns proximaux, hyalinisation et sclrose des glomrules, et dveloppement dune fibrose interstitielle (Hald, 1991; Krogh, 1991, 1992). Les cellules pithliales des tubules contourns proximaux se ncrosent, dgnrent et se desquament (Szczech et al., 1973; Elling, 1977, 1979, 1983; Krogh et al., 1979; Tapia et Seawright, 1984; Stoev et al., 2001). Elles peuvent apparatre gonfles, ples et vacuolises (Krogh et al., 1974; Cook et al., 1986; Harvey et al., 1992, 1994; Stoev et al., 2001). Des dbris cellulaires sont retrouvs dans la lumire des tubules contourns et des canaux collecteurs (Krogh et al., 1974, 1979; Tapia et Seawright, 1984; Stoev et al., 2001). Ces constatations sont gnralement faites chez des porcs consommant des aliments contamins par au moins 1 mg dOTA/kg, mais aussi avec un faible degr de gravit lors dune contamination par seulement 0,2 mg dOTA/kg (Krogh et al., 1974; Stoev et al., 2001). Les tubules proximaux satrophient et dgnrent (Szczech et al, 1973; Krogh et al, 1976a; Elling, 1979, 1983; Harvey et al, 1992). Les membranes basales des tubules des zones les plus atteintes spaississent (Krogh et al, 1974, 1976a, 1979; Elling, 1983). Inversement, la hauteur de la membrane en brosse diminue (Krogh et al, 1974, 1976a; Rutqvist et al, 1978), pouvant mme disparatre totalement (Tapia et Seawright, 1984). La rcupration semble dans une certaine mesure possible puisque, aprs un mois de distribution dun aliment non contamin, on ne trouve plus, ou seulement peu, de tubules proximaux dgnrs chez des porcs ayant prcdemment consomm un aliment renfermant 0,79 mg dOTA/kg (Stoev et al., 2001). La fibrose interstitielle se limite la zone o les tubules sont lss (Krogh et al., 1976a, 1979; Elling, 1979; Tapia et Seawright, 1984; Cook et al., 1986; Stoev et al., 2001). Dans les cas les plus graves ou lorsquun aliment fortement contamin est distribu pendant une longue dure, le parenchyme cortical est atrophi et la fibrose se dveloppe dans tout le cortex rnal. Des petits kystes contenant un liquide sreux (Krogh et al., 1979; Stoev et al., 2001, 2002), un matriel osinophile homogne et frquemment des lymphocytes (Krogh et al., 1974; Elling, 1983) peuvent aussi se dvelopper dans le cortex rnal. Lactivit denzymes du cortex rnal est diminue, cest le cas de la LAP, considre comme spcifique du rein et de la glutamate dshydrognase (Krogh et al., 1974). Il en va de mme pour la NADPH-ttrazolium rductase, la succinate dshydrognase, la glucose-6-phosphate dshydrognase, l-glycrophosphate dshydrognase (Elling, 1979), la PEPCK et la -glutamyl transpeptidase, enzyme localise dans la bordure en brosse des tubules proximaux (Krogh et al., 1988). Autres lsions Le tube proximal du rein constitue la cible principale de lOTA chez le porc, et les autres organes ne sont pas affects par la consommation dun aliment contenant jusqu 4 mg dOTA/kg (Krogh et al., 1974 1976a, 1979; Harvey et al., 1989, 1992; Tesch et Lusky, 1993). Selon Krogh (1980, 1991), ce nest quau-del dune teneur de 5 10 mg dOTA/kg, trs rarement trouve de faon naturelle, que les aliments deviennent toxiques pour dautres organes que les reins: la paroi des intestins devient fine et atonique, et leur muqueuse porte des taches de ncrose. Le foie est brun-ple jaune, les altrations correspondant une surcharge graisseuse. Les nodules lymphatiques msentriques et priphriques sont prominents, dmateux et faiblement congestionns et se ncrosent. Une atteinte limite des lymphocytes, caractrise par de la pycnose, de la caryorexie, et de la cytolyse se produit dans les centres germinatifs. Effets sur la reproduction LOTA est trouve dans le plasma sminal de verrats consommant 20 ou 40 g dOTA par jour (Solti et al., 1999; Bir et al, 2003), la viabilit des spermatozodes, leur motilit et leur longvit tant significativement rduites aprs un dlai li la dure du cycle de la spermatognse, de 39 jours chez le porc. Une baisse de la qualit du sperme a t galement constate par Ewald et Heer (1989) chez des verrats consommant un aliment contamin par de lOTA. Les trs faibles effectifs de truies dans les expriences (1 2 /Lot) sont insuffisants pour permettre de conclure labsence deffet de lOTA sur les performances de reproduction (Shreeve et al., 1977 ; Mortensen et al., 1983a). LOTA est trouve dans les tissus maternels et le placenta mais pas chez

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les foetus de truies ayant ingr de lOTA et de lOTB pendant les 8 jours prcdents (Patterson et al. (1976). De mme, Mortensen et al (1983a) ne dtectent pas dOTA dans les tissus des porcelets la naissance, leurs reins ont un poids normal et ne prsentent aucune anomalie morphologique. En revanche, un cas de transfert dOTA aux ftus porcins a t rapport par Barnikol et Thalmann (1988). De mme, Raji et al. (1986) en retrouvent 5 10 g/kg dans les muscles, les poumons et le foie des porcelets nouveau-ns nayant pas encore tt leurs mres, celles-ci ayant consomm un aliment avec 2,3 mg dOTA/kg pendant les 4 jours prcdents. Devenir de lochratoxine Labsorption de lOTA est beaucoup plus lente et plus complte (65,7% de lOTA administre) chez le porc que chez le lapin ou le poulet. Le volume de distribution de la toxine (42,9 mL/kg) correspond approximativement au volume du plasma. Le pic dOTA est atteint dans le plasma 10 h aprs son administration orale (Galtier et al., 1981). La demi-vie plasmatique de 88,8 h de lOTA (contre respectivement 8,3 et 4,2 h chez le lapin et le poulet) trouve par Galtier et al. (1981) est du mme ordre dans les reins, le foie et les muscles de porcs (respectivement 4,5, 4,3 et 3,3 jours daprs Krogh et al., 1976b). La toxine saccumule donc dans les tissus, et elle est encore trouve dans les reins 1 mois aprs larrt de sa consommation (Krogh et al., 1976b). La plus grande affinit de la srum albumine de porc pour lOTA contribuerait expliquer llimination particulirement lente des rsidus de la toxine chez cette espce (Galtier, 1991). Aprs 5 mois de consommation par des porcs dun aliment contenant de lOTA, la concentration de la toxine dans lurine est plus leve que dans le srum sanguin, et aprs une semaine de retrait de laliment contamin, lOTA est encore trouve dans lurine alors quelle nest plus dtecte dans le sang. La voie urinaire serait donc primordiale pour llimination de la toxine (Stoev et al., 2001). Lorsque laliment contient la fois de lOTA et de lOTB, toutes deux sont trouves dans le plasma, mais lOTA est davantage absorbe que lOTB (Patterson et al, 1976). Ni lOTB, ni lOT, mtabolite de lOTA, ne sont prsentes dans les tissus (Krogh, 1977; Krogh et al., 1976a,b, 1979). Rsidus dans les tissus et organes: consquences pour les aliments de lhomme Chez le porc expos une contamination alimentaire en OTA, la toxine est localise principalement dans le plasma (Galtier, 1991; Hult et al., 1992). Sa concentration plasmatique est lie la teneur dans laliment (Sandor et al., 1991; Lusky et al., 1994; Mller et al., 1999), mais elle demeure 1,5 fois plus leve dans le sang que dans laliment (Tesch et Lusky, 1993; Lusky et al., 1995; Solti et al., 1999). Lorsque laliment contamin cesse dtre distribu, le taux sanguin dOTA diminue de faon exponentielle (Bir et al., 2003). Stoev et al. (2001) nen trouvent plus dans le srum une semaine aprs que des porcs aient cess de consommer un aliment avec 0,79 mg dOTA/kg. Mais le plus souvent, on en retrouve encore 5 7 semaines plus tard (Mortensen et al., 1983a; Bir et al., 2003). Solti et al. (1999) constatent mme lapparition de pics dOTA 14 et 35 jours aprs que laliment contamin ne soit plus allou des verrats. Compte tenu de sa longue demi-vie, le taux dOTA dans le sang est considr comme reprsentatif du niveau de contamination de laliment lorsquil est distribu pendant une longue dure (Hult, 1991). Cette relation a t mise profit au cours denqutes en abattoirs conduites dans des rgions ou sur des troupeaux de porcs forte prvalence de MPN, et lOTA tait alors retrouve dans le sang dune proportion importante danimaux (65%, Marquart et al., 1988; 36%, Ominski et al., 1996). Cependant, pour un mme niveau de contamination de laliment, les variations individuelles de teneur en OTA du sang sont importantes (Mortensen et al., 1983a; Stoev et al., 2001). La teneur en OTA de la bile est proche de celle du sang (Lusky et al., 1994) mais elle est beaucoup plus faible dans les tissus et organes (Rutqvist et al., 1978; Cook et al., 1986; Krogh, 1991; Mortensen et al., 1983b; Mller et al., 1999). Les reins sont les organes dans lesquels le taux de toxine (localise dans les tubules contourns proximaux) est le plus lev, variant entre 4 et 71 g/kg la suite de la consommation daliments contamins par 0,1 et 1,4 mg dOTA/kg (Madsen et al., 1982b; Lusky et al., 1995, 1998). Dans le myocarde, des taux dOTA proches de ceux des reins ont t nots (Lusky et al., 1994,1995). Par ordre de teneur dcroissante, on trouve ensuite en gnral le foie, les muscles, puis les graisses (Krogh et al., 1976a,b; Rutqvist et al., 1978; Tesch et Lusky, 1993; Gareis et Scheuer, 2000; Malagutti et al., 2005).

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En raison de la longue demi-vie plasmatique de lOTA chez le porc, cette toxine peut se retrouver dans les produits carns consommables par lhomme. Un tiers des reins de porcs prsentant des signes de MPN contiennent plus de 10 g dOTA/kg (Krogh, 1977). Cette teneur est galement dpasse dans 33% des foies, 20% des muscles et 8% des graisses des mmes animaux. Mais la situation est meilleure lorsque lon considre les porcs dont les reins sont apparemment normaux. Au Danemark, des enqutes ont montr que si lOTA est dtecte dans une proportion relativement importante dchantillons de viande de porc, sa teneur ne dpasse 1 g/kg que dans 2 cas sur 83 (Jrgensen, 1998) ou 9 cas sur 300 dentre eux (Jrgensen et Petersen, 2002). Une tude analogue conduite en Allemagne sur 620 chantillons de viande et dabats issus de porcs, bufs et volailles dmontre que le risque de contamination par lOTA est beaucoup plus important avec le porc (Gareis et Scheuer, 2000). LOTA est galement retrouve dans la charcuterie, et laddition de sang, de srum ou de foie la viande en augmente la teneur. Gareis et Scheuer (2000) dtectent de lOTA dans 70% des boudins, 68% des saucisses base de foie, et 50% des saucisses ordinaires, avec des 90mes percentiles qui sont respectivement de 0,24, 0,16 et 0,11 g/kg. La charcuterie produite partir de porcs ayant consomm un aliment avec 0,09 mg dOTA/kg pendant leurs 4 dernires semaines de vie en contient, en moyenne 12,4 g/kg pour la saucisse avec plasma ajout, 11,4 g/kg pour le boudin et 10,0 g/kg pour la saucisse de foie (Lusky et al., 1995). La saucisse obtenue partir de porcs lourds qui ont reu une ration renfermant 2,5 g dOTA/kg contient environ 5 g dOTA/kg (Malagutti et al., 2005). La charcuterie contient dautant plus dOTA que le rgime tait davantage contamin (Lusky et al, 1994). LOTA contenue par ces produits nest pas dtruite par la fermentation, le stockage, la maturation, la cuisson (Krogh, 1977; Lusky et al., 1994) ou la conglation -70C (Rutqvist et al., 1978). Ainsi, la teneur en OTA de la saucisse frache nvolue pas aprs 40 ou 100 jours de maturation (Malagutti et al., 2005). Au Danemark, o les risques de contamination de la viande et des abats par lOTA taient levs, un contrle en abattoir des reins de porcs a t mis en place: lorsquun rein prsente des signes de nphropathie, sa teneur en OTA est dtermine. Si elle est suprieure 25 g/kg, lanimal entier est saisi, et quand elle est comprise entre 10 et 25 g/kg, seuls les reins et le foie sont limins. La dose limite de 25 g dOTA/kg dans les reins correspond une teneur thorique de 10 g dOTA/kg dans la viande, fonde sur des quations de rgression reliant les teneurs en rsidus dans les reins celle des tissus (Krogh, 1977). Lapplication de ces mesures jointe une plus grande surveillance de la qualit des aliments destins aux animaux et leurs conditions de schage et de conservation a amlior la situation sans liminer tous les risques (Jrgensen et Petersen, 2002). La citrinine, parfois retrouve simultanment lOTA dans lalimentation, a les mmes effets nphrotoxiques chez le porc mais des doses beaucoup plus leves que celles de lOTA (Krogh, 1980) (voir chapitre Autres mycotoxines ). Il ny a actuellement pas de donnes pidmiologiques disponibles montrant leur ventuelle potentialisation toxique lorsquelles sont prsentes de faon concommitente ltat naturel. 6.1.2 Les volailles Effets sur la sant Comme chez la plupart des espces dlevage, lintoxication par lOTA peut se manifester chez les volailles par une forme aigu ou une forme chronique. Ces deux formes sont observes aprs ingestion de doses relativement leves dOTA (de lordre du mg/kg ou plus, dans les aliments composs ou les crales). Peu de donnes sur les effets de faibles doses (quelques g/kg daliment) sont disponibles. Diffrentes tudes renseignent la toxicit compare de l'OTA et de lAFB1, de la toxine T2, de la citrinine ou du DON (Ruff et al., 1992 et 1990 ; Huff et al., 1992a et b ; Glahn et al., 1989; Osborne et al., 1982). Ces tudes sont gnralement conduites avec de fortes doses et nont pas pour objectif de documenter les risques dune exposition conjointe ces toxines. Les donnes disponibles concernant les expositions simultanes semblent conclure des effets synergiques entre OTA et AFB1 (Verma et al., 2004 ; Huff et al., 1984 ; Campbell et al., 1983 ; Huff et al., 1983 ; Huff et Doerr, 1981 ; Warren et Hamilton, 1980), y compris en ce qui concerne leur persistance ltat rsiduel (Micco et al., 1988) ou additifs entre OTA et trichothcnes (doxynivalnol, toxine T2, diacetoxyscirpenol) ou acide cyclopiazonique ou fumonisine B1 (Kubena et al., 1989 et 1988 et 1994 et 1997 ; Gentles et al., 1999) mais pas entre OTA et citrinine, un antagonisme pouvant mme tre constat dans ce cas (Glahn et al., 1988 ; Brown et al., 1986 ; Manning et al., 1985).

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Forme aigu Les DL50 tablies pour lOTA chez les volailles varient de 3,4 mg/kg p.v. chez les poulets 16,5 mg/kg p.v. chez les cailles (Prior et al., 1976). Chez les dindes, la DL50 orale est de 5,9 mg/kg p.v. LOTB et lOTC seraient environ 15 et 1,5 fois moins toxique que lOTA (Peckham, 1978). Le poussin de 1 jour serait environ 2 fois plus sensible que le jeune de 3 semaines, aussi bien chez les poulets que les dindes (Peckham, 1978 ; Chang et al., 1981). Les DL 50 seraient environ 20 fois plus basses lors dadministration intrapritonale (Chang et al., 1981). Les formes aigus de lintoxication sont rapportes lors dexposition des concentrations en OTA variant de 2 plusieurs dizaines de mg/kg daliment. Une diminution de la consommation alimentaire a t constate chez la dinde mais pas le poulet (Hamilton et al.,1982 ; Burditt et al.,1984). Les animaux sont prostrs, ataxiques avec des tremblements et une diminution des rflexes. La mortalit peut atteindre 55%. A lautopsie, les reins sont ples, gonfls et hmorragiques (Hamilton et al.,1982). Le foie est ple, on peut remarquer une hypertrophie des nuds lymphatiques et une congestion intestinale. Des hmorragies dans diffrents tissus, une gastrite et une entrite catarrhales ont galement t dcrites chez le poulet et le canard (Hamilton et al., 1982 ; Bryden, 1998). A ces doses, lOTA ne semble pas modifier la spermatogense mais augmenterait la mortalit embryonnaire prcoce (Prior et al., 1979). Forme chronique Les formes chroniques de lintoxication sont observes lors dexposition pendant plusieurs semaines des concentrations en OTA dans laliment de 0,3 4 mg/kg. Ces concentrations sont relativement leves, les niveaux toxiques minimum pour les volailles sont voisins de 0,5 mg/kg daliment chez les poules pondeuses et les poulets de chair (Huff et al., 1978). Administre hauteur de 0,2 mg/kg daliment pendant 20 jours, lOTA nentrane pas de lsions macroscopiques et/ou microscopiques des tissus cibles, ni lapparition de rsidus (LD = 0,0005 mg/kg) chez le poulet (Kozaczynski, 1994). Les principaux symptmes observs sont un retard de croissance et un mauvais indice de conversion alimentaire. Une nphropathie est rapporte dans toutes les espces exposes des concentrations suprieures ou gales 2 mg dOTA/kg daliment (Chang et al., 1981 ; Dwidedi et al., 1984a et c, Kubena et al., 1985, Hamilton et al.,1982). Elle saccompagne dune polyuro polydypsie cliniquement rvle par un large volume de fces humides (Elling et al., 1975). Des signes digestifs tels que laugmentation du poids du gsier et des problmes de conformation avec retards de maturit sexuelle sont parfois rapports (Huff et al., 1988). Chez le poulet, une dpigmentation, peut-tre lie une diminution des teneurs plasmatiques en carotnodes (cf. infra) et une diminution de la solidit des os ont t observes, de mme quune ostoporose (Hamilton et al., 1982, Dwidedi et al., 1984a ; Duff et al., 1987). Chez les poules pondeuses, on note une diminution de la production dufs avec un nombre excessif de taches sur les coquilles dufs produits et une diminution de la gravit spcifique des ufs : les coquilles sont minces et molles et les bris de coquilles plus levs (Page et al., 1980 ; Hollinger et Ekperigin, 1999). Un refus alimentaire ne semble pas tre la cause de la chute de ponte (Prior et Sisodia, 1978 ; Bryden, 1998). Un apport suprieur en protines ou une supplmentation de la ration en phnylalanine diminuent les signes cliniques (Gibson et al., 1989 et 1990). Ces troubles sont accompagns de diffrentes altrations biochimiques et hmatologiques. On note une diminution des concentrations sriques en protines, cholestrol, triglycrides, ammoniaque, calcium, phosphates inorganiques, potassium et carotnodes et une augmentation des concentrations en acide urique et en cratinine, accompagnes dune augmentation de la filtration glomrulaire avec augmentation de la diurse et diminution de losmolarit des urines (Huff et Hamilton, 1975 ; Huff et al., 1975 ; Page et al., 1980 ; Schaeffer et al., 1987 ; Huff et al., 1988 ; Glahn et al., 1988 et 1989 ; Ayed et al., 1991 ; Elissalde et al., 1994 ; Hollinger et Ekperigin, 1999). Une anmie microcytaire et hypochrome est parfois rapporte (Huff et al., 1979a et 1988), de mme quune altration de la coagulation sanguine (Doerr et al., 1981). Un apport suprieur en protines ou une supplmentation de la ration en phnylalanine diminuent les signes biochimiques et hmatologiques (Bailey et al., 1989 et 1990). Enfin, une altration des dfenses immunitaires est observe. Elle saccompagne dune lymphopnie variable, dune hypoplasie mdullaire, dune lymphopnie sanguine et tissulaire (bourse de Fabricius, thymus, rate, plaques de Peyer), dune diminution des teneurs en immunoglobulines et des capacits phagocytaires des monocytes et des polynuclaires neutrophiles avec, dans certains cas, une

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augmentation de la sensibilit aux infections et infestations (Chang et al., 1979 ; Huff et Russ, 1982 ; Hamilton et al.,1982 ; Singh et al., 1990 ; Elissalde et al., 1994 ; Fukata et al., 1996 ; Hollinger et Ekperigin, 1999 ; Stoev et al., 2000 et 2002 ; Kumar et al., 2003 et 2004). A lautopsie, dans les cas les plus svres, on constate une nphrose svre, avec accumulation durates dans les tubules, les uretres et sur le msentre. Une atrophie des reins uni ou bilatrale est constate chez certaines espces alors quune hypertrophie avec dme ou une absence deffet est constate dans dautres (Huff et al., 1975 ; Page et al., 1980 ; Change et al., 1981 ; Dwidedi et al., 1984c, Ruff et al., 1990 et 1992 ; Huff et al., 1990 et 1992b ; Hollinger et Ekperigin, 1999 ; Kumar et al., 2003 et 2004). Chez certains oiseaux, une lgre entrite catarrhale peut tre mise en vidence. Lexamen microscopique des reins rvle une atrophie et une dgnrescence des tubules proximaux et distaux (Huff et al., 1975 ; Hollinger et Ekperigin, 1999). Le tube contourn proximal est le plus atteint, il prsente une distension svre, un largissement et une hypertrophie, un paississement des membranes basales des glomrules avec, dans certains cas, de faibles accumulations de glycogne dans le cytoplasme (Burns et Maxwell, 1987). Le cytoplasme de lpithlium tubulaire est granuleuxavec hyperplasie cellulaires. Au niveau hpatique, on constate une vacuolisation prilobulaire avec une possibilit de dgnrescence et de ncrose focale (Burns et Maxwell, 1987). Le contenu hpatique en glycogne est augment, lOTA inhibant la mobilisation du glucose partir du glycogne ; en revanche le contenu lipidique demeure inaltr (Huff et al., 1979b ; Bryden, 1998). Lhpatotoxicit de lOTA serait plus importante chez la caille que chez les autres espces (Maxell et al., 1987). Enfin, un largissement du volume intestinal accompagn dune plus grande fragilit de la paroi a t dcrit (Warren et Hamilton, 1980). Toxicocintique et transfert tissulaire Labsorption orale de lOTA chez les volailles semble se drouler comme chez les autres espces monogastriques, par diffusion passive de la forme non ionise liposoluble. La biodisponibilit relative semble toutefois infrieure. Elle serait de lordre de 40% chez le poulet, et seulement de 6,2 % chez la caille. Le pic de concentration plasmatique est plus prcoce et obtenu aprs 0,33 heures chez le poulet. La demi-vie plasmatique de lOTA, aprs administration orale, varie de 4,1 heures pour le poulet 6,7 heures pour la caille. Cette demi vie est donc trs infrieure celle rapportes dans la plupart des espces de mammifres (Galtier et al., 1991). Une fois dans la circulation, lOTA se fixe aux protines plasmatiques, sa constante daffinit (Ka) pour les albumines sriques est de lordre de 5,1x104, trs proche de la valeur chez lhomme (Galtier et al., 1980). La distribution tissulaire de lOTA chez le poulet semble plus importante que dans les autres espces. Les concentrations tissulaires les plus leves sont observes dans les tissus suivants : reins > foie > muscles, aucun rsidu ntant retrouv dans les graisses ou dans la peau. Le passage dans les ufs est minime ou nul (Galtier et al., 1991). Aucune donne sur le mtabolisme de lOTA chez la volaille nest disponible. 6.1.3 Les ruminants Effets sur la sant Grce la prsence du rumen situ en amont de lestomac, les ruminants sont relativement rsistants aux intoxications aigus par l'OTA (voir ci-dessous). Cependant, Llyod (1980) et Llyod et Stahr (1980) ont dcrit un cas plutt exceptionnel dans lequel 63 bovins sont morts la suite dune consommation daliments fortement contamins en OTA et en citrinine, ayant entran des affections rnales graves des animaux. Mtabolisme de l'OTA dans le rumen La molcule dOTA peut tre aisment hydrolyse dans le rumen (Hult et al., 1976 ; Mller et al., 2001). Les protozoaires sont majoritairement impliqus dans le processus de dgradation de lOTA (Kiessling et al., 1984). LOT forme au cours des fermentations ruminales est beaucoup moins toxique que lOTA. On trouve l une explication la moindre sensibilit des ruminants lOTA dcrite par Ribelin et al. (1978). LOTA peut galement tre estrifie dans le rumen en ochratoxine C sans modification de la toxicit (Galtier et Alvinerie, 1976). Mller (1995) a estim que 33 72 mg dOTA peuvent tre dgrads chaque jour dans le rumen de vache, ce qui correspond 3 7 mg/j pour un mouton adulte. Selon Hhler et al. (1999), des diffrences notables existent dans la capacit des microorganismes du rumen dgrader lOTA, selon

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que la toxine est ajoute pure au milieu ou quelle est naturellement prsente dans la matrice alimentaire. Laccs des microbes la toxine est plus difficile dans laliment contamin, et sa dgradation est alors plus faible que sil est administr sous forme pure. La nature du rgime alimentaire des animaux agit sur la composition qualitative et quantitative de la population microbienne et sur son activit hydrolytique lgard de lOTA. Xiao et al. (1991a,b) ont montr que le mtabolisme de lOTA dans le rumen est augment lorsque lon passe dun rgime riche en crales un rgime base de fourrages. En effet, les demi-vies respectives de lOTA et de lOT dans le rumen sont 0,63 et 0,9 heures dans le cas dun rgime base de fourrages, et 2,7 et 1,9 heures dans le cas dun rgime contenant une proportion leve de concentr nergtique. Les auteurs ont calcul que la biodisponibilit de lOTA tait 4,3 fois plus leve chez le mouton nourri avec des crales que chez le mouton recevant des fourrages. A loppos, zpinar et al. (2002) ont montr que laddition dune quantit damidon infrieure 30% de la ration totale, diminue la demi-vie dans le rumen de lOTA de 3,7 h 1,9 heures, alors quelle passe 4,5 h aprs laddition de cellulose. Ces diffrences peuvent tre dues au fait que le rgime base de crales utilis par Xiao et al. (1991a) a conduit une chute svre du pH dans le rumen (pH=5,6) entranant une diminution importante de la population de protozoaires et une dgradation de lOTA plus faible. En revanche, le rgime utilis par zpinar et al. (2002) a vraisemblablement conduit un dveloppement de la population de protozoaires favorisant lhydrolyse de lOTA (Jouany, 1989). On peut noter que la cintique de dgradation de lOTA aprs le repas volue comme la concentration des protozoaires dans le rumen, ce qui confirme le rle primordial de ces composants de lcosystme microbien ruminal sur la dtoxication de lOTA (Mller et al., 1998 et 2001 ; Kiessling et al., 1984). Le rumen et sa population microbienne, impliquant principalement les protozoaires, peuvent donc tre considrs comme efficaces pour protger les ruminants contre la toxine OTA. Le rle des microorganismes du rumen devient vident lorsque lon considre la diffrence de LOAEL selon lOTA distribue par voie orale (13 mg/kg) ou par voie intraveineuse (1 mg/kg) (Cheeke, 1998). La toxicit de lOTA lgard des microorganismes du rumen a t tudie sur la souche Butyrivibrio fibrisolvens CE51 (Westlake et al., 1987), cette bactrie tant choisie pour sa contribution considre comme importante dans le processus de dtoxication ruminale des mycotoxines (Mackie et White, 1990). Les rsultats montrent que la croissance spcifique de B. fibrisolvens nest pas affecte par lOTA. Labsence deffet sur la digestibilit de la ration chez le mouton la dose de 5 mg/kg prouve que lOTA na pas deffet dltre sur la population microbienne digestive prise dans sa globalit. Absorption et excrtion de lOTA et de lOT par les ruminants Selon Marquadt et Frolisch (1992), lOTA serait absorbe par les ruminants sous une forme passive de la molcule non-ionise, labsorption tant surtout effective des valeurs faibles de pH, cette observation suggre que lestomac serait le lieu privilgi de labsorption dOTA. Hhler et al., (1999) ont adapt trois groupes de moutons recevoir une ration mixte compose de 70% de concentr et de 30% de fourrages contenant 3 niveaux de contamination dOTA (0, 2 et 5 mg/kg daliment). Des concentrations significatives dOTA et dOT ont t dtectes dans le srum sanguin pendant toute la dure de lexprimentation (10 et 3 ng/ml avec la dose 2 mg/kg ; 80 et 15 ng/ml avec la dose 5 mg/kg). Selon les auteurs, la capacit de lcosystme microbien dgrader lOTA serait limite pour ces fortes concentrations. Environ 75 % de lOTA ingr a t retrouv sous forme dOT dans les excrta (10 % dans les fcs et 65 % dans lurine), alors que seulement 1 % et 3,8 % de la toxine mre taient rcuprs dans les fces et lurine respectivement. Blank et al. (2003) ont expos des moutons une gamme de doses dOTA plus large : 0 ; 9,5 ; 19 ; 28,5 g/kg p.v./jour. Les auteurs ont dtect la prsence dOTA dans le srum des animaux pour toutes les doses testes. La concentration dOTA dans le srum (de 1,5 18 ng/ml) a augment avec la dure dadministration de la toxine, et a t quantitativement corrle dune manire linaire la dose initiale. La proportion excrte dans lurine a t constante, et a reprsent 6 8 % de la dose. Les faibles quantits dOT dtectes dans le srum (0,5 1,6 ng/mL ) ont augment linairement avec la dose administre. Ces rsultats montrent quune exposition faible dose peut aboutir une accumulation dOTA dans le srum des ruminants. LOTA possde la proprit de se lier aux protines et dtre rabsorbe au niveau des nphrons, ce qui lui permet de se maintenir longtemps dans le sang ou dans les tissus des animaux (Dahlmann et al., 1998). Cependant, laccumulation dOTA dans le sang est plus faible chez les ruminants que chez

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les autres animaux. Cette observation sexplique la fois par la dgradation de la toxine dans le rumen et par la faible rabsorption par les nphrons due au pH urinaire plus lev chez les ruminants puisque ce phnomne est rgul par le pH luminal (Blank et al. 2003). Ainsi, la demi-vie plasmatique dans lorganisme animal de lOTA est beaucoup plus courte chez le ruminant (17,3 h) que chez le singe rhsus (510 h), le porc et le rat (100 h) (Xiao, 1991b ; Kuiper-Goodman et Scott, 1986). Transfert de lOTA dans le lait des ruminants Lexprimentation mene par Shreeve et al. (1979) sur un nombre limit danimaux recevant des doses contrles dOTA avait montr que les laits ne contenaient pas dOTA dtectable (> 100 ng/L). . . En fait le risque existe de retrouver lOTA et son principal mtabolite lochratoxine (OT) dans le lait des animaux ayant ingr des aliments contamins par cette toxine (Breitholtz-Emanuelson et al., 1993 ; Valenta et Goll, 1996). Mais ce risque est faible : En Norvge, Skaug (1999) a dtect la prsence dOTA (>10 ng/L) dans 11/87 chantillons de lait, avec une concentration maximale de 58 ng/L. Une enqute ralise en Grande-Bretagne sur 100 chantillons de lait, a montr quils ne contenaient pas de teneur en OTA suprieure 100 ng/L. Une enqute conduite en France sur 264 chantillons a rvl la prsence dOTA dans 3 chantillons mais des teneurs infrieures 10 ng/L (Boudra et al., 2007). Ces enqutes corroborent les travaux exprimentaux de 1979. Il semble donc que le transfert trs limit de lOTA dans le lait des ruminants ne conduise pas un risque de contamination significative de cette production animale.

6.1.4 Animaux de compagnie et de loisirs Si les animaux de compagnie et de loisirs ne diffrent pas fondamentalement des autres animaux domestiques quant aux circonstances et aux consquences du risque li aux mycotoxines, ils prsentent cependant une diffrence notoire : celle de la durabilit de laction toxique inhrente leur trs longue esprance de vie. Pour ces espces, cest tout autant limpact de consommation de faibles doses sur de trs longues priodes avec ses rpercussions sur la fonction rnale, la baisse dimmunit ou la sensibilit accrue aux agents infectieux, que le risque ponctuel li des contaminations plus massives associes un tableau clinique plus explicite, quil savre particulirement pertinent de connatre. Les quids Aucune donne nest disponible quant la sensibilit ventuelle des quids face la consommation daliments contamins par lOTA. Les carnivores Diffrentes enqutes pidmiologiques laissent penser que les carnivores domestiques (chiens et chats) seraient exposs au risque toxicologique li la prsence dOTA dans les aliments. Scudamore et al. (1997) ont analys 35 aliments secs pour chiens et 35 aliments secs pour chats disponibles sur le march britannique afin de rechercher la prsence dOTA (seuil de dtection 0,5 g/kg). LOTA na t identifie que dans deux aliments pour chiens (1,1 et 1,3 g/kg) et dans deux aliment pour chats (1,2 et 2,3 g/kg). Razzazi-Fazeli et al.(2001) ont analys 26 aliments humides et 17 aliments secs pour chiens et chats : lOTA a pu tre identifie dans 47% des prlvements, majoritairement faibles doses (de 0,1 0,8 g/kg), deux chantillons seulement prsentant des valeurs leves (3,2 et 13,1 g/kg). Par ailleurs, 26 prlvements de tissu rnal de chats ont t analyss. Seize dentre eux prsentaient des teneurs en OTA comprises entre 0,35 et 1,5 g/kg, mais sans que ces valeurs puissent tre relies quelque signe pathologique que ce soit. Dans le prolongement de cette premire tude, Phringer (cit par Bhm et Razzazi-Fazeli, 2005) a analys 101 prlvements de tissu rnal de chats prsentant ou non des signes cliniques rnaux. Trente-neuf chantillons prsentaient des teneurs en OTA comprises entre 0,11 et 0,30 g/kg, et 16 entre 0,31 et 5,18 g/kg, mais sans que ces valeurs puissent tre relies une quelconque pathologie rnale. Paralllement, cet auteur a analys 55 aliments pour chats (45 humides et 10 secs). Quatorze (7 aliments humides et 7 aliments secs) prsentaient des teneurs comprises entre 0,11 et 2,17 g/kg (seuil de dtection 0,10 g/kg). Il serait intressant de connatre leffet long terme sur les carnivores domestiques des niveaux de contamination les plus levs. Deux tudes exprimentales majeures ont t conduites afin de mesurer limpact dun apport continu per os dOTA sur lorganisme de jeunes chiots (Szczech et al., 1973a, 1973b et 1974 ; Kitchen et al.,

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1977a, 1977b, 1977c). Dans la premire tude portant sur 23 chiots gs de 8 9 semaines et rpartis en lots de 3 animaux, la dose quotidienne de 0,2 0,4 mg/kg p.v. conduit un tableau clinique domin par de lanorexie, des vomissements, du tnesme, une lvation de la temprature corporelle, un syndrome polyurie-polydipsie, puis une dshydratation, de la prostration avec une volution mortelle en moins de 2 semaines (Szczech et al., 1973a). Des apports suprieurs (3 mg/kg p.v.) se sont rvls systmatiquement et rapidement mortels avec un tableau clinique similaire voluant en moins de 4 jours. A lvidence, les jeunes chiots savrent tre une catgorie animale particulirement sensible lOTA. En revanche, la dose de 0,1 mg/kg p.v. a t bien supporte par lensemble des animaux. A linstar des autres espces, chez le chiot, laction toxique de lOTA sexerce sur lpithlium tubulaire rnal comme le montrait dans cet essai, la dtrioration des paramtres urinaires (faible densit urinaire, protinurie et glucosurie) sans altration des paramtres plasmatiques. Lexamen anatomo-pathologique a montr la prsence dune entrite hmorragique (colon, ccum et rectum), dune hypertrophie des nuds lymphatiques qui taient dmateux, hypermiques et localement ncrotiques ainsi que dune ncrose et dune desquamation de lpithlium du tube contourn proximal (Szczech et al., 1973b) associe une altration profonde des membranes basales et du reticulum endoplasmique des cellules de lpithlium tubulaire (Szczech et al., 1974). Dans la seconde tude, ralise ultrieurement par la mme quipe de luniversit Purdue (West Lafayette, Indiana), laction toxique de lOTA per os a t teste sparment ou conjointement ladministration parentrale de citrinine aux doses respectives de 0,1 ou 0,2 mg/kg pc dOTA et 5 ou 10 mg/kg pc de citrinine sur des chiots gs de 10 semaines. Le mme tableau clinique que prcdemment na t retrouv que pour les chiots recevant lassociation dOTA per os et de citrinine en injection intrapritonale. Les associations OTA (0,1 mg/kg p.v.) citrinine (5 mg/kg p.v.) et OTA (0,2 mg/kg p.v.) citrinine (10 mg/kg p.v.) ont entrain la mort de 4 6 chiots en moins de 2 semaines, alors quen labsence de citrinine, aucun signe notable dintoxication navait t observ. Avec lassociation les 6 chiots moururent en 4 ou 15 jours, alors quen labsence de citrinine, aucun signe dintoxication notable navait t observ. La prsence de citrinine potentialise leffet toxique de lOTA et conduit une plus grande svrit des troubles ainsi qu une mortalit plus rapide des chiots, ce qui reflte une vritable synergie toxicologique des deux mycotoxines (Kitchen et al., 1977a). Lexamen anatomo-pathologique a confirm les effets dltres de lOTA : prsence dulcrations digestives, ncrose des tissus lymphodes ainsi que ncrose et desquamation de lpithlium du tube contourn proximal (Kitchen et al., 1977b) associes une altration profonde des cellules de lpithlium tubulaire (Kitchen et al., 1977c). Le tableau ncropsique a galement t amplifi par la prsence de citrinine. A la vue de la grande sensibilit de lespce canine lOTA, il nest donc plus possible dcarter lventuelle responsabilit dune contamination mme faible des aliments utiliss par les chiots en croissance dans la survenue de troubles de la fonction rnale, surtout lors de contamination fongique multiple. Dans la mesure o la dose de 0,1 mg/kg pc semble bien supporte (ce qui quivaut environ 1 mg/kg daliment) et en prenant une marge de scurit de 10, il est possible de fixer 0,1 mg/kg daliment la limite maximale tolrable pour les carnivores domestiques. 6.1.5. Les poissons Aucun cas dochratoxicose spontane chez le poisson na t rapport dans la littrature scientifique. On peut trouver de LOTA dans les crales telles que le bl et le mas qui peuvent tre incorpores dans laliment des poissons, des taux variables selon les espces (type carnivore ou omnivores). Les poissons sont donc potentiellement exposs une ingestion daliments contamins lOTA.

6.2. Calcul de lexposition animale en France La mthodologie gnrale est expose en annexe 2 6.2.1 Donnes de contamination A partir de donnes de diffrentes origines (voir dtails annexe 1), 1088 valeurs de contamination par lOTA ont t recueillies, rparties sur 38 types daliments. Cependant, de nombreuses valeurs sont inutilisables car effectues sur des aliments non dfinis clairement (composition inconnue) tels que aliments complets, complments, ou des aliments dont lintitul nest pas suffisamment prcis :

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fourrages bovins ou dshydrats , autres crales ou encore des analyses sur un mlange de produits : seigle, avoine Pour de nombreux aliments, on dispose de moins de 5 valeurs, voire souvent dune seule analyse, ceux-ci nont pas t intgrs dans le calcul de lexposition. Au total, une fois ces donnes retires, il reste 1042 valeurs de contamination regroupes en 13 types daliments. Tableau 6a : Rpartition des valeurs de contamination en OTA par types de matires premires (n>= 5) :
nombre de donnes 302 31 12 120 22 128 239 7 62 102 6 5 6 1042 % < LOD 50.3 0.0 0.0 0.0 0.0 80.5 55.6 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 37.0 % > LOQ 8.9 3.2 16.7 63.3 72.7 3.9 6.3 14.3 53.2 38.2 0.0 0.0 0.0 20.5

bl corn feed farine basse gluten feed de bl issues de crales mas orge paille de bl remoulage son sorgho tourteaux colza tourteaux soja total

Le pourcentage de valeurs non dtectes est de 37% tandis que 20.5% des valeurs sont suprieures la LOQ. Ces donnes quantifies serviront pour lestimation selon le 2me scnario. Les estimations moyennes de lensemble des donnes et aux p75 et p95 des valeurs positives sont compares aux valeurs rglementaires pour les aliments complets (Recommandation 2006/576/CE). Les statistiques descriptives des niveaux de contamination selon les scnarii indiqus sont fournis en annexes. Ces rsultats sont prsents pour les niveaux de contamination en poids frais (12% dhumidit), tel que dans la recommandation. On constate que les issues de crales sont les aliments les plus contamins. Ces issues ne sont pas employes dans les rgimes utiliss dans ces estimations mais pourraient ltre dans dautres rgimes alimentaires. Comme il existe diffrentes sortes dissues de crales, il ne sagit pas forcment dissues de meunerie.La contamination du remoulage est suprieure celle du son, cette mycotoxine parat plus prsente dans les grains. 6.2.2. Calcul de lexposition Les calculs de contamination des rations sont les suivants (les tableaux dtaills des rsultats sont en annexe II) : Pour les herbivores, ruminants (notamment bovins) Lexposition na pas t calcule ; en effet, les rgimes comportent pour une trs large part des matires premires pour lesquelles les donnes de contamination ne sont pas disponibles ou pas suffisantes : fourrages, pturages ou encore ensilages de mas pour ce qui concerne le rgime retenu (cf annexe II Exposition animale : Mthodologie gnrale ).

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Pour les volailles (Tableau 6b) Tableau 6b : Calculs de contamination en OTA des rations destines aux volailles
Contamination minimale calcule en g/kg d'aliment % de la ration 0.646 93.3 0.634 90.2 0.573 81.6 0.578 84.0 0.596 0.543 0.512 0.553 0.548 0.533 0.528 96.4 96.7 92.4 89.1 89.3 87.5 85.9 88.0 81.8 85.4 86.6 81.5 81.2 91.1 86.3 87.4 92.1 93.2 89.3 95.0 98.0 contamination des positifs Rec 2006/576/CE en g/kg d'aliment Teneurs max au p75 au p95 % de la ration (en g/kg) 0.840 0.841 0.778 0.798 0.791 0.759 0.723 0.757 0.784 0.774 0.741 0.830 0.796 0.824 0.799 0.790 0.782 0.683 0.601 0.572 0.819 0.821 0.793 0.775 0.490 2.126 2.360 2.403 2.572 1.938 2.103 2.041 1.866 2.061 2.031 1.852 1.789 1.970 2.152 2.188 2.394 2.489 1.332 1.306 1.197 2.404 2.620 2.715 2.193 1.274 93.3 90.2 81.6 84.0 96.4 96.7 92.4 89.1 89.3 87.5 85.9 88.0 81.8 85.4 86.6 81.5 81.2 91.1 86.3 87.4 92.1 93.2 89.3 95.0 98.0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100

Poulet standard

dmarrage croissance finition retrait dmarrage croissance finition-retrait dmarrage croissance repro-entretien pondeuse dmarrage croissance 1 croissance 2 finition 1 finition 2 finition 3

Poulet label

Poule pondeuse

Dinde

Pintade

Canard Barbarie

0.672 0.629 0.640 0.605 0.588 0.571 0.525 dmarrage 0.437 croissance 0.409 finition-retrait canard dmarrage 0.599 canard croissance 0.582 0.549 0.557 0.281

canard finition Canard prt levage gaver gavage

La part de la ration (exprime en pourcentage) susceptible dtre contamine par lOTA utilise dans le calcul dexposition varie selon les scenarii : - dans le cas de la contamination minimale calcule, elle correspond aux matires premires pour lesquelles on a des donnes (mme si elles sont ND) - dans le cas des scnarii contamination aux p75 et p95 des teneurs positives, elle correspond aux matires premires pour lesquelles les teneurs sont suprieures la LOD. Lestimation au 95me percentile est 3 5 fois plus importante que lestimation moyenne. Dune manire gnrale, les niveaux de contamination calculs sont trs infrieurs aux teneurs maximales de la rglementation ; la part de la ration susceptible dtre contamine par lOTA utilise dans cette estimation tant relativement importante (minimum 81%). Ces estimations permettent dindiquer un ordre de grandeur, et les niveaux de contamination sont largement infrieurs la rglementation europenne. On observe au minimum un facteur 40 et au maximum un facteur 200 entre la teneur issue de la recommandation et la plus haute teneur calcule.

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Pour les porcs (Tableau 6c) Tableau 6c : Calculs de contamination en OTA des rations destines aux porcins

Porcins

contamination des positifs Rec 2006/576/CE au p75 au p95 Teneurs max en g/kg d'aliment % de la ration en g/kg d'aliment % de la ration (en g/kg) 64.0 87.5 75.8 77.5 70.9 76.0 0.465 0.688 0.569 0.614 0.481 0.596 1.357 2.165 1.711 1.785 1.554 1.733 64.0 87.5 75.8 77.5 70.9 76.0 50 50 50 50 50 50

contamination minimale calcule

1er ge 0.316 2me ge 0.554 croissance CORPEN 0.474 finition CORPEN 0.509 truies gestantes 0.391 truies allaitantes 0.549

Compte-tenu de la nature de lalimentation destine aux porcins, un plus faible pourcentage de la ration est pris en compte ici (minimum 64%). La contamination au p95 est 3 4 fois plus importante que la contamination minimale calcule. Comme pour les volailles, les niveaux de contamination sont largement infrieurs la rglementation europenne. Lordre de grandeur fourni par ces estimations montre que lcart avec la teneur limite de 50 g/kg pour un aliment complet est important (au minimum 100 fois moindre).

7. Rglementation Pour lalimentation humaine, dans le cadre du rglement 1881/2006/CE (abrogeant le rglement 466/2001/CE) portant fixation de teneurs maximales pour certains contaminants dans les denres alimentaires, les teneurs maximales ont t fixes pour lOTA (tableau 7a). Pour lalimentation animale, aucune teneur maximale en OTA n'est encore fixe dans les aliments pour animaux. Cependant, la Commission recommande6 d'appliquer des teneurs maximales en OTA dans les matires premires et aliments destins l'alimentation animale (tableau 7b).

Tableau 7a : Teneurs maximales en ochratoxine A dans les denres alimentaires destines lHomme, exprimes en g/kg Matrice
Grains de crales brutes (y compris le riz brut et le sarrasin) Produits drivs des crales (y compris les produits de crales transforms et les grains de crales destins la consommation directe) Prparation base de crales pour enfants en bas ge et aliments dittiques destins des fins mdiales spciales spcifiquement pour les nourrissons Raisins secs (Corinthe, sultanines et autres raisins secs Grains de caf torrfi et caf torrfi moulu Caf soluble (instantan) Vin (rouge, blanc et ros et autres boissons base de vin et/ou de mot de raisins) Jus de raisin, ingrdients base de jus de raisin dans d'autres boissons, y compris le nectar de raisin et le jus de raisin concentr reconstitu Teneur maximale en g/kg 5 3

0,5 10 5 10 2 2

Recommandation 2006/576/CE de la Commission du 17 aot 2006 concernant la prsence de doxynivalnol, de zaralnone, d'ochratoxine A, des toxines T-2 et HT-2 et de fumonisines dans les produits destins l'alimentation animale.

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Tableau 7b : Teneurs maximales recommandes en ochratoxine A pour les produits destins lalimentation animale, selon la recommandation 2006/576/CE
Matrice Teneur maximale en g/kg (teneur en humidit de 12%)

Matires premires entrant dans la compositions des aliments pour animaux : crales, produits et sous produits de crales et fourrages Aliments complmentaires et complets pour : - les porcs - les volailles

250

50 100

Il convient de diffrencier dans cette recommandation, les teneurs maximales dans les matires premires des teneurs maximales dans laliment complet : des teneurs de 250 g/kg dans les matires premires pour une contamination globale de la ration 2,5 5 fois plus faible.

8. Surveillance et contrle Dans le cadre des plans de surveillance et de contrle des services de lEtat (Direction Gnrale de lAlimentation DGAL- et Direction Gnrale de la Concurrence, de la Consommation et de la Rpression des Fraudes- DGCCRF-), lOTA a t recherche dans de nombreux aliments prts consommer et matires premires importes ou non. Dans les cas de non-conformit, les actions correctives sont entreprises telles qu'interdiction de mise le march, retrait du march, saisie . Bien que les denres prleves au sein des catgories daliments rglementes ou non soient de nature et dorigine variables selon les annes, il peut nanmoins tre dgag les grandes tendances suivantes : Concernant les produits craliers (semoules et farines de bl, de mas, pains, biscottes, biscuits, riz, crales pour petit djeuner, aliments pour bbs) parmi les 80-100 dchantillons analyss annuellement, aucune non conformit na t releve avec des teneurs infrieures la rglementation (voir limites maximales indiques au prcdent). En ce qui concerne les autres catgories daliments rglementes, font lobjet de plans de contrle : les vins et jus de raisin, les raisins secs, et le caf : parmi les 80-100 prlvements effectus annuellement, aucune non conformit nest releve lexception dun chantillon de raisin sec en 2005. Enfin, lors dune enqute mene, la contamination moyenne du vin est de 0,15 g/L. Seulement 1% des 1090 chantillons analyss dpassent la limite rglementaire de 2 g/L, avec une teneur maximale de 6,2 g/L. Certaines catgories de denres bien que non rglementes, font lobjet dune surveillance et dun suivi sur plusieurs annes. Sont concernes : les bires, les pices (piments doux et forts, poivre, muscade), et les figues. Aucune teneur suprieure 0,1 g/kg na t identifie dans les bires (trentaine dchantillons). Par contre, des teneurs suprieures 10 g/kg ont t releves dans certaines pices en 2006 et 2007 (piments doux) et dans les figues en 2005, 2006 et 2007 dans une proportion de 5-10%. . Pour les produits dorigine animale, la teneur moyenne en OTA dans les rognons de porcs est de 0,18 g/kg, avec 90 % des chantillons non quantifiables (LOQ = 0,1 0,5 g/kg). La contamination des crales brutes (mas, bl et orge) est faible : sur 646 chantillons des plans de surveillance raliss entre 2003 et 2006, 95% des chantillons ont une teneur infrieure la limite de quantification (LOQ = 0,5 g/kg), et 0,5% des chantillons dpassent la limite rglementaire (5 g/kg).

9. Conclusion - Recommandations
LOTA est une mycotoxine qui prsente des effets nphrotoxiques dmontrs chez l'animal et suspects chez l'homme. En 2006, la DHT a t revue la hausse 120 ng/kg p.c./sem par l'EFSA. Cette rvaluation se fonde notamment sur la dmonstration de labsence de gnotoxicit directe de lOTA.

76

Des techniques analytiques plus sensibles sont dvelopper de faon affiner les estimations d'exposition du consommateur, pour deux raisons majeures. Dune part, le nombre de donnes de contamination par lOTA des denres alimentaires infrieures la limite de dtection est important et la mthode de calcul conduit vraisemblablement une surestimation de lexposition du fait de la multiplicit des denres susceptibles dtre contamines. Les farines de seigle et de sarrasin apparaissent les plus contamines ; aussi conviendrait-il de renforcer les plans de surveillance et de contrle de lOTA dans ces produits. Les donnes de contamination relies la consommation montrent que les forts consommateurs franais sont exposs 3,5 ng/kg p.c./j (20% de la DJT) pour les adultes et 7,8 ng/kg p.c./j (45% de la DJT) pour les enfants. Cependant, il est souligner que les calculs dexposition ne prennent pas en compte les nourrissons, et de ce fait que des donnes supplmentaires seraient ncessaires afin dvaluer les taux dexposition de cette population de consommateurs avec prise en compte de leurs prfrences alimentaires. Des interrogations subsistent quant l'origine et la signification toxicologique de la prsence dOTA faible concentration dans le sang humain et dans le lait maternel. Des tudes complmentaires associant les donnes dexposition et la prsence de cette toxine dans les liquides biologiques humains, sont ncessaires pour clairer cet aspect afin de mieux estimer le risque pour l'homme.

Rfrences bibliographiques : voir document spcifique

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chapitre 3 Les s trichoth hcnes s


Coordin nation : Dom minique Pare ent Massin et e Bernard Marie M Paragon

Introduc ction Les mo oisissures productrices p de trichoth hcnes so ont du genre Fusarium m et con ntaminent principal lement les crales (bl, mas, orge, sarrasin, seigle, millet, avoine, riz), mais gale ement les fruits (ba ananes). Certaine es conditions de temprature et dhum midit ainsi que q le rappor rt oxygne/di ioxyde de ca arbone de latmosp phre leur sont favorabl les (Betina, 1989) ; elle es sont capa ables de r sister des s climats rigoureux ; leur dve eloppement et la production de tox xines sont mme m fortem ment stimuls s par les pisodes s de refroidis ssement (Cis sti et al., 1983), et neutr raliss par lacidit (par exemple dan ns le cas des ensilages). Les contaminatio ons peuvent t survenir en n cours de culture c ou lor rs des rcolt tes, mais aussi lor rs dun stockage des cr ales en con nditions humi ides, avant schage s des grains. Des con ntaminations s par des Fusarium F on nt t rappo ortes dans toutes les rgions du u monde, principal lement dans les rgions climat tem mpr dAmrique du Nor rd, dEurope et dAsie o tous les pays sem mblent affect ts, aucune rgion ni auc cun type de culture c cra alire ne sem mblant pargns. Les tene eurs les plus levs ret trouves dan ns les cra ales sont de e l'ordre de quelques mg/kg, m les valeurs maximales ayant a t dtects en Ch hine (14 mg/kg de bl). Dans les de enres alime entaires base de crales, les s teneurs sont gnralem ment infrieures au mg/kg g. Pour m moire, des trichothcn nes (T-2, DA AS, roridine A et T-2 tt traol) ont t dtects dans d des poussir res de systm mes de venti ilation au Ca anada (Smoragiewicz et al. a , 1993). Pa ar ailleurs, le eur usage dans les s armes chim miques en Ir ran, Afghanis stan et dans s le Sud-Est asiatique a t suspect t (pluies jaunes ou o "Yellow ra ain"), comme e latteste la prsence p de trichothcn nes dans les urines et de e sang de soldats iraniens i exposs ces pluies. Aucu une confirma ation na cep pendant t apporte (Rosen et Rosen, 1982 ; Heyn ndrickx et Heyndrickx, H 1984 ; Heynd drickx et al. ., 1984 ; Schiefer et Su utherland, 1984).

1. Prop prits phys siques et ch himiques des trichothc cnes rale 1.1 Structure gnr odes qui po Les trich hothcnes (TCT) appart tiennent au groupe g des sesquiterpn s ossdent un squelette tricycliqu ue (appel trichothcane) form par un u cyclopent tane, un cyclohexane, un n cycle six chanons oxygn s et quatre groupements g s mthyles (f figure 1). Tous les trichothcnes na aturels poss dent une double li iaison (ou po ont olefinique e) en C9,10 ainsi quun groupement poxy en C C12,13 caractristique des 12,1 13 poxy-trichothcnes (Ueno et al., 1985 ; Vida al et al., 1985 5).

e molculair re de deux TCT T : Nivalnol (NIV) et DOxyNiva alnol (DON) ) Figure 1 : Structure Ueno (19 977) a propo os une class sification des s trichothc nes en 4 gro oupes :

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Groupe A : constitu par les trichothcnes dpourvus de fonction ctone en C8 ; la toxine T2, la toxine HT-2 et le diactoxyscirpnol (DAS) en font partie Groupe B : constitu par les trichothcnes possdant une fonction ctone en C8 ; le nivalnol, le doxynivalnol (DON) et la fusarnone-X en font partie. Groupe C : constitu par les trichothcnes possdant un poxyde supplmentaire entre C7 et C8 comme la crotocine. Groupe D : constitu par les trichothcnes possdant un macrocycle entre C4 et C15 ; les verrucarines, les roridines et les satratoxines en font partie.

Les trichothcnes des groupes A et B sont les plus frquemment retrouvs dans les denres alimentaires. L'exposition aux TCT des groupes C et D est plus frquente par voies cutane et respiratoire et ne seront donc pas traits dans ce chapitre (le cas des satratoxines sera toutefois abord dans le chapitre 7 autres mycotoxines )

1.2 Proprits communes Les trichothcnes se prsentent en gnral sous la forme de poudres incolores, cristallisables (Ueno, 1980 ; IPCS, 1990). Leur poids molculaire varie de 154 697 daltons, pour la plupart entre 300 et 600 daltons. Ils sont optiquement actifs (lvogyres ou dextrogyres) et nabsorbent pas les radiations ultraviolettes ou visibles, except les trichothcnes macrocycliques qui prsentent des doubles liaisons conjugues et absorbent 260 nm (groupe D) (IPCS, 1990). Le spectre infrarouge est caractris par la prsence de bandes dabsorption : 1 720 cm-1 et 1 259 cm-1, correspondant la vibration de valence des C = O et C O des groupes actyles ; 1 580 cm-1 et 825 cm-1, dues la prsence dune double liaison bi substitue en 9-10 ; 3 400 cm-1 et 3 480 cm-1, dues la prsence des groupements hydroxyles. Les trichothcnes sont des composs neutres d'un point de vue acido-basique. Ils sont gnralement solubles dans les solvants modrment polaires tels que les alcools, les solvants chlors, lactate dthyle ou lther thylique et parfois quelques uns tant lgrement solubles dans leau (Ueno, 1980). Les drivs alcooliques ont une solubilit dans leau suprieure celle des drivs estrifis (nivalnol et diactylnivalnol) et sont difficilement cristalliables (Ueno, 1980). Le noyau trichothcane rsiste un traitement par les alcalis concentrs. Louverture du cycle 12-13 poxyde conduit la formation de drivs totalement inactifs.

1.3 Trichothcnes du groupe A La toxine T-2 (12,13-epoxytrichothec-9-ene-3,4,8,15-tetraol, 4,15-diacetate 8-isovalerate ; formule brute C24 H34 O9) est galement connue sous le nom de fusariotoxine T2, 8-isovalerate, isariotoxine ou mycotoxine T-2 (Figure 1). Le poids molculaire est de 466,50 g/mol. Le point de fusion est de 151152C. Elle est soluble dans les solvants organiques polaires comme lactone, lactonitrile, le chloroforme, lther dithylique, lactate dthyle ou le dichloromthane. Elle est stable, au moins 24 mois, dans lactate dthyle quelles que soient les conditions de stockage, de -18 C + 40 C (Widestrand, 2001). La toxine HT-2 (12,13-epoxytrichothec-9-ene-3,4,8,15-tetraol, 15-acetate 8-isovalerate ; formule brute C22 H32 O8) a un poids molculaire de 424,5 g/mol. Le pic dabsorption en UV est le mme que celui de la toxine T-2 (218 nm). Le cristal est soluble dans les solvants organiques polaires. Elle est galement stable au moins 24 mois dans lthyle actate, quelles que soient les conditions de stockage, de - 18 C + 40 C (Widestrand, 2001). Le diactoxyscirpnol (DAS) (12,13-epoxytrichothec-9-ene-4, 15-diacetoxy-3hydroxyle ; formule brute est C19 H26 O7) est galement connue sous le nom de languidine, trichothec-9-ene (Figure 1).. Le poids molculaire est de 366,41 g/mol. Le diactoxyscirpnol est incolore, cristallisable et soluble dans les solvants polaires. Il est trs peu soluble dans leau. Il est chimiquement stable et rsiste bien la cuisson des aliments (Vidal, 1990).

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1.4.2

Trichothcnes du groupe B

Le doxynivalnol (DON) (trichothec-9-en-8-one,12,13-epoxy-3,7,15-trihydroxy- ; formule brute C15H20O6) est galement connu sous le nom de dehydronivalnol , 4-deoxynivalnol , 12,13-epoxy3,7,15-trihydroxy-9-trichothecen-8-one, Rd toxin, spiro[2,5-methano-1-benzoxepin-10,2oxirane]trichothec-9-en-8-one deriv ou encore vomitoxine (Figure 1). Le poids molculaire est de 296,36 g/mol. Il est cristallisable, le point de fusion est de 151 - 153 C, et le pic dabsorption aux UV est de 218 nm. Le DON est soluble dans lthanol, le mthanol, lactate dthyle, leau et le chloroforme. Il est stable dans lactate dthyle pendant 24 mois -18 C mais se dcompose significativement aprs 24 mois 4 C et aprs 12 mois 25 C. Le nivalnol (trichothec--9-en-8-one, 12, 13-epoxy-3, 4, 7, 15-tetrahydroxy ; formule brute C15 H2 0O7 ; Figure 1). Le poids molculaire est de 312,32 g/mol. Il est cristallisable, le point de fusion est de 222 - 223 C, le pic dabsorption au UV est de 218 nm. Le nivalnol est soluble dans les solvants organiques polaires comme le mthanol, lthanol, lthyle dactate et le chloroforme. Il est en revanche faiblement soluble dans leau. Comme le DON, le nivalnol est stable dans lactate dthyle pendant 24 mois - 18 C, mais se dcompose significativement aprs 24 mois 4 C et aprs 12 mois 25 C (Widestrand, 2001). La fusarnone X (12,13-epoxy-3,4,7,15-tetrahydroxytrichothec-9-en-8-one4-acetate ; La formule brute est C17 H22 O8 ; Figure 1) est aussi connue sous le nom de fusarenon, fusarenon X, nivalnol monoactate, nivalenol 4-O-actate, 3,7,15-trihydroxy-4-acetoxy-8-oxo-12-13-epoxy-9-trichothecene. . Le poids molculaire est de 338 g/mol. La fusarnone X est cristallisable, le point de fusion est de 9192 C. La fusarnone X est soluble dans le mthanol, lactate dthyle, leau et le chloroforme mais insoluble dans le n-hexane et le n-pentane. La fusarnone X est gnralement stable mais peut tre hydrolyse en nivalnol par des bases.

2 Mthodes danalyse (voir principes gnraux en Annexe 1) Bien quil existe des mthodes valides en intra-laboratoire, rares sont les mthodes officielles et/ou normalises et/ou valides en inter laboratoires de dtermination des toxines T-2 et HT-2. Les quelques tudes inter-laboratoires disponibles montrent le besoin damliorations techniques tant en ce qui concerne les taux de rcupration lors de lextraction que la prcision et lexactitude des mesures. La disponibilit de matriaux de rfrence (matrices avec contamination certifie) et la mise en uvre dtudes collaboratives sont aujourdhui prioritaires. Des mthodes valides et reconnues sont disponibles pour le doxynivalnol (DON), en particulier pour les crales et lalimentation du btail Comme la stratgie analytique applicable aux trichothcnes A diffre sensiblement de celle suivie pour les toxines du groupe B, les deux familles ont t traites sparment dans la suite du document. 2.1 Trichothcnes de type A Lextraction de matrices solides telles que les grains ou les aliments est gnralement ralise par des mlanges binaires associant eau et actonitrile (ou mthanol) ou encore le chloroforme et lthanol ou plus simplement le mthanol seul. La purification est conduite sur des cartouches SPE reposant sur le principe de la phase normale en particulier du type silice, florisil, cyano, ou encore en phase inverse (C18). Les colonnes multifonctionnelles, associant plusieurs types de phase sont de plus en plus frquemment utilises. Les immuno-essais sont utilises en routine pour le dpistage de T-2 et HT-2 dans les crales, avec des , comprises entre 0,2 et 50 ng/g pour T-2. Divers types de mthodes danalyse peuvent tre appliques pour analyser les trichothcnes, mais comme les molcules du groupe A ne peuvent tre suivies par HPLC-UV du fait de labsence de groupe ctonique en position C-8, la CPG est gnralement utilise pour cette famille. La drivatisation de ces molcules par silylation ou fluoroacylation apparat ncessaire pour amliorer la sensibilit. La dtection peut tre assure par dtecteur capture dlectrons (ECD) lorsque des halognes ont t pralablement introduits par perfluoroacylation sur la molcule, ou par

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spectromtrie de masse. Dans les crales, les limites de quantification lordre de la dizaine de g.kg-1 pour T-2 et HT-2 pour la CPG-ECD, et de lordre du g/kg pour la CLHP-SDM ..

2.2 Trichothcnes de type B Ltape dextraction des trichothcnes de type B est ralise par technique solide-liquide au moyen de mlanges associant actonitrile et eau, ou chloroforme/mthanol. Lextraction par fluide supercritique (SFE) qui peut tre aussi utilise pour extraire le DON (Krska et al., 2001), est trs efficace sur matrice solide, ; elle permet en outre de combiner en une seule tape, extraction et purification, en couplant en ligne une cartouche de silice greffe ou non, qui retient spcifiquement les analytes cibles. Ltape de purification des trichothcnes de type B seffectue au moyen de colonnes remplissage mixte de type charbon/alumine/clite ou encore de colonnes multifonctionnelles spcifiquement ddies la purification du DON. Les mthodes de sparation bases sur la chromatographie couche mince (CCM) restent encore communment utilises pour le dpistage en particulier dans les pays ne disposant pas de chromatographie en phase gazeuse (CPG) ou de chromatographie liquide haute performance (CLHP) indiscutablement plus performantes. La visualisation du DON en CCMrequiert lutilisation de rvlateurs tels que lacide sulfurique, le para-anisaldhyde ou encore le chlorure daluminium. Les limites de dtection sont comprises entre 20 et 300 g/kg. Les tests ELISA permettent lobtention rapide dun rsultat semi-quantitatif mais pas spcifique puisque donnant une rponse globale caractristique de lensemble des trichothcnes de type B.Ces tests permettent nanmoins la mise en vidence de concentrations infrieures au g/kg sur des extraits dchantillon ayant subit une raction dacylation . Des approches sans drivation pralable ont une moindre sensibilit (20 300 g/kg). La CPG couple un dtecteur capture dlectrons, un spectromtre de masse simple (MS) ou en tandem (MS/MS), est rgulirement utilise sur des analytes prlablement drivatiss, gnralement par trimthylsilylation ou perfluoroacylation. La premire technique implique, outre lusage dun agent de silylation classique, ladjonction dun catalyseur (type trimthylchlorosilane ou trimethylsilylimidazole), qui amliore le rendement de la raction en permettant le greffage de TMS y compris des positions encombres de la structure chimique. Le produit de la raction est alors unique, ce qui constitue un avantage pour la quantification. La fluoroacylation par des anhydrides dacides perfluors (TFAA, PFPA ou HFBA) permet dabaisser considrablement les limites de dtection de la mesure par ECD ou SDM (ionisation chimique ngative). Lapproche par CPG, qui savre suffisamment sensible eu gard aux concentrations gnralement rencontres dans les crales, donne cependant des rponses quantitatives variables pour le DON, le NIV, mais aussi lHT-2 et la T-2. En effet, les rsultats dtudes collaboratives entre 21 laboratoires europens ciblant les quatre principaux trichothcnes selon une mthode officielle AOAC (rfrence 986.18) ont rvl des coefficients de variation inter-laboratoires de lordre de 50 % pour des niveaux de contamination compris entre350 g/kg et 750 g/kg. Les problmes analytiques concernent entre autres les sources de molcules de rfrence (diffrentes selon les laboratoires), la non linarit des courbes de calibration (lie la non adquation des talons internes), la prsence dinterfrences matricielles (causes par une spcificit insuffisante de la mthode de purification). Ces observations plutt dcevantes conduisent les analystes recourir davantage lapproche par CLHP-SDM. Le couplage chromatographie liquide spectromtrie de masse, avec en particulier lintroduction des techniques dionisation pression atmosphrique, simpose progressivement. La sparation des analytes en phase inverse sur phase stationnaire type C18 et phase mobile methanol-eau ou actonitrile-eau apparat parfaitement compatible avec cette approche. Si la SDM nest pas utilise en dtection, une mthode de purification multi-tapes doit tre dveloppe pour compenser la non spcificit de la mesure ; cest le cas notamment des approches UV/DAD ou fluorimtriques. Parli les techniques voques ci-dessus, le couplage GC-MS est le plus sensible pour dtecter le DON dans les crales, si lanalyte est fluoro-acyl (ordre du g/kg).

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3 Facteurs influenant la teneur en trichothcnes dans les denres Les conditions de dveloppement des Fusarium sur des crales et des aliments et de production de mycotoxines sont complexes, et sont encore incompltement comprises dautant que ce ne sont pas toujours les mmes qui agissent sur la croissance des champignons et sur la production de mycotoxines. Selon les souches de Fusarium, le dveloppement fongique est indpendant de la production de fusariotoxines : les unes sont gntiquement incapables de produire des trichothcnes, les autres le sont mais les produisent en fonction des conditions du milieu telles que la temprature ou l'humidit. Parmi les trichothcnes du groupe A : La toxine T-2 a t isole pour la premire fois en 1968 partir de Fusarium tricinctum, puis a t dtecte sur de nombreuses crales (bl, mas, avoine, orge, riz, fves, soja). Elle est produite par de nombreuses espces de Fusarium, en particulier Fusarium sporotrichioides et Fusarium langsethiae (Thrane et al., 2004). La toxine HT-2 est produite par de nombreuses espces de Fusarium, en particulier Fusarium langsethiae, F. tricinctum, F. sporotrichioides, F. poae, F. solani, F. equiseti (Thrane et al.,2004), la plus frquente tant F. sporotrichioides. Cette moisissure se dveloppe entre -2 C et +35 C, dans des milieux haute activit en eau. (trs humides). Le diactoxyscirpnol (DAS) est produit par diffrentes souches appartenant aux espces de Fusarium dont les principales sont F. graminearum et F. roseum (Jimenez, 2000) mais aussi Fusarium langsethiae (Thrane et al., 2004) . Parmi les trichothcnes du groupe B : Le DON est lun des trichothcnes les plus rpandus dans le monde. Il est principalement produit par Fusarium graminearum et par Fusarium culmorum qui se dveloppent principalement dans les pays temprs. La temprature optimale de dveloppement de F. graminearum est lgrement suprieure celle de F. culmorum : 25-27C versus 22-25C (Doohan et al., 2003). Ces moisissures ncessitent des humidits relatives (Aw) leves caractristiques de la phase de production au champ plus que de celle du stockage. La fusarnone X est principalement produite par Fusarium crookwellense et certaines souches de Fusarium graminearum, mais elle peut aussi tre produite par dautres Fusarium (F. solani, F. sporotrichiodes, F. tricinctum) (Ueno et al., 1975). On retrouve peu de fusarnone X en Europe, notamment en France. 3.1 Facteurs lis au dveloppement fongique au champ Le premier facteur de risque de production de fusariotoxines, notamment de DON dans le bl tendre (Triticum aestivum) et les crales, est la pluie au moment de la floraison, voire dans les semaines qui suivent la floraison. La toxine T2 se retrouve principalement sur des crales ayant reues de la pluie et moissonnes en priode froide. D'autres facteurs dits secondaires peuvent influer sur cette production de mycotoxines, modulant l'effet du facteur climatique : parmi les facteurs secondaires modulant leffet de la pluie au moment de la floraison figurent la sensibilit la fusariose de la varit de bl ainsi que la relation entre varits et teneurs en trichothcnes (encore mal connues). La prsence dans le sol de reliquats de la rcolte prcdente contamins (tiges, feuilles, ) et le potentiel de survie des Fusarium peuvent tre l'origine de la contamination des cultures de rotation (Obst et al. 1997). Le risque de fusariose est plus grand pour un bl cultiv aprs un mas que pour un bl succdant bl (Yi et al., 2002). La qualit du "travail du sol" et la profondeur d'enfouissement des reliquats de la culture prcdente influe galement sur la survie des Fusarium dune saison l'autre. La survie est maximale en labsence de travail du sol et rduite en cas de labour et ce dautant plus que lenfouissement est profond (Yi et al. 2002). De plus, la rotation des cultures et travail du sol peuvent interagir comme dmontr par Obst et al. (2000) : la teneur en DON du bl tait plus leve si la culture prcdente tait un mas grain et si aucun labour navait t effectu. Par contre, le risque li la prsence de reliquats contamins de la

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rcolte prcdente ne se retrouve pas avec une rotation de bl sur bl, du fait de la taille des particules de pailles, dpillets et de glumes qui ne favorisent pas la survie fongique. Le traitement phytosanitaire peuvent galement moduler la teneur en DON du bl, notamment ceux base de triazoles et de strobilurines dont les effets protecteurs sont variables voire mme contraires : les triazoles rduisent le dveloppement des Fusarium et font chuter la teneur en DON, alors que les strobilurines rduisent le dveloppement de Microdochium nivale (donnant des symptmes de fusariose, mais sans production de toxines au champ). Au contraire, la strobilurine favoriserait le dveloppement des Fusarium (et donc la production de DON) d'une part, en supprimant leurs comptiteurs (Simpson et al., 2001) et d'autre part, par un effet de stress sur les Fusarium (Magan et al., 2004). Comme la fusariose du champ provoque par Microdochium se distingue visuellement mal dune fusariose provoque par Fusarium, il importe donc de traiter avec un mlange triazolestrobilurine. Ce traitement doit tre appliqu le plus rapidement possible aprs apparition des risques ou des symptmes. Malgr ces prcautions, lefficacit du traitement nest jamais totale (diminuant au mieux de moiti la progression de la fusariose et la teneur en DON) et dautant plus rduite que les autres facteurs de risque subsistent (Nicholson et al., 2004). Enfin, dautres facteurs sont parfois voqus tels que la fertilisation azote (Yi et al., 2002), mais les donns sont contradictoires.. Les facteurs de variation des autres fusariotoxines du bl tendre au champ sont mal connus du fait des teneurs faibles en ces mycotoxines. Les facteurs de variation de la teneur en trichothcnes du mas sont moins bien connus que ceux du bl et semblent plus complexes, probablement parce que le grain de mas sur pied conserve longtemps un taux dhumidit leve (suprieur 20%), favorable au dveloppement des Fusarium et la production de mycotoxines. La date de rcolte est un facteur de risque spcifique au mas par rapport aux crales paille : plus la rcolte est effectue tardivement et plus la teneur en fusariotoxines peut tre leve (Reyneri et Blandino, 2003). Cependant, ces facteurs de variation de la teneur en trichothcnes au champ semblent identiques ceux cits prcdemment pour le bl tendre (pluie la floraison, reliquats de culture prcdente, rsistance varitale). La protection phytosanitaire contre les vrais Fusarium est inefficace et par ailleurs difficile mettre en uvre en raison de la hauteur des tiges. Le mas n'est pas concern par le Microdochium nivale. Pour les autres crales paille cultives en France, les facteurs de risque de production des trichothcnes au champ sembleraient identiques ceux considrs pour le bl. Pour le sorgho, ces facteurs de risque seraient comparables ceux dcrits pour le mas. Mais cela reste au stade de suppositions, faute de donnes suffisantes pour ces deux cas. En conclusion, la connaissance des facteurs influenant le dveloppement des Fusarium et la production de leurs toxines au champ est dterminante dans la lutte prventive contre la contamination des crales. Les diffrents facteurs influenant la teneur en trichothcnes des crales et notamment de crales paille agissent variablement selon quils sont associs ou non avec dautres facteurs dits secondaires et ils doivent donc tre considrs surtout comme des facteurs de risque et non comme des facteurs tiologiques. Ltude de ces facteurs de risque, pris individuellement et en association, a donn lieu la construction de modles probabilistes permettant de prdire limportance de la contamination des crales paille (Barrier-Guillot et al., 2004) et de renseigner sur la hirarchie des facteurs prendre en considration pour matriser la contamination en fusariotoxines.

3.2

Facteurs lis au dveloppement fongique au cours du stockage

Lors du stockage, lhumidit des lots de crales est en gnral trop faible pour conduire au dveloppement des Fusarium et la production de trichothcnes, lexception du mas en cribs, installation propice la persistance dune forte humidit.

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En ce qui concerne le mas et le sorgho qui doivent tre schs, la contamination en fusariotoxines dpend aussi des conditions de pr-stockage, comme par exemple la dure dattente entre la rcolte et le schage.

3.3 Impact des procds technologiques sur la teneur en trichothcnes Le nettoyage des grains par tri-sparation ou sur table densimtrique reprsente le premier procd susceptible de rduire la teneur en trichothcnes, qui devrait tre appliqu par les industries cralires, avant ou aprs le stockage. Cette opration consiste sparer les grains nettoys des "issues de nettoyage" qui contiennent des graines trangres lespce cralire du lot, des petits grains et des grains casss de cette espce, ainsi que des fragments de tige, glumes et glumelles. Sachant qu'un lot de grains contamins par des Fusarium comporte davantage de grains petits, lgers et casss qu'un lot de grains sains, les issues peuvent prsenter des niveaux de contamination leves en fusariotoxines. Pour une teneur en DON de 100 mg/kg dans des grains de bl nettoys, la teneur des grains avant nettoyage varie de 110 120 mg/kg et celle des issues de nettoyage de 361 560 mg/kg (Scott et al. 1983, 1984 ; Young et al. ,1984 ; Seitz et al.,1985) . Une observation similaire a t faite sur le mas (Bennett et al., 1976). Les poussires gnres lors des oprations de travail des grains sont frquemment mlanges aux issues de nettoyage des grains. Ces poussires sont gnralement fortement contamines par les spores des champignons et par les mycotoxines. Pour ce qui concerne les procds de meunerie, des travaux ont t mens sur les diffrentes fractions de bl contamin par le DON. Par rapport une teneur en DON des bls nettoys de 100 mg/kg, les teneurs relatives en DON des sons, des issues (comprenant les remoulages) et des farines sont respectivement de 103 270 mg/kg, de 142 225 mg/kg et de 15 99 mg/kg. Ces plages de variation peuvent sexpliquer par limportance, variable selon les essais, de la contamination par les Fusarium (pntration plus ou moins profonde des champignons qui dgradent les tissus du grain) et le caractre hard ou soft de lendosperme (Scott et al.,1984 ; Young et al.,1984, Seitz et al.,1985). Les procds de semoulerie sont similaires ceux de la meunerie, mais peu de travaux ont tudi la rpartition des fusariotoxines dans les procds de semoulerie utilisant le bl dur. Nowicki et al. (1988) ont observ que la teneur en DON des sons, des issues, de la farine et de la semoule sont respectivement de 151, 137, 111 et 86 % par rapport celle du bl dur propre. Dexter et al. (1997) ont indiqu que la teneur en DON de la semoule est moiti moindre que celle des grains avant traitement. Les trichothcnes sont remarquablement stables temprature ambiante. Ils ne sont pas dtruits lors de la cuisson des aliments, ni dans les conditions de strilisation (environ 15 minutes 118C) (Vidal, 1985). Nanmoins, la cuisson des aliments peut rduire leur teneur en TCT, non pas en raison de la temprature, mais de la solubilit :la cuisson des ptes alimentaires diminue de 50 % la teneur en DON; la quantit rsiduelle du DON retrouv dans l'eau de cuisson doit tre pris en compte dans le cas de soupe avec du vermicelle (Visconti et al., 2004). Lamidonnerie de mas comporte des oprations par voie humide avec une phase de trempage destine solubiliser certains composants, suivie du dgermage du grain par broyage grossier, le reste du grain tant spar en amidon, gluten et drches. Le gluten, les drches et les composs solubles du trempage peuvent tre mlangs pour tre commercialiss en alimentation animale (corn gluten feed). Le travail par voie humide joue de faon significative sur la migration des mycotoxines hydrosolubles, comme lont montr Lauren et Ringrose (1997) et Collins et Rosen (1981) qui relvent des teneurs en DON et en nivalnol dans les concentrs deaux de trempage comprises respectivement entre 270 et 5000 % et entre 200 et 4900 % des teneurs observes initialement dans les grains propres. Dans ces conditions, les teneurs en mycotoxines des fractions non solubles du grain sont plus faibles aprs le trempage, les glutens sont moins contamins et lamidon encore moins.

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En malterie, les mycotoxines hydrosolubles passent en grande partie dans les eaux de trempage comme lont montr Schwarz et al. (1995) pour le DON, Flanningan et al. (1985, cit par Scott, 1996) pour la toxine T2. Lors de la germination, des mycotoxines peuvent tre produites. Ainsi, Schwarz et al. (1995) ainsi que Boivin et al. (2001) ont not une augmentation de la teneur en DON dans le grain germ. Dans les oprations de brasserie, ils observent que le DON du malt passe dans une trs grande proportion dans la bire et accessoirement dans les drches.

4 4.1

Devenir et Proprits toxicologiques Trichothcnes du groupe A

4.1.1 Absorption, distribution et excrtion (groupe A) Aucune donne n'est disponible sur le mtabolisme de la toxine T-2 et la toxine HT-2 chez l'homme. Chez lanimal, la toxine T-2 est rapidement absorbe aprs ingestion dans la plupart des espces et distribue dans l'organisme sans accumulation dans un organe spcifique. Les concentrations plasmatiques maximales sont observes aprs 30 minutes chez les rongeurs. La toxine T-2 est rapidement mtabolise par dactylation, hydroxylation, glucuronoconjugaison et d-poxydation : la principale voie de biotransformation est une dactylation au niveau du carbone 4, qui aboutit la formation de toxine HT-2 (seul mtabolite isol aprs incubation en prsence de microsomes de foie, de rein et de rate de diffrentes espces animales). La raction est catalyse par une carboxyestrase non spcifique, prsente dans le srum et plusieurs tissus, principalement dans le foie. La toxine HT-2 peut tre ensuite deactyle, hydroxyle et conjugue selon diffrentes voies mtaboliques en 3'hydroxy HT62, T-2 triol, 3'hydroxy T-2 triol, 4-deacetylneosolaniol qui est converti en T-2 tetraol et ses conjugus glucuronides. La toxine T-2 peut galement tre directement hydroxyle en 3'hydroxy T-2. Ces mtabolites ont t retrouvs chez plusieurs espces de rongeurs, le porc (Johnsen et al., 1988, Conrady-Lork et al., 1989). Chez les rongeurs, le foie est le principal site de mtabolisation avec une excrtion principalement biliaire (Matsumoto et al, 1978). La toxine T-2 traverse la barrire placentaire chez le rat femelle et se retrouve prfrentiellement dans le thymus et la rate du ftus (Lafarge-Frayssinet et al., 1990). Chez le porc, 4 heures aprs une injection intraveineuse de la toxine T-2 radioactive, 15-24 % de la radioactivit est retrouve dans le tractus gastro-intestinal et 4,7-5,2 % dans les autres tissus, principalement dans les muscles et le foie (Corley et al., 1986). Dans cette espce, 63 % des mtabolites de la T-2 sont retrouvs dans les urines et 77% de ceux retrouvs dans la bile sont sous forme de conjugus d'acide glucuronide (Corley et al., 1985). Chez le singe recevant une administration intraveineuse unique de la toxine T-2 radiomarque, la radioactivit plasmatique slve de 22% aprs 5 minutes, . 25 % aprs 2 heures et 8% aprs 24 heures. Les principaux mtabolites retrouvs jusqu 5 jours aprs l'injection sont le T-2 tetraol et le 3'hydroxy T-2 pour le plasma et le T-2 tetraol, le 3'hydroxy T-2 et le 3'hydroxy HT-2 ceux pour l'urine . Les conjugus n'ont pas t dtermins (Naseem et al., 1995). La toxine T-2 et des mtabolites hydroxyls ont t ont t retrouvs dans le lait de vaches exposes par voie orale 180 mg de T-2 (Yoshizawa et al., 1981).

4.1.2

Toxicit cellulaire (groupe A)

Synthse protique Chez la souris Swiss, une inhibition de la synthse protique a t mise en vidence, sur des cellules de la moelle osseuse, de la rate et du thymus aprs injection intrapritonale de 0,75 mg/kg pc/j de la toxine T-2 pendant 3 7 jours. (Rosenstein et Lafarge-Frayssinet, 1983, Trusal, 1985, Trusal et OBrien, 1986). Ces rsultats ont t confirmes chez le rat au niveau du muscle, du cur, du foie et de la rate, aprs injection intrapritonale de 0,3 ; 0,75, ou 2 mg/kg

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pc de toxine T-2 (Thompson et Wannemacher, 1990). Des observations analogues ont t effectues sur culture de cellules d'hpatomes, de lymphocytes stimuls, de cellules Vero, des hpatocytes de rat Synthse dADN La toxine T-2 inhibe l'incorporation de [3H]thymidine fortement dans des lignes cellulaires de thymus (concentration de 10 ng/ml dans le milieu de culture) et dans des lymphocytes stimuls par la PHA (inhibition totale 8 ng/ml et de 80% 1,5 ng/ml) (Cooray, 1984, Munsch and Muller, 1980). Membranes cellulaires Leffet des trichothcnes sur les membranes cellulaires reste claircir. En 1985, GyongyossyIssa et al. suggrent que les trichothcnes sintercaleraient dans la membrane jusqu atteindre un seuil critique au del duquel une lyse se produit rapidement. Cependant, en 1987, DeLoach et al., concluent que les interactions entre les trichothcnes et la membrane plasmique sont minimales voire inexistantes. Par contre Bunner et Morris (1988) suggrent que les trichothcnes ont de multiples effets indpendants de linhibition de synthse protique, sur les fonctions de la membrane plasmique faible concentration. Apoptose Chez la souris BALB/c femelle, l'injection intrapritonale de 1,75 et 5 mg/kg pc de toxine T-2 induit rapidement l'apoptose (15 minutes aprs injection la plus forte dose) dans le thymus, dans le rein et principalement dans le foie (Islam et al., 1998a ; Sugamata et al., 1998). Dans des cellules HL60 exposes 10 ng toxine T-2/ml, l'apoptose apparat entre 2 et 6 heures (Ueno et al., 1995). L'induction de l'apoptose est inhibe par la cycloheximidine (inhibiteur de la synthse protique) injecte 5 minutes aprs celle de toxine T-2, indiquant que la synthse protique de novo est ncessaire l'apoptose induite par les trichothcnes (Islam et al., 1998b). L'exposition de cellules HL-60 la toxine T-2 inhibe l'expression du gne Bcl-2 (inhibiteur de lapoptose). Linduction de lapoptose par la toxine T-2 est toujours prcde par une augmentation prcoce (quelque minutes) de concentration du calcium intracellulaire aprs linjection de la toxine (Ueno et al., 1995 ;Yoshino et al., 1996 ; Sugamata et al., 1998 ; Okumura et al., 1998). In vitro, la toxine T-2 induit l'apoptose des progniteurs hmatopotiques CD34+ issus de sang de cordon ombilical humain aprs 6 heures d'incubation en prsence de 10-7 M (Ledran et al., 2005),

4.1.3 Toxicit aigu (groupe A) Chez les rongeurs, la DL50 de la toxine T-2 est comprise entre 5 et 10 mg/kg pc. Les nouveaux ns semblent plus sensibles que les animaux plus gs (JECFA, 2002) Les principaux effets relevs dans les tudes exprimentales de toxicit aigu apparaissent pour des doses de toxine T-2 comprises entre 0,06 et 10 mg/kg pc suivant les espces animales et comportent des symptmes non-spcifiques comme la perte de poids, l'inapptence, des dermatites, des vomissements, des diarrhes, des hmorragies ainsi que des lsions ncrotiques de l'pithlium stomacal et intestinal, de la moelle osseuse, de la rate, des testicules et des ovaires. Daprs De Nicola et al. (1978), l'organe cible de la toxicit de la toxine T-2 aprs exposition unique ou rpte est le tissu hmatopotique. (cf section hmatotoxicit/mylotoxicit) 4.1.4 Toxicit subchronique (groupe A) Chez le rat, ladministration par voie orale de 5, 10 et 15 mg/kg pc/j de toxine T-2 pendant 4 semaines entrane des lsions de l'pithlium de l'sophage aux deux plus fortes doses (Ohtsubo et Saito, 1977) De jeunes porcs exposs par voie orale des doses comprises entre 0,04 et 0,64 mg/kg pc (1 16 mg T-2/kg d'aliment) pendant 8 semaines n'ont pas rvl de modifications hmatologiques. Par contre, une diminution du gain de poids a t observe ds la plus faible dose, 0,04 mg/kg pc/j. Les

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animaux refusaient la nourriture contamine avec 16 mg/kg d'aliment de T-2, mais acceptaient celle contamine avec 10-12 mg/kg de T-2 (Weaver et al., 1978). Le porc expos pendant 5 semaines doses comprises entre 0,016 et 0,132 mg/kg pc /j ne prsente pas de modifications des paramtres hmatologiques classiques et aucune diminution de la consommation alimentaire n'est observe (Friend et al., 1992). Dans une tude mene pendant 3 semaines sur des porcs gs de 7 semaines, des modifications hmatologiques et immunologiques ont t rapportes pour des doses de 0,03 et 0,06 mg/kg pc/j (Raifai et al., 1995) (Voir sections Immunotoxicit et Hmatotoxicit/Mylotoxicit). Une tude de toxicit subchronique mene chez le singe (mle, rhsus) exposs pendant 4 5 semaines 0,1 mg/kg pc a permis d'observer une diminution importante du nombre de leucocytes (40 %), de lymphocytes B et T (Jagadeesan et al., 1982).

4.1.5 Gnotoxicit (groupe A) Les donnes des tudes de gnotoxicit sur les trichothcnes apparaissent contradictoires et ne permettent pas de tirer de conclusion dfinitive. Les tests de mutations rverses sur Salmonella typhimurium et Saccharomyces cerevisiae sont ngatifs en absence et en prsence d'activation mtabolique. Les tests de rparation de l'ADN (SOS Chromotest) sur bactrie sur galement ngatifs (Haschek, 1989 ; JECFA, 2001). In vitro, la T-2 (0,05 g T-2/ml ) induit de cassures simple-brin dADN sur des lymphocytes splniques et thymiques de souris et des hpatocytes de souris (Lafarge-Frayssinet et al., 1981). T-2 induit in vitro de trs faibles concentrations (0,001 g/ml 0.5 g/ml) des aberrations chromosomiques sur les cellules V79 (hamster chinois) et sur des lymphocytes humains exposs 0,1 ng T-2/ml (Thust et al., 1983 ; Hsia et al., 1986 ; Zhu et al., 1987 ; Hsia et al., 1986, 1988). Deux tests sur trois d'change de chromatides surs sont positifs (Thust et al. 1983, Zhu et al. 1987, Cooray 1984). Le test du micronucleus in vitro est positif, et un test de synthse non programme d'ADN sur fibroblastes humains est positif (Zhu et al., 1987, Oldham et al., 1980). In vivo, les rsultats sont galement contradictoires. Chez Drosophila melanogaster, le test du micronoyau est positif, alors que les essais de mutation rcessive lie au sexe sont l'un positif, l'autre ngatif (Sorsa et al. 1980). Chez la souris BALB/c, linjection intrapritonale de 3 mg de toxine T-2/kg pc induit des cassures simple-brin d'ADN au niveau de la rate et du thymus (Lafarge-Frayssinet et al., 1981). Des aberrations chromosomiques ont dcrites sur cellules de moelle osseuse de hamster chinois et de souris exposes respectivement 1,7 et 3 mg toxine T-2 /kg pc (Norppa et al., 1980 ; Bilgrami et al., 1995). Cependant, aprs injection intrapritonale de 3 mg de toxine T2/kg pc, aucune induction de cassures simple-brin nest releve dans les cellules de foie de souris, et le test du micronucleus sur moelle osseuse de hamster chinois est ngatif (Norppa et al., 1980 ; LafargeFrayssinet et al., 1981). 4.1.6 Toxicit chronique et Cancrogenicit (groupe A) Des souris exposes par voie orale pendant 12 mois 1,5 et 2,25 mg de toxine T-2/kg pc/j ont prsent des lsions rversibles de l'sophage (hypoplasie, hyperkratose) apparaissant ds la 13me semaine. Chez le rat, les mmes lsions sont observes au del de 0,5 mg/kg pc (Ohtsubo et al., 1977; Ohtsubo et Saito, 1977). Des rats albinos exposs pendant 8 mois 10 mg/kg d'aliment n'ont prsent aucune lsion dans les organes observs (Marasas et al., 1969). Chez la souris, ladministration de 0,23 0,45 mg/kg pc/j de toxine T-2 pendant 16 mois induit une augmentation de l'incidence d'adnomes pulmonaires de l'ordre de 10 % la plus faible dose et de 15 % la plus forte dose, ainsi que des adnomes hpatocellulaire chez les mles la plus forte dose et une augmentation dose dpendante des d'hyperplasie de l'pithlium de l'estomac antrieur dans les 2 sexes aux deux doses testes. Aucune modification des paramtres hmatologiques et immunologiques na t rapporte dans cette tude (Schiefer et al., 1987). Cependant ces donnes sont insuffisantes pour conclure. 4.1.7 Autres effets (groupe A)

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Neurotoxicit Chez le rat expos la toxine T-2 (2-21 mg /kg pc/j) des modifications des taux de neurotransmetteurs (dopamine, srotonine, tryptophane, acide 5-hydroxy-3 indolactique, acide 3,4 dihydroxyphenylactique) toutes les doses testes ont t rapportes par Mac Donald et al., 1988, & Wang et al., 1993). Dans un autre tude, Wang et al., 1993 observent une augmentation du taux de l'acide 5-hydroxy-3 indolacetique aprs administration de 0,1 et 0,4 mg/kg pc/j de T-2. Chez le rat et le poulet, ladministration de 2,5 et 2 mg/kg pc de toxine T-2 respectivement induit une augmentation de la dopamine et une rduction de la noradrnaline chez le poulet uniquement (Chi et al., 1981 ; MacDonald et al., 1988 ; Wang et al., 1993). Aucune modification comportementale na t observe chez des rats Wistar aprs administration de 0,4 mg/kg pc de toxine T-2. Par contre, une diminution du poids corporel aprs 7 jours, des troubles comportementaux et une diminution de l'activit motrice aprs administration de 2 mg/kg pc (Sirkka et al., 1992). Chez le rat Sprague-Dawley, recevant 1 mg/kg pc par voie intrapritonale ou 10 mg/kg de toxine T-2 dans la nourriture, une augmentation de la permabilit de la barrire hmato-encphalique au mannitol a t dcrite (Wang et al., 1998). Reprotoxicit La toxine T-2 inhibe la libration de la progestrone chez le lapin trait la GnRH ainsi que chez la brebis (Fekete et Huszenicza, 1993) chez laquelle elle retarde la maturation folliculaire et lovulation aprs administration de 0,025 mg /kg pc/j pendant 20 jours (Huszenicza et al., 2000). In vitro, la toxine T-2 inhibe la scrtion de testostrone par les cellules interstitielles de gerbille (Fenske et Fink-Gremmels, 1990). Les trichothcnes provoquent la mort ftale partir de 3 mg T-2/kg p.c. administrs po ainsi que des malformations ftales lorsque les souris sont soumises 1 mg T-2/kg pc (Stanford et al., 1975 ; Rousseaux et al., 1986 ; Rousseaux et Schiefer, 1987 ; Tutelian et al., 1991). Le taux de rsorption ftale est respectivement de 100 % et 73 % pour des concentrations gales 4 et 3,5 mg T-2/kg pc chez des souris exposs au neuvime jour de gestation 0.5, 1, 2, 3, 3.5 et 4 mg T-2/kg pc (Rousseaux et al. 1986). Linjection ip de 0,5 mg T-2/kg pc induit des malformations de la queue et des pattes chez la souris (Hood et al., 1978 et 1986). Ladministration de 5, 10 et 15 mg de toxine T-2/kg pc pendant 4 jours diminue le poids corporel et le nombre de ftus vivants et provoque des malformations cphaliques (Khera et al., 1982). Ladministration ip de 0,2 et 0,4 mg de toxine T-2/kg pc induit une diminution du poids du thymus de 39 % et une augmentation du poids du foie. Leffet sur le thymus est transitoire (Lafarge-Frayssinet et al., 1990). Immunotoxicit

Chez la souris, lexposition par voie orale ou systmique T-2 induit une diminution du nombre de splnocytes, de thymocytes, et lymphocytes circulants ainsi quune dpltion des lymphocytes B dans le foie ftal (Friend et al., 1983ab ; Islam et al., 1998ab ; Holladay et al., 1993). La stimulation in vivo des lymphocytes B et T de souris est inhibe de faon rversible (Lafarge-Frayssinet et al., 1979). Des souris exposes par voie orale simultanment Salmonella typhimurium et la T-2 (1 mg/kg p.c.) prsentent une diminution du poids et une mortalit plus leve que les souris exposes seulement S. typhimurium (Tai et Petska, 1988). De mme, lexposition orale T-2 diminue la rsistance linfection mycobactrienne (Kanai et Kondo, 1984). Les effets de T-2 sur la rsistance Listeria monocytogenes ont t tudis sur des souris exposes 4.105 ou 4.104 CFU de L. monocytogenes et traites par une dose unique orale de 4 mg T-2/kg pc : chez les animaux traites par la T-2 et expos aux bactries, une rapide multiplication bactrienne dans la rate, un excs de mortalit et une ncrose des tissus lymphodes du thymus et de la rate ont t relevs. Corrier et Ziprin (1986) ont rapport une augmentation de la rsistance L. monocytogenes lorsque T-2 (2 mg/kg pc) est administre avant linfection bactrienne. Une telle rsistance est frquemment observe lorsque les trichothcnes sont administrs peu avant le dbut de linfection (Bondy et

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Petska, 2000). La capacit prolifrative des lymphocytes de souris exposs aux trichothcnes dpend de la concentration en mycotoxines et en molcules mitognes (Paucod et al., 1990) et elle est inhibe dans le cas de lymphocytes exposs des concentrations en T-2 suprieures 0,75 nM et stimuls par ConA, PWM et PHA. In vitro, la fonctionnalit des macrophages alvolaires de rat est perturbe par la T-2 (10-7 M), se traduisant par une diminution de la phagocytose (Gerberick et al., 1984 ; Sorenson et al., 1986). Sur les modles cellulaires humains, la T-2 inhibe la production dimmunoglobulines IgA, IgG, IgM (Thuvander et al., 1999). Lexposition de monocytes humains 10-8 M de T-2 inhibe leur diffrenciation en macrophages, se traduisant par une inhibition de la phagocytose, de lendocytose, de la production de radicaux oxygns, de lexpression phnotypique du CD71 et de la scrtion du TNF- (Hymery et al., 2007). Lincorporation de 1 2 nM de T-2 dans le milieu de culture de lymphocytes induit une modification des proportions cellulaires et notamment, lexpression des marqueurs CD69, CD25 et CD71 sur les cellules CD4+ et CD8+ (Johannisson et al., 1999), Dautres tudes ont montr linhibition de la prolifration des lymphocytes humains par la T-2 (Tomar et al., 1988 ; Charoenpornsook et al., 1998 ; Thuvander et al., 1999 ; Johanisson et al., 1999) et leffet immunosuppresseur de diffrents trichothcnes notamment la T-2 et le NIV sur les lymphocytes priphriques humains, ainsi quune diminution de lactivit des cellules NK (natural killer) (Berek et al., 2001 ; Meky et al., 2001 ; Froquet et al., 2003). L'ajout de 1,6 ng T-2/ml au milieu de culture inhibe la prolifration stimule par ConA et celle de 2,4 ng T-2/ml inhibe la prolifration stimule par la phytohemaglutinine (Tomar et al., 1988). In vitro, la prsence de 10-8 M de T-2 inhibe la maturation des cellules dendritiques humaines alors incapables de prsenter lantigne, de costimuler les lymphocytes, dinduire la prolifration lymphocytaire et de scrter les interleukines 12 et 10. Cependant, les cellules dendritiques gardent leur capacit de migration et leur pouvoir dendocytose (Hymery et al., 2006ab). Hmatotoxicit

Ligne des globules blancs Des diminutions du nombre de globules blancs (leucopnie) apparaissent aprs exposition aux trichothcnes chez le chat, la souris, le cochon dinde, le rat, le lapin, le mouton et le porc (Sato et al., 1975 ; Sato et al., 1978 ; DeNicola et al., 1978 ; Fromentin et al., 1980 ; Friend et al., 1983c ; Yarom et al., 1984a ; Lorenzana et al., 1985, Bergers et al., 1987 ; Niyo et al., 1988 ; Suphiphat et al., 1989 ; Rotter et al., 1994, ). Les intoxications aux trichothcnes se traduisent de diffrentes manires si on considre la ligne des globules blancs. Dans les premires 24 heures aprs administration dune dose unique, une leucocytose (augmentation du nombre de globules blancs) est observe suivie dun retour la normale pour une dose moyenne ou dune leucopnie pour une dose plus forte (Ueno et al., 1985). Lors dadministrations rptes, une leucopnie est observe (Otokawa et al., 1983 ; Ueno et al., 1983 ; Ryu et al., 1988 ; Suphiphat et al., 1989). Chez la souris, linjection unique de toxine T-2, induit une leucocytose alors que les injections quotidiennes de 3 mg de toxine T-2/kg pc pendant 3 jours provoquent une leucopnie (Sato et al., 1978). Chez la souris CD-1 mle, linjection intra-pritonale de 15 mg/kg pc de DAS induit une leucocytose aprs 6 heures, due essentiellement une lymphocytose et une augmentation transitoire du nombre de neutrophiles, elle mme suivie dune leucopnie (Conner et al., 1986). Chez la souris, linjection intrapritonale rpte (1 8) de 1,56 mg/kg pc entrane une rapide lymphopnie dose dpendante et une granulocytose pour les 2 concentrations les plus leves, suivie dune granulocytopnie retarde 48 heures. Un retour la normale est observ 4 7 jours aprs injection (Bergers et al., 1987). Chez le rat, une dose initiale de 0,31 mg de toxine T-2/kg pc entrane une faible leucopnie et une forte granulocytose 24 heures. In vitro, lincubation de globules blancs humains en prsence. de 100 et 300 g de toxine T-2/106 cellules, provoque des modifications morphologiques des granulocytes alors que les lymphocytes et les monocytes ne sont pas affects (Yarom et al., 1984a).

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Ligne des globules rouges La ligne des globules rouges (rythrocytes) est galement atteinte lors dintoxications par les trichothcnes. In vivo, des anmies, une diminution de la concentration en hmoglobine et une chute de lhmatocrite ont t dcrites chez le rat, le chat, la souris, le poulet et le cochons dinde (Sato et al., 1975 ; DeNicola et al., 1978 ; Lutsky et al., 1978, 1981ab ; Hayes et al., 1980, 1990 ; Rukmini et al., 1980 ; Gentry et al., 1981 ; Cosgriff et al., 1984 ; Conner et al., 1986 ; Ryu et al., 1987 ; Suphiphat et al., 1989 ; Harvey et al., 1991). Chez des rats Wistar recevant 1 mg de DAS/kg pc par gavage, les rythrocytes, lhmatocrite et le taux dhmoglobine sont les paramtres les plus affects. En labsence de modifications du volume globulaire moyen et la concentration corpusculaire en hmoglobine cellulaire, ces effets ont t attribus par les auteurs une atteinte de la moelle osseuse et une hmolyse conjointe (Janse van Rensburg et al., 1987). Chez le chat, ladministration orale chronique de 0.08 mg/kg pc de toxine T-2 induit une anmie avec une chute de lhmatocrite de 30 %, du taux dhmoglobine (Lutsky et al., 1981) et la prsence drythrocytes nucls dans le sang signant la rgnration mdullaire avec libration dlments immatures (Conner et al., 1986). Ce dernier phnomne est galement observ chez le porc aprs administration de toxine T-2 et la souris aprs administration de DAS (Lutsky et al., 1978 et 1981 ; Lorenzana et al., 1985 ; Conner et al., 1986). Chez le rat, ladministration de toxine T-2 entrane une augmentation progressive de lexcrtion de porphyrines (coproporphyrine) au dcours du traitement (Schoental et al., 1979). In vitro leffet hmolytique la toxine T-2 observ sur les rythrocytes de rat pour des concentrations leves (0,43 M et 0,536 M), et non aux faibles concentrations (0,28 M), serait tributaire soit de la pntration du toxique dans la bicouche phospholipidique, soit dune interaction du toxique avec une cible membranaire, ou dune peroxydation lipidique induite par la libration de radicaux libres (Rizzo et al., 1992). In vitro, la toxine T-2 entrane la lyse des globules rouges pour des concentrations de 200 g/5.107 rythrocytes (Gyongyossy-Issa et al., 1985). La proximit des doses lytiques et non lytiques conduit lauteur suggrer que la toxine T-2 agirait suivant le mme mcanisme daction que les antibiotiques polynes qui sintercalent dans la membrane cellulaire jusqu un seuil critique, au-del duquel la lyse cellulaire se produirait rapidement. Cette notion de seuil critique sera reprise par Rizzo et al. en 1992. Dans cette mme tude, lauteur value la taille des lsions induites par la toxine T-2 sur les rythrocytes de cochon dinde 5,5 . Pendant la phase dattente prcdant lhmolyse, les rythrocytes subissent des dformations morphologiques aboutissant la formation dchinocytes , modification indpendante de la concentration en Ca++, Mg++ et ATP, lauteur conclut que la toxine T-2 agit prfrentiellement sur la bicouche phospholipidique (Gyongyossy-Issa et al., 1985b, 1986 ; DeLoach et al., 1987). La forte inhibition de lincorporation de 59 Fe dans les rythrocytes de souris par la toxine T-2 apparat lie linhibition de la synthse dhmoglobine au stade rticulocytaire et lactivit cytotoxique sur les progniteurs rythrodes (Faifer et al., 1991). Il est important de noter que les tudes menes chez 12 espces animales ainsi que chez lhomme montrent que leffet hmolytique est tributaire de la prsence de phosphatidylcholine dans la membrane cellulaire : seuls les animaux monogastriques (porc, cochon dinde, lapin, rat, souris, chien, cheval et Homme) possdant de la phosphatidylcholine membranaire prsentent une hmolyse (3 10-4 et 1,5 10-4 M T2) ; par contre, les rythrocytes de 5 espces de ruminants (vache, mouton, buffle, chvre et chevreuil) ne possdant pas de phosphatidylcholine membranaire ne sont pas lyss par la toxine T-2 (DeLoach et al., 1987 et 1989). Ligne plaquettaire : Lapparition dhmorragies constitue un des symptmes caractristiques des intoxications aux trichothcnes. Chez la souris gravide, ladministration orale de 3 mg de la toxine T-2/kg pc. provoque la mort de 17 % des animaux par hmorragie massive vaginale prenant son origine au niveau des points dattache des enveloppes ftales (Rousseaux et al., 1984). Chez le singe, ladministration de 1 mg/kg pc/jour de la toxine T-2 est suivie de lapparition de ptchies au niveau de la face (Rukmini et al., 1980). Des thrombocytopnies ont t rapportes chez plusieurs espces animales (Sato et al., 1975 et 1978 ; Lutsky et al., 1978 et 1981 ; Rukmini et al., 1980 ; Cosgriff et al., 1984 ; Suphiphat et

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al., 1989). Chez le porc, ladministration intraveineuse de 17,59 et 14,05 mg de DAS provoque des hmorragies au niveau des muqueuses du tractus digestif (jjunum, ilon, colon et caecum). Outre les dficits en plaquettes, les trichothcnes inhibent lagrgation plaquettaire chez les bovins, chez les ovins et chez l'Homme (Chan et al., 1984 ; Gentry et al., 1987ab ; Yarom et al., 1984b). Ce phnomne, qui apparat dpendant de la dose, saccompagne dune diminution du relargage de thromboxane B2 par les plaquettes chez les bovins (Chan et al., 1984 ; Bondy et al., 1988 et 1989). Les agrgats plaquettaires stimuls par lADP sont moins stables en prsence de la toxine T-2 (Chan et al., 1984 ; Bondy et al., 1988). Cependant, in vitro, les plaquettes humaines et bovines ne subissent pas de modifications morphologiques lorsquelles sont exposes la toxine T-2 (Yarom et al., 1984b ; Bondy et al., 1989), mais une modification de la permabilit des membranes plaquettaires humaines est observe en prsence de 500 g T-2/109 plaquettes (Yarom et al., 1984b). Chez le cochon dInde, ladministration parentrale de la toxine T-2 (1mg/kg pc) des inhibe partiellement lagrgation plaquettaire stimule par lADP et dans une moindre mesure celle stimule par le collagne. Lagrgation plaquettaire effectue sur PRP (Plasma Riche en Plaquettes) nest pas affecte par la toxine T-2 (Cosgriff et al., 1984). Dans cette tude, 1g de toxine T-2/ml ninhibe pas in vitro lagrgation plaquettaire que ce soit en prsence de sang total ou de PRP. Ces mmes auteurs suggrent que le mcanisme dinhibition de lagrgation plaquettaire serait li linhibition de la synthse du thromboxane B2, alors que dautres autres considrent quil sagit dun mcanisme secondaire (Yarom et al., 1984b ; Gentry et al., 1987). La toxine T-2 provoque des modifications dans la composition phospholipidique de la bicouche membranaire des plaquettes bovines exposes 2 mM ou 0,68 g/106 (Bondy et al., 1988, 1989 ; Grandoni et al., 1992). La toxine T-2 inhiberait la fonction plaquettaire bovine selon un mcanisme biochimique diffrent de ceux impliquant linhibition des cyclooxygnases, linhibition des canaux calcium et/ou un modulateur AMPc (Bondy et al.,1988). Ladministration de toxine T-2 (1 mg/kg p.c.) au cochon dInde et au porc allonge les temps de prothrombine (PT) et de thromboplastine (APTT) ce qui reflte une diminution de la concentration en facteurs de coagulation. Paralllement, le temps de thrombine (TT) augmente pour atteindre son maximum 24 heures, ce qui indique une concentration maximale en fibrinogne 24 heures aprs administration (Cosgriff et al., 1984 et 1986 ; Gentry, 1982). La toxine T-2 modifie la concentration plasmatique des facteurs de coagulation (Doerr et al., 1981; Gentry 1982 et Gentry et Cooper 1983; Cosgriff et al., 1984 et 1986) qui subissent une diminution maximale 24 heures aprs injection im de 0.65 mg/kg pc chez le singe et de 1 mg/kg pc chez le cochon dInde (Cosgriff et al., 1984 et 1986 ). La concentration en fibrinogne dcline paralllement aux autres facteurs chez le singe mais nest pas affecte chez le cochon dInde (Cosgriff et al., 1984, 1986). Gentry et al., en 1982 et 1983, mettent en vidence une diminution de la concentration plasmatique des facteurs de coagulation VII, IX, X, XI chez le lapin et le veau exposs respectivement 0,5 mg de toxine T-2/kg pc et 0,25 mg de toxine T2/kg pc. On peut noter galement que le facteur VIII est diminu de 40 % chez le lapin expos 0,5 mg/kg pc alors quil reste normal chez le veau intoxiqu par 0,25 mg de T2/kg pc (Gentry, 1982 ; Gentry et Cooper, 1983). La dpression des facteurs de coagulation est corrle ngativement la concentration en toxine. Cosgriff et al. (1986) expliquent les dpltions en facteurs de coagulation par linhibition de la synthse protique due la toxine T-2. Compte tenu des dures de vie des facteurs de coagulation variant de quelques heures 2 ou 3 jours, Gentry et al. (1987ab) semblent rfuter cette ide du fait de lapparition du "nadir" pour chaque facteur 24 heures aprs administration Alors que le facteur VII significativement diminu ds 4 g/mg, il faut atteindre 16 g/kg pour observer une dpltion significative du facteur X chez le jeune poulet; le facteur V ne prsente quant lui aucune modification (Doerr et al., 1981). La toxine T-2 provoque une coagulopathie chez le poulet expos 16 g/kg, caractrise par une diminution de lactivit du facteur VII puis par une dficience de la prothrombine et du fibrinogne (Doerr et al., 1981). Dans toutes les tudes ci dessus, la vitamine K na aucun effet protecteur contre les coagulopathies provoques. Ladministration dune dose subltale (3 mg/kg pc) de la toxine T-2 des souris QRF femelles provoque une diminution de la concentration en prekallikreine et de prothrombine 1 4 heures aprs administration. Le nadir est atteint aprs 24 heures. La scrtion du fibrinogne et du facteur XIII par les mgacaryocytes pourrait participer lexplication des dsordres observs par lyse des mgacaryocytes aprs injection (Johnsen et al., 1988). Lors des chocs hmorragiques provoqu par 17,59 mg DAS chez le porc, de multiples thrombus de fibrine apparaissent au niveau des ganglions lymphatiques (Weaver et al., 1978).

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h Mylotoxicit Le terme mylotoxicit dsigne les troubles induits sur la formation des cellules sanguines lors de l'hmatopoise qui se droule dans la moelle osseuse. Les atteintes de la moelle osseuse par les trichothcnes ont t rapportes chez le mouton, la souris, le poulet et le cochon dInde (De Nicola et al., 1978 ; Hoerr et al., 1982 ; Friend et al., 1983c ; Smith et al., 1994b). Elles sont caractrises par des hypoplasies rsultant de la ncrose des cellules mdullaires. Ladministration intra-pritonale de 10 mg DAS/kg p.c./j des souris provoque une chute de la concentration de tous les types cellulaires de la moelle osseuse aprs 1 7 jours dexposition ainsi quune leucopnie et une thrombopnie (Suphiphat et al., 1989). Lhypoplasie induite par les trichothcnes est transitoire et le temps de rgnration est variable. La capacit rgnratrice de la moelle osseuse et de la rate a t tudie chez la de souris en mesurant lincorporation de 59 Fe aprs induction dune hypoplasie svre par administration sous cutane de 2 mg de toxine T-2/kg pc. La rgnration de lactivit rythropotique est plus rapide dans la rate (4872 heures) que dans la moelle osseuse (21 jours) ; de plus, chez les souris splnectomises, la rgnration intervient en 48 heures ce qui tmoigne de la rversibilit des dommages de la moelle osseuse, tant au niveau des cellules hmatopotiques que des cellules stromales (Velazco et al., 1996). La dure de rgnration de lactivit rythropotique de la souris est allonge par un rgime alimentaire pauvre en protines (Hayes et Schiefer , 1980, 1990), mais raccourcie par ladministration de rhG-CSF qui acclre la rgnration de la moelle osseuse murine et peut prvenir les hypoplasies induites par les trichothcnes et (Othani et al., 1993). Le retour la normale peut saccompagner dune hyperplasie mdullaire (Hayes et al., 1980, 1990). Des souris exposes 20 mg de toxine T-2 /kg p.c./j pendant 28 jours prsentent une hypoplasie mdullaire pendant les 3 premires semaines. Au bout du quatorzime jour, la population rythrode est presque inexistante alors que les populations mylodes et thrombocytiques ne sont que modrment rduites. La granulopose et la thrombocytopose reprennent avant lrythropose. Au 21me jour, la mylopose neutrophile induit une hyperplasie mdullaire (Hayes et al., 1980). Les trichothcnes peuvent galement provoquer des perturbations dans la distribution des diffrents phnotypes cellulaires. Ainsi, malgr une concentration stable en CD44+ dans la moelle osseuse, Holladay et al., (1995) observent une diminution du nombre de CD44lo (prolymphodes) et une augmentation des CD44hi (granulocytes/macrophages) aprs exposition des souris 1,75 mg T-2/kg pc pendant 5 jours. La chute du nombre de CD45R+ permet lauteur de conclure que les progniteurs lymphodes sont hautement sensibles aux trichothcnes. Linjection de 0,3 mg T-2/kg p.c./j des souris mles provoque la chute du nombre de CFU-GM dans la moelle osseuse, rversible en 72 heures. Cet effet saccompagne dans certains cas dhyperplasie tendant indiquer lexistence dun mcanisme de compensation dans le systme hmatopotique (Faifer et al., 1992). Chez des souris males CD-1 recevant 0,1, 0,5 et 2,5 mg/kg p.c. de T-2 pendant 14 jours tous les deux jours, la croissance des colonies de granulocytes 0,5 mg T-2/kg pc et des colonies de monocytes 0,1 et 2,5 mg/kg pc est stimule. En revanche, la formation de colonies granulo-monocytaires est inhibe 0,5 et 2,5 mg T-2/kg pc (Dugyala et al., 1994). Chez le cochon dInde, aprs administration de 0,9 mg T-2/kg pc/jour pendant 27 jours, le retour une cellularit mdullaire normale saccompagne dune hyperplasie apparemment lie une hyperplasie rythrode (DeNicola et al., 1978). Chez le mouton, ladministration de 0,6 mg de toxine T-2/kg pc/jour pendant 21 jours entrane la suppression de lrythropose ds le 12me jour, les cellules de la ligne mylode sont majoritaires et celles de la ligne mgacaryocytaire sont toujours prsentes (Friend et al., 1983c). Les cellules de la moelle osseuse de souris sont plus rsistantes la toxine T-2 (400 g/107 cellules) que les splnocytes, les thymocytes et les cellules pritonales (DiNinno et al., 1985). Les auteurs concluent la capacit des cellules lymphodes de la moelle recoloniser les organes lymphodes et la lente adaptation des cellules hmatopotiques la toxine T-2. La prolifration des progniteurs granulo-monocytaires de souris exposes des concentrations croissantes de toxine T-2 a t tudie par Dugyala et al. (1994). Linhibition de la prolifration des progniteurs est dosedpendante. Ds 1 nM, une inhibition de la prolifration est observe si on considre les colonies de

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granulocytes et les colonies mixtes de granulocytes/monocytes. Aucune prolifration nest note pour les trois types de colonies (granulocytes, monocytes et granulocytes/monocytes) pour 6 et 10 nM de T-2. Lauteur conclut que la toxine T-2 serait plus toxique in vitro quin vivo. Elle affecterait la capacit des cellules souches pluripotentes se diffrencier en CFU-GM in vivo. Elle affecterait galement la capacit former des colonies in vitro. L'tude de leffet des toxines T-2, HT-2, et DAS sur la prolifration et la diffrenciation des progniteurs hmatopotiques humains et murins a montr que les progniteurs hmatopotiques sont extrmement sensibles aux trichothcnes (Parent-Massin et al., 1994, 1995 ; Lautraite et al., 1995, 1996, 1997a,b ; Rio et al., 1997, Froquet et al., 2001). Les sensibilits des CFU-GM et des BFU-E sont les mmes chez lHomme. Les concentrations non cytotoxiques sont toutes infrieures 5.10-8 M. Dans tous les cas la toxine T-2 est la plus mylotoxique des trichothcnes.

4.2

Trichothcnes du groupe B

4.2.1 Absorption, distribution et excrtion (groupe B) La d-poxydation de DON en DOM-1 est observe chez le rat, le porc, le poulet et les bovins (Worrel et al., 1989 ; He et al., 1992 ; Kollarczik et al., 1994). Chez le mouton, DON se retrouve sous forme DOM-1 et de glucurono-conjugu, la biodisponibilit de DON est faible, de lordre de 7,5%., (Prelusky et al., 1984, 1985). Chez le porc, une biodisponibilit systmique de 54,9 % a t mesure (Prelusky et al., 1988). Chez le porc, aprs linjection de 1 mg DON/kg pc, les concentrations les plus leves sont releves dans le plasma, les reins et le foie, slevant respectivement 551, 931, 439 ng DON/g de tissu, trois heures aprs injection (Prelusky et Trenholm, 1991). La demi-vie de DON est estime 100-125 minutes chez le mouton et 3,9 heures chez le porc (Prelusky et al., 1985 ; Prelusky et Trenholm, 1991). Les trichothcnes sont excrts par les urines, les excrments (Lake et al., 1987) et la bile (Chi et al., 1978a), de faon relativement rapide (DON et DOM-1 sont limins en 30 heures chez le mouton). Les trichothcnes se retrouvent dans les ufs en trs faible quantit, de lordre de 0,1 % de la dose administre (Chi et al., 1978b, Prelusky et al., 1987a). Une exposition prolonge ninduit pas daccumulation de DON dans les ufs (Prelusky et al., 1989). Une contamination du lait maternel par des trichothcnes a t rapporte (Robison et al., 1979 ; Yoshizawa et al., 1981). Le mtabolite DOM-1 est galement dtect dans le lait (Prelusky et al., 1987b). 4.2.2 Toxicit cellulaire (groupe B)

Synthse protique Les trichothcnes sont des inhibiteurs de la synthse protique. Le DON inhibe llongation de la chane protique (Ehrlich et Daigle, 1987 ; Betina, 1989) et exerce une toxicit in vivo suprieure celle attendue daprs les exprimentations in vitro, du fait de sa lipophilie (Sato et Ueno, 1977 ; Thompson et Wannemacher, 1986). Apoptose La roridine A, le DON et le NIV sont capables dinduire lapoptose Ueno et al (1995). Les mtabolites de 3AcDON 7,4.10-7M et 15AcDON 6.10-7M induisent lapoptose des cellules CD34+ aprs 15h dincubation par la voie des caspases (Josse et al., 2006).

4.2.3 Toxicit aigu (groupe B) La DL50 par voie orale de DON est gale 78 mg/kg pc chez la souris B6C3F1 et 46 mg/kg pc chez la souris DDY. Les effets toxiques observs dans les tudes de toxicit aigu et subaigu chez l'animal sont des vomissements, refus de s'alimenter, perte de poids et diarrhes. Aprs intoxication aigu une ncrose

93

tissulaire est observe au niveau du tractus intestinal, de la moelle osseuse et des tissus lymphodes. La dose mtique par voie orale la plus basse chez le porc qui semble tre l'espce la plus sensible DON est comprise entre 0,05 et 0,2 mg/kg pc. La consommation alimentaire est rduite chez cette mme espce ds 1 2 mg/kg p.c..

4.2.4 Toxicit subchronique (groupe B) Chez la souris sept tudes de toxicit subaigu et subchronique (7 jours 56 jours d'exposition) mettent en vidence une rduction de la consommation alimentaire, une diminution du gain de poids et des modifications de paramtres sanguins, notamment le taux d'immunoglobulines sriques, jusqu' des doses infrieures 0,7 mg/kg pc/j. Chez le rat, trois tudes publies (2 sur 90 jours et 1 sur 60 jours) montrent essentiellement une diminution du poids corporel pour des doses gales ou suprieures 0,5 mg/kg pc /j. Les plus petites doses sans effet (NOAEL) ont t identifies lors de deux tudes chez le jeune porc recevant une nourriture naturellement contamine par le DON pendant environ 3 semaines ; elles sont comprises entre 0,04 et 0,06 mg/kg pc/j. Aux plus fortes doses (de 0,08 0,16 mg/kg pc/j) il a t observ une rduction du gain de poids, une augmentation du poids du foie, une diminution de la concentration des protines sriques et de l'albumine ainsi qu'une diminution temporaire du taux de calcium et de phosphore srique.

4.2.5 Gnotoxicit (groupe B) Diffrents tests mens sur le seul DON sont dcrits dans la littrature. Des rsultats assez contradictoires sont observs qui ne permettent pas de statuer sur ce caractre pour le DON (Voir tableau 1).

94

Tableau 1 : Tests de gnotoxicit raliss sur le DON :


Tests in vitro Mutation Reverse S. typhimurium TA98, a TA100, TA1535, TA1537 0.4400 mg/plaque Ngatif Wehner et al. (1978); Kuczuk et al. (1978) Concentration Resultats Reference

Mutation Reverse

S. typhimurium TA98, a TA100

0.7500 mg/plaque

Ngatif

Knasmuller et al. (1997)

Aberration Chromosomique

E. coli PQ37

5500 mg/essai

Ngatif

Knasmuller et al. (1997)

Mutation Genique

Cellules V79 de hamster

13 mg/mL

Ngatif

Rogers & HerouxMetcalf (1983)

Synthse non programme d'ADN

Culture primaire d'hpatocyte de rat

0.11000 mg/mL

Ngatif

Bradlaw et al. (1985)

DNA repair

E. coli K12 (2 espces)

0.7500 mg/mL

Ngatif

Knasmuller et al. (1997) Hsia et al. (1988)

Aberration Chromosomique

Cellules V79 de hamster

1 mg/mL

Positif

Aberration Chromosomique Micronucleus In vivo Aberration Chromosomique

Culture primaire d'hpatocyte de rat

0.001100 mg/ml Max at 1 mg/ml

Positif Ngatif

Knasmuller et al. (1997)

Cellules de moelle osseuse de souris

3 mg/kg pc 2 x/semaine par gavage pendant 8 semaines 0.06 mg/kg pc/ dans l'alimentation

Positif

Bilgrami et al. (1993)

Ngatif

avec et sans S9 ; avec et sans activation via des hpatocytes

4.2.6

Cancrognicit (groupe B)

Dans une tude de toxicit chronique (2 ans) chez la souris B6C3F1, les doses administres par voie orale sont gales : 0, 0.1, 0.5 et 1.1 mg/kg pc/j chez le mle et 0, 0.1, 0.7 or 1.5 mg/kg pc./j chez les femelles. Une diminution significative du gain de poids est observe partir d'une dose journalire de 0,7 mg/kg pc. Aucune modification des paramtres hmatologiques et biochimiques nest releve en dehors dune augmentation des IgA et des IgG (< 10 %) sriques chez les femelles recevant les doses les plus leves ; une augmentation du poids du foie et des testicules et une diminution du poids de la rate est observe chez les mles. Aucun excs daffections noplasique ou

95

prnoplasique n'est rapport. La dose sans effet indsirable (NOAEL) est gale 0,1 mg/kg pc/j (Verson et al, 1995). Aucune tude de cancrogense ou de toxicit long terme chez d'autres espces nest disponible. 4.2.7 Autres effets (groupe B)

Neurotoxicit Chez les rats Sprague-Dawley, le DON administr une fois raison de 2,5 mg/kg pc provoque une augmentation de la concentration de serotonine (+ 102180%) et du 5-hydroxyindole-3-acide acetique (+ 2779%) dans toutes les rgions du cerveau de rats(Fitzpatrick et al., 1988a, b). Daprs Prelusky et al., (1992), les effets neurochimiques induits lors d'intoxication aigu DON pourraient tre lis des vnements priphriques tels que les vomissements. Bien quayant une faible affinit pour le rcepteur la srotonine (Prelusky et al., 1996), le DON augmente lactivit srotoninergique crbrale (Prelusky et al., 1993). Selon le mme auteur, la rduction de la prise alimentaire des souris exposes DON serait lie un mcanisme srotoninergique (Prelusky et al., 1997). Toxicit sur la reproduction Une tude multignration chez la souris exposes 0, 0,38, 0,75, or 1,5 mg/kg pc/j de DON n'a pas rvl d'effets toxiques sur la fertilit mle et femelle, la gestation, ni de malformation majeure dans la descendance (Khera et al., 1984). Deux tudes de reproduction, menes chez le rat, sur une gnration, soumis 0, 0,25, 0,5, 1 ou 2 de DON ne mettent pas en vidence d'effets sur les paramtres de la reproduction et la gestation, ni danomalie chez les petits. Le seul effet observ est une diminution de poids corporel, conscutive une diminution de la consommation alimentaire dans la premire tude (Khera et al., 1984) et une diminution de taux de fertilit et du poids des petits entre 14 et 21 jours aprs la mise bas (Morrissey et Vesonder, 1985). DON na pas deffet sur les organes reproducteurs du porc mle et femelle exposs 0,17 mg de DON/kg pc/j pendant 7 semaines (Friend et al., 1986). Des tudes de tratognese ont t conduites chez la souris, le rat et le lapin exposs au DON. Chez la souris, un pourcentage lev de rsorptions (100%, 100 %, 80 %) est observe 5, 10 et 15 mg/kg pc/j et des anomalies viscrales majeures (exencphalies, cerveau hypoplasique, syndactyly) sont observes aux doses plus basses (1, 2,5 et 5 mg/kg pc/j). Ces malformations sont doses dpendantes et observs en labsence de toxicit maternelle. Aucun effet tratogne ni embryotoxique n'est observ 0,5 mg/kg pc/j (Khera et al., 1982). Chez la rate expose 0,025, 0,1, et 0,25 mg/kg pc/j pendant la gestation, aucun effet tratogne n'est relev (Morrissey, 1984), mais des effets foetoxiques (anomalies du squelette et retard dans l'ossification) sont dcrits pour des doses de 1,5 et 10 mg/kg pc/j, dans une tude permettant de fixer la dose sans effet de cette tude 0,2 mg/kg pc/j (Tutel ian et al., 1991). Chez la lapine exposes 0, 03, 0,6, 1, 1,6, 1,8, et 2 mg/kg pc/j de DON l'incidence des rsorptions est gale 100 % aux deux plus fortes doses. Aucun effet tratogne n'a t observ aux plus faibles doses (Khera et al., 1986). h Immunotoxicit Chez la souris, lexposition aux trichotcnes en gnral induit une diminution du nombre de splnocytes et de thymocytes (Friend et al., 1983ab ; Islam et al., 1998a, b ; Tryphonas et al.,1984), ainsi quune diminution du nombre de lymphocytes circulants et une dpltion des lymphocytes B dans le foie ftal de souris (Holladay et al., 1993). La stimulation in vivo des lymphocytes B et T de souris est inhibe de faon rversible (Lafarge-Frayssinet et al., 1979). Par ailleurs, le DON augmente la sensibilit des souris une infection orale par S. enteridis (Hara-Kudo et al., 1996) par Listeria monocytogenes (Tryphonas et al.,1984 ) ou par des rovirus (Li et al., 2005). Chez la souris, le DON induit une augmentation dIgA jusqu 25 mg DON/kg de nourriture (Forsell et al., 1986 ; Petska et al., 1989), mais diminue la concentration dIgG et dIgM. Il est galement susceptible de modifier lexpression des cytokines in vitro et in vivo chez la souris (Azcona-Olivera et al., 1995ab ; Ji et al., 1998 ; Wong et al., 1998).

96

h Hmatotoxicit Des souris B6C3F exposes par voie orale 0, 0,1, 0,4, 1, 2, et 5 mg/kg pc/j de DON pendant 6 semaines ont prsent une diminution du nombre de leucocytes aux deux plus fortes doses, la dose sans effet tant de 1mg/kg pc/j (Forsell et al., 1986). Chez le rat, le chat, la souris, le poulet et le cochon dInde une anmie, une chute de la concentration corpusculaire en hmoglobine et de lhmatocrite ont t rapportes dans de nombreuses tudes (Sato et al., 1975 ; DeNicola et al., 1978 ; Lutsky et al., 1978, 1981ab ; Hayes et al., 1980b, 1990 ; Rukmini et al., 1980 ; Gentry et al., 1981 ; Cosgriff et al., 1984 ; Conner et al., 1986 ; Ryu et al., 1987 ; Suphiphat et al., 1989 ; Harvey et al., 1991). Chez la souris C57BL/6crSlc SPF, la consommation daliments contamins par 30 mg/kg de NIV induit une diminution du nombre drythrocytes sans modification de lhmatocrite ni de la concentration corpusculaire en hmoglobine (Ryu et al., 1987). In vitro, le DON exerce un effet hmolytique sur des rythrocytes de rat aprs exposition des concentrations de 130, 200, et 250 g/ml pendant 11 h ; lhmolyse est totale aux deux plus fortes concentrations aprs 7 heures d'incubation. Cet effet pourrait tre li soit la pntration de DON dans la bicouche phospholipidique, soit une interaction de DON avec une cible membranaire et/ou une peroxydation lipidique induite par la libration de radicaux libres. (Rizzo et al., 1992). In vitro, Le DON (10-8 M) inhibe la maturation des cellules dendritiques et la diffrentiation des monocytes en macrophages (Hymery et al., 2006 a et b, 2007). Lingestion par des souris de 30 mg/kg de nivalnol pendant 24 jours induit une diminution du nombre de cellules hmatopotiques dans la moelle osseuse (Ryu et al., 1987). Lhypoplasie induite par les trichothcnes est transitoire et le temps de rgnration est variable. Des progniteurs hmatopotiques humains et de rat ont t cultivs en prsence de 4-400 ng/ml de DON pendant 14 jours. Le DON inhibe le dveloppement de ces cellules de faon dose dpendante pour des doses gales de 100 400 ng/ml. La CI50 est gale 16 ng/ml pour les cellules humaines et 64 ng/ml pour les cellules murines aprs 14 jours d'incubation; Les cellules humaines sont plus sensibles que les cellules murines. Ces rsultats laissent penser que les leucopnies dcrites lors d'intoxications DON sont dues un effet mylotoxique ( Parent-Massin et al., 1994, 1995, 1998; Lautraite et al., 1995, 1996, 1997ab ; Rio et al., 1997). Des tudes complmentaires ont montr que DON est le moins mylotoxique des trichothcnes, et que les progniteurs de la ligne rouge sont moins sensibles ces effets mylotoxiques que ceux de la ligne des globules blancs et/ou plaquettaire (Rio et al., 1997, Froquet et al., 2003). Bien que prsentant une forte mylotoxicit sur les CFU-GM humains, les mtabolites de DON (3AcDON et le 15AcDON) sont moins mylotoxiques que leur molcule mre (Hymery et al., 2007).

h Mylotoxicit

4.3

Valeurs toxicologiques de rfrences

Le CIRC a class les diffrents trichothcnes (T-2, DON, ) en 1993 dans le groupe 3, du fait de donnes insuffisantes pour statuer. 4.3.1 Trichothcnes du groupe A

Toxine T-2 et toxine HT-2 : bien que peu d'tudes aient t ralises sur la toxine HT-2, la dose journalire tolrable fixe par le JECFA et le SCF concernent ces deux toxines. Ces comits ont retenu l'tude ralise chez le porc sur la T-2 comme tude pertinente (Raifai et al., 1995). Les effets toxiques observs aux faibles doses dans cette tude sont des effets immunotoxiques et hmatotoxiques. Comme il n'a pas t identifi de dose sans effet dans cette tude, c'est la plus petite dose avec effet (LOAEL) qui a t retenue, soit 0,029 mg/kg pc/j. Un facteur de scurit de 500 (10 x 10 x 5) a t appliqu et la dose journalire tolrable provisoire des toxines T-2 et HT-2 est de 0,06 g/kg pc/j. 4.3.2 Trichothcnes du groupe B

97

DON : Le JECFA et le SCF ont retenu l'tude de toxicit chronique mene sur la souris (Iverson et al, 1995). La dose sans effet (NOAEL) est gale 100 g/kg pc/j . L'effet toxique pertinent identifi dans cette tude est une diminution du gain de poids entranant un retard de croissance. Un facteur de scurit de 100 (10 x10) a t appliqu la dose sans effet pour obtenir la dose journalire tolrable de DON qui est en consquence gale 1 g/kg pc/j ( JECFA ,SCF 2001). NIV : Le SCF a fix une dose journalire tolrable pour le nivalnol partir des tudes de toxicit chronique menes chez la souris (2 ans). Les effets toxiques pertinents identifis pour dterminer la dose sans effet sont les effets immunotoxiques et hmatotoxiques. Aucune tude n'ayant permis d'identifier une dose sans effet, c'est la plus petite dose avec effet qui a t retenue, soit 0,7 mg/kg pc/j laquelle il a t appliqu un facteur de scurit de 1000 (10x10x10) compte tenu du fait que peu de donnes sont disponibles sur cette toxine. La dose journalire tolrable provisoire du nivalnol est donc gale 0,7 g/kg pc/j.

5 5.1

Exposition humaine aux trichothcnes Effets sur la sant humaine (donnes pidmiologiques)

La consommation de produits contamins par les trichothcnes serait l'origine de graves mycotoxicoses chez lhomme. La premire manifestation pouvant tre impute aux trichothcnes survint en 1891 dans le comt dOussouri en Sibrie Orientale. Elle fut dsigne sous le nom de maladie chancelante (GrevierRames, 1989). Les affections les plus connues, dans lesquelles les trichothcnes sont suspectes d'tre incrimines, sont lAleucie Toxique Alimentaire (ATA) dcrite en Russie et aussi la "Moldy Corn Toxicosis" en Amrique du Nord, la "Red Mold Disease" ou "Akakabi byo disease" au Japon, toutes provoquant les mmes symptmes. LATA est rapporte depuis la fin du 19me sicle en Russie. Mais, cest dans les annes 1940 que les cas dintoxication les plus graves ont t signals. Cette intoxication a provoqu le dcs de 10 % de la population du comt dOrenburg en Russie. L'ATA se caractrise par des diarrhes, des vomissements et des modifications hmatologiques et par lapparition de ptchie au cours des deux premiers stades. Lors du troisime stade, l'atteinte du systme hmatopotique s'intensifie et le nombre de cellules circulantes diminue. Le nombre de thrombocytes tombe sous les 5 000/mm3 alors que le nombre de leucocytes chute sous les 100/ mm3 et le nombre drythrocytes devient infrieur 1x106/ mm3 La population touche avait consomm du pain prpar partir de grains de bl contamins par des Fusarium. Le bl n'ayant pas t moissonn en raison de la guerre, la population utilisait des grains de bl rcolts sous la neige en hiver. A partir de souches de Fusarium poae et sporotrichiodes) impliques dans les pidmies dATA en Union Sovitique, de nombreux auteurs ont montr la capacit de ces moisissures produire des trichothcnes, notamment T-2 (Sato et al., 1975 ; Szathmary et al., 1976). Le mcanisme impliqu dans la survenue des troubles hmatologiques due une forte cytotoxicit sur les progniteurs hmatopotiques a t mis en vidence 20 ans aprs.

5.2

Exposition de la population Franaise

L'tude de lalimentation totale (EAT) entreprise en 2000 pour dterminer le niveau dexposition de la population franaise aux trichothcnes partir daliments "prts consommer" montre que sur les 238 chantillons analyss, des concentrations suprieures la limite de dtection nont t relevs que pour les seules toxines HT-2 et fusarnone X (2 chantillons sur 238), NIV (3 chantillons) et DON (31 chantillons) (Leblanc et al., 2005). Les niveaux dexposition moyens et des forts consommateurs (95me percentile) adultes (15 ans et plus) et enfants (de 3 14 ans) de la population franaise gnrale (tableau 1) et de la population vgtarienne (tableau 2) ont t estims pour le DON et le NIV (Leblanc et al., 2005).

98

Le principal vecteur d'exposition pour les deux groupes de population est reprsent par les produits drivs des crales (> 90% pour le DON et environ 80% pour le NIV, en particulier le pain et les biscottes (entre 45 et 70% pour le DON et entre 19 et 32% pour le NIV). Les autres vecteurs contribuent moins de 2% (DON ) et moins de 4% (NIV) de lexposition alimentaire totale.
Tableau 1 : Exposition de la population moyenne et des forts consommateurs (P95) (adultes et enfants) en DON et NIV lors de lEAT

DON
% d'individus % de la pouvant DJT pour Moyenne dpasser la P95 "limite * maximale " 57 % 0,4 % 0,088

NIV % % de la d'individus DJT pour pouvant P95 dpasser la "limite * maximale " 23 % 0%

Moyenne en P95 g/kg p.c./j)

P95

adultes (15 ans et 0,281 +) Enfants (3-14 ans)

0,571

0,157

0,451

0,929

93 %

4%

0,163

0,300

43 %

0%

* Le JECFA a tabli la dose journalire tolrable pour le DON 1 g/kg pc/j et le NIV 0,7 g/kg pc/j.

Tableau 2 : Exposition de la population vgtarienne franaise adultes (15 ans et +) aux DON et NIV lors de lEAT

DON
% % de la d'individus DJT pouvant Moyenne pour dpasser la P95 "limite maximale* " 72 % 4% 0,120

NIV % % de la d'individus DJT pour pouvant P95 dpasser la "limite * maximale " 33% 0%

Moyenne en g/kg p.c./j)

P95

P95

Ovolacto vgtariens

0,360

0,720

0,230

Lactovg tariens

0,320

0,830

83 %

5,3 %

0,120

0,190

27 %

0%

Vgtaliens/ 0,410 macrobiotes

0,960

96 %

3,8 %

0,210

0,420

60 %

3,8 %

* Le JECFA a tabli la dose journalire tolrable pour le DON 1 g/kg pc/j et le NIV 0,7 g/kg pc/j.

Les niveaux dexposition moyens des adultes (15 ans et plus) et enfants (de 3 14 ans) de la population franaise gnrale estims pour les DON et NIV lors de lEAT sont plus faibles denviron 60% ceux estims par la Tche SCOOP europenne7 ralise en 2003 pour les DON, NIV et T-2 (tableau 3). Pour lessentiel, la diffrence est due au fait que les donnes de contamination proviennent pour lEAT des denres telles que consommes et pour la tche SCOOP des matires premires entrant dans la composition des aliments.

SCOOP report on Tasks 3.2.10. (2003). Collection of occurrence data of Fusarium toxins in food et assessment of dietary intake by the population of EU members states.

99

Tableau 3 : Exposition alimentaire de la population franaise aux trichothcnes (Tche Scoop, 2003)

Exposition moyenne (g/kg p.c./j) DON NIV T-2

Population Adultes 0,460 0,060 0,075 Enfants (3-14 ans) 0,730 0,090 0,111

6.1 6.1.1

Effets sur la sant animale et transfert dans les tissus animaux Les porcins

Les trichothcnes de type A Cas de la toxine T-2 * Effets sur les performances de croissance Les consquences de la T-2 sur les performances de croissance des porcs ont t beaucoup moins tudies que celles des trichothcnes de type B (DON). Nanmoins toutes les tudes ralises sur de jeunes animaux, part celle de Weaver et al. (1978a) o aucun effet nest constat lors de la consommation dun aliment renfermant jusqu 8 mg de T-2/kg, des rductions de la consommation daliment et de la vitesse de croissance sont mises en vidence pour des teneurs en T-2 infrieures 1 mg/kg d'aliment (Friend et al., 1992), significativement partir de 3 mg de T-2/kg (Rafai et al., 1995a) et dautant plus marques que les concentrations sont plus leves par rapport aux tmoins (Rafai et Tuboly, 1982; Rafai et al., 1989, 1995a; Harvey et al., 1990, 1994). Les porcs refusent de consommer un rgime renfermant 16 mg de T-2/kg (Mirocha, 1977; Weaver et al., 1978a). Leur vitesse de croissance est galement rduite, les porcs perdant mme du poids lorsque les aliments renferment 5 15 mg de T-2/kg (Rafai et al., 1995a). Comme pour le DON (voir plus loin), ces effets s'attnuent avec le temps alors que les animaux continuent consommer laliment contamin (Rafai et Tuboly, 1982). Lefficacit alimentaire n'est significativement altre dans aucun de ces essais. * Signes cliniques La DL50 de la T-2 est de 4 mg/kg pc par voie orale (Smalley,1973) et de 1,21 mg/kg pc par voie intraveineuse, la plus faible dose ltale tant de 0,9 mg/kg pc (Mirocha, 1977; Weaver et al., 1978a). La toxicit aigu de la T-2 administre par voie intraveineuse se manifeste par des ractions de mastication, de salivation, suivies de vomissements, de polyphagie, de polydipsie, doligurie, puis dapathie, de difficults respiratoires et dune coloration violace des muqueuses buccales et du groin (Weaver et al., 1978a; Corley et al., 1983; Lorenzana et al., 1985b; Beasley et al., 1986; Pang et al., 1986). Le porc dfque frquemment. Entre 1 et 6 h, aprs la contamination, lapparition dune parsie postrieure, dune dmarche titubante entranant des chutes frquentes est suivie dune lthargie extrme et de la mort qui intervient 19 h aprs l'injection. Chez les porcs qui ne meurent pas, les symptmes rgressent partir de 5 12 h suivant linjection, et les animaux retrouvent un tat normal aprs 24 h. Lors dune intoxication chronique de porcs par la consommation d'un aliment contamin renfermant entre 5 et 15 mg de T-2/kg, aucun vomissement nest observ, mais une lthargie sinstalle au bout de quelques jours ainsi quune frilosit apparente en dpit d'une temprature rectale et de conditions ambiantes normales (Try et al., 1989; Harvey et al, 1990; Rafai et al., 1995a). Chez les animaux consommant un aliment renfermant plus de 4 mg/kg de T-2, une ncrose et une ulcration des tissus pithliaux se dveloppent sur le groin, les commissures et la cavit buccales, la langue, les zones cutanes rtro-auriculaires et pri-prpuciales partir de 9 14 jours aprs le dbut de lintoxication et s'aggravent au cours temps sans que les animaux manifestent de signes de douleur ou d'inconfort (Harvey et al., 1990). Lorsque laliment renferme entre 0,5 et 3 mg/kg de T-2, seul l'examen histologique des tissus rvle la prsence de lsions (Rafai et al., 1995a).

100

* Effets sur la circulation sanguine L'injection intraveineuse de 0,6 ou 4,8 mg de T-2/kg pc entrane un tat de choc circulatoire avec chute du dbit sanguin cardiaque et de la pression artrielle, dont la dure apparat dose dpendante en dpit d'un accroissement du rythme cardiaque (Lundeen et al., 1986, 1991; Beasley et al., 1987). La teneur en catcholamines du sang augmente, le pH et la pression partielle en oxygne diminuent. * Lsions L'injection intraveineuse de 0,6 4,8 mg de T-2/kg p.c provoque des lsions oedmateuses multifocales et des hmorragies du myocarde, des dmes et des hmorragies des ganglions lymphatiques, du pancras, des surrnales et de la vsicule biliaire, une congestion et des hmorragies de lestomac, du jjunum, de l'ilon et du colon, associes des ncroses superficielles (Weaver et al., 1978a; Pang et al., 1986, 1987a,b; Williams, 1989). Par contre, le duodnum parat indemne, mme aux doses ltales (Corley et al., 1983; Williams, 1989). L'examen histologique rvle des infiltrats de cellules mononucles, une pycnose des myofibrilles du cur (Pang et al., 1986, 1987b) ainsi quune dgnrescence et une ncrose des cellules de la corticosurrnale, des acini du pancras et de l'pithlium tubulaire de la mdulla rnale (Pang et al., 1987b). Des lsions similaires ont t rapportes au niveau de la surface et des cryptes de l'pithlium ilal et jjunal, des tissus lymphodes de l'intestin grle et du caecum, des follicules lymphodes de la rate et des centres germinatifs des ganglions lymphatiques (Pang et al., 1987a,b; Weaver et al., 1978a). La T-2 est donc un puissant agent cytotoxique pour les systmes digestif, lymphode et hmatologique, lsant aussi bien les cellules division rapide que celles faible renouvellement (Pang et al., 1987a,b). Lors d'une intoxication sub-aigu par consommation d'un aliment contamin par T-2 (0,4 10 mg/kg), on nobserve pratiquement pas de lsions dans la plupart des organes: foie, reins, rate, cur, surrnales, thymus (Patterson et al., 1979; Harvey et al., 1990, 1994; Friend et al., 1992). Cependant, Rafai et Tuboly (1982) et Try et al (1989) ont relev une rduction du poids du thymus et de la rate, ainsi quune augmentation du poids des surrnales aprs consommation dun aliment avec 5 mg T2/kg. Pour des teneurs comprises entre 0,4 et 3,2 mg/kg daliment, Friend et al., (1992) constatent une lvation dose dpendante de lincidence des lsions de la muqueuse sophagienne. Certains des effets relevs aprs administration intraveineuse de T-2 sont retrouvs chez des truies consommant un aliment contamin par 12 mg de T-2/kg, tels que la congestion de l'ilon, du colon, de la vsicule biliaire et un dme svre des canaux biliaires (Weaver et al., 1978c). Une dgnrescence du foie et des reins et un dme du msentre dmateux ont observs chez les porcelets issus dune truie qui avait consomm un aliment contamin par 8 mg/kfg de T-2 purifie pendant le dernier quart de la gestation et la 1re semaine de lactation (Vanyi et al., 1991). * Paramtres sanguins, hmatologie et immunit Aprs administration intraveineuse de 0,6 ou 4,8 mg/kg pc de T-2 des porcs de 40 60 kg, une augmentation du taux srique de calcium, de potassium, de magnsium, d'ure, de cratinine, de phosphatase alcaline et dAST, et une diminution du pH sanguin ont t observes (Lorenzana et al., 1985a). Pour de plus faibles doses (1 et 2 mg de T-2/kg d'aliment), Rafai et al (1995a) observent une baisse de la glycmie et du taux d'acides gras libres et une augmentation de lAST, mais aucun effet sur les taux sriques de protines, d'albumine et d'ure. Chez des porcs nourris avec un aliment contamin par 10 mg de T-2/kg, le taux de triglycrides est augment et l'urmie diminue (Harvey et al., 1990). Par contre, Friend et al., (1992) ne constatent aucune altration des paramtres mtaboliques entre 0 et 3,2 mg de T-2/kg d'aliment. L'injection intraveineuse de 0,6 ou 4,8 mg de T-2/kg pc provoque une leucocytose suivie dune leucopnie (Lorenzana et al., 1985a), et la plus forte dose, une augmentation de lhmatocrite, du nombre d'rythrocytes et du taux d'hmoglobine. Des rythrocytes nucls sont trouvs aux deux doses, mais ne persistent au-del de 24 h qu la dose leve. Les temps de coagulation ne sont pas affects. La T-2 inhibe donc la production de leucocytes. La prsence de globules rouges nucls sans augmentation du nombre de globules rouges matures suggre une lsion de l'endothlium de la moelle osseuse. Le nombre de globules rouges, le taux d'hmoglobine et le pourcentage de lymphocytes T diminuent lorsque l'aliment renferme 2 ou 3 mg/kg de T-2 (Rafai et al., 1995b). Inversement, daprs Rafai et Tuboly (1982) et Harvey et al., (1990), la consommation d'un aliment contamin par 5 ou 10 mg de T-

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2/kg ne modifie pas le nombre de leucocytes ni d'rythrocytes, mais provoque une anmie microcytaire hypochrome. La consommation par de jeunes porcelets d'aliments contamins par 0,5 5 mg/kg de T-2 purifie affecte leurs rponses immunitaires (Rafai et Tuboly, 1982; Rafai et al., 1989, 1995b). La prolifration lymphocytaire aprs stimulation et le titre d'anticorps aprs vaccination contre la gastro-entrite hmorragique sont diminus. Cependant, Harvey et al., (1994) ne constatent pas d'altration des fonctions immunitaire la dose de 8 mg de T-2/kg daliment. * Effets sur la reproduction Seules, quelques tudes de cas (1 3 truies/lot) sont disponibles. Linjection intraveineuse de 0,41 ou 0,21 mg de T-2/kg p.c au 3me tiers de la gestation de truies provoque lavortement (Weaver et al., 1978d). La consommation d'un aliment contamin par 13,5 mg/kg de T-2 et 5,4 mg/kg de HT-2 par des porcelets entrane une atrophie utrine et ovarienne avec atrsie des follicules (Palyusik et al., 1990), Des troubles de fertilit sont constats aprs le sevrage de truies ayant consomm un aliment contamin par 12 mg/kg de T-2 purifie (Weaver et al., 1978b). Les porcelets nouveau-ns issus dune truie dont laliment renfermait 8 mg/kg de T-2 taient chtifs et mouraient avant le sevrage (Vanyi et al., 1991). Le passage de la T-2 dans le lait a t dmontr chez une truie consommant un aliment contamin par 12 mg de T-2/kg (Robison et al., 1979a). Une frquence leve d'avortements et de retours en strus chez les truies, une augmentation du nombre de porcelets momifis, des lsions cutanes et des difficults de dplacement chez les porcelets ont t observes dans des levages o des truies consommaient un aliment renfermant de la T-2, mais aussi de lergot (Barnikol et al., 1982, 1985). * Mtabolisme et transfert de T-2 dans les tissus animaux Aprs injection intra-aortique, la T-2 est trs rapidement pure du sang, selon un modle 2 compartiments. Sa demi-vie plasmatique est estime 90 min, 13,8 min ou 5,3 min suivant les auteurs (Corley et al., 1983; Beasley et al., 1986; Bauer, 1995), et son volume de diffusion 0,37 L/kg. Elle n'est plus retrouve dans le sang ds 2 h aprs son administration par injection intraveineuse ou par intubation intra-gastrique. Le driv HT-2, libre ou conjugu, est dtect ds les 5 premires minutes suivant l'injection. Les principaux mtabolites qui sont prsents sous forme non conjugue (3'-OH T-2, HT-2 et 3'-OH HT-2), dcroissent trs rapidement (60% des mtabolites totaux, 10 min aprs linjection, moins de 10% 4 h). En fait, la majeure partie de la radioactivit (89%) est retrouve dans les glucuronides drivs de T-2, 3'-OH T-2, HT-2 et 3'-OH HT-2 (Corley et al., 1983; Beasley et al., 1986; Bauer, 1995),. Plus de 20% de la T-2 est absorbe. La T-2 est limine principalement par lurine (Robison et al, 1979b; Corley et al., 1985) dans laquelle on retrouve moins de 0,1% de la toxine (Beasley et al., 1986), les mtabolites libres (principalement le 3'-OH T-2 et T-2 triol qui reprsentent 24 30% du total des formes limines), et les glucuronides conjugus (principalement de HT-2, 3'-OH T-2, 3'-OH HT-2 et T-2 reprsentant 59 68% du total des formes limines) (Corley et al., 1985). L'limination biliaire de la T-2 na pas t quantifie, mais est pour 77% sous la forme de glucuronides conjugus (Corley et al., 1985). Dix-huit heures aprs administration de T-2 marque par intubation gastrique, 50% de la dose est retrouve dans les tissus de l'animal, et le reste dans le tractus digestif (Robison et al, 1979b). La T-2 parente n'est pas retrouve dans les fces de porcs auxquels 2,4 mg de T-2/kg pc avaient t administrs par voie intra-gastrique (Beasley et al, 1986). Le principal mtabolite dans les fces serait HT-2, et le 3'-OH HT-2, le T-2 triol et le T-2 ttraol n'y seraient retrouvs qu'en faibles quantits (Bauer, 1995). La microflore intestinale hydrolyse les drivs conjugus de T-2 et de ses mtabolites ; une grande partie des formes parentes pourrait ainsi tre rabsorbe et entrer dans un cycle entrohpatique (Corley et al., 1985). Aprs injection intra aortique, la T-2 parente disparat rapidement des tissus des porcs. Sa clairance tissulaire (57 92 ml/kg/min) est dautant plus faible que la dose de T-2 administre (entre 0 et 1,2 mg/kg pc) est leve (Beasley et al., 1986). Les concentrations les plus leves sont releves dans les organes lymphodes, la rate et les nodules lymphatiques, les muscles, puis dans les reins , les niveaux dans le foie ni le tissu adipeux tant infrieurs la limite de dtection (Beasley et al., 1986). Les teneurs en T-2 et de ses mtabolites prsentes dans les tissus 18 h aprs administration par

102

intubation gastrique sont proportionnelles la dose, mais les niveaux de contamination sont trs faibles et les risques de toxicit pour le consommateur humain semblent donc trs limits. Ainsi, il ny aurait que 1,2 g rsidus dans 200 g de viande provenant dun porc qui aurait consomm un aliment renfermant 2,5 mg/kg de T-2 (Robison et al., 1979b). Cas du diactoxyscirpnol (DAS) * Signes cliniques et performances Les effets du diactoxyscirpnol (DAS) administr par voie orale ou intraveineuse sont similaires ceux de la T-2, mais apparaissent plus prcocement ou pour des doses infrieures (Weaver et al., 1978b; Bauer et al., 1985; Coppock et al., 1985a). La DL50 du DAS est de 0,376 mg/kg pc administr par voie intraveineuse (Weaver et al., 1978b) et nest pas rapporte par voie orale. La consommation d'aliment et la vitesse de croissance de porcelets de 7 9 kg diminuent lorsque la concentration du DAS dans l'aliment augmente entre 2 et 10 mg/kg, mais l'efficacit alimentaire reste inchange (Weaver et al., 1981). Au-del dune teneur de 10 mg de DAS/kg daliment, les animaux ne consomment plus la nourriture. Daprs Weaver et al. (1981), le DAS provoque des ulcrations des muqueuses linguale, gingivale et buccale dont le nombre et la taille augmentent avec le temps, quelle que soit sa teneur dans le rgime * Effets sur les organes et les tissus Le DAS est cytotoxique pour les tissus forte prolifration ou forte activit mtabolique. Ladministration intraveineuse de 0,5 ou 1 mg de DAS/kg pc provoque des rosions graves et des hmorragies des muqueuses, du tube digestif (intestin grle, ccum, colon), du cortex surrnalien, de la vsicule biliaire, ainsi que des lsions des tissus lymphodes. L'examen histologique rvle une ncrose, une pycnose et une caryorrhexie de la partie glandulaire de l'estomac, des entrocytes des cryptes intestinales, des acini du pancras, des cellules pithliales des tubules proximaux et des papilles rnales, et dans une moindre mesure de la moelle osseuse et des parotides, ainsi quune lympholyse svre des centres germinatifs des nodules lymphatiques, des plaques de Peyer et des follicules de la rate. Les tissus lymphodes riches en lymphocytes B sont prfrentiellement affects. Des ncroses des capillaires et des hmorragies multifocales du cerveau, des hmorragies et une congestion diffuse du myocarde sont galement rapportes(Weaver et al., 1978b; Coppock et al., 1985a). L'injection intraveineuse de 0,5 ou 1mg de DAS /kg pc entrane une hypoglycmie ou une hyperglycmie marque (Coppock et al., 1985a), une augmentation significative de l'ure et la cratinine sriques en relation avec linstallation dune anurie, ainsi que de lAST. Le nombre de globules rouges, l'hmatocrite et la teneur en hmoglobine du sang ne sont pas affects pendant les 8 h suivant l'injection de 0,5 ou 1 mg de DAS/kg pc (Coppock et al., 1989). Cependant, la prsence de nombreuses cellules prsentant des anomalies morphologiques dont le nombre augmente avec le temps et la dose suggre une destruction progressive des lments hmatopotiques de la moelle osseuse. La diminution du nombre de neutrophiles et la libration par la moelle osseuse de neutrophiles et de lymphocytes immatures tmoignent dun arrt de la prolifration des progniteurs mdullaires. Cependant, aucune anomalie sanguine ou mdullaire ne persiste chez les porcs survivants 8 jours aprs l'injection de 0,3 0,5 mg de DAS/kg pc (Weaver et al, 1978b). Dans le cas d'une l'intoxication chronique par un rgime renfermant jusqu 10 mg de DAS /kg, seule une hyperplasie cellulaire de l'pithlium glandulaire et muqueux est observe (Weaver et al., 1981). A la diffrence de l'intoxication aigu, lintoxication par un aliment contamin par le DAS ne provoquerait pas d'hmorragies chez le porc. * Mtabolisme du DAS et rsidus Les donnes sur le mtabolisme du DAS et les niveaux de rsidus dans les tissus du porc sont fragmentaires. La concentration srique maximale est atteinte entre 30 et 60 min aprs administration de 2 mg de DAS /kg pc par canule gastrique (Bauer et al., 1985). Deux mtabolites, le 15monoactoscirpnol, presque aussi toxique que le DAS, et le scirpenetriol (SCT) sont galement prsents dans le srum (Bauer et al., 1989). Le DAS et ces mtabolites diminuent rapidement et ne sont plus mesurables 24 h. Ces donnes indiquent que le DAS est trs rapidement absorb et

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mtabolis , mais les drivs glucuronides du DAS et de ses mtabolites, nont pas t dtermins dans cette tude, ce qui limite linterprtation des rsultats. Chez le porc, la demi-vie du DAS administr par voie intraveineuse est de 8,3 150,7 min et sa clairance de 27,3 191,7 ml/min/kg (thse de Coppock, 1984, cite par Bauer et al., 1989). Le DAS est partiellement limin dans l'urine, et principalement dans les fces o sont retrouvs les mtabolites SCT libre et d-poxy SCT (Bauer et al., 1989). Huit heures aprs l'injection intraveineuse de 0,1, 0,5 ou 1 mg de DAS/kg pc, des rsidus de DAS sont dtects l'tat de traces (au plus10 ng/g) dans tous les tissus des porcs (Coppock et al., 1988). Les concentrations les plus leves sont mesures dans la rate (jusqu' 384 ng/g) et les nodules lymphatiques (jusqu' 288 ng/g). Les trichothcnes de type B : cas du DON De nombreux cas d'intoxication du porc par des crales infectes par Fusarium ont t rapports, notamment aux Etats Unis (Mains et al., 1930; Vesonder et al., 1978; Ct et al., 1984; Osweiler et al., 1990) au Canada (Trenholm et al., 1983; Abramson et al., 1997) et en Australie (Moore et al., 1985), avec des symptmes comparables ceux qui avaient t observs chez l'homme dans des circonstances analogues (Vesonder et Hesseltine, 1980/81). C'est la suite de vomissements constats dans la "Corn Belt" des Etats Unis chez des porcs ayant consomm du mas contamin par Fusarium graminearum que le doxynivalnol, a t isol et dnomm alors vomitoxine (Vesonder et al., 1973). * Effets sur la consommation alimentaire Le porc est plus sensible aux trichothcnes que le rat (Vesonder et al., 1979), les volailles et surtout les ruminants (Trenholm et al., 1984; Rotter et al., 1996; Eriksen et Pettersson, 2004). L'effet le plus manifeste est une baisse dose dpendante de la consommation alimentaire au del de teneurs de l'aliment gales au moins 1 mg de DON/kg, sachant toutefois que la variabilit de la consommation alimentaire est trs leve chez le porc (Friend et al., 1982, 1986b,c; Bergsj et al., 1993). Les donnes indiquent une rduction moyenne de 4,3% de la consommation par mg/kg de DON supplmentaire dans laliment (figure 1). La baisse de consommation persiste gnralement pendant toute la dure des expriences si la teneur des aliments dpasse 3 mg de DON/kg daliment, mais la consommation tend redevenir normale au bout de 1 2 semaines si la teneur est plus faible (Forsyth et al., 1977; Ct et al., 1985; Lun et al., 1985; Pollmann et al., 1985; Chavez et Rheaume, 1986; Friend et al., 1986b; Bergsj et al., 1992; Rotter et al., 1995; Grosjean et al., 2002). Une consommation alimentaire normale est galement observe lorsquun rgime non contamin succde au rgime contamin (Grosjean et al., 2003).

104

120

100 Consommation, % des tmoins


Porcelets

80

Porcs l'engrais

60

40

20

Y = - 4,29 X + 94,70 R2 = 0,57

0 0 5 10 DON, mg/kg d'aliment 15 20

Figure 2 : Effets de la teneur en DON de l'aliment (X) sur la consommation des porcelets et des porcs l'engrais (Y) ( partir des donnes de contamination nexcdant pas 20 mg de DON/kg daliment obtenues par
Forsyth et al. (1977), Friend et al. (1982, 1984, 1986b,c), Young et al. (1983), Lun et al. (1985), Pollmann et al. (1985), Chavez et Rheaume (1986), Foster et al. (1986), Bergsj et al. (1992, 1993), He et al. (1993), Prelusky et al. (1994, 1997), Trenholm et al. (1994), Rotter et al. (1995), Grosjean et al. (2002, 2003), Pinton et al. (2004), Goyarts et al. (2005)).

Contrairement ce que son appellation "vomitoxine" laisse supposer, seules des doses leves de DON provoquent des vomissements, qui sont notamment observs aprs linjection intraveineuse de 0,25 ou de 0,5 mg de DON/kg pc (Prelusky et al., 1992; Coppock et al., 1985b) ou la suite de lingestion de 50 g (Petska et al.,1987; Mller et al., 1999), de 0,1 0,2 mg (Forsyth et al., 1977) ou de 0,3 mg de DON/kg pc (Prelusky et Trenholm, 1993), ou aprs consommation dun aliment prsentant une teneur de 20 mg de DON/kg (Young et al., 1983). Chez le porc, les effets du DON, et plus gnralement des trichothcnes, sur la baisse de l'apptit et les vomissements semblent faire intervenir certains neuromdiateurs. Le DON administr par intubation gastrique (1 mg/kg pc) dans l'estomac apparat trs rapidement dans le liquide cphalorachidien (Prelusky et al., 1990), mais comme les trichothcnes du groupe A, il possde une trs faible affinit pour les rcepteurs de la srotonine (Prelusky, 1996). Cependant, certains antagonistes spcifiques des rcepteurs de la srotonine sont trs efficaces pour prvenir les vomissements provoqus par le DON (Prelusky et Trenholm, 1993). L'administration de DON des doses ne provoquant pas de signes cliniques (6 fois 10 g de DON /kg pc en injection intraveineuse, ou 10 mg DON/j dans laliment par infusions intragastriques rptes) entrane des variations importantes des concentrations de mtabolites de la srotonine et de la dopamine dans le liquide cphalorachidien (Prelusky, 1993). Swamy et al. (2004) observent galement des modifications des concentrations de neuromdiateurs srotoninergiques, noradrnergiques et dopaminergiques dans des zones du cerveau de porcs ayant consomm des rgimes contamins par du DON et de l'acide fusarique. L'implication dans ces altrations du tryptophane, prcurseur de la srotonine, a t suggre (Smith, 1992; Prelusky, 1993). Cependant, Prelusky (1994) ne constate aucune modification des niveaux plasmatiques de srotonine, d'acide 5-hydroxyindolactique ou de tryptophane dans le sang priphrique aprs administration de doses faibles ou leves de DON par voie intra gastrique ou intraveineuse. * Effets sur la croissance

105

150
Porcelets

100 GMQ, % des tmoins

Porcs l'engrais

50

0
Y = - 7,14 X + 97,47 R2 = 0,55

-50

-100 0 5 10 DON, mg/kg d'aliment 15 20

Figure 3 : Effets de la teneur en DON de l'aliment (X) sur la vitesse de croissance des porcelets et des porcs l'engrais (gain moyen quotidien, Y) ( partir des donnes de contamination nexcdant pas 20
mg de DON/kg daliment obtenues par Friend et al. (1982, 1984, 1986b,c), Young et al. (1983), Lun et al. (1985), Pollmann et al. (1985), Chavez et Rheaume (1986), Foster et al. (1986), Bergsj et al. (1992, 1993), He et al. (1993), Prelusky et al. (1994, 1997), Trenholm et al. (1994), Rotter et al. (1995), Grosjean et al. (2002, 2003), Pinton et al. (2004), Goyarts et al. (2005)).

Paralllement la rduction de la consommation alimentaire, la prsence de DON dans l'aliment diminue de faon dose dpendante la croissance pondrale du porc. Le regroupement des donnes de la littrature sur des taux de DON n'excdant pas 20 mg/kg d'aliment montre que la croissance pondrale est rduite d'environ 7% par mg/kg de DON ajout dans l'aliment (figure 2). Comme pour la consommation alimentaire, leffet s'attnue gnralement partir de la 2me semaine si laliment renferme moins de 4 mg de DON/kg (Friend et al., 1982; Pollmann et al., 1985; Foster et al., 1986; Bergsj et al., 1992; Rotter et al., 1994), mais il persiste jusqu' l'abattage si les teneurs sont plus leves (Bergsj et al., 1992, 1993). La rduction de la vitesse de croissance de porcs dont la consommation alimentaire est diminue, soit parce quils consomment un aliment contamin par le DON, soit parce quils sont rationns (animaux pair-fed), est similaire (Lun et al., 1985; Chavez et Rheaume, 1986; He et al., 1993; Rotter et al., 1995; Goyarts et al., 2005). L'effet du DON sur la croissance des porcs rsulterait donc directement dune moindre consommation daliment sans que leur mtabolisme soit affect, bien quun effet moindre dune contamination de 3 mg de DON/kg daliment par rapport au rationnement ait t rapport Rotter et al. (1994). Par ailleurs, Ct et al. (1985) suggrent une diffrence de sensibilit suivant le sexe, la croissance des porcs mles castrs tant plus affecte que celle des femelles, mais Friend et al. (1986b) n'observent pas de diffrence significative. Certains travaux rapportent des effets d'une dose donne de DON sur l'apptit ou la croissance des porcs plus importants si laliment est contamin par la toxine naturelle plutt que par la toxine purifie (Forsyth et al., 1977; Foster et al., 1986; Friend et al., 1986b; Prelusky et al., 1994; Trenholm et al., 1994). L'explication gnralement avance est que bien qu'aucune mycotoxine autre que le DON n'ait t retrouve dans les aliments contamins, d'autres substances toxiques, telles lacide fusarique (Smith, 1992), seraient prsentes. L'cart pourrait aussi rsulter d'une sous-estimation du taux de DON dans les aliments contamins en raison de la complexit de la matrice, ou de diffrences de vitesses d'absorption entre les deux formes. D'aprs Dersjant-Li et al. (2003), la baisse de l'efficacit alimentaire serait relie au ralentissement de la croissance des porcs ingrant du DON. Bergsj et al. (1992,1993) constatent que l'efficacit alimentaire diminue pendant toute la dure de l'engraissement pour des concentrations de 3,5 et 4 mg de DON/kg. Au contraire, Rotter et al. (1994) rapportent que lindice de consommation tend tre

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amlior de faon linaire lorsque la teneur en DON de l'aliment passe de 0 2,85 mg/kg ; le DON aurait alors le mme effet qu'un rationnement alimentaire modr. En fait, plusieurs tudes conduites avec des aliments renfermant jusqu 6,5 mg de DON/kg ne montrent pas daltration de l'indice de consommation (Chavez, 1984; vernes et al., 1997; Grosjean et al., 2002, 2003; Goyarts et al., 2005). Par ailleurs, aucune diffrence de rtention azote na t rapporte entre des porcs consommant un aliment naturellement contamin par 3,7 (Dnicke et al., 2004b) ou 5,3 mg de DON/kg (Friend et al., 1986c) et des porcs recevant un aliment sain. Goyarts et al. (2005) observent une amlioration du bilan azot chez des porcs en croissance lorsque laliment renferme 6,5 mg de DON/kg. Cependant, leffet inhibiteur du DON sur la synthse protique a t mis en vidence dans les reins, la rate et lilon du porc, mais pas dans le foie, le duodnum et le jjunum, ni les muscles (Dnicke et al., 2006). * Effets sur la reproduction Il existe peu d'tudes sur les effets du DON sur la reproduction chez le porc. Lexamen histologique des testicules et des ovaires nindique pas deffet de la consommation pendant 7 semaines dun aliment contenant 3,7 ou 4,2 mg de DON/kg sur le dveloppement sexuel (Friend et al., 1986b). Chez la truie gestante ou allaitante, la consommation de nourriture nest pas affecte si les aliments renferment jusqu 6,2 mg de DON/kg lorsque les truies sont rationnes (Chavez, 1984; Friend et al., 1986a; Diaz-Llano et Smith, 2006; Etienne et al., 2006), mais elle est diminue en cas daccs ad libitum laliment (Friend et al., 1983d; Etienne et al., 2006). Dimportantes variations individuelles de consommation sont alors observes (Friend et al.,1986a; Etienne et al., 2006). Lorsque la prsence de DON rduit l'apptit, le gain pondral est diminu pendant la gestation (Friend et al., 1983d), et les pertes de poids augmentes pendant la lactation (Etienne et al., 2006). Par contre, si lapptit nest pas modifi, ces paramtres ne sont pas affects. Quel que soit le niveau de contamination,des aliments (tudi jusqu 6,2 mg de DON/kg), les performances de reproduction (nombre et poids des porcelets vivants la naissance, taux de survie et croissance post-natale), ne sont gnralement pas affectes. Enfin, seules des traces de DON sont retrouves dans le lait des mres (Friend et al., 1986a; Etienne et al., 2006). * Effets sur les paramtres hmatologiques et plasmatiques Les effets du DON sur les paramtres hmatologiques et biochimiques (constantes plasmatiques, hormones ou enzymes) sont peu documents et parfois contradictoires selon les tudes: absence deffet sur la formule sanguine entre 0,28 4,5 mg de DON/kg daliment (Harvey et al., 1989, 1996; Rotter et al., 1994, 1995; Accensi et al., 2006), modifications pisodiques du nombre d'hmaties et de plaquettes, de l'hmatocrite (Prelusky et al., 1994) et augmentation du nombre de leucocytes (Rotter et al., 1994) 3 mg de DON/kg d'aliment, rduction du taux d'hmoglobine pour une teneur de 10,5 mg DON/kg (Lun et al., 1985), diminution du volume globulaire moyen et de la concentration corpusculaire en hmoglobine pour 4,6 mg de DON et 23,4 mg dacide fusarique/kg daliment (Swamy et al., 2002). L'urmie et la cratinmie ne sont pas affectes pour des teneurs en DON de l'aliment allant de 0,28 19 mg/kg (Lun et al., 1985; Chavez et Rheaume, 1986; Harvey et al., 1989, 1996, Prelusky et al., 1994; Trenholm et al., 1994; Dnicke et al., (2004b; Accensi et al., 2006). Une diminution des protines et de l'albumine (Bergsj et al., 1993) et des taux de protines, d'-globuline (Prelusky et al., 1994; Rotter et al., 1994) et de -globuline sriques (Rotter et al., 1995) ont t rapportes chez des porcs qui consommaient un aliment renfermant de lordre de 3,5 mg de DON/kg. Ces modifications pourraient tre lies la diminution de la synthse protique provoque par le DON (Rotter et al., 1995; Eriksen et Pettersson, 2004). Les teneurs en ions du plasma ne sont pas significativement modifies par la prsence de DON dans laliment (Prelusky et al., 1994; Accensi et al., 2006; DiazLlano et Smith, 2006). L'activit de diverses enzymes hpatiques n'est pas affecte jusqu 4 mg de DON /kg daliment (Lun et al., 1985; Harvey et al., 1996; Dnicke et al., 2004b; Accensi et al., 2006; Diaz-Llano et Smith, 2006). Daprs Rotter et al. (1994), la prsence de 3 mg de DON/kg daliment augmente la T4 plasmatique, alors que la T3 est inchange. * Effets sur la fonction immunitaire Comme pour dautres mycotoxines, la prsence de DON dans laliment peut altrer la fonction immunitaire des porcs (Oswald et al., 2005; Oswald, 2007). Dans la plupart des cas, la teneur en IgA du srum augmente aprs consommation daliments renfermant de 0,6 6,5 mg de DON/kg (Grosjean et al., 2002, 2003; Swamy et al., 2002; Drochner et al., 2004; Pinton et al., 2004, 2006; Accensi et al., 2006; Goyarts et al., 2005), lexception des tudes de Bergsj et al. (1992), Dnicke

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et al. (2004b) et Goyarts et al. (2006) qui nobservent pas ces effets jusqu des doses de 5,7 mg/kg daliment. Les variations des taux dIgM et dIgG sont plus limites et paraissent moins rptables (Grosjean et al., 2002, 2003; Swamy et al., 2002; Pinton et al., 2004, 2006; Accensi et al., 2006; Goyarts et al., 2006). Chez des porcs vaccins par lovalbumine, les teneurs en IgA et IgG anti-ovalbumine augmentent davantage lorsquils consomment un aliment contamin par 2,5 mg de DON/kg (Pinton et al., 2006). Par contre, le titre en anticorps anti-globules rouges de mouton est diminu aprs ingestion dun aliment contamin par 3 mg de DON/kg (Rotter et al., 1994). De mme, les porcs consommant un aliment qui renferme 1,8 ou 4,7 mg de DON/kg prsentent une rponse anticorps plus faible la toxine ttanique, mais pas la srumalbumine humaine, aux globules rouges de mouton, au vaccin de la paratuberculose et la toxine de la diphtrie (vernes et al., 1997). La capacit de prolifration non spcifique des lymphocytes est accrue chez des porcs dont l'aliment renferme de 1,6 4,7 mg de DON /kg (vernes et al., 1997; Grosjean et al., 2002; Pinton et al., 2004), mais elle n'est pas modifie dans dautres tudes pour des teneurs comprises entre 2,9 et 5 mg de DON/kg (Harvey et al., 1996; Grosjean et al., 2003, 2007). La production de cytokines sanguines ou tissulaires de porcelets qui consomment un aliment renfermant 0,84 ou 3,9 mg de DON/kg n'est pas affecte (Grosjean et al., 2002, 2003). En ce qui concerne la rponse immunitaire spcifique, la consommation dun aliment contenant 2,5 mg de DON/kg par des porcelets immuniss par lovalbumine provoque une augmentation transitoire de la capacit de prolifration des lymphocytes, suivie dune immunosuppression (Pinton et al., 2006). vernes et al. (1997) rapportent une diminution limite de rponse la toxine du ttanos chez des porcelets qui consomment des aliments renfermant 1,8 et 4,7 mg de DON/kg. Rotter et al. (1994) ne constatent pas de diffrence aprs immunisation par des hmaties de mouton pour des taux de 1,5 et 3 mg de DON/kg. Les tudes in vitro rvlent galement que le DON modifie certaines fonctions des cellules immunitaires de porcs. Par exemple, un traitement de 2 heures avec 10-5 ou 10-6 M de DON diminue de 35 et 26% la production de drivs oxygns (Takayama et al., 2005). Cependant, une exposition de 18 heures de lymphocytes 10-5 M de toxine na pas deffet sur leur activit chimiotactique. La prolifration des lymphocytes sanguins aprs stimulation mitognique par la concanavaline A est inhibe de 50% pour des concentrations de 200 ou 309 ng de DON/mL selon le test utilis (Goyarts et al., 2006) * Effets sur divers organes et tissus En dehors des cas dintoxication aigu (Coppock et al., 1985b), l'autopsie ne rvle gnralement aucune anomalie des organes analyss jusqu' des doses de 6 mg de DON/kg d'aliment (Friend et al., 1982, 1983d; Trenholm et al., 1984, Pollmann et al., 1985; Harvey et al., 1996), y compris lorsque laliment a t consomm pendant prs de 6 mois (Friend et al., 1986a; Etienne et al., 2006). Ont t cependant signales, une augmentation du poids relatif du foie aprs ingestion daliments renfermant 2,9 8,7 mg de DON/kg pendant toute la priode dengraissement (Friend et al., 1986c; Bergsj et al., 1993; Trenholm et al., 1994) et des reins pour 2,9 et 3,9 mg de DON/kg daliment (Friend et al., 1986c; Rotter et al., 1994; Trenholm et al., 1994). Rotter et al. (1994) rapportent galement une diminution du poids de la thyrode de porcelets qui consomment un aliment contenant 3 mg de DON/kg. L'examen anatomo pathologique du tractus digestif, pratiqu dans de nombreuses tudes, met en vidence des effets relativement limites pour des teneurs en DON de l'aliment allant de 0,6 19 mg/kg: dcoloration de la muqueuse stomacale (Friend et al., 1982, 1984), accroissement des plissements de la zone oesophagienne ou fundique de l'estomac (Rotter et al., 1992, 1994, 1995; Trenholm et al., 1984, 1994), paississement et kratinisation (Trenholm et al., 1984), ou au contraire amincissement et rosion de la muqueuse de la zone oesophagienne (Trenholm et al., 1994). Dans dautres tudes, aucune modification n'est rapporte pour une consommation daliments contamins contenant jusqu 4,7 mg de DON/kg pendant plusieurs mois (Friend et al., 1983d; vernes et al., 1997).Cependant, Ct et al. (1985) rapportent une congestion vasculaire avec une rosion minime des muqueuses de l'estomac et de l'intestin grle, ainsi qu'une dgnrescence et une dpltion lymphode faible modre des plaques de Peyer et des nodules lymphatiques chez des porcelets consommant un rgime renfermant de 0,7 5,8 mg de DON/kg pendant 4 semaines. * Transfert dans les tissus animaux

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Absorption Le DON est largement et rapidement absorb chez le porc: partir de bilans digestifs ou aprs administration intragastrique de DON marqu, comme latteste lexcrtion urinaire de 67 ou 68% de la toxine et de son driv dpoxyde DOM-1 (Friend et al., 1986c; Prelusky et al., 1988) ainsi que son apparition dans le sang et dans le liquide cphalo-rachidien dans les 2,5 min suivant linstillation dans l'estomac (Prelusky et al., 1990). Le pic plasmatique de DON est atteint aprs 15 30 min, et son niveau reste lev pendant environ 9 h (Prelusky et al., 1988). Daprs Dnicke et al. (2004a), le pic est atteint 4,1 h aprs la consommation d'un aliment qui contient 4,2 mg de DON/kg. Mtabolisme Le DON n'est pratiquement pas mtabolis par le porc: plus de 95% du DON marqu inject par voie intraveineuse est excrt sans transformation (Prelusky et al., 1988), et seulement 4 8% du DON est retrouv sous forme de DOM-1 dans l'urine et les fces (Friend et al., 1986c; Prelusky et al., 1988; Dnicke et al., 2004b). Le DOM-1 nest pas prsent dans la bile (Doll et al., 2003). Le trs faible mtabolisme du DON chez le porc a t confirm in vitro par Ct et al. (1987). Chez le porc, le DON n'est donc pas activ en un produit plus toxique, ni mtabolis en un compos moins toxique. La demi-vie du DON dans le plasma est de 2,08 3,65 h (Coppock et al., 1985b). Selon Prelusky et al. (1988, 1990), le devenir plasmatique du DON peut tre dcrit par un modle 3 compartiments avec une phase initiale dpuration rapide (demi-vie de 5.8 ou 5,2 min), suivie d'une phase de distribution plus lente (demi-vie 97 ou 66 min), puis d'une phase d'limination trs lente (demi-vie 510 ou 251 min). La clairance plasmatique du DON est de 1,81 ml/min/kg (Prelusky et al., 1988). Son volume apparent de diffusion, de l'ordre de 1,3 l/kg est beaucoup plus lev que le volume de liquide extra-cellulaire (environ 0,17 l/kg) (Coppock et al., 1985b; Prelusky et al., 1988, 1990). La toxine serait donc capte par les tissus et largement distribue dans l'organisme. Le DON est retrouv dans tous les tissus du porc ds 20 min aprs administration intraveineuse de 1 mg de toxine/kg pc (Prelusky et Trenholm, 1991). Les niveaux les plus levs (1 2 g/g de tissu frais) sont mesurs dans le plasma, les reins et le foie, l'urine et la bile. La graisse, la lymphe, les poumons et les surrnales prsentent des teneurs en DON un peu moins leves (200 500 ng/g), tandis que dans la rate, les testicules, le cerveau, le cur, le muscle, la peau, l'intestin et le pancras, les concentrations sont bien plus faibles (20 165 ng/g). Environ 1/5 des rsidus sont retrouvs dans les graisses, ce qui reprsente 4% de la dose administre. Ainsi, les profils de distribution du DON chez le porc ne montrent pas de capture ou de rtention importante de la toxine dans les tissus et suggrent que les rsidus de DON ne saccumulent pas aprs consommation prolonge daliments faiblement contamins (Prelusky et Trenholm, 1991). Le volume de distribution lev de la toxine serait d sa rpartition large dans l'organisme, ainsi qu' une squestration rapide, mais limite et temporaire, dans certains tissus. Excrtion et rsidus Des tudes bases sur la consommation dun aliment contamin par 5,3 mg de DON/kg (Friend et al., 1986c) ou ladministration intraveineuse de 0,3 mg de DON/kg pc ( Prelusky et al., 1988) montrent que lexcrtion du DON est principalement urinaire (90 94% du DON absorb)???) une faible fraction tant limine dans la bile (3,5%), et seules des traces sont dtectes dans les fces (Friend et al., 1986c;. Aprs administration intra-gastrique de 0,6 mg de DON/kg pc, 68,2% du DON est rcupr dans l'urine, 2,2% dans la bile, et 20,3% dans les fces (Prelusky et al., 1988). La proportion de DOM-1 dans les contenus digestifs augmente partir de l'intestin grle terminal jusqu' atteindre 80% du total du DON et de ses mtabolites dans le rectum (Dnicke et al., 2004a). Le DON est limin rapidement avec environ la moiti en 5,8 h (Dnicke et al., 2004a) et la quasi totalit en 24 h (Prelusky et al., 1988), temps au bout duquel le DON nest plus dtect que dans le rein. En particulier, on n'en retrouve pas dans les muscles squelettiques (Coppock et al., 1985b) et seules des traces sont retrouves dans le foie et les graisses (Prelusky et Trenholm, 1991). Chez des porcs ayant consomm pendant 6 semaines un aliment renfermant 2,2 mg de DON/kg, aucune trace de DON n'est retrouve dans le foie, les reins, le cur, les poumons ou l'estomac si les animaux navaient plus accs l'aliment pendant les 12 15 h prcdant labattage (Pollmann et al., 1985). Dans le cas contraire, seules des traces de DON sont retrouves (Ct et al., 1985; Pollmann et al., 1985; Prelusky et Trenholm, 1992). * Conclusion

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Les particularits du mtabolisme du DON chez le porc expliquent sa plus grande sensibilit cette mycotoxine que les autres animaux domestiques: le DON est largement et rapidement, distribu dans l'organisme, et n'est que trs faiblement mtabolis. Toutefois, les risques de contamination du consommateur de viande porcine sont quasi-nuls, puisque seules des traces de DON sont retrouves dans quelques tissus et organes dans les conditions normales d'abattage (cad 12 24 heures aprs arrt de laccs la nourriture. Les principales consquences de la consommation du DON par le porc sont donc dordre zootechnique et lies la diminution de la consommation daliment induite au-del dune teneur de 1 mg/kg daliment (Tableau 4). Dans le cas de teneurs plus leves, les interactions ventuelles du DON avec la fonction immunitaire mriteraient cependant dtre approfondies. Tableau 4 : Principaux effets du DON observs chez le porc
Paramtre Consommation aliment Vitesse de croissance Efficacit alimentaire Rtention azote Reproducteurs Observations diminution diminution pas d'effet, voire amlioration pas deffet ou diminution pas d'effet amlioration pas d'effet sur le dveloppement sexuel consommation alimentaire rserves corporelles des truies pas d'effet sur le poids des porcelets pas deffet sur le nombre de ns vivants nombre de mort-ns traces de DON dans le lait effets limits et pisodiques: des leucocytes de l'hmoglobine protines, albumine, globulines T4 trs frquente des IgA totales effets non systmatiques pour autres paramtres: ou des IgG ou pas deffet sur prolifration lymphocytes Parfois aprs vaccination ou challenge immunitaire: IgA et IgG anti-ovalbumine anticorps anti-SRBC ou toxine ttanique prolifration spcifique des lymphocytes effets non systmatiques ncrose du pancras, nodules lymphatiques poids relatif du foie poids relatif des reins morphologie de l'estomac (plusieurs tudes) Teneur en DON (aliment) si > 1 mg/kg -1 -1 - 4 - 5 % mg DON kg si > 1 mg/kg -1 -1 - 7 %.mg DON kg < 3 mg/kg > 3 mg/kg 3,7 et 5,3 mg/kg 6,5 mg/kg 4 mg/kg 2 et 3,5 mg/kg si consommation diminue de 2 6,2 mg/kg de 2 6,2 mg/kg 5,7 mg/kg 2, 3,8, 6,2 mg/kg 3 mg/kg 10,5 mg/kg 3,5 mg/kg 3 mg/kg entre 1,4 et 6,6 mg/kg 5,5 et 2,5 ou 1,6 mg/kg 1,6 3,9 mg/kg ou 2,9 et 5 mg/kg 2,5 mg/kg 3 mg/kg ou 1,8 et 4,7 mg/kg 2,5, 1,8 et 4,7 mg/kg 0,5 mg/kg PV en i.v. entre 2,9 et 8,7 mg/kg entre 2,9 et 3,9 mg/kg 0,6 19 mg/kg

Paramtres sanguins

Fonction immunitaire

Effets sur organes et tissus

6.1.2

Les volailles

Effets sur la sant : Comme dans la plupart des espces dlevage, lintoxication par les trichothcnes peut se manifester chez les volailles sous la forme dune intoxication aigu ou chronique. La forme aigu est relativement rare mais assez facile diagnostiquer. La forme chronique est plus difficile dceler, et souvent suspecte en levage sans quun diagnostic de certitude puisse tre toujours tabli (Grevet, 2004). Forme aigu Diffrentes DL 50 des trichothcnes ont t tablies chez la volaille. A titre dillustration, chez le poussin de 1 jour, elles varient de 1,75 2 mg/kg poids vif pour la T-2 et le DAS 140 mg/kg poids vif pour le DON. Les symptmes de lintoxication aigu sont domins par des troubles nerveux et digestifs (Grevet, 2004). Dans les minutes qui suivent ladministration orale une hyperpne apparat, elle saccompagne de lthargie, tte et ailes basses, avec perte dquilibre. Les signes nerveux disparaissent rapidement pour faire place aux signes digestifs. Ces derniers se caractrisent par des efforts de dglutition 110

rpts, la prsence de diarrhe et dun refus total de prise daliment et deau. La mort survient 3,513,5 heures aprs ladministration de la toxine. Les lsions sont domines par un syndrome hmorragique de localisation digestive et musculaire. Dans le cas des scirpnols, des hmorragies massives des rseaux vasculaires du bec et des orteils sont observes. Des ulcrations du ventricule et du proventricule, une ncrose du gsier, et/ou une inflammation accompagne de congestion gnralise lensemble du tractus digestif sont dcrites. Lexamen histologique des tissus lymphodes rvle une dpltion leucocytaire, une ncrose et datrophie de tous les organes lymphodes primaires et secondaires. Chez le poussin dun jour, une goutte viscrale peut galement tre observe. Aprs 7 jours, les survivants ne prsentent aucune lsion macroscopique. Il est intressant de noter que ces tudes sont les seules prsenter un syndrome hmorragique rappelant celui voqu dans les premiers rapports concernant des suspicions dintoxication par les trichothcnes. Les doses massives utilises, atteignant jusqu 8 fois la DL50, ainsi que le trs jeune ge des animaux expliquent peut-tre cette particularit. Forme chronique Comme dans les autres espces, les symptmes de lintoxication chronique par les trichothcnes sont particulirement frustres : les signes neurologiques et la diarrhe observs lors de lintoxication aigu ne sont pas prsents et seule une altration des performances (altration de la croissance, de la production dufs) parfois accompagne de lsions radiomimtiques (lsions cutanes rappelant dans leurs aspects macroscopiques une exposition des radiations ionisantes) peut tre mise en vidence. Quelques rares auteurs mentionnent galement des anomalies du plumage (il est possible que ces altrations soient plus frquentes mais non rapportes car peu spcifiques). Un tableau rsumant ces effets en fonction de la dose et de la dure dexposition est fourni pour la toxine T-2 et le DON (tableaux 5a et 5b). Chez les animaux en croissance, les rsultats exprimentaux sont relativement disparates, notamment en ce qui concerne les effets sur le GMQ et lIC. Lanalyse des rsultats les plus probants et les plus nombreux dmontre une diminution du GMQ et, contrairement ce qui est observ chez lespce porcine, une augmentation de lIC. Dans plusieurs tudes, les niveaux de contamination des aliments entranant une altration du GMQ sont infrieurs celles qui augmentent lIC, suggrant un mcanisme diphasique : 1) baisse du GMQ lie la baisse de consommation alimentaire, 2) baisse du GMQ provoque par des effets cytotoxiques (tableau 5a et 5b). A doses infrieures, cette toxicit pourrait tre masque par la baisse de consommation alimentaire. Chez les poules pondeuses, les effets observs sont domins par un refus partiel de laliment sans consquence significative sur le poids final, mais accompagn dune chute de ponte (proportionnelle au niveau et la dure de lexposition) et la production dufs plus fragiles (tableau 5a et 5b). Les poules et coqs de reproduction seraient plus rsistants, probablement en raison de rserves nergtiques plus importantes que chez les poules pondeuses dufs de consommation. La chute de ponte saccompagne dune diminution de lclosabilit. Laltration de ce paramtre semble plus importante si ce sont les femelles qui sont exposes et non les males. Les palmipdes seraient plus sensibles que les gallinacs. Les lsions observes lors dintoxication chronique par les trichothcnes sont assez vocatrices pour orienter le diagnostic lorsque des troubles zootechniques sont rapports dans un levage (tableau 5a et 5b). Les plus utiles sont certainement les lsions cutanes et laugmentation du poids relatif du gsier. Des lsions des organes lymphodes, inconstantes, peuvent galement orienter le diagnostic. Il est intressant de constater que la svrit des lsions, leur vitesse dapparition et les doses ncessaires leurs apparitions varient selon le pouvoir dermoncrosant des diffrents trichothcnes et lespce considre (tableau 5). Peu dtudes font tat daltrations biochimiques ou hmatologiques lors dintoxication par les trichothcnes. Les seules altrations retrouves rgulirement semblent tre une diminution dactivit de la LDH, des PAL, ainsi quune baisse des protines totales et de lalbuminmie, probablement secondaires une altration des synthses protiques.

111

Tableau 5a : Effets dune administration prolonge de toxine T-2 chez les volailles
Espce Dose* et dure P ; 0.2-2 mg/kg ; 39 sem. P ; 2-16 mg/kg ; 24 sem. CA ; 0.2-4 mg/kg ; 7 sem PP ; 8 mg/kg ; 8 sem. P ; 0.2-4 mg/kg ; 9 sem. P ; 1-16 mg/kg ; 3 sem. P ; 4-10 mg/kg ; 24 sem. PP ; 05-1 mg/kg ; 8 sem. PP ; 1-10 mg/kg ; 4-8 sem. Oie ; 0.2-3 mg/kg** ; 18 j DI ; 2-10 mg/kg ; 4 sem. P ; 10 mg/kg ; 4 sem. CA ; 3-4 mg/kg ; 7 sem. Oie ; 0.6-3 mg/kg**, 18 j. CA ; 0.2-4 mg/kg ; 7 sem. DI ; 10 mg/kg ; 4 sem. PP ; 0.5-8 mg/kg ; 4-8 sem. P ; 1-16 mg/kg ; 39 sem. P ; 0.2-2 mg/kg ; 9 sem. P ; 2-10 mg/kg ; 4 sem. P ; 8-16 mg/kg ; 3 sem. PP ; 4-8 mg/kg ; 8 sem. DI ; 10 mg/kg ; 4 sem. P ; 8-16 mg/kg ; 34 sem. P ; 4 mg/kg ; 3 sem. CA ; 0.2-4 mg/kg ; 7 sem.

Manifestations
RAS, sauf augmentation transitoire du GMQ 0.2 mg/kg les 6 premires semaines. Baisse du GMQ et de consommation alimentaire (latence fonction de la dose)

Rfrences Chi 1977b, Wyatt 1973 Chi 1977b, Diaz 1994, Hoelher 1996, Huff 1988, Kubena 1989, Osborne 1982, Richard 1978, Wyatt 1973, Rafai 2000 Chi 1977a Chi 1977b Wyatt 1973 Hoelher 1996, 1978 Chi 1977a Richard

Baisse de consommation alimentaire. Pas de modification de lIC. Pas de modification de lIC. Augmentation de lIC. RAS Chute de ponte, augmentation du nombre dufs re infertiles (1 sem.) et chute de lclosabilit ( partir de me sem.), proportionnelles la dose la 3 Chutes de ponte et de lclosabilit Baisse du GMQ Augmentation de lIC. 50% 10-70% L : ncrose cutano-muqueuse de la langue, du palais, des commissures de la bouche et du pharynx pour les doses les plus fortes. L : ncrose cutano-muqueuse de la cavit buccale L : ncrose cutano-muqueuse de la cavit buccale L : ncrose cutano-muqueuse de la cavit buccale partir de la troisime semaine. RAS RAS (sauf trs lgre ncrose chez quelques animaux 10 mg/kg). S : stathorre, diminution dactivit lipase, RNase, amylase, trypsine. L : ulcre dans la partie antrieure du gsier. L : diminution de la taille de la bourse de Fabricius, involution thymique acclre L : diminution de la taille de la bourse de Fabricius L : augmentation du poids de la bourse de Fabricius

Performances

Chi 1977a, Tobias 1991 Vanyi 1994 Richard 1978 Richard 1978 Rafai 2000 Vanyi 1994 Rafai 2000 Richard 1978 Chi 1977a, Diaz 1994, Kubena 1989 Chi 1977b, Huff 1988, Wyatt 1973 Chi 1977b Richard 1978 Osborne 1982 Chi 1977a Richard 1978 Richard 1978, 1973 Kubena 1989 Rafai 2000 Wyatt

Mortalit

Peau muqueuses

et

App. digestif

Systme immunitaire

Diminution de la rponse des lymphocytes aux agents mitognes et blastognes, dpression lymphocytaire dans les organes lymphodes 3-4 mg/kg. * : sauf prcision contraire, les doses de toxine sont exprimes en mg/kg daliment. ** : dose exprime en mg/kg de poids vif.

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Tableau 5b : Effets dune administration prolonge de doxynivalnol chez les volailles


Espce, dose* et Manifestations dure P ; 0.3-1.87 mg/kg ; RAS 4 sem. P ; 16 mg/kg ; 3 Diminution du GMQ (transitoire et avec une Performances sem. priode de latence), augmentation de lIC PP ; 0.12-4.9 RAS, sauf ufs un peu plus petits et fragiles mg/kg ; 10-24 sem. 0.7 mg/kg pendant 10 sem. P ; 0.3-1.87 mg/kg ; RAS Mortalit 4 sem. P ; 16mg/kg ; 3 L : ncrose cutano-muqueuse de la cavit buccale Peau et sem. muqueuses PP ; 0.7-4.9 mg/kg ; RAS 12-24 sem. P ; 0.3-1.87 mg/kg ; RAS 4 sem. App. digestif P ; 16 mg/kg ; 3 L : augmentation du poids relatif du gsier. sem. PP ; 0.12-4.9 Augmentation de lincidence de malformations Reproduction mg/kg ; 10 sem. lclosion. Systme P ; 16mg/kg ; 3 L : augmentation du poids de la bourse de immunitaire sem. Fabricius P ; 16mg/kg ; 3 Diminution du VGM sem. Hmatologie P ; 16mg/kg ; 3 Diminution du nombre de globules rouges et de sem. lhmatocrite P ; 16mg/kg ; 3 Diminution de Pl-triglycrides et de lactivit de la Biochimie sem. LDH. * : sauf prcision contraire, les doses de toxine sont exprimes en mg/kg daliment. Rfrences Hulan 1982 Huff 1986, Kubena 1989 Bergsj 1992, Hamilton 1984 Hulan 1982 Kubena 1989 Hamilton 1984 Hulan 1982 Huff 1986 Bergsj 1992 Kubena 1989 Kubena 1989 Huff 1986 Huff 1986

Toxicocintique et transfert tissulaire Labsorption orale du DON et de la toxine T2 est faible chez les volailles (<10% 6h). A titre dexemple, chez la poule pondeuse, aprs administration par gavage de 0,25 mg/kg PV de DON, le pic plasmatique moyen est observ 2,25 heures et la biodisponibilit moyenne est de 0,64 %, de grandes variations interindividuelles tant notes (Chi et al., 1978b, Giroir et al., 1991, Prelusky et al., 1986a). Comme dans les autres espces, la distribution des trichothcnes est large et rapide (tableau 5c). Les concentrations tissulaires maximales en DON, T-2 et leurs mtabolites sont observes 3 heures pour le foie et les reins et 4-6 heures pour le muscle, le tissu adipeux et loviducte. Les concentrations les plus importantes se retrouvent dans le tractus digestif antrieur, le rein, le foie, la vsicule biliaire et la rate. Les profils de distribution plasmatique ne montrent pas de pic secondaire rvlateur dun cycle entro-hpatique (Chi et al., 1978a, Prelusky et al., 1986a). Lors dadministrations rptes (tableau 5d) les teneurs maximales tissulaires en DON sont atteintes rapidement et restent sensiblement constantes sur la dure de lexposition. Les concentrations les plus importantes sont observes dans les mmes organes que lors dadministration unique (Prelusky et al., 1986a). Une administration prolonge de trichothcnes entrane leur persistance des niveaux suprieurs une administration unique ; dcroissance des rsidus est aussi plus lente (tableaux 5c et 5d).

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Tableau 5c : Rsidus en quivalent-toxine suite une administration unique


Toxine Espce Voie Dose (mg/kg PV) Tissus muscle DON Poule VO 1.3-1.7 foie reins Poulet T-2 Poulet/ Canard ND : non dtectable VO 5 VO 0.126/1.895 muscle foie reins muscle foie reins Rsidus (g/kg) 6h 12 h 24 h 8.46 6.6 4.3 74 165 56 123 30 44 17/220 32/416 24/327 <10 10/<10 <10 t 2j 2.1 13 19 4j ND ND 2 15.7 h 8.2 h Prelusky et al., 1986a Rfrences

Chi et 1978a <10 <10 <10

al.,

30 130/90 30

30 30/40 20

Giroir et al., 1991

Tableau 5d : Rsidus en quivalent-toxine suite une administration prolonge


Toxine Espce Voie Dure Dose 1.3-1.7 mg/kg PV 5 mg/kg daliment Tissus muscle foie reins muscle foie reins Rsidus (g/kg) 2j 4j 6j 8j 16 17 10 11 37 60 <10 41 51 39 55 25 21 Rfrences

10j 7 15 15

12j 3 9 9

Poule DON Poulet

VO

6j

Prelusky et al., 1986a

VO

28-190 j

El-Banna et al., 1983

Le mtabolisme des trichothcnes chez la volaille est intense. Si in vitro, les microsomes hpatiques de poulet semblent moins actifs que ceux des mammifres pour biotransformer la toxine T-2 (Knupp et al., 1987b, Kobayashi et al., 1987), le profil mtabolique de cette toxine dans les excrtas de canard et de poulet 18 heures aprs une injection intra-pritonale tmoigne dun mtabolisme intense avec 41% de 3-OH-HT-2, 18% de HT-2, 16.5% de 3-OH T-2, 10% de 4-dactylnosalaniol, 5% de 4-actoxy T-2 ttraol et des traces de T-2 ttraol, 8-actoxy T-2 ttraol, T-2, T-2 triol et 3actoxy-3-OH HT-2 forms (Visconti et Mirocha, 1985). Dans le foie, la toxine T-2 non mtabolise est la plus abondante, suivie du 3-OH HT-2, suivi dans des quantits moindres de HT-2, T-2 triol et de traces de 4-dactyl-nosalaniol, 4-actoxy-T-2 ttraol, T-2 ttraol et T-2 (Giroir et al., 1991, Visconti & Mirocha, 1985). La flore digestive de poulet est trs active dans la mtabolisation du DON en DOM-1. Ainsi, au terme dune culture en anarobiose de 96 heures, seulement 1,8 % du DON nest pas transform en DOM-1 (He et al., 1992, 1993), alors que 57 % du DAS sont mtaboliss en MAS et en STO (Swanson et al., 1988). Llimination des trichothcnes est rapide (plus de 50% en 24 heures) et essentiellement fcale. Chez le poulet et le canard, 30 minutes aprs gavage par 0,5 mg/kg poids vif de toxine T-2 radiomarque, la radioactivit se concentre dans la bile pour atteindre un maximum au bout de 12 heures, alors que les teneurs rnales restent faibles. Lexcrta contient 25 % de toxine au bout de 6 heures et 60 %au bout de 24 h. Au terme de ces 24 heures, le gros intestin et les caeca contiennent encore 25 % de la quantit de toxine administre (Chi et al., 1978a, Giroir et al., 1991). Llimination du DON se dcomposerait en deux phases : une phase dexcrtion trs rapide, durant environ 3 heures, et une phase dlimination plus lente de 6 heures. Au-del, seules des traces de toxines sont encore dtectes dans le plasma. Au bout de 48 heures, la toxine et ses mtabolites ne sont plus dtectables. La bile semble la voie dexcrtion majeure du DON. La toxine sy concentre trs rapidement (excrtion maximale 12 heures, avec une concentration 100 fois suprieure la concentration plasmatique). Les concentrations en DON et ses mtabolites sont faibles dans les autres organes ou tissus, y compris le rein (Prelusky et al., 1986a). La production dufs constitue pour les volailles une autre forme dexcrtion des trichothcnes. Essentiellement sous forme mtabolise, cette excrtion est quantitativement minime aprs dadministration unique. Ainsi, chez la poule, aprs administration de 0,25 mg/kg PV de toxine T-2 par intubation gastrique, le maximum dexcrtion dans luf est atteint 24 heures et ne reprsente que

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0,175 % de la dose administre . Aprs 2 et 7 jours, luf ne contient respectivement plus que 0,1 et 0,025 % de la dose administre. La toxine T-2 et/ou ses mtabolites sont dtects dans le jaune, le blanc et les enveloppes (Chi et al., 1978b). Le DON suit le mme profil que la toxine T-2. Aprs une administration orale unique de 1,3-1,7 mg/kg poids vif, le maximum atteint dans les parties comestibles de luf 24 heures est de 1,91 g de DON et de ses mtabolites, soit 0,087 % de la dose administre. Aprs 2 et 4 jours, la teneur slve respectivement 0.058 et 0.0049 %. La radioactivit spcifique 24 heures est maximale dans le blanc, suivi des enveloppes et du jaune (dans un rapport de 1:5 environ par rapport au blanc). Seulement 10 % de la toxine se trouve sous sa forme originelle (Prelusky et al., 1987a). Lors dadministration chronique, mme si les quantits excrtes dans les ufs sont plus importantes, elles restent modres. Chez des poules, ladministration orale journalire de 0,1 mg/kg poids vif de toxine T-2 pendant 8 jours, entrane une accumulation de la toxine et/ou ses mtabolites dans le jaune alors quun plateau est atteint pour le blanc et les enveloppes au bout de 3 jours. A larrt de lexposition, la concentration en toxine diminue trs rapidement dans toutes les parties de luf. En moyenne, le niveau de contamination des parties comestibles de luf serait de 0,9 g avec un aliment contamin hauteur de 1,6 mg/kg, ce qui reprsente 0,56 % de la dose de toxine T-2 administre quotidiennement (Chi et al., 1978b). Les rsultats obtenus lors dadministration dun aliment contamin par du DON diffrent peu de ceux obtenus avec T-2. La distribution pendant 65 jours dun rgime contamin hauteur de 5,5 mg/kg de DON dtermine une contamination maximale de luf au 8me jour aprs une accumulation plus rapide et plus forte dans le jaune que dans le blanc. Un uf contient alors 1,7 g de DON et de ses mtabolites, soit 0,31 % de la dose quotidienne apporte. Seulement 0-10 % de la toxine se trouve encore sous sa forme originelle. La prsence du DON et de ses mtabolites diminue sensiblement jusquau 30me jour, pour se stabiliser ensuite : luf nen contient alors plus que 0.4 g soit 0.07 % de la dose quotidienne. Cette baisse pourrait tre attribue une modification progressive de lquipement enzymatique de la poule et donc du devenir du DON (El-Banna et al., 1983, Prelusky et al., 1987a, Prelusky et al., 1989). 6.1.3 Les ruminants

La contamination possible des rafles de mas et du mais densilage par le DON (Drochner et al. 1984 ; Oldenburg et al. 1996 ; Dieber et Kofer 1999 ; Hochsteiner et Schuh 2000, 2001) corrobore le risque dexposition des ruminants. Daprs une enqute mene en Allemagne sur le mas destin au fourrage (196 chantillons), les teneurs en DON taient suprieures 300 g/kg pour 59% des chantillons, 2000 g/kg pour 9,2% et 5000 g/kg pour 2,6% (Oldenburg et Hppner, 2003). Les fourrages traditionnels utiliss au pturage ou stocks sous forme humide (ensilage, balles enrubannes) ou sche (foin, herbe dshydrate) peuvent tre contamins par Fusarium spp. produisant du DON (Di Menna et Parle, 1970). La synthse de DON peut cependant tre considre comme ngligeable lors de la conservation des fourrages (Burmeister et al. 1965) puisque les conditions ncessaires au dveloppement de ces champignons (arobiose, prsence deau libre) ne sont pas runies simultanment.

Effet sur ltat sanitaire et les performances des ruminants Chez des vaches laitires taries , recevant du concentr base de bl naturellement contamin par 1,5 6,4 mg/kg de DON pendant 10 semaines, une diminution de la consommation de nourriture est observe la plus forte concentration et un retour la normale est obtenu aprs distribution du concentr contenant 1,5 mg/kg de DON ; dans cette tude, la prsence dautres toxines na pas t recherche (Trenholm et al., 1985). La consommation de mas artificiellement contamin par Fusarium graminearum (jusqu 66 mg/kg de DON dans la ration) ne modifie pas la consommation alimentaire, ni la production de vaches en lactation (Ct et al., 1986b). Daprs Whitlow et al. (1994), le DON peut entraner une baisse significative de la production laitire de la vache, en partie explicable par une diminution des quantits daliments ingrs. Cependant, dans une exprimentation utilisant de lorge contamin, Ingalls (1996) nobserve pas deffet significatif du DON sur les quantits daliments ingres, sur le poids vif des animaux, sur la production ou la composition du lait ni sur le pH du contenu ruminal. La concentration des acides gras volatils dans le rumen qui traduit lefficacit des fermentations, na pas t modifie par lingestion de bl contenant 3,1 et 3,5 mg/kg de DON. Selon lEFSA (2004), la

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distribution dun concentr contenant 5,0 12,1 mg DON/kg de matire sche naurait pas deffet sur la consommation daliments ni sur la production laitire. Des essais similaires ont t conduits sur des moutons en croissance. Chez des agneaux nourris pendant 28 jours avec un bl contenant 15,6 mg de DON/kg, aucune modification de la consommation de nourriture, ni des performances zootechniques na t observe (Harvey et al.,1986). En revanche, une dose de 5 mg de DON par/kg p.c. introduite directement dans le rumen de moutons a entran une diminution de 44% de la consommation alimentaire et de 5% de la digestibilit de la ration (Brewer et al., 1996). Toutefois, ces conditions extrmes (dose unique et leve de toxine pure) ne sont pas reprsentatives de conditions susceptibles dtre rencontres sur le terrain. Le ruminant semble relativement bien protg contre le DON jusqu la dose de 12 mg/kg daliment (Eriksen et Pettersson, 2004). Peu dtudes ont t ralises sur les effets de la T-2 chez les ruminants. Comme la dpoxydation de T-2 dans le rumen rduit fortement sa toxicit (Swanson et Corley, 1989), le jeune animal dont le rumen nest pas fonctionnel pourrait tre plus sensible. Chez de jeunes veaux, une contamination de lordre de 20 mg T-2 /kg daliment a entran des refus daliment, des diarrhes, des pertes de poids, ainsi quune diminution de la taille du thymus et des surrnales (Osweiler et al., 1985). En conclusion, les tudes menes montrent que ltat sanitaire et les performances zootechniques du ruminant ne semblent pas altrs lors de lingestion dune teneur en trichothcnes dune dizaine de mg/kg daliment.

Devenir dans le rumen Les microorganismes du rumen dgradent le DON en ouvrant le cycle poxy pour former le dine 12,13-dpoxydoxynivalnol ou DOM-1 (King et al., 1984 ; Ct et al.,1986a). Cette bioconversion du groupement poxy (responsable de la toxicit) est effectue par une poxyde rductase microbienne, entrane une diminution significative de la toxicit du DON chez le ruminant. Selon Ueno (1980), lpoxyde rductase implique serait de type thiol, groupement trs actif vis vis des groupements poxy.
Le carbone-4 de La toxine T-2 est rapidement dactyl dans le rumen pour former la toxine HT-2 qui est ensuite dactyle au niveau du carbone-15 en T-2 triol (Yoshizawa et al., 1981, 1985). Lisovalryl-dactylation du carbone-8 forme le nosolaniol (Westlake et al., 1987). Les voies de bioconversion ruminale des trichothcnes sont rsumes dans la figure 2. 90% de la dactylation du DAS et de la T-2 provient de lactivit des protozoaires (Hussein et Brasel, 2001). Ainsi les protozoaires jouent un rle plus important que les bactries dans le mtabolisme des trichothcnes dans le rumen (Westlake et al. 1989).

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DON (1) DOM-1 (2) MAS (2)

DAS (1) + De-DAS (1) (2) (3)

T-2 (2) Neosol (2) (1) De-HT-2 De-Neosol T-2 triol De-T-2 triol HT-2

Sci-triol

De-MAS

(1)

(2)

(1) De-Sci-triol

(2) T-2 tetraol (1) De-T-2 tetraol

Figure 4 : Voies mtaboliques possibles de transformation des trichothcnes dans le rumen (schma de Mackie et White 1990 modifi par Jouany)
DON = deoxynivalenol; DOM-1 = deepoxy deoxynivalenol; DAS = diacetoxyscirpenol; MAS = monoacetoxyscirpenol; De-DAS = deepoxy diacetoxyscirpenol; Sci-triol = scirpentriol; De-MAS = deepoxy monoacetoxyscirpenol; De-Sci-triol = deepoxy scirpentriol; Neosol = neosolaniol; De-HT-2 = deepoxy HT-2; De-Neosol = deepoxy neosolaniol ; De-T-2 triol = deepoxy T-2 triol; De-T-2 tetraol = deepoxy T-2 tetraol. [reactions of deepoxidation (1), deacetylation (2), isovaleryl deesterification (3)].

Les bactries du rumen qui possdent une activit estrase comme Butyrivibrio fibrisolvens, Selenomonas ruminantium et Anaerovibrio lipolytica, sont vraisemblablement impliques dans les ractions de dactylation ruminale. Westlake et al. (1987) a notamment montr que la croissance de B. fibrisolvens en culture nest pas affecte par 1 mg/mL de T-2. Aucun effet du DON (100 g/mL) na t mis en vidence sur les deux bactries du rumen Ruminococcus albus, qui joue un rle dterminant dans la cellulolyse et produit de lhydrogne et Methanobrevibacter ruminantium qui utilise cet hydrogne (May et al., 2000).

Absorption et excrtion chez les ruminants : cas du lait Les proprits physicochimiques du DON, faible poids molculaire (296,3), hydrosolubilit (lie la prsence dune fonction alcool primaire et deux fonctions alcools secondaires), expliquent sa vitesse dabsorption et son taux dexcrtion.
Chez deux vaches ayant reu une dose orale unique de 920 mg de DON , les concentrations sanguines maximales taient respectivement de 200 et 90 ng/mL 4,7 et 3,5 h aprs ladministration, et infrieures 2 ng/mL aprs 24 h (Preluski et al.,1984). La forme libre et la forme conjugue reprsentent respectivement 24 et 46% du DON sanguin. En premire approche, labsorption du DON et de ses mtabolites est estime 30% sur 24 heures. Les quantits extrmement faibles dtectes dans le lait ( 4ng/mL) ont conduit les auteurs considrer le DON ingr nest pas significativement transfr dans le lait. Des rsultats similaires ont t obtenus par Ct et al. (1986b) : aprs distribution pendant 5 jours de mas densilage naturellement contamin par du DON (66 mg/kg daliment) trois vaches laitires, environ 20% du DON est excrt sous forme de dpoxy DON non conjugu (96%) et de DON (4%) dans lurine et les fces o ils ne sont plus dtects au-del de 72 h ; dans le lait, aucune trace de DON libre na t dtecte (LOD = 1 ng/ml) seules des concentrations de DOM-1 dpoxyl, hauteur de 26 ng/mL ont t dceles pendant les cinq jours du traitement. Dans 3 lots de 6 vaches laitires, recevant respectivement 0, 3 et 6 mg de DON/kg pendant 10 semaines (bl et des pis de mas naturellement contamins), aucun transfert de DON ou de DOM-1 na pu tre dtect dans le lait (Charmley et al., 1993). Preluski et al. (1987b) en utilisant du 14C-DON

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chez des brebis ont indiqu la prsence de DON ou de son mtabolite conjugu dans le lait tait rduite. Ainsi, le transfert du DON ingr dans le lait des ruminants nest pas significatif. La prsence du DOM-1 dans le lait ne prsente pas de risque pour le consommateur compte tenu de lexcrtion rduite et de la toxicit faible de ce mtabolite du DON. Selon Eriksen et Pettersson (2004), la toxine T-2 serait trs peu prsente dans le lait commercialis. En conclusion, les donnes disponibles conduisent considrer que le transfert des trichothcnes dans le lait de ruminants est ngligeable et ne poserait pas de problme de sant publique.

6.1.4 Animaux de compagnie et de loisirs Les animaux de compagnie et de loisirs ne diffrent pas fondamentalement des animaux domestiques dlevage en matire dexposition et deffets des mycotoxines, mais ils prsentent une diffrence notoire en rapport avec la durabilit de laction toxique inhrente leur longue esprance de vie. Pour ces espces, il savre donc particulirement pertinent de dterminer non seulement limpact de consommation de faibles doses de TCT sur de trs longues priodes avec ses rpercussions sur la fonction sanguine, lintgrit des pithliums, la fonction hpatique, la fonction de reproduction ou la baisse dimmunit, mais aussi le risque ponctuel li des contaminations massives associs un tableau clinique plus vident,. Les quids Les donnes disponibles sur la sensibilit des quids consommant des aliments contamins par les TCT sont de mieux en mieux documentes, notamment celles relatives au DON. Toxine T-2 chez le cheval Deux cas anciens dintoxication par la toxine T-2 sont rapports dans la littrature. Le premier concerne deux chevaux ayant consomm un aliment contenant de lorge contamine par la toxine T-2 (25 mg/kg) en Colombie Britannique (Greenway et Puls, 1976) et qui ont prsent une apathie, une hypersialorrhe et de lhyperthermie. Le second concerne 30 chevaux adultes ayant consomm un mlange base de mas grain, de rafle de mas et de son de bl contenant 204 mg/kg de toxine T-2, parmi lesquels 12 succombrent dans un dlai maximum de 4 semaines aprs avoir prsent des troubles locomoteurs graves. Des modifications importantes de la formule sanguine (leucocytose, anmie) et une dgnrescence graisseuse du foie furent notamment observes (Gabal et al., 1986). Par ailleurs, chez 6 juments, ladministration per os de 7 mg de toxine T-2 par jour pendant 30 42j, na permis dobserver quune dermatite prilabiale rgressant rapidement la fin de lessai chez 3 des juments. Aucun effet dltre sur lactivit ovarienne et la fonction de reproduction na t observ (Juhasz et al., 1997). DON perte de poids et atteinte hpatique chez le cheval Dans une tude rcente portant sur 5 chevaux adultes, aucune dpression de lapptit, ni altration plasmatique ou hmatologique notables nont t observes aprs consommation durant 40 jours, en complment du pturage, de 1,3 kg dorge naturellement contamine par 36 44 mg/kg de DON (soit environ 50 mg / animal / jour) (Johnson et al. (1997). Par contre, dans un essai de 21 jours durant lequel des chevaux adultes ont consomm 2,8 kg/j de concentrs base de crales (bl et mas) naturellement multicontamins (15 mg/kg de doxynivalnol soit environ 40 mg / animal / jour ; 0,8 mg/kg de 15-actyldoxynivalnol ; 9,7 mg/kg dacide fusarique et 2 mg/kg de zaralnone), une baisse significative de la consommation du concentr, ainsi quune augmentation transitoire de la gamma-glutamyl transfrase plasmatique, signe dune atteinte hpatique prcoce, ont t releves (Raymond et al., 2003). Le mme type de protocole, conduit sur des chevaux consommant 3,5 kg/j de concentrs base de crales (bl et mas) naturellement multicontamins (11 mg/kg de doxynivalnol soit environ 40 mg/animal/jour ; 0,7 mg/kg de 15-actyldoxynivalnol et 0,8 mg/kg de zaralnone) a montr des rsultats analogues, notamment une baisse significative de la consommation daliments et une perte de poids au terme des 21 jours de lessai (Raymond et al., 2005). Peut-tre lacide fusarique, frquemment associ aux autres mycotoxines dans les crales multicontamines, a-t-il accru la toxicit du DON. Cette action potentialisatrice de lacide fusarique sur la toxicit du DON chez les chevaux a dj t dcrite chez dautres espces animales, le porc notamment (Smith et al., 1997).

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Les crales en grains ne constituent pas la seule source de contamination en DON. Ainsi, Zeyner et al. (2002) rapportent un pisode de perte de poids survenu sur environ la moiti dun effectif de 104 chevaux ayant, durant plusieurs mois, eu accs une litire faite dune paille dun stockage de plein champ et contamine par 0,5 2,7 mg/kg de DON. Latteinte hpatique observe paralllement et matrialise par des taux plasmatiques anormalement levs en acide glutamique dshydrognase (163 108 ui/L) et en gamma-glutamyl transfrase (151 58 ui/L) na rtrocd quaprs retrait de la paille avarie. En dfinitive, les chevaux, initialement considrs comme relativement rsistants la contamination par DON, semblent, lors de consommation chronique, prsenter une plus grande sensibilit, avec une baisse notable de la consommation alimentaire et une perte significative de poids. La disparit des niveaux de contamination associs lobservation de dsordres cliniques tient sans doute des synergies entre les diverses mycotoxines produites par le Fusarium, gnralement prsentes et non toujours systmatiquement recherches. En consommation chronique, un seuil critique de 2 mg/kg de DON semble devoir ne pas tre dpass dans les aliments pour les quids. Les carnivores domestiques De frquentes remontes du terrain laissent penser que les carnivores domestiques (canids notamment) seraient susceptibles de manifester un refus alimentaire lors de la consommation daliments secs contenant des crales avaries (bl notamment). En 1995, un fabricant daliment nord amricain a dailleurs rappel 16 000 tonnes daliments secs la suite dune contamination de ses croquettes par le DON . Une telle msaventure sexplique dautant mieux que le DON rsiste la strilisation, lautoclavage, mais aussi la cuisson-extrusion lors de la fabrication des aliments secs pour chiens ou pour chats (Hughes et al., 1999 ; Wolf-Hall et al., 1999). Aucune donne de terrain nest disponible pour les autres TCT (toxines T-2 et HT-2 notamment). DON et refus alimentaire chez les carnivores domestiques Hughes et al. ont conduit une srie dessais sur chiens et chats en utilisant du bl naturellement contamin en DON (37 mg/kg). Les aliments secs produit selon un procd dextrusion classique ont t formuls pour contenir in fine 0, 1, 2, 4, 6, 8 et 10 mg de DON par kg daliment. Dans un essai conduit durant 14 jours sur des chiens, les animaux recevant les aliments doss 0, 1, 2 ou 4 mg/kg de DON ont consomm leur ration quasi-normalement et nont prsent aucun trouble digestif (vomissement notamment). Les 14 chiens recevant laliment contenant 6 mg/kg de DON ont progressivement rduit leur consommation daliment, en relation linaire avec le temps, et perdu rgulirement du poids, mais nont pas prsent de vomissements. Le niveau de consommation daliments est revenu la normale aprs distribution dun aliment sain. Les 2 chiens recevant laliment contenant 8 mg/kg de DON ont trs rapidement prsent des vomissements, puis ont fortement rduit leur niveau de consommation (jusqu 21% du niveau de rfrence), ont prsent une chute significative de poids et furent retirs de lessai au 8me jour. Les 13 chiens recevant laliment le plus fortement contamin (10 mg/kg de DON), ont majoritairement (en dpit de fortes variations individuelles) prsent des vomissements importants ds le premier jour, et comme les chiens prcdents, ont trs fortement rduit leur niveau de consommation (jusqu 15% seulement du niveau de rfrence pour certains), et ont perdu du poids. Pour les auteurs, le seuil de chute de la consommation alimentaire se situe chez le chien 4,5 1,7 mg de DON par kg daliment (soit 0,09 mg/kg pc/j) et la dose sans effet avoisine 0,06 mg/kg pc/j. Par ailleurs, les auteurs ont galement montr que les chiens initialement exposs laliment contamin, puis un aliment sain, refusent ultrieurement de consommer nouveau (en libre choix) laliment contenant du DON. Dans lessai conduit sur les chats, les animaux recevant les aliments doss 0, 1, 2, 4, 6 ou 8 mg de DON /kg durant 14 jours ont consomm leur ration quasi-normalement, nont prsent aucun trouble digestif (vomissement notamment lexception dun cas isol), mais ont tous perdu du poids (5 10 g/j). Les 8 chats recevant laliment renfermant 0 mg de DON /kg ont majoritairement, comme les chiens, (avec de fortes variations individuelles) prsent des vomissements importants ds le premier jour, ont fortement rduit leur niveau de consommation (46% seulement du niveau de rfrence en moyenne), et ont galement fortement maigri (22 g/j). Pour les auteurs, le seuil de dtrioration de la

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consommation alimentaire se situe chez le chat 7,7 1,2 mg de DON par kg daliment (soit 0,135 mg/kg pc/j) et la dose sans effet avoisine 0,110 mg/kg pc/j. En dfinitive, le DON, toxine fusarienne la plus frquente, prsente une toxicit similaire chez le chien, le chat et le porc, espce considre comme la plus sensible. Cependant, si dans les deux espces carnivores, les vomissements surviennent pour un niveau de contamination de lordre de 8 10 mg de DON par kg daliment, la baisse de la consommation daliments peut survenir pour des valeurs plus basses en fonction des individus (3 mg chez le chien et 6 mg chez le chat). Labsence de neutralisation de cette mycotoxine lors du procd habituel de fabrication des aliments pour carnivores domestiques et la consommation en continu dun mme aliment requirent une grande vigilance des industriels vis--vis des approvisionnements en crales et drivs de crales. Si, sur une courte priode, le seuil de dtrioration du niveau de consommation alimentaire se situe 4,5 mg de DON par kg daliment chez le chien et 7,7 mg de DON par kg daliment chez le chat, en consommation chronique, un seuil critique de 1 mg/kg de DON semble devoir ne pas tre dpass dans les conditions pratiques dalimentation des carnivores. Toxine T-2 chez le chat La toxine T-2, la plus toxique des TCT, na jamais t implique dans des accidents de carnivores domestiques. Seules les donnes dun essai toxicologique (Lutsky et Mor, 1981) conduit sur des chats pour tenter de reproduire les manifestations bien connues de laleucie alimentaire toxique de lHomme, a t concluant avec mise en vidence du mme tableau symptomatologique (aplasie mdullaire, pancytopnie, troubles de lhmostase, etc.) aprs ladministration per os de 0,08 mg/kg pc tous les 2 jours. Les 10 chats du test sont tous morts dans un dlai maximal de 32 jours (temps moyen de survie de 21 jours). La sensibilit particulire des flids vis--vis de la toxine T-2 ne serait quune preuve de plus de lincapacit de cette espce recourir la glucuronoconjugaison, voie habituelle de mtabolisation de cette toxine.

6.1.5

Les poissons

Intoxication aux TCT observes sur le terrain : Comme des crales sont susceptibles dtre contamines par les TCT et dtre incorpores dans les aliments pour poissons, telles quelles ou aprs avoir t transformes, les poissons peuvent tre exposs aux TCT. A notre connaissance, aucun cas d'intoxication aux TCT en pisciculture na t rapport dans la littrature scientifique.

Etudes exprimentales menes sur les poissons : Gogal et al. (2000) ont montr l'induction de l'apoptose des cellules immunes (lymphodes) chez le tilapia (Oreochromis niloticus) aprs injection pritonale dune solution contenant de la toxine T-2, ce qui suggre que les poissons ont une rponse immunologique similaire celle des mammifres aprs exposition un compos immunotoxique. Aucune autre donne nest disponible sur un quelconque effet des trichothcnes sur les poissons.

6.2. Exposition animale La mthodologie gnrale est expose en annexe 2 6.2.1. Donnes de contamination 2386 valeurs de contamination en DON ont t recueillies, rparties sur 30 types daliments. Pour certaines matires premires, ces donnes ne sont pas exploitables (moins de 5 donnes, problme de libell), de sorte que 2343 donnes de contamination sur 15 types daliments sont disponibles.

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Tableau 6a : Rpartition des donnes de contamination par groupe de matires premires (n>= 5)
Nombre de donnes avoine bl bl dur coproduit de bl dur corn feed fveroles gluten feed de bl issues de crales mas orge paille de bl pois remoulage son triticale Total 19 795 267 16 22 19 84 21 633 106 10 101 46 158 46 2343 0.0 15.0 30.0 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 3.9 0.9 0.0 94.1 0.0 0.0 0.0 14.5 % < LOD 68.4 76.2 64.0 100.0 95.5 0.0 100.0 100.0 93.4 52.8 100.0 4.0 100.0 99.4 73.9 78.1 % > LOQ

Parmi ces donnes, 14.5% des valeurs sont infrieures la limite de dtection et 78.1% sont suprieures la limite de quantification. Les estimations des teneurs > LOQ (moyennes et aux 75me et 95me percentiles comme dcrit dans la mthodologie gnrale) sont compares aux teneurs rglementaires pour les aliments complets (Recommandation 2006/576/CE). Les donnes analytiques de bl dur provenant de lenqute ONIC ont t distingues des autres analyses bl : ces 2 matires premires prsentent une diffrence non significative de la moyenne de contamination.. Cependant, toutes les autres sources de donnes, na pas fait de distinction sur le type (dur ou tendre), ce qui a pu avoir une influence sur lamoyenne de contamination relie au le libell bl .. On retrouve la gradation de la contamination entre les crales, notamment le classement entre bl, remoulage et son, plus contamin. Les statistiques descriptives des niveaux de contamination selon les scnarii indiqus sont fournis en annexe (rsultats sont prsents pour les niveaux de contamination en poids frais (12% dhumidit), tel que dans la recommandation. 6.2.1. Calcul de lexposition Les calculs de contamination des rations sont indiqus dans les tableaux 6b et 6c suivants (les tableaux dtaills des rsultats sont en annexe II) : Pour les herbivores, ruminants (notamment bovins) : lexposition na pas t calcule car les rgimes comportent, pour une trs large part, des matires premires pour lesquelles les donnes de contamination sont manquantes ou insuffisantes (pturages, ou encore ensilages et autres fourrages) (cf annexe 2 Exposition animale : Mthodologie gnrale ). - Pour les volailles

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Contamination minimale calcule Espces Poulet standard Phases dlevage dmarrage croissance finition retrait dmarrage Poulet label croissance finition-retrait dmarrage Poule pondeuse croissance repro-entretien pondeuse dmarrage Dinde croissance 1 croissance 2 finition 1 finition 2 finition 3 dmarrage Pintade croissance finition-retrait canard dmarrage Canard Barbarie canard croissance canard finition Canard prt gaver levage gavage en g/kg d'aliment 305.6 290.0 270.1 295.3 416.2 492.3 472.2 404.3 449.4 459.3 418.1 200.1 188.6 221.0 280.7 250.8 269.3 422.2 480.0 527.5 359.4 400.4 400.0 444.8 825.3

contamination des positifs au p75 au p95 % de la ration en g/kg d'aliment % de la ration 58.5 369.8 1249.7 58.5 62.2 342.0 1252.2 62.2 62.6 312.3 1212.6 62.6 68.4 341.5 1325.4 68.4 65.8 519.8 1565.6 65.8 77.6 615.7 1849.7 77.6 79.7 597.7 1805.8 79.7 68.8 509.5 1549.7 68.8 76.7 559.9 1730.8 76.7 79.5 575.6 1771.3 79.5 65.1 517.0 1568.1 65.1 40.9 238.7 844.4 40.9 47.5 221.6 871.4 47.5 55.0 261.8 1013.1 55.0 58.3 333.5 1193.7 58.3 66.0 296.4 1179.0 66.0 64.3 308.9 1228.6 64.3 58.2 548.2 1490.7 58.2 62.5 619.6 1671.5 62.5 65.4 685.3 1804.0 65.4 70.4 432.7 1485.9 70.4 79.1 481.0 1662.4 79.1 81.8 476.9 1688.5 81.8 75.0 551.6 1718.5 75.0 98.0 1078.0 2779.3 98.0

Rec 2006/576/CE valeurs limites DON en g/kg d'aliment 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 5000

NB : La part de la ration (exprime en pourcentage) prise en compte dans le calcul de lexposition varie selon les scenarii : dans le cas de la contamination moyenne, elle correspond aux matires premires pour lesquelles on a des donnes (mme si elles sont ND), dans le cas des scnarii de contamination aux p75 et p95 des teneurs positives, elle correspond aux matires premires pour lesquelles les teneurs sont suprieures la LOD.

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La contamination est la plus faible pour les dindes ainsi que pour les poulets standard (les pourcentages de la ration pris en compte sont les plus faibles : 55 60%). Aucun dpassement de la valeur recommande nest observ pour une espce mme aux forts percentiles de contamination. Pour les autres espces, les pourcentage de la ration pris en compte sont approximativement de 75%. Pour les porcs

Tableau 6c : Calculs de contamination en DON des rations pour les porcins Contamination minimale calcule

contamination des positifs Rec 2006/576/CE en g/kg d'aliment valeurs limites DON Porcins en g/kg d'aliment % de la ration au p75 au p95 % de la ration en g/kg d'aliment 1er ge 375.4 57.0 474.5 1382.8 57.0 900 2me ge 349.8 78.0 430.2 1386.9 78.0 900 croissance corpen 324.4 83.0 431.7 1319.4 83.0 900 finition corpen 439.0 87.0 569.8 1679.0 87.0 900 truies gestantes 423.1 85.0 535.5 1564.7 85.0 900 truies allaitantes 419.5 80.0 532.1 1519.8 80.0 900 En fonction de la phase dlevage, la moiti de la valeur limite recommande est atteinte que ce soit dans les scnarii de contamination moyenne ou au p75. Au niveau extrme de contamination (p95), tous les rgimes sont au dessus de la valeur limite. Compte-tenu de son rgime particulier, seul le calcul pour les porcins 1er ge ne prend en compte que moins de 60% de la ration. Pour les autres rgimes, sont pris en compte jusqu 85% de la ration totale.

7. Rglementation Pour lalimentation humaine, dans le cadre du rglement 1126/2007/CE modifiant le rglement 1881/2006/CE (abrogeant lui mme le rglement 466/2001/CE et ses modifications) portant fixation de teneurs maximales pour certains contaminants dans les denres alimentaires, des teneurs maximales ont t fixes pour le DON (tableau 7a). Aucune teneur n'a t fixe pour NIV, T-2 et HT-2 dans les denres alimentaires. La fixation de ces teneurs maximales a t reporte pour permettre de collecter davantage de donnes sur la prsence de ces toxines dans les produits vgtaux. Pour lalimentation animale, aucune teneur maximale en trichothcnes n'est fixe dans les matires premires et les aliments pour animaux. Cependant, la Commission recommande8 d'appliquer des teneurs maximales en DON dans les matires premires et aliments destins l'alimentation animale (tableau 7b).

Recommandation 2006/576/CE de la Commission du 17 aot 2006 concernant la prsence de doxynivalnol, de zaralnone, d'ochratoxine A, des toxines T-2 et HT-2 et de fumonisines dans les produits destins l'alimentation animale.

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Tableau 7a : Teneurs maximales en DON dans les denres alimentaires exprimes en g/kg Teneur maximale en g/kg 1 250 1 750 1 750 750 500 750 200

Denres Crales brutes autres que le bl dur, l'avoine et le mas Bl dur et avoine bruts Mas brut lexception du mas brut destin tre transform par mouture humide (*) Crales destines la consommation humaine directe, farine de crales, son et germe en tant que produit fini commercialis pour la consommationhumaine directe, lexception des denres alimentaires figurant aux points 7, 8 et 9 Pain (y compris les petits produits de boulangerie), ptisseries, biscuits, collations aux crales et crales pour petit djeuner Ptes (sches) Prparations base de crales et aliments pour bbs destins aux nourrissons et enfants en bas ge Fractions de mouture de mas dont la taille des particules est > 500 microns auxquelles sapplique le code NC 1103 13 ou 1103 20 40 et autres produits de mouture de mas dont la taille des particules est > 500 microns on destins la consommation humaine directe auxquelles sapplique le code NC 1904 10 10 Fractions de mouture de mas dont la taille des particules est 500 microns auxquelles sapplique le code NC 1102 20 et autres produits de mouture de mas dont la taille des particules est 500 microns on destins la consommation humaine directe auxquelles sapplique le code NC 1904 10 10

750

1 250

(*) lexception sapplique uniquement au mas dont ltiquetage ou la destination, par exemple, font clairement apparatre quil est destin tre utilis dans un processus de mouture humide (production damidon)

Tableau 7b : Teneurs maximales en DON dans les aliments pour animaux selon la recommandation 2006/576/CE du 17 aot 2006 : Produits Matires premires entrant dans la composition des aliments pour animaux : Les crales et produits base de crales, except les sous-produits du mas Les sous-produits du mas Aliments complmentaires et complets except : Les aliments complmentaires et complets pour les porcs Les aliments complmentaires et complets pour les veaux (<4mois), les agneaux et les chevreaux Teneur maximale recommande en g/kg (teneur en humidit de 12%) 8000 12000 5000 900 2000

La recommandation indique que ces valeurs sont dtermines pour les espces animales les plus tolrantes prcisant ainsi que ces valeurs doivent tre considres comme des valeurs de rfrence suprieures.

8. Surveillance et contrle en France La contamination en T-2, HT-2 et DAS a t recherche dans les crales brutes (bl, orge, mas) prleves au champ ou en silo sur plus de 570 chantillons. Plus de 95 % des chantillons prsentent des teneurs infrieures la LOQ de 20 g/kg. Plus de 75% des chantillons de crales brutes prsentent des teneurs en NIV infrieures la LOQ (20 g/kg). La contamination moyenne est

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comprise entre 12 et 36 g/kg, avec des valeurs maximales pouvant atteindre 485 g/kg (cas du mas prlev au champ). Dans le cadre des plans de surveillance et de contrle des services de lEtat (Direction Gnrale de lAlimentation DGAL- et Direction Gnrale de la Consommation de la Concurrence et de la Rpression des Fraudes- DGCCRF-), diffrents trichothcnes ont t recherchs sur des crales brutes et des aliments prts consommer Dans les cas de non-conformit, les actions correctives sont entreprises. Bien que les denres prleves au sein des catgories daliments rglementes soient de nature et dorigine variables selon les annes, il peut nanmoins tre dgag les grandes tendances de conformit suivantes : Concernant les crales brutes, les plans ( 2004, 2005, 2006, 2007) conduits aprs les rcoltes de 2003 2006, montrent que la contamination des orges, bls et mas en trichothcnes non rglements : DAS, toxine T2, toxine HT2, et NIV est faible. Avec une LOQ de 20 g/kg pour chacune de ces quatre mycotoxines, aucun chantillon ne prsente une teneur en DAS suprieure la LOQ. Les toxines T2 et HT2 sont plus frquentes car seulement 94% des orges, 94% des bls et 82% des mas prsentent des teneurs en toxine T2 infrieures la limite de quantification, et 78% des orges, 91% des bls et 80% des mas prsentent des teneurs en toxine HT2 infrieures la limite de quantification. Le nivalnol est plus prsent que ces mycotoxines prcdemment cites puisque seulement 76% des orges, 66% des bls et 51% des mas ont des teneurs en nivalnol infrieures la limite de quantification. Ces plans montrent que le niveau de contamination en DON, seul trichothcne rglement, est plus important et quil est variable selon la crale. En effet, sur 192 chantillons dorge, 286 de bl, et 223 de mas, par rapport aux limites de conformit (voir rglementation au prcdent) aucun chantillon dorge ne dpasse 1250 g/kg, alors que 96% des chantillons de bl ne dpassent pas 1250 g/kg et que 97% des chantillons de mas ne dpassent pas 1750 g/kg. Par ailleurs, la contamination est variable selon les annes. Les formes actyles du DON (3aDON et 15aDON) sont quasiment absentes dans les bls et orges puisque prs de 99% des chantillons ont une teneur infrieure la LOQ ; par contre, ces formes actyles ont t trouves sur mas, 65% des chantillons ayant une teneur en 3aDON suprieure la LOQ et 53% ayant une teneur en 15aDON suprieure la LOQ. Concernant les aliments transforms (y compris les aliments pour nourrissons), les plans de contrle nont montr aucune non conformit.

9. Conclusion - Recommandations Les TCT sont des mycotoxines produites principalement par des Fusarium dans les pays au climat tempr et humide. Les TCT reprsentent une famille de plusieurs centaines de molcules, mais seules quelques unes sont retrouves sur les matires premires cralires et les produits finis craliers, en raison de la grande stabilit de ces molcules aux fortes tempratures. Parmi ces mycotoxines, cest le deoxynivalnol (DON) qui est le plus frquemment retrouv sur les crales en France, des taux variables qui dpendent principalement des conditions climatiques lors de la floraison et de la rcolte. Dautres TCT mritent dtre suivis en raison de leur risque potentiel tant en terme de toxicit que de prvalence: le nivalnol (NIV), le diacetoxyscirpnol (DAS), et les toxines T-2 et HT-2. Parmi les TCT, le DON est la toxine la moins toxique et la plus souvent retrouve dans les denres alimentaires, alors que la toxine T-2, plus toxique que le DON est moins frquemment retrouve. Les principaux effets toxiques des trichothcnes du groupe A (T2, HT2, DAS), notamment lhmatotoxicit et limmunotoxicit, qui se manifestent par une diminution du nombre de cellules sanguines circulantes, principalement les globules blancs et les plaquettes et par un affaiblissement des dfenses immunitaires, y compris pour de trs faibles niveaux de contamination. Les principaux effets toxiques des trichothcnes du groupe B (DON, NIV) se traduisent par une diminution de la consommation alimentaire et du gain pondral, ce qui entrane une perte conomique pour l'leveur. Toutefois, l'exposition humaine au travers de la consommation de produits animaux provenant d'levages exposs, apparat faible. Les animaux de compagnie, et plus particulirement les flids,

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sont galement sujets des troubles hmatologiques et immunologiques induits par la consommation d'aliments contamins par des TCT. Le consommateur franais est expos des doses infrieures aux doses considres dpourvues deffets toxiques, ce qui correspond une Dose Journalire Tolrable (DJT) de 1 g/kg pc /j pour le DON, de 0,07 g/kg pc /j pour le NIV et 0,06 g/kg pc /j pour les toxines T-2 et HT-2. Il faut cependant noter que ces valeurs toxicologiques de rfrence ont t fixes partir d'tudes chez l'animal dont la qualit et la quantit sont insuffisantes. Dailleurs, les agences internationales en charge de fixer les DJT ont soulign la carence en tudes toxicologiques de rfrence. Il est donc pertinent de suivre leurs recommandations visant la mise en oeuvre d'tudes subchroniques (1/10 de la dure de vie de lanimal, 90 jours chez le rat) et chroniques (2 ans chez le rat) suivant les lignes directrices OCDE, sur les espces les plus sensibles afin de fixer des valeurs toxicologiques de rfrence plus prcises. Les TCT n'ont pas t assez pris en compte au cours du sicle dernier en tant que contaminants alimentaires. Il est indispensable de disposer de donnes suffisamment solides la fois en toxicologie conventionnelle et en exposition humaine pour caractriser le risque pour l'homme, mais galement en termes d'chantillonnage et de dosage dans l'alimentation humaine et animale compte tenu des consquences de leurs prsence potentielles dans les produits craliers. La Commission europenne a publi un rglement fixant des limites maximales en DON dans les denres alimentaires destines l'alimentation humaine. Toutefois, il convient de dvelopper des mthodes de multidtection rapides et compatibles avec les limites rglementaires, utilisables dans les auto-contrles. Ainsi, dans le cadre des plans de surveillance et de contrle, il conviendrait de rechercher les teneurs en toxines T-2 et HT-2, conjointement aux teneurs en DON et en NIV dans les produits craliers avec des limites analytiques permettant lestimation de lexposition. Il est important galement de prendre en compte la possibilit de multicontaminations par des TCT diffrents, ou des TCT et d'autres mycotoxines comme la zaralnone, voire les fumonisines. Des tudes subchroniques sont entreprendre pour valuer les consquences toxicologiques de telles multicontaminations.

Rfrences bibliographiques : voir document spcifique

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Chapitre 4 La zaralnone
coordination : Pierre Galtier et Michel Etienne _________________________________________________________________________________

Introduction La zaralnone (ZEA) est une mycotoxine effet strognique se dveloppant dans les crales (mas, shorgo, orge, bl, riz, avoine), principalement au champ (flore du champ), lors du stockage du mas en cribs9 ou dans lorge dans la phase de germination au cours du maltage. Des souches isoles partir de bananes peuvent galement produire la zaralnone (Jimnez et al., 1997). Les espces de champignons productrices appartiennent pour la plupart au genre Fusarium : F.graminearum, F. culmorum, F. crookwellense, F. equiseti, F. oxysporum. Ainsi Dactylium dendrodes utilis pour la production de galactose oxydase a t identifi comme Fusarium graminearum (Wilbert et al., 2003). Leur systmatique repose actuellement essentiellement sur des critres morphologiques mais les mthodes molculaires devraient permettre une clarification (Miller, 2002). Ces espces ont des biologies diffrentes et sont aussi bien phytopathognes, saprophytes qupiphytes. Toutes les souches ne sont pas productrices, et leur capacit produire des toxines fusariennes nest pas spcifique dune espce; un mme compos peut tre synthtis par des voies diffrentes (Miller, 2002). Par ailleurs, il a t montr que, dans des conditions dhumidit trs leves (74%), Aspergillus oryzae, A. parasiticus et A. versicolor pouvaient galement produire la toxine dans des grains de bl (Atalla et al., 2003).

Proprits physiques et chimiques de la zaralnone

La zaralnone (C18H22O5 ; Figure 1), de masse molculaire de 318 Da, est une lactone de lacide rsorcylique (zaralane) (Urry et al., 1966 ; Mirocha et al., 1967). Il sagit dun nantiomorphe de lacide--rsorcylique-6-(10-hydroxy-6-cto-trans-1-undcnyl)--lactone .
O H O CH3

O 4 H O 6 1' 2'

10'

6' O

Figure 1 : structure molculaire de la zaralnone Les produits de rduction de la fonction ctone en 6 sont les et zaralnols, mtabolites naturels produits dans les organes des animaux (foie, compartiments fermentaires du tube digestif) ou dans les crales contamines. Laction des UV produit la cis zaralnone dont lactivit est semblable celle de lisomre trans. La rduction catalytique de la fonction ctone en 6 et de la double liaison en 1 par lhydrogne donne les et zaralanols dont lpimre , purifi, est utilis aux USA comme anabolisant (Bennett et al., 1974). La rduction de la double liaison en 1 conduit la zaralanone. La zaralnone, est un solide cristallin blanc dont le point de fusion est 165C. Le carbone asymtrique en 10 rend la molcule optiquement active, son pouvoir rotatoire 25 est de 170,5 pour 10 g/L dans le mthanol. La molcule est trs faiblement soluble dans leau (20 mg/L 25C) et dans lhexane ; sa solubilit augmente avec la polarit des solvants : benzne, chloroforme, actate dthyle, actonitrile, actone, mthanol, thanol, actone (Hidy et al., 1977). Lactate dthyle est dailleurs le solvant le plus utilis pour sonextraction dans les produits alimentaires.
9

Installation munie de grillages, dans laquelle on entrepose et sche l'air les pis de mas

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La molcule prsente 3 maxima dabsorption dans lUV 236 nm, 274 nm, 314 nm ; les coefficients dextinction molaire sont respectivement de 29700, 13909 et 6020 dans le mthanol (Mirocha et al., 1977). Le maximum dabsorption 274 nm, le plus caractristique, est le plus souvent utilis pour la dtection UV. La molcule met une fluorescence bleue avec un maximum dmission 450 nm lorsquelle est excite entre 230 et 340 nm dans lthanol.

Mthodes danalyse (voir principes gnraux en Annexe 1)

2.1 Purification et sparation De nombreuses revues bibliographiques dtaillent les mthodes danalyse de la zaralnone (Krska et Josephs, 2001 ; Betina, 1993 ; Frisvad et Thrane, 1993 ; Scott, 1993 ; Lawrence et Scott, 1993 ; Steyn et al., 1991). Les procdures de purification consistent principalement en des extractions liquide-liquide (LLE), la purification sur phase solide (SPE) ou par immuno-affinit (IAC) ou encore la chromatographie liquide ou gazeuse. La technique LLE met en jeu deux phases, lune organique, lautre aqueuse. Etant donn son caractre acide faible (phnol), un pH alcalin (NaOH ou KOH) permet de la transfrer de la phase organique vers la phase aqueuse. Les solvants utiliss pour lextraction liquide-liquide de la zaralnone et de ses mtabolites sont principalement lactate dthyle, le mthanol, lactonitrile et le chloroforme, seuls ou en mlange, le mlange CH3CN/H2O restant le plus couramment utilis. Lorsque la matrice est solide, des techniques comme des extractions acclres par solvant, ultrasons ou micro-ondes, peuvent tre mises en oeuvre (Pallaroni et al., 2003a et 2003b). Lextraction partir de matrices biologiques (plasma, urine, matires fcales) ncessite une tape dhydrolyse des mtabolites de phase II avant le processus de purification. Cette tape de clivage du conjugu peut tre ralise par voie enzymatique (suc dHelix pomatia, -glucuronidase dEscherichia coli) ou par voie chimique (solvolyse ou mthanolyse). Une valuation prcise de la concentration en zaralnone et/ou de ses mtabolites dans des fluides biologiques implique la ralisation et la matrise de cette tape considre gnralement comme la plus critique dans lensemble du protocole opratoire (Zllner et al., 2002). Dans les matrices vgtales, la prsence de conjugus sulfate (Plasencia et Mirocha, 1991) ou glycoside (Gareis et al., 1990) peut interfrer et engendrer une sousestimation de la contamination relle en zaralnone. Une purification sur cartouche ou disque SPE (Ware et al., 1999) permet de sparer les zaralanols de manire plus fine dventuelles interfrences. Toutes les phases stationnaires ou presque peuvent tre utilises : phase inverse (silice greffe type C18, C8 ou C4, ou copolymre type styrne, divinylbenzne), phase normale (Florisil, SiOH, NH2) (Llorens et al., 2002) ou encore change danions (SAX). Il existe galement des colonnes prtes lemploi Mycosep (Romer Labs Inc, Union, MT, USA, #224 pour ZON) qui permettent une purification rapide de lchantillon (30 sec) sans rinage avec rtention slective des interfrences (Silva et al., 2001). Les phases stationnaires multifonctionnelles Mycosep sont alors des adsorbants type charbon, clite ou rsines changeuses dions. Des colonnes dIAC ont galement t dveloppes pour cette classe de toxines et sont frquemment utilises (De Saeger et al., 2003 ; Eskola et al., 2002 ; Meyer et al., 2002 ; Fazekas et Tar, 2001 ; Kruger et al., 1999 ; Zllner et al., 1999 ; Schuhmacher et al., 1998 ; Visconti et Pascale, 1998 ; Rosenberg et al., 1998). Enfin, lHPLC semi-prparative a galement fait lobjet de dveloppements concernant les dosages de zaralnone et de ses mtabolites. Quoique dutilisation plus lourde, son pouvoir sparatif est remarquable, rendant cette technique de purification idale comme mthode de confirmation. Il est noter que la zaralnone est photosensible, tout particulirement en solution : des dispositions doivent tre prises au cours de sa purification afin de prvenir sa photodgradation. 2.2 Dtection et dosage Plusieurs techniques immunologiques ont t dveloppes pour la dtection de la zaralnone dans les crales, le lait et les fluides biologiques. Elles incluent le RIA ou lELISA (Meyer et al., 2002 ;

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Pichler et al., 1998) avec anticorps monoclonaux ou polyclonaux. Cependant, ces kits peuvent donner des ractions croises (Maragos et al., 2004), avec l-zaralnol et le -zaralnol et leur limite de dtection , de lordre de la dizaine la centaine de g/kg, est faible. Ces techniques peuvent prsenter un avantage lorsque lobjectif est uniquement de conclure en labsence de contamination par cette mycotoxine dans un chantillon, sans besoin de quantification du compos ou de ses mtabolites. En termes de techniques physico-chimiques, une mthode sparative est systmatiquement couple en amont de la dtection. La structure chimique de ce groupe de mycotoxines permet la fois de considrer lapproche HPLC et GC, la chromatographie couche mince tant pratiquement abandonne de nos jours (Dawlatana et al., 1998 ; De Oliveira et al., 1998). Une majorit significative des travaux publis a choisi pour stratgie la sparation par chromatographie liquide, en utilisant presque systmatiquement le principe de la phase inverse ; les combinaisons phase stationnaire type C18 et phase mobile CH3CN/H2O sont nombreuses dans ce domaine. Des dveloppements plus rcents ont t introduits avec succs avec les empreintes molculaires (MIP) beaucoup plus spcifiques de lanalyte (Weiss et al., 2003). Plusieurs types de dtecteurs peuvent tre utiliss: le fluorimtre (De Saeger et al., 2003 ; Eskola et al., 2002 ; Fazekas et Tar, 2001 ; Kruger et al., 1999 ; Ware et al., 1999 ; Visconti et Pascale, 1998), le dtecteur UV longueur donde fixe est le plus souvent remplac par la barrette de diodes beaucoup plus spcifique (Llorens et al., 2002 ; Fazekas et Tar, 2001). La sensibilit observe diffre selon les mtabolites et est plutt moindre pour les mtabolites rduits (-zaralanol et -zaralanol). Avec lintroduction des techniques couples comme la LC-MS, et en particulier des interfaces pression atmosphrique, les approches mthodologiques ddies aux lactones dacide rsorcylique progressent. La technique dite dionisation chimique pression atmosphrique (APCI) est probablement la plus utilise (Pallaroni et al., 2002a ; Jodlbauer et al., 2000 ; Zllner et al., 2000 ; Zllner et al., 1999 ; Rosenberg et al., 1998) suivie par llectrospray (Kleinova et al., 2002). Le rle de la purification avant analyse LC-MS/MS, du fait de la trs haute spcificit de la technique, a t discut (Jodlbauer et al., 2000 ; Pallaroni et al., 2003b ; Zllner et al., 1999 ; 2000 ; 2002). Les interfrences co-extraites nuisent lefficacit de lionisation et peuvent contribuer sous estimer la concentration de lanalyte (mcanisme de suppression dions). La zaralnone et ses mtabolites peuvent galement tre analyss par GC-MS (Meyer et al., 2002 ; Pillay et al., 2002 ; Tanaka et al., 2000 ; Ryu et al., 1996), mais ils doivent au pralable subir une raction de drivation : la trimthylsilylation est frquemment utilise (Ryu et al., 1996), tout comme la fluoroacylation, cette dernire permettant daccrotre de manire spectaculaire la sensibilit du signal, en particulier dans le mode dionisation chimique ngative (Miles et al., 1996 ; Kennedy et al.,1998).

3 3.1

Facteurs influenant la teneur dans les denres alimentaires Facteurs lis au dveloppement fongique et la production de zaralnone

La zaralnone est produite par les champignons toxinognes en mme temps que dautres toxines, notamment les trichothcnes, au cours de la maturation des grains de crales lorsque les conditions climatiques sont mauvaises (exposition des pis aux intempries) dans les rgions tempres dEurope, dAmrique et dAsie (Gajecki, 2002). Les conditions de production dans les grains dpendent dinteractions entre la temprature, lhumidit et lactivit de leau (aw), le substrat et la souche fongique. La production de zaralnone est trs faible 32C et maximale 20C mais dpend des diffrences gntiques des souches (Llorens et al., 2004). Des auteurs ont montr que la production est considrablement augmente lors de variations successives de tempratures (Sherwood et al., 1974, Eugenio et al., 1970), conditions qui peuvent se produireau cours du stockage du mas en crib. Leffet de comptition entre F. graminearum, F. verticillioides et F. proliferatum, se traduit sur la croissance de ces colonies de Fusarium mais pas sur la production de zaralnone (Velutti et al., 2000). Au champ, dans les conditions de culture, la zaralnone se trouve davantage dans le mas et le sorgho que dans les crales paille.

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La zaralnone est produite dans le bl sous forme libre mais galement sous forme du conjugu zaralnone-4--D-glucoside (42% des chantillons positifs analyss) des concentrations variant entre 17 et 104 g/kg pour des teneurs en zaralnone de 10 860 g/kg (Schneweiss et al., 2002). Les mtabolites naturels ( et zaralnols) sont galement prsents dans les crales contamines (Hagler et al., 1979 ; Schwadorf et al., 1992). Si les moisissures produisant la zearalenone colonisent principalement les crales, elles ont t galement dtectes dans les foins et les pailles mal sches (Scudamore et Livesey, 1998). Les fourrages ensils peuvent aussi contenir de la zaralnone dont lorigine est double : la toxine a pu tre apporte par le fourrage contamin au moment de sa mise en silo, ou tre produite dans le silo. Il est vraisemblable que la production en silo est mineure par rapport la contamination hors silo. Toutefois, un mauvais tassement du silo et une acidification rduite au cours des premires heures aprs la mise en silo peuvent favoriser le dveloppement de Fusarium spp. et la production de zaralnone. Ces conditions sont frquemment rencontres avec les mas ensils sous forme de brins longs et des teneurs en matire sche suprieures 35 %. Ainsi, Borreani et al. (2003) ont montr que la concentration en zaralnone dans des silos de mas est plus importante en priphrie que dans la zone centrale du silo o la teneur en oxygne est plus faible. Une enqute pidmiologique ralise au Brsil de mai 1997 mars 2001 montre que la zaralnone dtecte dans 57,5% des chantillons analyss est la mycotoxine la plus frquemment rencontre dans lensilage de mas (Netto et al., 2002). Des espces productrices de zaralnone contaminent frquemment les herbages pturs en Nouvelle-Zlande (Di Menna et Parle, 1970). La zaralnone a ainsi t dtecte des concentrations de 300 3000 g/kg de matire sche dans de lherbe pture (Towers, 1993 ; Towers et Sposen, 1993) et dans du foin (Mirocha et al., 1968).

3.2

Impact des procds technologiques sur la teneur en zaralnone

La rpartition de la zaralnone dans les fractions issues de meunerie est semblable celle du doxynivalnol (voir chapitre trichothcnes ), avec des teneurs dans les sons et les issues de crales bien suprieures celles de la farine (Lee et al., 1987 ; Trigo-Stockli et al., 1996). La zaralnone est nettement moins hydrosoluble que le doxynivalnol et le nivalnol et de ce fait se rpartit diffremment dans les coproduits issus de lamidonnerie de bl. Lauren et Ringrose (1997) ont montr que le gluten est plus fortement contamin en zaralnone que le grain (de 200 1200%). Les germes sont galement trs contamins (de 80 522 % de la teneur des grains). La teneur en zaralnone des fractions solubles diverge selon les auteurs : Lauren et Ringrose (1997) ne trouvent que peu ou pas de zaralnone dans les eaux de trempage, la diffrence de Bennett et al., (1978). En semoulerie de mas, Bennett et al., (1976) ont not que la concentration en zaralnone est la plus leve dans les germes et atteint 2 3 fois celle des grains, notamment dans la matire grasse. Les sons savrent plus contamins que les grains mais moins que les germes, alors que les gritz (semoules) sont peu contamins.

Proprits toxicologiques

Les donnes toxicologiques disponibles ont t examines par le SCF et le JECFA en 2000. Les donnes et conclusions mentionnes dans cette section sont largement tires de ces deux sessions dvaluation et ont t compltes par des travaux postrieurs cette date. 4.1 Toxicocintique

Les diffrentes tudes de pharmacocintique et de mtabolisme montrent que la zaralnone est absorbe rapidement aprs administration orale et peut tre mtabolise en - et -zaralnol, sous laction dhydroxystrode deshydrognases et en - et -zaralanol, lesquels peuvent subir, ensuite une glucuronoconjugaison.

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Des diffrences mtaboliques ont t rapportes en fonction de lespce : chez le rat, la majorit de la zaralnone est retrouve sous forme libre ou conjugue. En revanche, seule une petite quantit de zaralnols et de leurs conjugus est forme (SCF, 2000 ; JECFA 2000). On observe une excrtion biliaire avec circulation entrohpatique chez le rat et la souris, alors que chez le lapin, cest lexcrtion urinaire de la toxine qui prdomine. Cette dernire voie dlimination est galement majoritaire chez le porc en dpit dune circulation entrohpatique dmontre de la zaralnone, en raison dune moindre rabsorption dans les viscres. Des tudes in vitro ont confirm cette forte disparit du devenir de la zaralnone entre les espces animales, notamment en termes dactivation par rduction strospcifique en -zaralnol ou de conjugaison lacide glucuronique (Malekinejad et al., 2006a). Il existe une seule donne chez lHomme : celle-ci suggre que la zaralnone subit, comme chez le porc, une excrtion urinaire sous forme du compos parent glucuronoconjugu et d-zaralnol (SCF, 2000 ; JECFA 2000). Dans le sang, la zaralnone et le zaralanol se lient aux globulines spcifiques des hormones sexuelles humaines (JECFA, 2000; Eriksen et Alexander, 1998).

4.2

Toxicit gnrale

4.2.1 Toxicit aigu La zaralnone possde une faible toxicit aigu aprs administration orale mais aussi intrapritonale chez la souris, le rat et le cobaye. La DL50 varie entre 4000 et plus de 20 000 mg/kg pc (JECFA, 2000). 4.2.2 Toxicit sub-aigu et sub-chronique Les tudes de toxicit orale sur 90 jours permettent de mettre en vidence que les effets observs aussi bien sur animaux de laboratoire que sur animaux domestiques dpendent des interactions de la zaralnone et de ses mtabolites avec les rcepteurs aux strognes. Les porcs et les moutons semblent plus sensibles que les rongeurs. Dans des tudes par administration ritre, la NOAEL chez le porc est gale 40 g/kg pc/jour sur la base des effets strogniques dans les tissus cibles et des performances en terme de reproduction. En revanche, la NOAEL chez le rat est de 100 g/kg pc/j (JECFA, 2000 ; Kuiper-Goodman et al., 1987). 4.2.3 Gnotoxicit LIARC a tabli (1993) que le chromo test SOS de rparation de lADN ralis sur B. subtilis se rvle ngatif tandis que le rsultat du rec-essai sur cette mme bactrie est positif. La zaralnone ninduit pas de mutation gnique sur la bactrie Salmonella typhimurium (test dAmes) ou de recombinaison gnique sur S. cerevisiae, tout en provoquant un change de chromatides surs, des aberrations chromosomiques et une polyplodie sur cellules CHO en labsence dactivation mtabolique (IARC, 1993). Des tudes plus rcentes ont dabord montr que cette toxine peut induire le systme SOS de rparation de lADN chez une bactrie lysognique et que cet effet est supprim en prsence de vitamine E (Ghedira-Chekir et al., 1998). Cette mme vitamine protge aussi linduction de micronoyaux par la zaralnone mise en vidence dans des cellules de rein de singes ou de moelle osseuse de souris (Ouanes et al., 2003). Concernant les effets gnotoxiques observs in vivo, le pourcentage daberrations chromosomiques augmente dans la moelle osseuse de souris recevant des doses fractionnes et rptes quivalent 0,4 4 p.100 de la DL50 soit 10 40 mg/kg pc. Le prtraitement des animaux par la vitamine E, le 17-stradiol ou la progestrone rduit significativement le pourcentage daberrations chromosomiques, suggrant que ces composs pourraient inhiber les processus molculaires lorigine de cette gnotoxicit, notamment par comptition sur les rcepteurs nuclaires (Ouanes et al., 2005). La formation dadduits lADN a t recherche sur des souris femelles BalB/c traites par 2 mg/kg pc de zaralnone par voie intrapritonale ou orale, aprs marquage du compos au phosphore. Douze quinze adduits diffrents ont t retrouvs dans les reins et le foie. Le niveau total dadduits lADN se rvle suprieur dans le foie, surtout aprs administration intrapritonale. La co-administration de vitamine E (4 mg/kg pc/j) diminue significativement cette formation dadduits lADN (Grosse et al., 1997). Dans les ovaires de souris, 6 adduits lADN diffrents ont t observs aprs administration orale ritre de 1 mg/kg pc au jour 1, 5, 7, 9 et 10 (Pfohl-Leszkowicz et al., 1995). La formation de ces adduits est augmente de faon dose-dpendante aprs traitement

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pralable des souris par la -naphtoflavone. Toutefois, laugmentation nest plus observe chez des souris dficientes en rcepteur Ah. Cette observation est confirme sur modles in vitro, lesquels attestent de limplication probable du cytochrome P450 1A2 dans cette possible voie dactivation mtabolique (Pineau et al., 1998). En revanche, aucun adduit lADN na pu tre dtect dans les organes de rats Sprague-Dawley femelles recevant une alimentation contenant 0,05 mg/kg de zaralnone (5 g/kg pc) pendant 3 semaines (Li et al., 1992).

4.2.4 Cancrognicit La zaralnone a t value par le CIRC/IARC en 1993 : elle a t classe, avec les autres toxines de Fusarium, dans le groupe 3, cest dire inclassable quant sa cancrognicit pour l'homme en raison d'indications limites chez lanimal (IARC, 1993). Selon le rapport du NTP (1982), une tude sur des souris B6C3F1 a qui lon a administr durant 103 semaines des rgimes contenant 0, 50 ou 100 mg/kg de zaralnone (soit chez les femelles 0, 9 ou 18 mg/kg pc/jour et chez les mles 0, 8 ou 17 mg/kg pc/jour) a montr quaucune diffrence significative dans la survie ou la diminution du gain de poids corporel na t observe entre les groupes. Aucune lsion non-noplasique due au traitement na t rapporte chez les mles. Chez les femelles, des effets strogniques dose-dpendants ont t observs dans certains tissus (fibrose de lutrus, canaux cystiques des glandes mammaires), ainsi quune mylofibrose au niveau de la moelle osseuse. Des adnomes hpatocellulaires ont t trouvs chez 8, 6 et 14 % des mles et chez 0, 4 et 14 % chez les femelles. Laugmentation tait statistiquement significative chez les femelles. Une tendance statistiquement significative a t observe en ce qui concerne lincidence dadnomes hypophysaires aussi bien chez les mles (0, 9 et 14 %) que chez les femelles (7, 5 et 31 %). Des carcinomes hypophysaires ont t observs chez un des mles traits avec la faible dose et chez deux femelles traites avec la forte dose. Cependant, lincidence de ces carcinomes hypophysaires dans les groupes traits et tmoins ntait pas significativement diffrente. De plus, ces tumeurs ayant t rapportes uniquement des doses largement suprieures aux concentrations provoquant des effets hormonaux (notamment pour des doses de lordre de 8-9 mg/kg pc/j ou plus), le comit du SCF, en 2000, a conclu que ces tumeurs taient les consquences des effets strogniques de la mycotoxine. La mme conclusion avait t faite par le JECFA en 1998 lors de lvaluation de l-zaralanol. Une tude mene sur rats Fisher (NTP, 1982) qui lon a administr durant 103 semaines des rgimes contenant 0, 25 ou 50 mg/kg de zaralnone (soit 0, 1, 2 mg/kg pc/jour) a permis de montrer que le gain de poids corporel moyen tait plus faible que celui des tmoins et cette diminution du poids moyen (pour 19 % des mles et 11 % des femelles traits la plus forte dose aprs 44 semaines de traitement) tait fonction de la dose administre. Aucune diffrence significative de survie des animaux na t observe entre les diffrents groupes. Les lsions non-noplasiques suivantes ont t observes : inflammation de la prostate, atrophie testiculaire, canaux cystiques dans les glandes mammaires des mles, augmentation de lincidence des vacuolisations cytoplasmiques hpatocellulaires chez les mles et augmentation de lincidence des nphropathies chroniques progressives dans les deux sexes pour les deux doses testes. Une augmentation de lincidence des rtinopathies et des cataractes a t observe chez les mles et pour la faible dose chez les femelles. Aucune augmentation dpendante du traitement au niveau de lincidence des tumeurs na t trouve dans cette tude. Dans une tude mene sur rats Wistar nourris avec une alimentation contamine en zaralnone pendant 104 semaines (0, 0,1, 1,0 ou 3,0 mg/kg pc/jour), une augmentation significative du poids du foie a t observe chez les mles et les femelles exposs la dose de 3 mg/kg pc. De plus, le poids de lutrus a t augment pour deux femelles du groupe trait la plus forte dose. Chez les rats ayant reu la dose de 3 mg/kg pc, une augmentation de la trabculation du fmur a t observe. En dehors de cette observation, aucun changement biologique significatif na t observ et aucune tumeur due au traitement na t trouve (Becci et al., 1982). Les taux de survie et lincidence des tumeurs nont pas t rapports. Une NOAEL de 0,1 mg/kg pc/jour a pu tre dduite de cette tude.

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4.3 4.3.1

Toxicit dorganes Immunotoxicit

Plusieurs altrations des paramtres immunologiques ont t montres in vitro aprs exposition de lymphocytes la zaralnone : inhibition de la prolifration lymphocytaire aprs stimulation par un mitogne, augmentation de la production dIL-2 et dIL-5 (JECFA, 2000). Par contre, aucune tude ralise in vivo ne montre dimmunotoxicit de la zaralnone. Des souris B6C3F1 ont reu de la nourriture supplmente par 10 mg/kg de zaralnone pendant 2 semaines. Aprs infection par Listeria monocytogenes (iv), le comptage de bactries splniques a montr une tendance laugmentation aux jours 1 et 4 compare aux animaux tmoins. Aucun effet ngatif na t observ aprs administration de 8 semaines de nourriture contamine (Pestka et al., 1987). Une autre tude a t mene sur des souris B6C3F1 qui une dose unique de 45 mg/kg pc tait administre par voie sous-cutane, puis les animaux ont t infects par L. monocytogenes. Aucune diffrence dans la survie ou le nombre de bactries dans la rate na pu tre observe entre les animaux exposs la zaralnone et les tmoins (Pung et al., 1984). Chez des souris femelles B6C3F1 ayant reu un aliment supplment par 10 mg/kg de zaralnone (1,5 mg/kg pc/jour) pendant 6 semaines, aucune variation de la concentration srique dIgG, IgM ou IgA ou encore du nombre de lymphocytes, neutrophiles, monocytes et osinophiles (nombre global et individualis) na t observe (Forsell et al., 1986). 4.3.2 Toxicit pour la reproduction Plusieurs tudes in vitro ont montr que la zaralnone ainsi que certains de ses mtabolites se lient de faon comptitive aux rcepteurs aux strognes (ER). Cette liaison des rcepteurs spcifiques a t galement dmontre in vivo dans lutrus, les glandes mammaires, le foie et lhypothalamus de diffrentes espces.. Les taux de liaison relatifs de la zaralnone et de ses drivs aux rcepteurs cytoplasmiques dutrus de rat sont varient dans lordre suivant : -zaralanol > -zaralnol > zaralanol > zaralnone > -zaralnol (Kuiper-Goodman et al., 1987 ; Eriksen et Alexander, 1998). Il semblerait que la zaralnone puisse se lier et activer les rcepteurs ER et ER dans les cellules transfectes avec les rcepteurs ER et ER humains. La zaralnone savre tre un antagoniste total pour ER la fois un agoniste et un antagoniste pour ER (Kuiper et al., 1998). Son potentiel strognique, mesur par le test de cornification vaginale de souris et compar celui de lstradiol, est respectivement de 0,001 et 0,01 aprs administration sous-cutane et topique. L-zaralanol possde approximativement le mme potentiel strognique dans ce dernier test, mais semble plus actif avec le test sur utrus (Kuiper-Goodman et al., 1987). Dans des essais in vitro, des homognats de prostate hyperplasique humaine ont mtabolis la zaralnone en - et -zaralnols. Ce sont les 3- et 3-hydroxystrode dshydrognases qui sont responsables de cette rduction (Thouvenot et al., 1981). Ces rsultats ont t rcemment confirms sur des cultures de cellules de granulosa ou doocytes porcins (Malekinejad et al., 2006b) et avec des fractions subcellulaires de foie de porc (Malekinejad et al., 2005). La zaralnone se comporte comme un inhibiteur comptitif du 17-stradiol dans le mtabolisme de la testostrone en 5dihydrotestostrone, mtabolite responsable des effets androgniques chez lhomme (Thouvenot et al., 1980). Teste sur des cellules de granulosa lutales humaines parmi dautres phytostrognes de lalimentation (coumestrol, querctine, biochanine A), la zaralnone inhibe lactivit de laromatase mais pas celle de la 17 -hydroxystrode dshydrognase de type 1 (Whitehead et Lacey, 2003). Sur le mme modle cellulaire, la zaralnone sest avre la plus efficace inhiber la formation dstradiol partir dandrostne dione, correspondant lactivit de laromatase. Toutefois, cette modulation ne saccompagne pas dune diminution dexpression protique de cette enzyme (Lacey et al., 2005). De telles interactions molculaires pourraient participer lactivit strognique de la zaralnone dcrite chez de nombreuses espces animales et suspecte chez lhomme. La zaralnone induit des troubles de la reproduction chez les rongeurs et chez des animaux domestiques. Des effets strogniques varis tels quune diminution de la fertilit, une augmentation

133

des rsorptions embryoltales, une diminution de la taille des portes, des changements de poids des glandes surrnales, de la thyrode et de lhypophyse ainsi que des changements de niveaux sriques de progestrone et dstradiol ont t observs chez la souris, le rat, le cobaye et le lapin. Toutefois, aucun effet tratogne na t rapport (JECFA, 2000). Les porcs semblent plus sensibles aux effets reprotoxiques de la zaralnone que les rongeurs. Une tude a t ralise sur des truies sexuellement matures non gestantes recevant 2 kg de nourriture contenant 0, 1, 5 ou 10 mg/kg de zaralnone entre le 5me et le 20me jour du cycle stral (0, 40, 200 ou 400 g/kg pc/jour). Lintervalle inter-strus augmente significativement de 21 0,3 jours chez les tmoins 32,7 3,3 jours chez les truies ayant consomm de la nourriture contamine 5 ou 10 mg/kg mais pas 1 mg/kg. Une augmentation de la concentration plasmatique en progestrone et une persistance des corps jaunes ont t observes chez les truies ayant un cycle prolong. Les corps jaunes rgressent lorsque la zaralnone est retire de laliment (Edwards et al., 1987b). Une tude ralise sur un petit nombre de truies prpubres rapporte des effets strogniques faibles doses (Bauer et al., 1987) : deux truies ont reu une alimentation contamine par 0,25 mg/kg de zaralnone, soit lquivalent de 10 g/kg pc/jour pendant 11 jours, suivi dune alimentation dpourvue de zaralnone durant 5 jours ; deux autres truies ont reu une alimentation contamine 0,05 mg/kg de zaralnone, soit lquivalent de 2 g/kg pc/jour pendant 21 jours, et un animal seulement a t utilis comme tmoin. La plus forte dose a provoqu une rougeur et une tumfaction de la vulve ainsi quune tumfaction mammaire. De plus, de nombreux follicules vsiculaires et de follicules kystiques ont t observs au niveau des ovaires. Avec la faible dose, aucune modification extrieure na t rapporte la fin de lexprience mais lautopsie a mis en vidence que le nombre de follicules vsiculaires sur les ovaires tait plus important chez les animaux traits que chez les tmoins. Ces effets doivent tre confirms par une nouvelle tude utilisant un plus grand nombre danimaux avant de pouvoir tablir une DSE.

4.4

Valeur toxicologique de rfrence

Le Conseil Suprieur dHygine Publique de France (CSHPF) a propos en 1999 une DJT de 0,1 g/kg/j calcule partir deffets strogniques observs sur la reproduction du singe, considrs comme les plus pertinents et caractriss par une NOAEL de 50 g/kg/j. La mme anne, le comit du JECFA a tabli une dose journalire maximale tolrable provisoire (DJMTP) de 0,5 g/kg pc/j calcule partir de ltude court terme (15 jours) chez les truies adultes ralise par Edwards et al., (1987b). Utilisant un facteur de scurit de 100, le comit a tabli la DJMTP partir de la dose sans effet observ de 40 g/kg pc/j. Le comit a aussi considr la plus faible dose entranant un effet, 200 g/kg/j, et la possibilit deffet du mtabolite -zearalanol. Le Comit recommandait que la dose journalire de zaralnone et de ses mtabolites nexcde pas 0,5 g/kg pc. En 2000, le SCF a fix une dose journalire temporaire (temporary TDI) de 0,2 g/kg pc base sur la mme tude court terme chez les truies adultes (Edwards et al., 1987b). De cette recherche, une NOAEL de 40 g/kg pc/j a t tablie en considrant les effets hormonaux et en appliquant un facteur de scurit de 200.

5 5.1

Exposition de la population franaise la zaralnone Effets sur la sant humaine (donnes pidmiologiques)

La zaralnone a t mesure dans lendomtre de 49 femmes. Il a t rapport 27 adnocarcinomes ,11 hyperplasies endomtriques et 11 endomtres prolifratifs normaux pour lesquels les valeurs de zaralnone taient respectivement, dans chacun de ces groupes, de 48 6, 167 18 ng/ml et infrieur la limite de dtection. Dans 8 cas de tissus endomtriques hyperplasiques et 5 cas de tissus noplasiques, la zaralnone na pas t dtecte (Tomaszewski et al., 1998). La zaralnone ou le zaralanol ont t suspects tre les agents responsables dune pidmie de modifications prcoces de la pubert chez de jeunes enfants Porto-Rico entre les annes 1978 et 1981 (Senz de Rodriguez, 1984 ; Senz de Rodriguez et al., 1985). Le zaralanol ou ses mtabolites ont t dtects dans le plasma sanguin. Les auteurs ont rapport de forts taux de rponse dans le

134

test du rcepteur cytosolique ER dutrus de rat, lors de lanalyse dhomognats de viande produite localement, ce qui tend montrer la prsence de substances capables de se lier aux ER. Des tudes entreprises par la FDA nont pas permis de mettre en vidence de facteurs de croissance strogniques dans la nourriture. Plus tard, une corrlation statistique entre les changements de pubert et la consommation de produits carns et de formules base de soja a t trouve. Cependant, les associations statistiques nont pas pu expliquer plus de 50 % des cas identifis (FreniTitulaer et al., 1986). Les diffrentes tudes nont pas permis de conclure de manire dfinitive limplication de la zaralnone ou du zaralanol dans les troubles observs. Une autre hypothse mettant en cause des phtalates effet strognique a galement t avance (Colon, 2000 ; LarriuzSerrano et al., 2001).

5.2

Exposition de lHomme

L'tude de lalimentation totale (EAT) entreprise en 2000 (Leblanc et al., 2005) afin de connatre le niveau de consommation et dexposition de la population franaise la zaralnone partir daliments "prts consommer" montre que, sur 245 chantillons daliments analyss, 5 (2%) ont des niveaux de zaralnone suprieurs la limite de dtection, dont 2 suprieurs la limite maximale de 50 g/kg fixe par la Commission europenne (crales petit djeuner de type muesli et ptales de mas enrichis avec 200 g/kg et 22 g/kg, soja appertis avec 53 g/kg, graines de ssame avec 18 g/kg). L'exposition moyenne et des forts consommateurs (95me percentile) adultes et enfants de la population gnrale et vgtarienne est prsente dans le tableau 1. Tableau 1 : Estimation des apports alimentaires moyens et des forts consommateurs (P95) pour diffrents types de population franaise en zaralnone Apport moyen (g/kg pc/j % d'individus Apport au % de la 1 pouvant P95 DJTP dpasser la (g/kg pc/j pour P95 DJTP 0,070 35 0,2 0,132 0,110 0,120 0,570 65 55 60 285 2,5 0 0 31

Type de population Population gnrale

Adultes (15 ans et 0,033 +) Enfants (3-14 ans) 0,066 Population Ovolactovgtariens 0,050 vgtarienne Lactovgtariens 0,060 (15 ans et +) Vgtaliens 0,200 1 Le SCF a fix une DJTP de 0,2 g/kg pc/j

Les aliments contributeurs lexposition de la population franaise la zaralnone sont le bl, les produits drivs du bl, ainsi que le mas et le riz. La proportion dindividus dont lapport thorique de zaralnone dpasse la DJT tablie par le SCF est de 2,5% pour les enfants de 3 14 ans, et de 31% pour la population vgtalienne. A titre de comparaison, les niveaux dexposition alimentaire moyenne de la population franaise dtermins lors dune tude ralise lchelle europenne(SCOOP Task, 2003) sont du mme ordre de grandeur que ceux observs lors de l'tude franaise (tableau 2). Tableau 2 : Exposition alimentaire moyenne de la population franaise la zaralnone (Tche Scoop, 2003) Exposition moyenne Population (g/kg p.c./j) Population totale adulte 0,027 Adultes hommes 0,029 Adultes femmes 0,024 Enfants (3 15 ans) 0,042 La population franaise prsente une exposition alimentaire la zaralnone relativement proche de celle calcule en Autriche (0,029 g/kg/j), en Finlande (0,027), aux Pays-Bas (0,021) ou au Royaume-

135

Uni (0,014). Les populations dAllemagne (0,005), de Norvge (0,008), d'Italie (0,001) et du Portugal (0,004) semblent moins exposes. Cependant, le type d'enqute alimentaire, le nombre d'chantillons analyss, les mthodes analytiques et les laboratoires tant diffrents selon les pays, il n'est pas possible de tirer de vritables conclusions comparatives des niveaux d'exposition entre les pays europens.

6 6.1 6.1.1

Exposition animale Effets sur la sant animale et transfert dans les sous-produits Les porcins

Effets sur la sant Les symptmes d'hyperstrognisme dus la consommation de zaralnone purifie ou d'un aliment contamin naturellement ont t trs frquemment dcrits chez les porcs impubres. Chez la femelle, un rougissement et un gonflement de la vulve et un prolapsus du vagin sont observs (Zwierzchowski et al., 2006). L'utrus est hypertrophi, les ovaires sont atrophis (Jakimiuk et al., 2006) et l'paisseur de l'pithlium vaginal est accrue. On constate une atrophie des testicules (Farnworth et Trenholm, 1981), un prolapsus du rectum chez le mle et le dveloppement des ttines dans les deux sexes. Ces symptmes apparaissent 3 7 jours aprs la consommation d'un aliment renfermant des quantits de zaralnone allant de 1,5 2 mg/kg, et disparaissent entre 7 et 14 jours aprs le retrait de l'aliment contamin. La mort de l'animal peut intervenir par hmorragie ou infection des tissus prolapss. Contrairement aux jeunes porcs, l'hyperstrognisme a rarement t observ chez les truies pubres, gestantes ou allaitantes chez lesquelles des niveaux de contamination beaucoup plus levs sont ncessaires pour le provoquer (par exemple 64 mg/kg d'aprs Long et al., 1982). Cependant, les performances de croissance de jeunes truies qui consomment un aliment renfermant jusqu 2,21 mg/kg de zaralnone ne sont pas affectes (Friend et al., 1990). Les consquences de lingestion de zaralnone sur la maturit sexuelle des truies ne sont pas claires. La distribution pendant 2 semaines d'un aliment renfermant 10 mg/kg de zaralnone des truies ges de 178 jours (Green et al., 1990), ou 1,5 2 mg/kg partir de 70 jours d'ge (Rainey et al., 1990) n'a pas d'effet sur la maturit sexuelle. Dans un essai sur trois, Edwards et al. (1987a) observent cependant un retard de pubert de 10 jours chez des truies consommant un aliment contenant 10 mg/kg de zaralnone entre 145 et 193 jours d'ge, mais la proportion d'animaux atteignant la pubert n'est pas affecte. Au contraire, d'aprs Rainey et al. (1990), la pubert de jeunes truies recevant un aliment avec 2 mg/kg de zaralnone partir de l'ge de 70 jours est plus prcoce. Ces divergences s'expliquent peut-tre par des diffrences de doses, d'ge des animaux et de dure de distribution de l'aliment contamin. La dure du cycle stral ou de l'intervalle sevrage-strus est augmente chez les truies adultes consommant un aliment contamin par 5 ou 10 mg/kg de zaralnone pendant 15 jours (Edwards et al., 1987a, b). Cet effet ne s'observe pas pour une contamination de 1 mg/kg correspondant une dose quotidienne de 40 g/kg pc, cette dose a donc t choisie par le JECFA et le SCF comme NOAEL. Young et al. (1990) ont tabli une relation linaire entre le niveau de contamination et la dure du cycle. Au-del d'un taux de 3 mg/kg, le retard d'strus peut devenir si important que certaines truies sont considres en anstrus. Ainsi, la moiti des truies (15/33) qui consommaient un rgime naturellement contamin environ 4 mg/kg de zaralnone partir de leur pubert n'avaient pas eu de nouvel strus 50 jours plus tard (Etienne et Jemmali, 1982). L'absence de cyclicit tait confirme l'abattage par la prsence de corps jaunes et l'absence de corps blancs sur les ovaires. Les cornes utrines taient hypertrophies et n'avaient pratiquement plus de lumire. La rgression des corps jaunes interviendrait dans les 30 jours suivant le retrait de l'aliment contamin (Edwards et al., 1987b). Les mcanismes impliqus dans la persistance des corps jaunes par la zaralnone sont discuts. Pour Flowers et al. (1987), la zaralnone agirait directement au niveau ovarien puisqu' la diffrence du benzoate d'stradiol, elle n'empche pas l'augmentation de scrtion de PGF2 et n'inhibe pas la scrtion de LH. Cependant, Green et al. (1990) observent une diminution des concentrations moyennes de LH chez des truies ayant reu pendant une semaine un aliment renfermant 10 ppm de zaralnone, mais la frquence et l'amplitude des pulses de LH et la scrtion de FSH ne sont pas

136

modifies. Enfin, d'aprs Diekman et al. (1986), la scrtion de LH et de FSH est inhibe chez des truies ovariectomises recevant une seule forte dose orale de 1 mg de zaralnone /kg pc. Jusqu' 10 mg/kg de zaralnone dans l'aliment distribu avant l'insmination, le taux d'ovulation, la fertilit et le taux de conception, la taille de la porte in utero ou la naissance et la mortalit embryonnaire ne sont pas affects. Avec des concentrations leves pendant la gestation, la taille de la porte est diminue, voire nulle dans certains cas (64 ppm : Long et al., 1982 ; 60 et 90 mg/kg : Long et Diekman, 1984 ; 108 mg/j : Long et Diekman, 1986). L'importance de l'effet parat relie la dose de toxine (Long et Diekman, 1984; Young et al., 1990) et dans la plupart des tudes, mme un taux infrieur 60 ppm de zaralnone provoque des portes de plus faible taille et rduit la survie embryonnaire. Ainsi, Long et al. (1982) trouvent que la proportion de truies sans ftus ou avec des portes de taille anormalement faible (1 3 ftus) augmente lorsque la teneur en zaralnone de l'aliment passe de 0 7, 38 et 64 mg/kg. Une priode limite de consommation suffit accrotre la mortalit ftale : seule une truie sur 4 tait gestante lorsque la zaralnone tait consomme entre le 7me et 10me jours de gestation, mais aucun effet n'tait constat entre les 2me et 6me ou les 11me et 15me jours (Long et Diekman, 1986). La mort de ftus a t confirme par l'observation de membranes ftales dgnres prsentes dans l'utrus 40 jours de gestation ds un taux dexposition de 7 mg/kg de zaralnone (Long et al., 1982) ou au-del de 30 mg/kg (Long et Diekman, 1984). De mme, chez des truies recevant 1 mg de zaralnone /kg pc entre les 7me et 10me jours de gestation, Long et al. (1992) ont constat une dgnrescence des blastocystes partir du 11me jour qui s'aggravait au 13me jour. Les mcanismes d'action de la zaralnone sur la mortalit embryonnaire ne sont pas lucids. Dans plusieurs tudes o les truies consommaient jusqu' 108 mg/j de zaralnone, l'aspect macroscopique, histologique et microscopique des tissus utrins n'tait pas affect et conforme au stade physiologique des animaux (Long et Diekman, 1984, 1986 Long et al., 1992). L'espacement des blastocystes et les concentrations en progestrone et en stradiol-17 dans l'utrus n'taient pas modifis, mais les teneurs en Ca, Mn et Zn diffraient de celles des tmoins (Long et al., 1988). Une diminution des teneurs en progestrone et en prolactine, ainsi que du nombre de pics de LH a galement t rapporte (Long et Diekman, 1984, 1986). Cependant, la relation entre ces altrations et la mort des embryons n'est pas tablie. La persistance des corps jaunes et l'absence de retour en strus ont t observes chez des truies n'ayant pas de ftus l'issue du premier tiers de la gestation (Etienne et Jemmali, 1982 ; Long et al., 1982 ; Long et Diekman, 1984 ; Young et King, 1986). Cet effet pourrait tre d au fait que les truies non fcondes consommant la zaralnone sont pseudo-gestantes, tout comme les truies non insmines qui n'ont plus de cycles straux (Etienne et Jemmali, 1982). Une autre raison du maintien des corps jaunes serait la mort de tous les ftus chez les truies fcondes, celles-ci se retrouvant alors dans la mme situation que les femelles non fcondes. La croissance et le dveloppement des ftus peuvent tre affects par la zaralnone. La consommation de rgimes renfermant environ 4 mg/kg de zaralnone partir de l'insmination diminue de 24 % leur poids 80 jours de gestation (323 vs. 423 g) et accroit considrablement l'htrognit des portes (Etienne et Jemmali, 1982). Le poids des placentas est galement rduit, suggrant une altration des changes materno-ftaux. De plus, les ftus sont anmis (-11% d'rythrocytes). Young et King (1986) ont aussi constat que le poids des porcelets la naissance diminue lorsque la teneur en zaralnone de l'aliment augmente (de 1,42 1,05 kg entre 0 et 9 mg/kg de zaralnone). Au contraire, Long et Diekman (1984, 1986) n'ont pas observ d'effet similaire, mais dans leur exprience, la priode de consommation de zaralnone est trs courte et les ftus sont encore peu dvelopps, les truies tant sacrifies 30-40 jours de gestation. Par ailleurs, des cas d'abduction des membres postrieurs (splayleg) ont t signals sur des porcs nouveau-ns issus de truies consommant de l'aliment contamin (Miller et al., 1973). Peu d'tudes se sont focalises sur les consquences de la prsence de zaralnone dans le lait. D'aprs Young et al. (1982) et Dacasto et al. (1995), la survie post-natale des porcelets est affecte, alors qu'Edwards et al. (1987a) ne constatent aucun effet. Des symptmes d'hyperstrognisme chez des porcelets allaits ont t dcrits ds les premiers jours de vie (Dacasto et al., 1995), partir du 8me jour (Palyusik et al., 1980) et lge de 35 jours (Young et al., 1982). De l' et du -zaralnol ont t dtects dans le lait de truies consommant un aliment qui artificiellement contamin 40

137

mg/kg de zaralnone purifie (Palyusik et al., 1980). Par contre, aucun de ces composs n'a t trouv dans le placenta (Etienne et Jemmali, 1982). Les effets de la zaralnone sur la reproduction du verrat paraissent limits. Chez l'animal impubre, la consommation d'un aliment contenant 40 mg/kg de zaralnone jusqu' l'ge de 18 semaines diminue leur libido, mais n'affecte pas leur ge la pubert, la taille et le poids des testicules et de l'pididyme, le nombre de spermatides ni la motilit des spermatozodes (Berger et al., 1981). Chez le verrat reproducteur, Ruhr et al. (1983) ne constatent aucun effet d'un aliment ayant entre 0 et 200 mg/kg de zaralnone distribu pendant 8 semaines sur la taille des testicules, la libido, la testostrone et le 17-stradiol plasmatiques, et concluent l'absence d'effet de cette mycotoxine sur le potentiel de reproduction des verrats. Transfert dans les tissus animaux Il existe peu de donnes sur le stockage de la zaralnone ou de ses rsidus dans les tissus du porc (Sundlof et Strickland, 1986). Chez le porc, la zaralnone conjugue et l'-zaralnol sont les principaux mtabolites de la zaralnone, l'-zaralnol tant 3 4 fois plus strognique que la zaralnone. De la zaralnone libre apparat dans le sang 10 minutes aprs qu'elle ait t administre par voie orale (de 0 11,5 mg/kg de poids vif) des porcs de 20 30 kg (Farnworth et Trenholm, 1981). Sa teneur culmine 10 20 minutes plus tard, ce qui suggre qu'elle est rapidement absorbe. Elle dcrot ensuite rapidement par mtabolisation ou excrtion mais elle est encore retrouve aprs 24 h dans le sang des porcs ayant reu la plus forte dose. Dnicke et al. (2005) ont tabli 2,6 h la demi-vie dlimination de la zaralnone dans le plasma. Chez un porc femelle recevant 192 g de zaralnone /kg pc/j pendant 4 jours, la zaralnone et l'-zaralnol, tous deux sous forme lie l'acide glucuronique, sont dtects jusqu'au 5me jour dans le sang et jusqu'au 4me jour dans l'urine (Olsen et al., 1985). Aprs administration quotidienne pendant 7 jours de faibles doses de zaralnone (200 g, soit la LOAEL, ou 400 g/kg) 24 porcs de 49 kg, Obremski et al. (2003) constatent une augmentation de la zaralnone et de l'-zaralnol dans le sang 2 h aprs la 1re prise. Les concentrations en zaralnol sont toujours plus leves que celles en zaralnone. Le foie de porcelets d'environ 10 kg consommant pendant 4 semaines un aliment contamin 40 mg/kg de zaralnone contenait au maximum 0,23 mg/kg de zaralnone et 0,31 mg/kg d'-zaralnol (James et Smith, 1982). Dans le lait de 2 truies ayant consomm un aliment renfermant 40 mg/kg de zaralnone pendant 9 jours en lactation, Palyusik et al. (1980) retrouvent la toxine principalement sous forme de zaralnol (82 84 % sous forme de -zaralnol et 13-17% d'-zaralnol). Ces toxines taient dtectes partir de 4244 h aprs le dbut de la distribution du rgime contamin, la concentration maximale de zaralnol dans le lait tant de 0,58-0,79 mg/kg. En injectant de la zaralnone tritie par voie intraveineuse, Biehl et al. (1993) ont montr que la bile constitue une voie d'excrtion trs importante de la zaralnone et de ses mtabolites, et que ces produits sont recycls grce un cycle entrohpatique qui contribue augmenter leur dure de vie (86,6 h au lieu de 3,3 h chez des porcs dont la bile tait collecte). La zaralnone, l' et le zaralnol ont d'ailleurs t dtects dans la bile de la plupart des 792 truies prsentant des problmes de fertilit (Meyer et al., 2000). Seule la bile renferme du -zaralnol d'aprs Doll et al. (2003). Aprs 12 semaines de consommation dun aliment renfermant 0,24 mg de DON et 0,009 mg de zaralnone/kg, le rapport entre la teneur totale en zaralnone et ses mtabolites dans la bile et la teneur de laliment tait de 4, contre seulement 0,009 dans le foie (Goyarts et al., 2007). Seules des quantits minimes de zaralnone et de ses mtabolites (0,05%) persistent dans les muscles de porcs ayant consomm pendant 18 jours un aliment multicontamin, notamment par 1,37 mg/kg de zaralnone. Mais la diffrence du foie ou de la bile, ils peuvent contenir du zranol, ce qui suggre que le mtabolisme de la zaralnone ne serait pas limit aux sphres hpatique et gastro-intestinale (Zllner et al., 2002). D'aprs Mirocha et al., (1981), la zaralnone et ses mtabolites sont limins dans les fces et dans l'urine, 63% sous forme de zaralnone libre ou conjugue, 32% sous forme d'-zaralnol et 5% sous forme de -zaralnol.

138

6.1.2

Les volailles

Effets sur la sant

Parmi toutes les espces animales tudies, les volailles semblent tre les plus rsistantes la zaralnone (Gaumy et al., 2001a). Lors dtudes exprimentales, des teneurs suprieures 100 mg/kg sont en gnral ncessaires pour obtenir des signes cliniques. Ces manifestations sont rsumes dans le tableau II. Parmi les diffrentes espces, les dindons seraient les plus sensibles. Chez le jeune, un effet anabolisant est constat chez les animaux de 10-12 jours nourris avec une ration contenant 300 mg/kg de zaralnone. Une augmentation des scrtions muqueuses dans les fces, une hypertrophie de loviducte et du cloaque, suivie dune version de ce dernier aprs 4 jours de traitement sont galement observes (Mirocha et al., 1971). Chez ladulte, ladministration de 100 mg de zaralnone /kg daliment pendant 56 jours entrane une diminution de 20 % de la production dufs chez les femelles (Allen et al., 1983), alors que ladministration de 400 et 800 mg de zaralnone /kg entrane un dveloppement plus important des pendeloques chez les mles (Allen et al., 1981b). Limpact "conomique" de la zaralnone dans les conditions industrielles de production ne semble pas document.

Tableau 3 : Effets de la zaralnone chez les volailles


(Allen et al., 1981a et b, Allen et al., 1983 ; Bacon et Marks, 1976 ; Chi et al., 1980 ; Marks et Bacon, 1976 ; Mirocha et al., 1971).

Espce, sexe et ge Dindons de 3 semaines Dindons de 10 j Dindons mles adultes Poulets / cailles Poulets de 6 semaines Poules

Zaralnone 10-25 mg/kg 300 mg/kg 400-800 mg/kg 1-10-30 mg/kg 50-100-400-800 mg/kg 15 g/kg pc 50-200-400-800 mg/kg

Dure de Symptmes et lsions lexposition GMQ, autopsie, histologie : 3 semaines RAS Augmentation GMQ et des 4 jours scrtions muqueuses fces Dveloppement des pendeloques, formule chronique numration et biochimie sanguine : RAS 4 semaines RAS 3 semaines Autopsie, histologie : RAS administration Pas de lsion orale unique 7 jours Augmentation linaire du conscutifs poids de loviducte Aucun effet sur la 28 jours reproduction Aucun effet sur la chronique reproduction Semence normale, chronique diminution de phosphatmie, cholestrolmie, PAL

Poules reproductrices de 25-100 mg/kg 20 semaines Poules pondeuses de 30 10-25-50-100-200semaines 400-800 mg/kg Coqs adultes 100-800 mg/kg

RAS : aucune anomalie, GMQ : gain moyen quotidien, PAL : phosphatases alcalines

Mtabolisme et persistance ltat rsiduel Bien que le mtabolisme de la zaralnone soit un facteur clef de sa toxicit (Gaumy et al., 2001b), peu dtudes sont disponibles chez les volailles. Ex vivo, les poules produisent presque entirement l-zaralnol avec la fraction microsomale et le -zaralnol avec la fraction cytosolique (Olsen et Kessling, 1983). Les hpatocytes de poule produiraient principalement du -zaralnol, seules des traces d-zaralnol tant retrouves (Pompa et al., 1986). Ces rsultats divergent de ceux obtenus in vivo. Chez le poulet, ladministration dune ration contenant 100 mg de zaralnone /kg pendant 8 jours suivie de ladministration de 109 dpm/kg de zaralnone tritie rvle que la cintique de la

139

zaralnone est rapide, les temps de demi-vie tissulaires variant de 24 48 h (Mirocha et al., 1982). En dehors du tube digestif et des excrtas (incluant bile et vsicule), lessentiel de la radioactivit retrouve est prsente dans le foie et les reins, le pic de concentration tant obtenu 30 minutes aprs ladministration. Le profil rsiduel hpatique, en ng/g, est alors le suivant : zaralnone 681, zaralnol 1200, -zaralnol 662. Aprs 24 h, les quantits totales retrouves dans le foie, le gsier (sans la muqueuse), le muscle, le plasma, la peau et la graisse sont respectivement de 651, 297, 111, 91, 70 et 53 ng/g. Ces rsultats sont voisins de ceux obtenus par Maryamma et al. (1992) suite ladministration de 10 mg de zaralnone /kg pc des poulets pendant 20 j. Des teneurs hpatiques de 207 ng/g et 170 ng/g dans les muscles sont retrouves 24 h aprs la dernire administration, . De mme, chez le dindon, ladministration dune alimentation contenant 800 mg de zaralnone /kg pendant 2 semaines conduit des concentrations plasmatiques de 66 ng/ml en zaralnone et de 194 ng/ml en -zaralnol, essentiellement sous formes conjugues, seules des traces de -zaralnol tant retrouves (Olsen et al., 1986). Toutes ces tudes ont t effectues laide de trs fortes doses de zaralnone. Une exprimentation rcente ralise chez la poule par administration dune ration contenant 1,58 mg/kg de zaralnone pendant 16 semaines semble confirmer leur validit pour de faibles doses. Les concentrations hpatiques mesures en fin dtude sont de 2,1 ng/g en zaralnone et 3,7 ng/g en -zaralnol, essentiellement prsents sous forme de conjugus (glucuronoconjugus et sulfoconjugus), les teneurs en -zaralnol tant infrieures aux limites de dtection (3 ng/g) (Danicke, 2002). Aucune trace de zaralnone ou de ses mtabolites nest retrouve dans les muscles, la graisse et les ufs cette dose. Signalons toutefois que les auteurs ne prcisent pas le dlai entre la dernire administration daliment et la ralisation du bilan bilan rsiduel.

6.1.3

Les ruminants

Effets sur la sant Des problmes dinfertilit de vaches laitires associs la prsence de zaralnone dans des foins ont t identifis initialement par Mirocha et al. (1968). A partir denqutes ralises aux Etats-Unis sur des troupeaux laitiers, Linn et Chapman (2002) montrent que lingestion daliments contenant des doses suprieures 500 g/kg de zaralnone entrane une baisse de la fertilit. Des cas dinfertilit chez des brebis et des gnisses au pturage en Nouvelle-Zlande ont t attribus aussi la zaralnone (Towers et Sposen,1993). En fait des troubles de la reproduction sont frquemment observs chez les vaches laitires haute production. Or les dysfonctionnements digestifs et mtaboliques lis lutilisation de rations trs riches en nergie et en protines peuvent galement intervenir dans lexplication de linfertilit des animaux (Jouany, 2006). Il est donc difficile aujourdhui de prciser la part revenant chacun des deux facteurs dans ces troubles de la reproduction. Devenir de la zaralnone dans le rumen Plus de 90 % de la zaralnone peut tre mtabolis en -zaralnol et dans une moindre mesure en -zaralnol par les microorganismes du rumen in vitro (Kiessling et al., 1984) ; lactivit strognique de l-zaralnol est suprieure celle de la toxine parente alors que laffinit du zaralnol pour les rcepteurs strogniques est moindre, mais il prsente un fort effet inhibiteur sur la prolifration des cellules endomtriales (Tiemann et al., 2003). Lessentiel de la dgradation de la zaralnone a lieu pendant la premire heure dincubation dans le rumen (Moschini et al., 1999). Les protozoaires sont principalement impliqus puisque leur activit mtabolique lgard de la zaralnone est environ neuf fois plus forte que celle des bactries (Kiessling et al., 1984). Le zranol (ou -zaralanol) form par saturation de la double liaison 1,2 du cycle non aromatique de lzaralnol produit dans le rumen a t dtect dans la bile de bovin nayant pas reu de zranol de synthse utilis comme anabolisant10 (Meyer et al., 2002). Ce rsultat prouve que la zaralnone est mtabolise en zranol chez les ruminants aprs ingestion. Du zranol est galement limin dans la bile de bovins ayant reu des doses de 10 mg de zaralnone ou d-zaralnol par gavage : Meyer et al. (2002) ont montr que le rapport de concentrations urinaires -zaralnol/zranol est toujours suprieur 5, et que ce rsultat peut tre utilis pour diffrencier lutilisation frauduleuse du
10

Lutilisation de cet anabolisant est interdite en France

140

zranol comme facteur de croissance, dune production naturelle de lstrogne. Le rapport zranol/talranol (le talranol tant le mtabolite spcifique retrouv chez les animaux traits frauduleusement au zranol) peut galement tre utilis dans ce but chez les bovins (Launay et al., 2004). Lstrognicit de la zaralnone et de ses mtabolites a t analyse par Kuiper-Goodman et al. (1987), et quelques tudes rcentes ont pu discriminer des sous-types de rcepteurs (Eriksen et al., 2000). Ces travaux montrent que les mtabolites ont des effets strogniques gaux voire suprieurs ceux de la toxine parente. Toutefois, si lon considre que la rduction de la zaralnone en zaralnol augmente sa polarit, labsorption et lexcrtion du mtabolite sera alors accrue. Une hydroxystrode-dshydrognase qui est habituellement implique dans le mtabolisme des strodes intervient galement dans la conversion de la zaralnone en zaralnol au niveau du foie (Kiessling et Pettersson, 1978 ; Olsen et al., 1981). La disponibilit de lenzyme hpatique est donc augmente lorsquune partie de la conversion en zaralnol a dj eu lieu dans le rumen. Transfert dans le lait Les donnes disponibles pour identifier si le taux de transfert de la zaralnone dans le lait est significatif sont issues dexprimentations. Des doses quotidiennes orales de zaralnone de 50 165 mg administres des vaches nont pas permis de dtecter la prsence de toxines ou de mtabolites dans le plasma ou le lait (Prelusky et al., 1990). Une ingestion quotidienne de 544,5 mg de zaralnone par une vache laitire, pendant 21 jours, a conduit la dtection de la toxine mre et d-zaralnol dans le lait, avec un taux cumulatif de transfert de 0,06%. Une administration orale unique de 1,8 ou 6,0 g de zaralnone a galement abouti la dtection dune concentration maximale de 0,004 ou 0,0061 g/mL de zaralnone, 0,0015 ou 0,004 g /mL d-zaralnol et de 0,0041 ou 0,0066 g/mL de zaralnol dans le lait pendant 48 heures. Le taux de transfert a t faible et a vari avec la dose administre : 0,016 et 0,008% correspondant respectivement aux doses orales de 1,8 et 6,0 g (Prelusky et al., 1990). Ces donnes montrent que la zaralnone ne prsente pas de risque avr pour le consommateur de produits laitiers (Guerre et al., 2000). Nanmoins le taux de transfert dans le lait na t tudi quau travers de ces quelques exprimentations.

6.1.4

Animaux de compagnie et de loisirs

Si les animaux de compagnie et de loisirs ne diffrent pas fondamentalement des autres animaux domestiques quant aux circonstances et aux consquences du risque li aux mycotoxines, ils prsentent cependant une diffrence notoire : celle de la dure de laction toxique inhrente leur longue esprance de vie. Pour ces espces, cest tout autant limpact de consommation de faibles doses sur de trs longues priodes avec des rpercussions sur la fertilit ou les performances, la baisse dimmunit ou la sensibilit accrue aux agents infectieux, que le risque ponctuel li des contaminations massives associes un tableau clinique plus explicite, quil savre particulirement pertinent de connatre.

Les quids Les donnes disponibles quant la sensibilit des quids face la consommation daliments contamins par la zaralnone sont rares. Gimeno et Quintanilla (1983) rapportent un cas dintoxication naturelle par des issues de mas contamines 2,7 mg/kg de zaralnone. Les juments ont prsent refus alimentaires, prolapsus utrins et hmorragies internes. A contrario, dans un essai contrl, Juhasz et al. (2001) ont administr per os une faible dose de zaralnone (10 mg/j pendant 10 jours, ce qui correspond une contamination moyenne de la ration de 1 mg/kg) 6 juments, 10 jours aprs lovulation sans observer aucune dtrioration des paramtres de la reproduction.
Les carnivores De frquentes remontes du terrain laissent penser que les carnivores domestiques (canids et flids) seraient susceptibles de prsenter des signes cliniques de mycotoxicoses strogniques suite la consommation daliments secs contenant des crales avaries (bl et surtout mas). Cependant aucune de ces observations nest clairement documente et na fait lobjet de publication.

141

A loccasion dune enqute pidmiologique conduite entre mai 2001 et mai 2002 et portant sur la contamination des aliments destins aux animaux domestiques, 45 chantillons daliments secs pour chiens disponibles en Pologne ont fait lobjet dun dpistage de zaralnone (Gajecki, 2002). Quarante-deux se sont rvls positifs avec des valeurs comprises entre 5 et 299,5 g/kg. Lenqute conduite par Zwierzchowski et al. (2004) dans le mme pays fournit des rsultats comparables : sur 57 aliments pour carnivores analyss, 48 (soit 86 %) se rvlent positifs la zaralnone (de 0,5 299,5 g/kg) avec un taux moyen de contamination de 36 g/kg. Cependant, les seules observations faisant clairement le lien entre zaralnone et reproduction des carnivores ont t faites dans des conditions de contamination exprimentale daliments destination de chiens ou de visons. Aucune donne nest disponible dans lespce fline. Hidy et al. (1977) font les premiers rfrence un nombre significativement rduit de corps jaunes chez des chiennes recevant durant 13 semaines une alimentation contamine exprimentalement par la zaralnone (1 mg/kg pv/j). Plus rcemment, lactivit cible de la zaralnone sur la fonction de reproduction de la chienne a t confirme (Gajecka et al., 2004a et b). Des chiennes ges de 6 mois ont reu de la zaralnone pure additionne leur aliment, la dose de 200 g/kg pv durant 7 jours, quivalant une concentration dans laliment de 10 mg/kg environ. Au terme de cet essai, les animaux ont t ovario-hystrectomiss. Les tissus prlevs ont fait lobjet dun examen macroscopique et microscopique. Lutrus tait dmati, hypermique et hyperplasique avec un endomtre pulpeux et congestif. Le cervix et le vagin prsentaient de nombreuses cellules mtaplasiques. Quant aux ovaires, il tait possible de noter une hypermie, mais galement une atrsie folliculaire. Avec un niveau de contamination infrieur (25 et 50 g/kg pc durant 50 jours), il est not un effet dpresseur sur certains paramtres de limmunit humorale (Gajecka et al., 2004a). In vitro, des cellules de la granulosa et de la thque interne exposes 25 ng/mL de zaralnone rvlent une dgnrescence vacuolaire, signant une atteinte fonctionnelle des tissus folliculaires (Skorska-Wyszynska et al., 2004). Au vu de ces observations, il nest donc plus possible dcarter lventuelle responsabilit dune contamination, mme faible, des aliments pour carnivores dans la survenue de troubles de la fcondit en levage chez les femelles potentiellement reproductrices (strus prolong, kystes ovariens, pyomtre, etc.). Parmi les animaux fourrure, les visons (Mustela vison) constituent une catgorie part compte tenu du caractre intensif de la conduite de la reproduction. Limpact dun effet dltre ventuel de la zaralnone a t valu par Yamini et al. (1997) : un quart seulement des femelles mises la reproduction et recevant des aliments contamins 20 mg/kg de zaralnone ont mis bas. Les femelles vides ont toutes prsent une atteinte utrine (hyperplasie de lendomtre, endomtrite et/ou pyomtre) et ovarienne (atrsie folliculaire).

6.1.5

Les poissons

Toxicits la Zaralenone observes en levage A notre connaissance, aucun cas dune toxicit la zaralnone en levage piscicole na t rapport dans la littrature scientifique. Par contre, des tudes exprimentales menes sur les poissons ont fait tat deffets de la zaralnone sur la reproduction. Etudes exprimentales In vitro, leffet strognique de la zaralnone et de ses mtabolites (-zaralnol et -zaralnol) a t dmontr sur des cultures primaires dhpatocytes de saumon atlantique (Salmo salar) (Celius et al., 1999) exposes des concentrations variant de 10 1000 nM. Cette gamme de concentrations induit la synthse des protines zr de la zona radiata des ufs et de la vitellognine, l-zaralnol tant le plus fort inducteur et les protines zr tant les plus sensibles. Des observations similaires ont t faites chez la truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss), o les affinits de la zaralnone et de lzaralnol pour les rcepteurs strognes sont respectivement de 1/300 et de 1/150 environ par rapport lstradiol (Arukwe et al., 1999). Arukwe et al. (1999) ont men une tude in vivo chez la truite arc-en-ciel. Des truites tmoins ont t compares des truites ayant reu une injection de 1 ou 10 mg /kg pc de zaralnone, -zaralnol et -zaralnol ou encore une injection de 5 mg/kg pc de 17-stradiol. Une induction dose-

142

dpendante de la vitellognine et des protines zr a t observe 7 jours plus tard avec la zaralnone et l-zaralnol. Aucun effet significatif na t observ avec le -zaralnol. La rponse des protines zr l-zaralnol correspond approximativement 50 % de celle au 17-stradiol. La sensibilit in vivo semble donc plus leve que celle dmontre in vitro chez les poissons. Il parat probable que linduction de la synthse hpatique de la vitellognine et des protines zr par la zaralnone et de ses mtabolites chez les poissons soit cause par leur liaison au rcepteur strogne. Le potentiel strognique de ces substances chez les salmonids suit lordre suivant : zaralnol > zaralnone > -zaralnol (Arukwe et al., 1999), comme chez la majorit des espces animales. Cependant, il est noter quune tude (Matthews et al., 2000) a montr que la zaralnone et ses mtabolites ont une plus forte affinit pour les rcepteurs strogne de la truite arc-en-ciel, compar aux rcepteurs des humains, de la souris, du poulet ou encore de la grenouille. Par contre laffinit et la spcificit des rcepteurs strognes pour la zaralnone est similaire quand on compare la truite arc-en-ciel au saumon atlantique (Tollefsen et al., 2002). Par ailleurs, chez la carpe (Cyprinus carpio), lingestion de zaralnone provoque une rduction du nombre et de la qualit des spermatozodes mais les mcanismes daction ne sont pas encore lucids (Sandor et Vanyi, 1990). Transfert dans les tissus animaux Bien quune mthode de dosage de zaralnone, -zaralnol et -zaralnol dans les tissus de truites arc-en-ciel par LC-MS ait t mise au point (Lagana et al., 2003), notre connaissance, aucune donne de transfert de zaralnone ou de ses mtabolites dans les tissus na t publie.

6.2. Calcul de lexposition animale en France La mthodologie gnrale est dcrite en annexe 2 6.2.1 Donnes de contamination 2162 valeurs de contamination ont t recueillies, rparties sur 17 types daliments (tableau 4). Quelques matires premires (manioc, rafles de mas, seigle) disposant de moins de 5 donnes ne sont pas prsentes dans le tableau 4, ni utilises pour le calcul de lexposition. Ainsi, une fois ces donnes retires, il reste 2153 valeurs de contamination, regroupes en 14 types daliments. Tableau 4 : Rpartition des donnes de contamination en zaralnone par groupe de matires premires (n 5)
nombre de donnes 56 % < LOD % > LOQ

Avoine Bl Corn feed Farine basse Fveroles Gluten feed de bl Issues de crales Mas Orge Pois Remoulage Son Sorgho Triticale
Total

0.0 8.1 0.0 0.0 100.0 0.0 0.0 11.6 11.2 60.0 0.0 0.0 0.0 0.0 12.9

8.9 17.4 86.4 0.0 0.0 54.5 75.0 26.3 5.4 14.7 18.2 17.1 25.0 50.0 23.4

322 22 9 19 112 8 972 258 150 55 76 24 70 2153

143

Ces donnes comportent 12.9 % de valeurs infrieures la limite de dtection et 23.4 % de valeurs quantifies (suprieures la limite de quantification). Les estimations minimales calcule ainsi que les estimations aux 75me et 95me percentiles des teneurs suprieures la limite de quantification peuvent tre compares aux teneurs rglementaires pour les aliments complets (Recommandation 2006/576/CE). Les 3 matires premires les plus contamines sont le mas, les issues de crales, en particulier les poussires, ainsi que le gluten feed de bl. Il est gnralement admis que le mas et donc les produits issus du mas sont plus contamins que le bl. Concernant les poussires de crales, le problme est rcurrent quant leur niveau de contamination, non seulement en zaralenone mais quelle que soit la mycotoxine considre. Cette matire correspond des dchets de crales provenant de diverses sources (fond de silo, de bateau ou de camion, issues des filtres poussire par exemple). Il serait recommand de ne pas les utiliser pour lalimentation animale. Les statistiques descriptives des niveaux de contamination selon les scnarii indiqus sont fournis en annexes. Ces rsultats sont prsents pour les niveaux de contamination en poids frais (12 % dhumidit), tel que stipul dans la recommandation (Recommandation 2006/576/CE). Calcul de lexposition Les calculs de contamination des rations sont les suivants (les tableaux dtaills des rsultats sont en annexe 2) : Pour les herbivores, ruminants (notamment bovins)

Lexposition na pas t calcule ; en effet, les rgimes comportent pour une trs large part des matires premires pour lesquelles les donnes de contamination ne sont pas disponibles ou pas suffisantes : pturages, ensilages et autres fourragespour ce qui concerne le rgime retenu (cf annexe 2 Exposition animale : Mthodologie gnrale ). Pour les volailles

Tableau 5a : Calculs de contamination en zaralnone des rations pour les volailles Contamination minimale calcule en g/kg d'aliment % de la ration 27.6 58.5 23.3 62.2 19.7 62.6 21.6 68.4 42.1 65.8 50.2 77.6 50.5 79.4 40.2 68.8 40.9 76.7 41.8 79.5 38.1 65.1 17.0 40.9 14.3 47.5 17.4 55.0 23.4 58.3 19.3 66.0 18.8 64.3 Contamination des positifs au p75 au p95 en g/kg d'aliment 33.1 92.7 27.7 69.8 23.2 52.2 25.4 57.2 51.0 157.6 60.8 188.5 60.9 197.7 48.6 158.6 49.6 157.9 50.7 166.2 46.3 140.0 20.2 53.6 16.8 43.6 20.4 55.5 27.8 72.5 22.5 61.7 22.1 46.8 % de la ration 58.5 62.2 62.6 68.4 65.8 77.6 79.4 68.8 76.7 79.5 65.1 40.9 47.5 55.0 58.3 66.0 64.3

Poulet standard

Poulet label

Poule pondeuse

Dinde

dmarrage croissance finition retrait dmarrage croissance finition-retrait dmarrage croissance repro-entretien pondeuse dmarrage croissance 1 croissance 2 finition 1 finition 2 finition 3

144

Pintade

dmarrage croissance finition-retrait Canard de Barbarie canard dmarrage canard croissance canard finition Canard prt gaver levage gavage

49.8 56.0 62.9 31.8 35.1 33.9 44.5 100.4

58.2 62.5 65.4 70.4 79.1 81.8 75.0 98.0

60.5 68.1 76.7 38.0 41.9 40.3 53.7 122.4

205.1 225.6 257.0 104.6 114.5 106.8 162.6 414.0

58.2 62.5 65.4 70.4 79.1 81.8 75.0 98.0

NB : La part de la ration (exprime en pourcentage) susceptible dtre contamine par la zaralnone utilise dans le calcul de lexposition varie selon les scenarii : - dans le cas de la contamination minimale calcule, elle correspond aux matires premires pour lesquelles les donnes sont suffisantes (mme si elles sont non dtermines), - dans le cas du scnario contamination aux 75ime et 95ime percentiles des teneurs positives, elle correspond aux matires premires pour lesquelles les teneurs sont suprieures la limite de dtection. Il nexiste pas de teneur maximale acceptable pour la contamination par la zaralnone des aliments complets ou complmentaires pour les volailles. Les valeurs de contamination moyenne de la ration varient entre 14 et 100 g/kg. On peut distinguer les poulets standards, les poules pondeuses et les dindes avec un niveau de contamination de la ration infrieur 40 g/kg daliment des autres volailles (poulet label, pintade, canard prt gaver) dont les niveaux de contamination moyens suprieurs 40 g/kg peuvent aller jusqu 100 g/kg, en fonction du taux de mas dans leur ration. La contamination de la ration des canards prts gaver est extrme compte-tenu de la teneur de 98% de mas de leur rgime . Aux percentiles levs, cette teneur en mas distingue dautant plus les espces de volailles. Les matires premires pour lesquelles on dispose dun nombre suffisant de donnes de contamination reprsentent une part importante de la ration dans le cas des canards, ainsi que des poulets labels et des poules pondeuses (environ 70%). Pour les porcs

Tableau 5b Calculs de contamination en zaralnone des rations pour les porcs

Contamination minimale calcule Porcins En g/kg d'aliment 1er ge 2me ge croissance corpen finition corpen truies gestantes truies allaitant 40.5 26.9 31.6 36.1 31.3 22.7 % de la ration 56.5 78.0 83.4 87.0 84.8 79.5 au p75

Contamination des positifs au p95 % de la ration 56.5 78.0 83.4 87.0 84.8 79.5

Rec 2006/576/CE valeurs limites

en g/kg d'aliment 49.1 155.8 33.5 100.0 38.8 156.3 44.3 171.1 40.5 146.2 29.2 107.5

100 100 250 250 250 250

La recommandation 2006/576 prvoit des valeurs limites de contamination de la ration pour les porcins. Il faut cependant noter que les valeurs de teneurs maximales recommandes pour les matires premires sont dfinies pour les animaux les moins sensibles et donc ne sont pas utilisables pour les porcins. Ainsi, les scnarii moyens de contamination reprsentent jusqu 40 % de la contamination autorise pour les aliments 1er ge porcins. On note relativement peu de diffrences pour lexposition au 75me

145

percentile ; par contre au 95me percentile , les valeurs limites de la recommandation sont atteintes voire dpasses pour les porcelets. Linterprtation de ces rsultats doit tre effectue avec prudence en fonction du pourcentage de la ration prise en compte dans ce calcul. Dans le cas des porcs, hormis pour les aliments 1er ge pour lesquels il na pu tre tenu compte que de 57% de la ration totale, jusqu 87% de la ration a pu tre pris en compte dans lestimation de la contamination, permettant ainsi de sapprocher au mieux de la contamination totale.

7. Rglementation Pour lalimentation humaine, le rglement 1126/2007/CE modifiant le rglement 1881/2006/CE (abrogeant le rglement 466/2001/CE et ses modifications) fixe les teneurs maximales pour certains contaminants dans les denres alimentaires, notamment pour la zaralnone (tableau 6a). Pour lalimentation animale (matires premires et aliments), aucune teneur maximale en zaralnone n'est fixematires premires et les aliments , bien que la Commission Europenne fasse des recommandations11 (tableau 6b). Tableau 6a : Teneurs maximales en zaralnone dans les denres alimentaires exprimes en g/kg Produit Teneur maximale en g/kg Crales brutes autres que le mas 100 Mas brut lexception du mas brut destin tre transform par mouture 350 humide (*) Crales destines la consommation humaine directe, farine de 75 crales, son et germe en tant que produit fini commercialis pour la consommation humaine directe, lexception des denres alimentaires figurant aux points 6, 7, 8, 9 et 10 Huile de mas raffine 400 Pain (y compris les petits produits de boulangerie), ptisseries, biscuits 50 collations aux crales et crales pour petit djeuner ( l'exception des collations au mas et des crales pour petit djeuner base de mas) Mas destin la consommation humaine directe, collations au mas et 100 crales pour petit djeuner base de mas Prparations base de crales ( lexception des prparations base de 20 mas) et aliments pour bbs destins aux nourrissons et enfants en bas ge Pprparations base de mas destines aux nourrissons et enfants en bas 20 ge Fractions de mouture de mas dont la taille des particules est suprieure 200 > 500 microns m auxquelles sapplique le code NC 1103 13 ou 1103 20 40 et autres produits de mouture de mas dont la taille des particules est suprieure > 500 m destins la consommation humaine directe auxquelles sapplique le code NC 1904 10 10 Fractions de mouture de mas dont la taille des particules est 500 300 auxquelles sapplique le code NC 1102 20 et autres produits de mouture de mas dont la taille des particules est 500 destins la consommation humaine directe auxquelles sapplique le code NC 1904 10 10

(*) lexception sapplique uniquement au mas dont ltiquetage ou la destination, par exemple, font clairement apparatre quil est destin tre utilis dans un processus de mouture humide (production damidon)

11

Recommandation 2006/576/CE de la Commission du 17 aot 2006 concernant la prsence de doxynivalnol, de zaralnone, d'ochratoxine A, des toxines T-2 et HT-2 et de fumonisines dans les produits destins l'alimentation animale.

146

Tableau 6b : Teneurs maximales dans les aliments pour animaux selon la recommandation 2006/576/CE du 17 aot 2006 Produits Matires premires entrant dans la composition des aliments pour animaux : Les crales et sous-produits craliers Les sous-produits du mas Aliments complmentaires et complets pour : Les porcelets et les jeunes truies Les truies et les porcs dengraissement Les veaux, le btail laitier, les ovins (y compris les agneaux) et les caprins (y compris les chevreaux) Teneur maximale en g/kg (teneur en humidit de 12%)

2000 3000 100 250 500

8. Surveillance et contrle en France Les donnes de contamination disponibles issues des plans de surveillance et de contrle des services de lEtat (Direction Gnrale de lAlimentation DGAL- et Direction Gnrale de la Concurrence, de la Consommation et de la Rpression des Fraudes- DGCCRF- 2004, 2005, 2006, 2007) des rcoltes 2003 2006 montrent que le mas est plus risque que les grains de crales paille. En effet, par rapport aux limites rglementaires (voir prcdent), sur 100 chantillons de bl, 100 dorge et 223 de mas, aucun chantillon de bl ou dorge ne renferme plus de 100 g/kg en zaralnone alors que 11 % des chantillons de mas en contiennent plus de 200 g/kg. Par ailleurs, la contamination est variable selon les annes puisque le pourcentage dchantillons de mas dont la teneur en zaralnone dpasse 200 g/kg varie de 0 20 %. Les semoules et farines de mas sont les aliments les plus contamins, avec une teneur moyenne en zaralnone de 13,3 g/kg. Aucun chantillon ne dpasse la limite rglementaire de 200 g/kg. Les autres produits base de crales, notamment les semoules et farines de bl, prsentent des teneurs beaucoup plus faibles, comprises entre 2 et 4 g/kg (plus de 80 % des valeurs nont pas t quantifies (LOQ = 5 10 g/kg).

9. Conclusions et recommandations Leffet toxique le plus proccupant de la zaralnone est son caractre de perturbateur endocrinien activit strognique. Leffet sur lhomme nest pas avr. En revanche, les porcins sont sensibles la zaralnone, et plus particulirement les jeunes femelles. Chez cette espce, la zaralnone est mtabolise en -zaralnol, dont lactivit strognique est suprieure celle du compos parental. Cette bioconversion pourrait intervenir dans le tube digestif des ruminants. Le risque dune contamination du lait des ruminants nest pas avr sur la base du taux de transfert non significatif. Nanmoins cette observation a t effectue lors de quelques exprimentations chez des vaches laitires. La prsence de zaralnone et de ses mtabolites, notamment l-zaralnol, dans les produits animaux, devrait ainsi faire lobjet dtudes complmentaires afin dvaluer la ralit du transfert dans les denres dorigine animale. La Dose Journalire Tolrable Provisoire fixe par le SCF en 2000 a t retenue pour la caractrisation du risque pour le consommateur. Lexposition alimentaire humaine est infrieure la dose journalire tolrable sauf pour 2,5% des enfants de 3 14 ans, et pour 31% de la population vgtalienne. Les principaux aliments vecteurs sont ainsi les crales (mas) contamines au champ par des Fusarium producteurs. Les plans de surveillance devraient tre conforts par la prise en compte des produits craliers base de bl destins lalimentation humaine et animale.

147

Les animaux dlevage peuvent tre exposs la zaralnone contaminant les crales et coproduits craliers des teneurs leves capables dinduire un risque dapparition deffets strogniques, notamment chez le porc. Concernant les poussires de crales (dchets de crales), le problme est rcurrent quant leur niveau de contamination. Il serait recommand de ne pas les utiliser pour lalimentation animale. Il serait galement souhaitable de disposer de plus de donnes de contamination de certaines matires premires, et notamment de fourrages et densilages. Compte tenu de la part prpondrante prise par les aliments secs dans lalimentation des carnivores domestiques, et de la contribution notable de certaines crales risque (mas notamment) dans la formulation de ces aliments, des essais devraient tre entrepris afin dvaluer scientifiquement le niveau de rceptivit et de sensibilit des femelles reproductrices de ces espces. Il serait souhaitable que des tudes toxicologiques soient ralises selon les lignes directrices reconnues internationalement afin de rviser les doses journalires tolrables provisoires fixes en 1999 et 2000 sur le fondement dtudes insuffisantes. Enfin, des tudes devraient galement tre conduites pour amliorer les connaissances toxicologiques sur les interactions entre la prsence de zaralnone avec celle des autres perturbateurs endocriniens, ou des associations de toxines fusariennes, notamment de la zaralnone avec des trichothcnes et des fumonisines.

Rfrences bibliographiques (voir document spcifique)

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Chapitre 5

Les fumonisines

Coordination : Isabelle Oswald et Franois Grosjean

Introduction Bien que la dcouverte de la structure de la fumonisine B1 (FB1) date de 1988 (Gelderblom et al., 1988), les effets de cette famille de mycotoxines sont connus depuis longtemps dans plusieurs espces animales, en particulier chez les quids o elles se manifestent par une hpatotoxicit et une ncrose crbrale. Cette famille de mycotoxines est principalement produite par Fusarium verticillioides (anciennement F. moniliforme) et F. proliferatum. Le mcanisme daction des fumonisines est en partie lucid. Au niveau cellulaire, les fumonisines perturbent les fonctions biologiques de plusieurs protines intervenant dans la biosynthse de certains lipides : les sphingolipides (molcules impliqus dans les structures cellulaires, la croissance, la diffrenciation et la transformation noplasique). Les fumonisines ont une structure proche de celle de la sphinganine (Sa) et de la sphingosine (So), molcules qui constituent le squelette carbon des sphingolipides. Les fumonisines agiraient par inhibition des cramides synthases (= Nacyltransfrases) qui interviennent dans la biosynthse et le catabolisme des cramides (sous classe de sphingolipides). Diffrents travaux suggrent une double comptition sur les sites enzymatiques des cramides synthases, par analogie structurale entre la FB1 et la Sa dune part et la FB1 et lacyl CoA, dautre part. Linhibition de la biosynthse des sphingolipides conduit laccumulation de bases sphingodes libres (surtout la Sa, mais parfois galement la So) et une diminution des cramides et des sphingolipides complexes (Merrill et al., 1996; Merrill et al., 2001). Cette inhibition peut tre rvle par laugmentation du rapport Sa/So, observe dans divers tissus et dans le srum danimaux ayant consomm des fumonisines. Ce rapport constitue un marqueur prcoce, dpendant de la dose et spcifique dune exposition aux fumonisines, pouvant tre utilis titre pidmiologique, dans le dpistage pr-clinique des intoxications (Wang et al., 1991; Riley et al., 1993).

1. Proprits physiques et chimiques des fumonisines Les fumonisines constituent un groupe de mycotoxines structurellement relies. La fumonisine (FB1) est le diester en positions 14 et 15 de l'acide 1,2,3-propane tricarboxylique et du 2-amino-12,16dimthyl-3,5,10,14,15-pentahydroxyicosane. La fumonisine B2 (FB2) est l'analogue du dsoxy C-10 de la FB1. La structure des autres membres de cette famille est donne dans la figure 1.
O OH OH O H3C

CH3

R1

OH CH3

O HO

O O CH3 R2 NH2

O HO O

Fumonisine B1 Fumonisine B2 Fumonisine B3 Fumonisine B4

R1 OH OH H H

R2 OH H OH H

Formule brute C34H59NO15 C34H59NO14 C34H59NO14 C34H59NO13

Nombre CAS 116355-83-0 116355-84-1 136379-59-4 136379-60-7

Masse Molc. 721,8 705,8 705,8 689,8

Figure 1 : Structure chimique des fumonisines.

149

Ces composs sont caractriss par 4 fonctions acides carboxyliques qui leur confrent une grande hydrophilie. Ce sont des composs polaires, solubles dans l'eau et insolubles dans les solvants apolaires.

2. Mthodes danalyse (voir principes gnraux en Annexe 1) Le rglement 401/2006 fixe les modes de prlvement d'chantillons et les mthodes d'analyse pour le contrle officiel des teneurs en toxines de Fusarium dans les denres alimentaires. Il existe une mthode normalise pour la recherche des FB1 et FB2 dans le mas et le mas peu transform12 base sur une extraction en phase solide et suivie dune sparation par CLHP et dtection en fluorimtrie aprs drivation lOPA (o-phthaldialdehyde). Il existe une norme analytique au CEN13 pour le dosage des FB1 et FB2 dans les produits drivs du mas14 (farine et crales du petit-djeuner). 2.1 Extraction et purification Lextraction de FB1, FB2 et FB3 dans des aliments solides (rendements de 80 100%) peut tre assure par des mlanges dactonitrile et deau (Rice et al., 1995 ; Dilkina et al., 2001) ou de mthanol et deau. Le rendement dextraction sur matrice solide peut tre amlior en utilisant le principe de lextraction par fluide supercritique le plus souvent du CO2 directement sur lchantillon (Selim et al., 1996) ; le temps danalyse sen trouve galement diminu. Lextraction reste nanmoins lune des tapes de leur analyse la moins bien matrise. La purification sappuie sur la technique dextraction en phase solide (SPE), utilisant des principes variables de rtention des toxines : lchange danions (SAX) (Shephard, 1998), la phase inverse (C18) (Mateo et al., 2002) ou encore limmuno-affinit (IAC) (Dilkina et al., 2001). 2.2 Analyse par chromatographie en phase gazeuse (GC) La technique de chromatographie en phase gazeuse a t applique au contrle des fumonisines pour la premire fois par Sydenham et al. (1990). Leur stratgie a consist en une hydrolyse des deux chanes dacide tricarballylique (TCA) de FB1 suivie dune estrification et dune analyse en chromatographie en phase gazeuse couple la spectromtrie de masse (GC-MS). Dans ces conditions, seule la chane TCA a t dtecte, ne donnant ainsi aucune information sur le squelette aminopolyol (AP1), lequel permet de diffrencier les fumonisines entre elles. Cest pourquoi cette approche na pu tre utilise quen mthode de dpistage. Jackson et Benett (1990) ont galement publi lune des rares mthodes de sparation par GC, en dveloppant une tape de drivation des toxines par trimthylsilylation avant dtection par chromatographie en phase gazeuse couple une dtection par ionisation de flammes (CG-FID) et GC-MS (aprs ionisation EI). 2.3 Analyse par chromatographie liquide (LC) Les fumonisines ne possdent pas de groupement chromophore ; elles ne peuvent donc pas tre analyses sans modification de leur structure chimique par chromatographie liquide haute performance couple une dtection par absorption ultraviolette (HPLC-UV). Les acides carboxyliques de ces toxines impliquent lutilisation systmatique dacide fort pour amliorer le comportement chromatographique, en particulier en phase inverse, sur phases stationnaires C18 (Srensen et Elbk, 2005 ; Molinie et al., 2005), C8 (Wikes et al., 1995) ou phnylhexyl (Pagliuca et al., 2005). Plusieurs mthodes de drivation sont proposes. Les plus anciennes mthodes utilisaient respectivement lanhydride malique pour une dtection UV, et la fluorescamine pour une dtection par fluorescence (Sydenham et al., 1990). La premire approche tait insuffisante en terme de sensibilit (car limite au g/g) et de spcificit, en raison dinterfrences matricielles, et la seconde tait peu performante,en raison dun double signal pour la FB1 (Holcomb et al., 1993, Wilkes et Sutherland, 1993). La drivation avec lo-phthalaldhyde (OPA) sest dveloppe car le driv offre une meilleure rponse en fluorescence, la limite de dtection dans les chantillons ayant t abaisse quelques dizaines de ng/g, bien que le driv synthtis soit connu pour son instabilit dans le temps (Shephard et al., 1990). La drivation OPA des fumonisines est devenue une technique
12

13
14

Norme NF EN 13585, fvrier 2002 : Dtermination des fumonisines B1 et B2 dans le mas. Mthode CLHP avec purification par extraction en phase solide. Octobre 1999 (AFNOR : V03-124) CEN : Centre europen de normalisation Norme CEN : prEN 14352 (indice classement AFNOR : V03-140). Determination of fumonisins B1 and B2 in maize based foods by HPLC and IAC cleanup (Mthode Visconti)

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dHPLC standardise (Stack et Eppley, 1992 ; Thiel et al., 1993 ; Shephard et al., 1994b et 1995 ; Scott et Lawrence, 1996 ; Viquez et al., 1996 ; Patel et al., 1997 ; Shephard, 1998 ; Dilkina et al., 2001 ; Ho et Durst, 2003 ; Pagliuca et al., 2005 ; Molinie et al., 2005) et adopte par lAOAC pour les FB1, FB2 et FB3 (Sydenham et al., 1996). Dautres drivs fluorescents ont t proposs, tels que le 4-fluoro-7-nitrobenzofurazane (NBD-F) (Scott et Lawrence, 1992 et 1996) et le (9-fluorophnylmthyle) chloroformate (FMOC) (Mateo et al., 2002). Dans ce dernier cas, les limites de dtection atteintes ont t de 200 ng/g pour la FB1 dans de laliment supplment (Holcomb et al., 1993), avec une stabilit du driv dmontre sur 72 heures. Enfin, un driv utilisant le naphthalne-2,3-dicarboxyaldhyde (NDA) a t dvelopp pour lanalyse de FB1 et FB2 dans le lait, abaissant ainsi la limite de dtection 5 ng/ml et permettant une bonne stabilit des toxines drives (Maragos et Richard, 1994 ; Maragos et al., 1996 ; Richard et al., 1996). La premire utilisation du couplage de la chromatographie liquide avec la spectromtrie de masse pour lanalyse de la FB1 est attribue Korfmacher et al. (1991), en particulier via un interfaage avec source lectrospray (ESI). Lanalyse simultane de la FB1, de la FB2 et de la FB3 (non drives) sur une HPLC en phase inverse (phase stationnaire polymrique et phase mobile dactate dammonium) suivie dune mesure ESI-MS a permis dabaisser les limites de dtection quelques dizaines de ng.g-1 dans des extraits dchantillons de mas (Doerge et al., 1994). Dans ces premires approches, la spectromtrie de masse monodimensionnelle limitait la spcificit de la mthode, puisque seul un signal celui de lion quasi-molculaire (M+H)+ pouvait tre suivi ; des tentatives de fragmentation dans linterface ont t inities (technique dite de CID, i.e. dissociation induite par collision) sans succs. Lintroduction progressive de la spectromtrie de masse multidimensionnelle (triple quadriple ou bien trappe ionique) a considrablement amlior la spcificit de lapproche de chromatographie liquide couple la spectromtrie de masse (LC-MS) ; ainsi, lion (M+H)+ a pu tre fragment en ions produits (dans la trappe ionique ou dans la cellule de collision), autorisant lenregistrement dune transition de lion prcurseur vers lion produit (Josephs, 1996). En outre, lutilisation dtalons internes deutrs ou marqus au [13C] est devenue possible, ce qui constitue un progrs notable pour ltape de quantification. Lucas et al. (1996) ont ainsi pu atteindre des limites de quantification (rapport signal/bruit > 10) infrieures au ng.g-1 dans des extraits de mas. Bien quelle soit plus coteuse et plus exigeante dans sa mise en oeuvre, le couplage de la chromatographie liquide la spectromtrie de masse en tandem aprs ionisation lectrospray (LC-ESI(+)-MS/MS) aujourdhui a tendance se gnraliser comme technique de confirmation (Srensen et Elbk, 2005). 2.4 Immuno-essais (ELISA) et techniques fluorescentes Lutilisation dun anticorps polyclonal a t mise profit pour dpister les fumonisines par technique ELISA dans le mas, les aliments pour animaux et les denres alimentaires (Sutikno et al., 1996). La comparaison des concentrations mesures par cette technique avec celles obtenues par HPLC fluorimtrie (avec drivation OPA) dmontre une survaluation quasi-systmatique des concentrations par la technique immunologique, ceci pouvant sexpliquer par la non spcificit de lanticorps et la ractivit croise avec des interfrences matricielles co-extraites (Sydenham et al., 1996). Sous rserve dune mthode de purification slective, la technique ELISA peut nanmoins tre considre comme une mthode de dpistage adapte, rapide, de cot modr et facile pratiquer.

3. Facteurs influenant la teneur en fumonisines dans les denres 3.1 Facteurs de dveloppement fongique au champ

Les fumonisines des crales semblent tre produites quasi exclusivement au champ, sur mas et sorgho par des espces de F. verticillioides (anciennement F. moniliforme) et F. proliferatum. Les facteurs de variation sont moins bien connus que ceux concernant les autres fusariotoxines. La prsence importante de fumonisines est lie des tempratures estivales leves, comme on a pu le constater en France certaines annes : ainsi, les mas cultivs dans la partie septentrionale sont peu ou pas concerns par les fumonisines, alors que ceux cultivs dans la partie mridionale peuvent ltre. Les mas cultivs en Europe du Sud seraient particulirement exposs la contamination par les fumonisines (SCOOP, 2003).

151

La prsence despces de Fusarium producteurs de fumonisines est aggrave par les attaques de pyrale (Ostrinia nubilalis), un insecte qui provoque des lsions dans les pis et les tiges, constituant des portes dentre pour ces Fusarium (Gatch et Munkvold, 2002 ; Alma et al., 2005), la diffrence des autres Fusarium pntrant dans les pis par les soies. Aussi, la lutte contre la pyrale se justifie non seulement par le besoin de productivit de la culture, mais aussi par la ncessaire qualit sanitaire de la rcolte. Cette protection sopre classiquement par lutte chimique, un peu moins classiquement par la lutte biologique (utilisation de trichogrammes insectes entomophages sattaquant aux pyrales-) mais elle pourrait lavenir senvisager par lutilisation de varits de mas transgniques contenant un gne de Bacillus thuringiensis (Bt) (Bakan et al., 2002 ; Wu, 2006). Des lsions provoques par dautres insectes foreurs tels que la ssamie (Sesamia nonagrioides) peuvent constituer des portes dentre dans les mas de Fusarium producteurs de fumonisines (Avantaggiato et al., 2003). Certaines pratiques agronomiques interviennent galement dans le dveloppement de F. verticillioides et dans la production de fumonisines. Ainsi, plus la rcolte est tardive et plus la teneur en fumonisines des grains de mas est leve (Bush et al., 2004). De mme, la teneur en fumonisines est lie la dure entre la rcolte et le schage des grains de mas.

3.2

Impact des procds technologiques sur la teneur en toxine

Le nettoyage des grains est efficace pour rduire la teneur en fumonisines dun lot (Scudamore et Patel, 2000), mais conduit la production dissues de nettoyage fortement contamines. En semoulerie de mas, des travaux de rpartition des fumonisines partir de lots commerciaux (Katta et al., 1997 ; Brera et al., 2004) montrent une plus forte contamination des sons (ils sont en moyenne de 1,6 2 fois plus contamins que le grain). Les teneurs relatives en fumonisines des germes par rapport celles des grains divergent selon les tudes alors les semoules et les farines ont des teneurs plus faibles que celle des grains. La rpartition de la FB1 est identique celle de la FB2 puisque le rapport FB1/FB2 est constant dans les diffrentes fractions (Katta et al., 1997). Le devenir des fumonisines concerne aussi la distillation des grains, bien que peu de travaux aient port sur ce sujet. Bothast et al. (1992) ont rapport que la FB1 ne se retrouve pas dans lthanol mais dans les drches (rsidu des grains aprs puisement de lamidon par fermentation). Les fumonisines tant thermostables, elles persistent dans les produits alimentaires transforms base de mas comme la polenta (Brera et al., 2004).

4. Proprits toxicologiques 4.1 Toxicocintique

4.1.1 Absorption et limination Chez le rat et la plupart des animaux, les tudes de la cintique de la FB1 indiquent une faible absorption, une distribution rapide et une limination selon un modle deux ou trois compartiments. Aprs administration par voie orale, peu de FB est dtecte dans le plasma et les tissus, indiquant une trs faible absorption (infrieure 4%). Chez les rats, aprs administration par gavage ou intragastrique de FB1 radio-marque, 80 100 % du marquage sont retrouvs dans les fces tandis que seulement des traces (au maximum 3%) de la toxine sont retrouves dans l'urine (Shephard et al., 1992 ; Norred et al., 1993 ; Dantzer et al., 1999). De mme, chez le singe, avec un gavage de la FB1 radio-marque, on retrouve 61 % de la dose administre dans les fces et 1,2 % dans lurine (Shephard et al., 1994b). Les tudes ralises chez le rat ou le singe avec de la FB2 montrent galement une faible absorption (Shephard et al., 1995 ; Shephard et Snijman, 1999). L'absorption de la FB1 par des entrocytes a galement t tudie in vitro. En utilisant, des cellules Caco-2 qui, en dpit de leur origine colique, sont reprsentatives de lintestin grle humain, Caloni et al. (2002) ont montr qu'aucune absorption de FB1 ou de mtabolites partiellement hydrolyss n'avait lieu dans des cellules diffrencies ou indiffrencies. En revanche, une absorption de FB1

152

totalement hydrolyse (compos appel AP1) est constate dans les cellules Caco-2 diffrencies, qui expriment des caractristiques enzymatiques et mtaboliques proches de celles des entrocytes matures. In vivo, chez des rats femelles gavs avec de la toxine marque au [14C], la FB1 hydrolyse est davantage excrte dans l'urine que la FB1 (17 % versus 0,7%). Les auteurs concluent donc que la FB1 hydrolyse est mieux absorbe que la FB1, bien que l'excrtion biliaire des deux formes de toxine soit semblable (Dantzer et al., 1999). La FB2 est moins biodisponible que la FB1, et proportionnellement la quantit de FB2 excrte dans la bile est moindre (Shephard et Snijman, 1999).

4.1.2 Distribution Aprs absorption, la FB1 se retrouve dans tous les tissus et majoritairement dans le foie et les reins, comme le montrent les tudes ralises chez le rat ou le porc recevant par voie orale de la FB1 marque au 14[C] (Shepard et al., 1992b ; Nored et al., 1993 ; Prelusky et al., 1994, 1996ab). Plusieurs tudes montrent que le foie contient plus de radioactivit que les reins, mais une tude de Nored (1993) conclut une hirarchie inverse. Comme cela a dj t mentionn, la FB1 inhibe la cramide synthase, induisant une augmentation de la sphinganine libre. Les tudes animales montrent que laugmentation tissulaire de la sphinganine libre mime la distribution de la radioactivit observe dans les tudes cites ci-dessus. Ainsi, par comparaison aux autres tissus, le foie et les reins montrent la plus grande augmentation de sphinganine aprs exposition des animaux la fumonisine. Chez le rat, la concentration en sphinganine libre dans les reins mais non le foie, est plus persistante (Enongene et al., 2000 et Garren et al., 2001). Enfin, dans une tude conduite chez les rats Wistar mles nourris par gavage avec de la toxine pure, les reins contenaient 10 fois plus de FB1 que le foie (Martinez-Larranaga et al., 1999). Les cellules intestinales sont trs exposes la toxine lorsque celle-ci est ingre. En effet, 24 heures aprs l'administration de FB1 radio-marque des primates non humains, 25% du marquage est retrouv dans les cellules pithliales intestinales (Shephard et al., 1995). La voie principale d'limination de la FB1 se fait via la bile, la toxine excrte tant toujours biologiquement active (Enongene et al. 2000 et 2002). La circulation entrohpathique augmente donc probablement le niveau d'exposition de l'intestin la mycotoxine, au moins pour les rats et les porcs (Norred et al. 1993; Shephard et al., 1994a; Prelusky et al., 1994; Prelusky et al. 1996a). Chez les rats et les lapins gravides, de faibles concentrations de FB1 ont t retrouves dans l'utrus, le placenta, et les ftus, indiquant peu de transfert placentaire de la toxine. Il y a galement peu de preuves d'un transfert de toxine pendant la lactation (JECFA, 2001).

4.1.3 Biotransformation Il y a trs peu de preuves que les fumonisines soient mtaboliss in vitro ou in vivo. En effet, Cawood et al. (1994) n'ont pas observ de mtabolisme des fumonisines par les estrases microsomales ou par des monooxygnases cytochrome P-450. Plus rcemment, Spotti et al. (2001) n'ont pas dcrit de mtabolisme de la FB1 par des microsomes de foie bovin. Une tude dans laquelle des hpatocytes primaires ont t exposs de la FB1 marque au [14C] a montr que la toxine est associe aux membranes cellulaires, mais aucun mtabolite n'a t dtect l'issue d'une incubation de 44 heures. Les fumonisines sont excrtes principalement dans les fces, soit sous forme native soit sous forme partiellement hydrolyse aprs limination d'un ester li aux acides tricarboxyliques en position C14. Seules des traces de FB1 entirement hydrolyse, AP1, ont t trouves dans les fces (Shephard et al., 1994b). Aucun mtabolite hydrolys n'ayant t retrouv dans l'urine ou dans la bile, on suppose que l'hydrolyse se produirait dans l'intestin, sous l'action de micro-organismes (Shephard et al., 1995; Shephard et al., 1994b). Bien qu'il n'y ait pas de preuve que les fumonisines soient mtabolises par des cytochromes P450, quelques tudes ralises in vivo ou in vitro, montrent que les fumonisines peuvent moduler l'activit de ces enzymes, souvent au travers de l'altration du mtabolisme des sphingolipides (Merrill et al., 1999; Spotti et al., 2000). Par exemple, la FB1 empche l'induction de CYP 1A1, une enzyme qui mtabolise les hydrocarbures aromatiques tels que le mthyl-cholanthrne, dans des cellules HepG2

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(Merrill et al., 1999). Chez des rats gavs par la FB1 (2 mg/kg p.c.), CYP 2C11 et un moindre degr CYP 1A2 sont galement inhibs (Spotti et al., 2000). L'inhibition de CYP 2C11 a t attribue la suppression de l'activit de protine kinase due l'inhibition de la biosynthse des sphingolipides mais galement llvation de la concentration en sphingosine, une base sphingode qui s'accumule chez les animaux exposs la FB1, (Merrill et al., 1999).

4.2

Toxicit gnrale

Une toxicit a t observe, pour toutes les espces animales tudies, dans le foie qui est la principale cible de la FB1. Les reins sont galement affects chez de nombreuses espces. Dans ces organes, la toxicit induite par la FB1 est souvent initialement caractrise par une ncrose lie des processus apoptotiques et oncotiques suivie dune rgnration et, dans le cas du foie, dune hyperplasie des conduits de la bile. Chez les rongeurs, la toxicit de la FB1 dpend la fois de la ligne utilise et du sexe des animaux. Par exemple, des rats mle BD IX sont plus rsistants aux effets nphrotoxiques de la FB1 que des rats mles Fischer 344N, Sprague-Dawley ou RIVM:WU (JEFCA, 2001).

4.2.1 Toxicit cellulaire Les fumonisines agissent en particulier sur la synthse des sphingolipides. Ceci a de multiples consquences sur la physiologie cellulaire. En effet, les bases sphingodes et les cramides sont des seconds messagers impliqus dans de nombreuses fonctions telles que lapoptose, la croissance et la diffrenciation cellulaire, linflammation, la scrtion protique, lendocytose et la synthse dautres classes de sphingolipides (Ohanian et Ohanian, 2001; Baumruker et Prieschl, 2002; Pettus et al., 2002; Ruvolo, 2003; Spiegel et Milstien, 2003). Par ailleurs, les sphingolipides sont des constituants structuraux essentiels des membranes cellulaires et la FB1 peut provoquer une atteinte de lintgrit membranaire. Les lsions observes chez diffrentes espces animales suggrent que les fumonisines sont des molcules cytotoxiques. Les signes de cytotoxicit sont trs variables et fonction des types cellulaires. On peut constater une altration du cycle cellulaire avec inhibition de la prolifration (Yoo et al., 1992 ; Abbas et al., 1993; Dombrink-Kurtzman et al., 1993; Gelderblom et al., 1995; Ciacci-Zanella et al., 1998; Marin et al., 2007) ou un dclenchement de lapoptose (Wang et al., 1991) ou de la mitose (Dombrink-Kurtzman et al., 1993). Les altrations morphologiques associes ces effets sont nombreuses : cellules arrondies et dtaches de leur support (Abbas et al., 1993), noyau dsintgr et cytoplasme vacuolis (Qureshi et Hagler, 1992; Gelderblom et al., 1995), rythrocytes ressemblant des rythroblastes (Dombrink-Kurtzman et al., 1993), pokilocytes en forme de fuseau (DombrinkKurtzman et al., 1993). Enfin, des atteintes fonctionnelles peuvent tre observes seules,comme par exemple, une baisse de phagocytose de macrophages de poulet (Qureshi et Hagler, 1992), une augmentation de la permabilit membranaire de cellules dendothlium vasculaire pulmonaire porcin (Ramasamy et al., 1995) ou une altration de la fonction de barrire des cellules pithliales intestinales (Bouhet et al., 2004 ; Loiseau et al., 2007). Deux processus peuvent entraner la mort cellulaire : la ncrose et lapoptose. Si les processus ncrotiques pouvant tre lorigine de la cytotoxicit des fumonisines sont peu caractriss, il nen est pas de mme pour les processus apoptotiques. Dans plusieurs modles animaux, l'administration de FB1 induit une apoptose dans divers tissus (Lim et al., 1996; Tolleson et al., 1996; Sharma et al., 1997; Bucci et al., 1998; Ciacci-Zanella et Jones, 1999; Lemmer et al., 1999; Dragan et al., 2001; Jones et al., 2001; Dombrink-Kurtzman, 2003; Gopee et al., 2003). L'apoptose semble jouer un rle important dans les effets toxiques de la FB1 y compris dans l'induction de tumeur. Dans les expriences ralises sur animaux, les phnomnes d'apoptose sont observs toutes les doses induisant des effets toxiques y compris les effets cancrognes. La dose de toxine induisant l'apoptose dpend de la dure de l'exposition, de lespce animale considre et varie de 0,9 12 mg FB1/kg p.c./j dans les expriences long ou court terme. La suppression des chanes latrales d'acides tricarboxyliques (produisant AP1) convertit cet inhibiteur de la cramide synthase en substrat pour l'enzyme. Le produit de cette raction, PAP1, inhibe galement la cramide synthase in vitro. On ne sait pas si ce produit est form in vivo, mais il est plus toxique que la FB1 ou la FB1 hydrolyse pour les cellules HT-29 (Merrill et al., 2001). Comme

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la FB1 et la FB2 hydrolyses sont les principaux produits de la dgradation aprs cuisson en milieu alcalin du mas et de ses drivs et quelles sont galement produites dans l'intestin partir de la FB1 et de la FB2, la toxicit des toxines hydrolyses devrait tre tudie. 4.2.2 Toxicit aigu Lespce animale domestique la plus sensible la FB1 est le cheval. Des manifestations aigus de la toxicit des fumonisines ont t mises en vidence : les chevaux dveloppent une leucoencphalomalacie, syndrome qui entrane la mort des animaux (Marasas et al., 1976 ; Marasas et al., 1988). Ces syndromes font lobjet dune description dtaille dans la partie sant animale . Chez les rongeurs, la DL50 de cette toxine est inconnue. 4.2.3 Toxicit sub-aigu et subchronique Plusieurs tudes de toxicit orale subaigu (allant de quelques jours plusieurs semaines) de la FB1 ont t ralises chez les rongeurs (Gelderblom et al., 1988; Gelderblom et al., 1994; Bondy et al., 1995; Bondy et al., 1997; Bondy et al., 1998; Bucci et al., 1998; Gelderblom et al., 1992; Gelderblom et al., 1993a; Voss et al., 1993; Suzuki et al., 1995). Dans toutes les tudes effectues chez le rat des effets nphrotoxiques et hpatotoxiques ont t observs. L'incidence et la svrit des altrations rnales ont t troitement corrles avec des concentrations accrues de sphinganine dans les tissus, le srum et l'urine (Riley et al., 1994). D'autres effets toxiques de la FB1 ont t galement rapports chez le rat, tels qu'une ncrose du myocarde et un dme pulmonaire svre (Gelderblom et al., 1993b). La dose sans effet pour la toxicit rnale (< 15 mg/kg d'aliment) est infrieure celle observe pour l'hpatotoxicit. Des hpatocytes et des cellules tubulaires proximales rnales contenant des corps apoptotiques ont t observs chez des animaux ayant reu de la FB1, suggrant que la toxine induit une mort programme acclre dans le rein et le foie. Chez la souris, la toxicit observe dans le foie est semblable celle dcrite chez le rat, mais la toxicit rnale est faible et apparat seulement chez les femelles (Bondy et al., 1997). Chez les rats, la toxicit se manifeste principalement au niveau rnal. Des lsions du tubule proximal situ dans la mdula externe ont t observes chez les mles F344 recevant un aliment contamin avec 9 mg de FB1/kg (soit 0,6 mg/kg p.c./j) ou des aliments plus contamins (27 et 81 mg de FB1/kg d'aliment) et chez les femelles recevant l'aliment le plus contamin (81 mg/kg d'aliment) pendant 13 semaines (Voss et al., 1995). Ces lsions sont du mme type que celles observes dans une tude mene sur quatre semaines (Voss et al., 1993). Le poids relatif des reins diminue chez les rats mles nourris pendant 4 semaines avec un aliment contenant 27 mg de FB1/kg et chez les mles et les femelles nourris pendant 13 semaines avec un aliment contenant 9 mg de FB1/kg. Dans le srum, la cratinine augmente chez les mles nourris pendant 13 semaines avec un aliment contenant au moins 27 mg de FB1/kg et chez les femelles nourries pendant 13 semaines avec un aliment contenant 81 mg de FB1/kg. Dans cette tude, la NOAEL est de 0,2 mg de FB1/kg p.c./j. Dautres manifestations toxiques sont dcrites chez le rat. En particulier, une thrombose cardiaque intraventriculaire a t observe chez tous les animaux ayant ingr quotidiennement de fortes doses de culture de F. verticillioides, sur des priodes allant de 44 78 jours (Kriek et al., 1981). Chez les souris B6C3F1, une hpatotoxicit et des dsordres biochimiques tmoignant de cette atteinte hpatique ont t observs chez les femelles nourries pendant 13 semaines avec un aliment contamin par 81 mg de FB1/kg d'aliment. Chez les souris mles, on n'a pas retrouv d'hpatotoxicit et aucune atteinte hpatique n'a t observe chez ces animaux, quel que soit leur sexe (Voss et al., 1995). Dans cette tude, la NOAEL est de 1,8 mg de FB1/kg p.c./j. En conclusion, les tudes de toxicit subchronique menes chez les rongeurs montrent au niveau des organes cibles des diffrences (entre le foie et le rein) selon lespce considre. On observe galement des diffrences selon le sexe des animaux : les rats mles sont plus sensibles que les femelles alors que les souris femelles sont plus sensibles que les mles.

4.2.4 Gnotoxicit La FB1 aussi bien que la FB2 ou la FB3 se sont rvles non mutagnes dans le test d'Ames ralis avec diffrentes souches de salmonelles TA97a, TA98, TA100, TA102 en prsence ou en absence de la fraction microsomale S9 (Gelderblom et Snyman, 1991; Park et al., 1992; Knasmller et al., 1997).

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La non-mutagnicit de la FB1 a t confirme dans le test chromotest SOS avec la souche d'Escherichia coli PQ37, ralis avec ou sans activation mtabolique ainsi que par l'analyse de la rparation diffrentielle de l'ADN avec la souche K12 d'E. coli (343/753, uvrB/recA et 343/765, uvr+/rec+). A des concentrations de 0,04 80 M/plaque et de 0,04 40 M/plaque pour la FB1 et la FB2 respectivement, ces deux toxines sont non gnotoxiques dans un test in vitro de rparation de l'ADN sur hpatocytes de rat ainsi que in vivo une concentration de 100 mg de FB1 ou de FB2 /kg (Gelderblom et al., 1989; 1992b). Cette constatation que la FB1 n'induisait pas une synthse nonprogramme d'ADN a t confirme in vitro sur des hpatocytes primaires pour des concentrations de 0,5 200 M (Norred et al., 1990, 1992a). En revanche, Sun et Stahr (1993) utilisant un test commercial de gnotoxicit (Vibrio fischeri), ont montr que la FB1, dans la gamme de concentrations de 5 20 g/ml, avait une activit gnotoxique observe sans activation mtabolique de la fraction S9. Dans une autre tude, quelques effets clastognes ont t observs (Knasmller et al., 1997). De faibles concentrations de toxine (1 g FB1/ml) augmentent la frquence des micronoyaux et le nombre des aberrations chromosomiques, mais pour ces deux paramtres aucun effet-dose n'a t observ. Cette tude portant seulement sur l'analyse de 20 mtaphases, et les rsultats n'tant pas exprims de manire conventionnelle, elle a t carte de l'analyse effectue par l'Union europenne.

4.2.5 Cancrognicit Plusieurs tudes ont t conduites chez diffrentes souches de rats (BDIX et F344/N), sur des priodes dintoxication allant jusqu 2 ans (Marasas et al., 1984; Jaskiewicz et al., 1987; NTP, 2001). La distribution des rats d'aliments contamins avec des extraits de culture de F. verticillioides produisant de fortes doses de fumonisines (principalement de la FB1) pendant 23 27 mois entrane lapparition de carcinomes hpatocellulaires, avec cirrhose et adnofibrose, mais aussi des carcinomes de lpithlium gastrique et une hyperplasie des cellules basales de lsophage (Marasas et al., 1984, Jaskiewicz et al., 1987). Deux tudes de toxicit long terme de la FB1 ont t effectues sur des rats BD IX (Gelderblom et al., 1991; Gelderblom et al., 1995). La premire a t ralise sur 25 rats mles recevant pendant 26 mois un aliment contamin avec 50 mg de FB1 semi-purifie (quivalent 2,5 mg FB1/kg p.c./j). Les animaux tmoins ont reu un aliment ayant une contamination rsiduelle de 0,5 mg de FB1/kg (quivalent 0,025 mg FB1/kg p.c./j) et exempt d'aflatoxine B1. Des animaux ont t autopsis 6, 12, 20 et 26 mois. Tous les animaux morts ou autopsis aprs 18 mois de traitement dveloppaient une atteinte hpatique. La svrit des lsions hpatiques est corrle avec la dure d'exposition et 10 des 15 rats (66 %) autopsis entre 18 et 26 mois ont dvelopp un hpatocarcinome primaire. Chez certains animaux, des mtastases taient visibles au niveau du cur, des poumons et des reins (Gelderblom et al., 1991). Bien que cette tude soit limite (peu d'animaux, une seule dose, un seul sexe), elle indique clairement que la FB1 est cancrogne et souligne l'volution de l'atteinte hpatique vers le cancer du foie. La deuxime tude a t ralise avec des animaux recevant pendant 24 mois des aliments contenant 0, 1, 10 et 25 mg FB1/kg (quivalent 0 ; 0,05 ; 0,5 et 1,25 mg FB1/kg p.c./j). Aucune tumeur n'a t observe, y compris chez les rats ingrant l'aliment le plus contamin (Gelderblom et al., 1995a). Ces deux tudes montrent quune exposition alimentaire 50 mg de FB1/kg daliment induit des carcinomes hpatiques (Gelderblom et al., 1991) tandis qu'une exposition 25 mg de FB1/kg daliment nen induit pas (Gelderblom et al., 1995a). Elles permettent de dterminer une NOAEL non tumorigne quivalente 1,25 mg de FB1/kg p.c./j. La toxicit long terme de la FB1 a galement t tudie sur rats F344/N (NTP, 2001). Les animaux ont t nourris pendant 105 semaines avec des rgimes contenant de 0 150 mg FB1/kg d'aliment (quivalent 0 7,5 mg FB1/kg p.c./j pour les mles et 0 6,0 mg FB1/ kg p.c./j pour les femelles). La consommation de toxine n'a pas eu d'effet sur la survie, le poids corporel et la consommation alimentaire. Une lvation du ratio sphinganine/sphingosine (Sa/So) a t observe partir de 26 semaines d'exposition dans l'urine des rats mles nourris avec des rgimes contenant au moins 15 mg de FB1/kg et dans les urines des femelles nourries avec des rgimes contamins au-del de 50 mg FB1/kg. Cette lvation a galement t note dans les reins des animaux recevant des aliments contamins avec 50 mg FB1/kg ou au del. L'atteinte rnale s'est galement traduite par une prolifration des cellules pithliales ( partir de 26 semaines chez les mles exposs 50 et 150 mg FB1/kg d'aliment) par une diminution du poids des reins ( partir de 6 semaines chez les mles

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exposs 50 et 150 mg FB1/kg d'aliment et partir de 26 semaines chez les femelles les plus exposes). A l'issue des deux ans de l'tude, il y avait aussi une augmentation significative de l'incidence des adnomes, des carcinomes et des hyperplasies des tubules rnaux chez les rats mles. Par contre, l'tude n'a pas montr d'activit cancrogne de la FB1 chez les rats femelles. Dans ce contexte, une dose sans effet (NOAEL) a t tablie 5 mg FB1/kg d'aliment (quivalent 0,25 mg FB1/kg p.c./j pour les rats mles et 0,3 mg FB1/kg p.c./j pour les rats femelles) (NTP, 2001). Une tude a t ralise par le National Toxicology Program sur des souris mles et femelles B6C3F1 nourries pendant 105 semaines avec des rgimes contenant de 0 150 mg FB1/kg d'aliment (quivalent 0 17 mg FB1/kg p.c./j pour les mles et 0 12,5 mg FB1/ kg p.c./j pour les femelles) (NTP, 2001). Les poids corporels et la consommation moyenne d'aliment taient gnralement semblables chez les souris exposes et les animaux tmoins. L'ingestion de toxine na pas eu deffet sur la survie des souris mles, alors que la survie des femelles nourries avec 80 mg de FB1/kg tait infrieure celle des animaux tmoins. La diminution de la survie a dbut au bout dun an de traitement et sest poursuivie jusqu la fin de lexprience. A l'issue des deux annes d'exprience, une augmentation de lincidence des adnomes et carcinomes au niveau du foie a t observe uniquement chez les souris femelles consommant les rgimes contenant 50 et 80 mg de FB1/kg ; ceci saccompagnait dune augmentation de la prvalence des hypertrophies hpatocellulaires et de foyers de ncrose. Lhypertrophie hpatocellulaire tait galement visible dans le foie des mles ayant consomm la plus forte concentration de FB1 mais elle n'tait pas accompagne d'une augmentation de l'incidence des tumeurs. En conclusion, cette tude montre clairement une activit cancrogne de la FB1 chez les souris B6C3F1 femelles mais pas chez les mles. Une dose sans effet (NOAEL) a t tablie 15 mg de FB1/kg (quivalent 1,9 mg de FB1/kg p.c./j ) chez les souris femelles (NTP, 2001). Chez la truite arc-en-ciel, une tude a t conduite pendant 34 semaines avec une nourriture contenant 0 ; 3,2 ; 23 et 100 mg de FB1 pure/kg d'aliment, en prsence ou en labsence dun initiateur cancrigne (aflatoxine B1 ou N-mthyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine). En labsence de linitiateur, aucune tumeur ou lsion na t observe, dans aucun des tissus examins (foie, reins, estomac, vessie). Le rgime alimentaire contenant la plus forte dose de FB1 n'a pas non plus induit la formation dadduits de fumonisine B1 actyle lADN. Au contraire, une augmentation de lincidence des tumeurs du foie a t observe dans le groupe ayant subi une immersion dans un bain contenant linitiateur. Dans cette tude, la NOAEL calcule pour la promotion des cancers hpatiques est de 0,2 mg de FB1/kg p.v./j (Carlson et al., 2001). Chez les singes Vervet, une tude a t ralise en nourrissant pendant 4 ans et demi les animaux avec un aliment contenant 0,5 % d'un extrait de culture de F. verticillioides. On estime que les animaux ont reu environ 0,3 mg de fumonisines totales /kg p.c./j.(la FB1 reprsentant environ 70 % des fumonisines totales). Une fibrose portale modre dans le foie ainsi que des changements des paramtres sanguins (indicateurs des maladies vasculaires) ont t observs (Fincham et al., 1992).

4.3

Autres Effets

4.3.2 Effets sur la reproduction, embryotoxicit et tratognicit Une suspicion d'effet toxique des fumonisines sur la reproduction a t mise suite aux observations suivantes: - avortement chez des truies ayant consomm un aliment contamin avec des fumonisines (Harrison et al., 1990), - dfauts de naissance pouvant tre corrls la consommation d'aliment contamin par les fumonisines chez des habitants du Texas (Hendricks, 1999) ; - inhibition de la synthse de sphingolipides par les fumonisines (Wang et al., 1991). In vitro, les fumonisines et les extraits de culture de F. verticilloides et de F. proliferatum contenant de fortes quantits de fumonisines se sont avrs embryotoxiques chez le poulet (Bacon et al., 1995; Flynn et al., 1994, 1997; Javed et al., 1993). L'injection de 1 100 M de FB1 purifie dans des oeufs fertiles de poulet entrane une toxicit et une mortalit embryonnaire dpendant du temps et de la dose. Les altrations morphologiques prcoces incluent des hydroencphalies, des allongements du cou et des largissements du bec, des altrations ayant t notes pour la plupart des organes

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(Javed et al., 1993; Bacon et al., 1995). Il faut noter que les stades embryonnaires prcoces sont plus sensibles que les stades tardifs l'action de la FB1. La FB1 est aussi embryotoxique in vitro sur des embryons de rat, de mme que l'aminopentol, produit d'hydrolyse de la FB1 (Flynn, et al., 1997). Cependant ce dernier compos s'est rvl 100 fois moins toxique que la FB1 (Flynn et al., 1997). Dans la plupart des tudes ralises in vivo chez la souris CD1, le hamster syrien, le rat SpragueDawley ou Fischer 344, le lapin de Nouvelle-Zlande ou le vison, des effets de la FB1 sur la reproduction ou le dveloppement ont t observs seulement pour des doses ayant un effet toxique sur la mre. Des changements morphologiques suggrant des effets tratognes n'ont t rapports dans aucune de ces tudes (Lebepe-Mazur et al., 1993; Gross et al., 1994; Gross et al., 1994; Reddy et al., 1995; Voss et al., 1996a, LaBorde et al., 1997; Collins et al., 1998; Penner et al., 1998). Seuls Floss et al. (1994a et 1994b) travaillant sur le hamster syrien, ont montr que la FB1 entranait des malformations lors du dveloppement des doses de 12 18 mg FB1/kg p.c./j, doses qui n'avaient pas d'effet sur la mre. Plus rcemment, il a t suggr que les fumonisines constitueraient un facteur de risque pour les malformations du tube neuronal, les anomalies craniofaciales et d'autres dfauts de naissance affectant les cellules neurales des crtes, et ce, en raison de la rduction apparente de l'utilisation de l'acide folique. En effet in vitro la FB1 entrane des dfauts de formation du tube neural et des altrations craniofaciales dans des embryons de souris, ces effets dltres peuvent tre vits par une supplmentation de l'aliment en acide folique (Marasas et al., 2004). Par ailleurs, des tudes conduites in vivo sur des souris LMBc montrent qu'une exposition la FB1 (20 mg/kg p.c. par administration intra-pritonale) augmente la frquence des dfauts de dveloppement chez les foetus. Dans ce modle galement, l'administration de folate ou d'un sphingolipide complexe a une action prventive. Enfin, une incidence plus leve de dfauts du tube neuronal chez lhomme a t constate dans certaines rgions du monde ayant une consommation importante de fumonisines (Guatemala, Afrique du Sud et Chine). Une tude rcente ralise au Texas, montre galement une association significative entre ces dfauts du tube neuronal et la consommation importante pendant le premier trimestre de la grossesse de tortillas de mas contamines (Missmer et al., 2006). 4.3.3 Immunotoxicit Les effets immunotoxiques des fumonisines ont t mis en vidence la fois in vivo et in vitro et auraient des consquences sur la sensibilit des animaux aux infections. Plusieurs tudes montrent que la FB1 affecte le poids des organes immunitaires, en particulier le thymus. Chez des rats, aprs administration intra-pritonale de 7,5 mg de FB1/kg p.c./j pendant 4 jours, on observe une diminution du poids du thymus et une ncrose de cet organe (Bondy et al., 1995). De mme, une injection sous-cutane de 2,25 mg de FB1 /kg p.c./j pendant 5 jours chez des souris femelles entrane une diminution du poids de la rate et du thymus. Cet effet n'est pas observ chez les souris mles (Johnson et Sharma, 2001). Par contre, chez les animaux dlevage, aucun effet de la fumonisine n'a t not sur le poids des organes immunitaires. Par exemple, des porcs recevant pendant 8 semaines un aliment contamin avec des extraits de culture fongique (10 mg FB1 /kg d'aliment) ou des poulets nourris pendant 21 jours avec un aliment contenant 80 mg toxine pure /kg ne prsentent pas de diminution de poids du thymus ou de la rate (Henry et al., 2000; ZomborskyKovacs et al., 2002). La rponse de type humoral est aussi affecte par les fumonisines. Chez des rats mles immuniss avec des globules rouges de moutons, recevant 25 mg FB1/kg p.c./j pendant 14 jours, on a observ une diminution significative des immunoglobulines M (IgM) spcifiques de l'antigne (Tryphonas et al., 1997). De mme, chez les souris, la FB1 rduit le nombre de lymphocytes spcifiques de la rponse aux globules rouges de moutons, lorsque la toxine (5 100 mg) est administre au moment de l'immunisation (Martinova et Merrill, 1995). Chez des porcs nourris pendant 4 semaines avec un aliment contamin par des extraits de cultures fongiques (8 mg FB1/kg d'aliment) on constate galement une diminution significative des anticorps spcifiques lors d'une immunisation avec un vaccin inactiv contre Mycoplasma agalactiae (Taranu et al., 2005). Cet effet serait plus prononc chez les mles que chez les femelles (Marin et al., 2006). Enfin des dindes recevant 200 mg de FB1 et vaccines contre le virus de la maladie de Newcastle, prsentent galement une diminution significative des titres en anticorps lors de la rponse secondaire (Li et al., 2000). En revanche, des porcelets recevant une dose leve de FB1 pendant une priode courte (100 mg /animal/j pendant 8 jours) ou une faible dose pendant une longue priode (10 mg/kg d'aliment pendant 3 4 mois) ne

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montrent pas de diminution de leur titre en anticorps aprs vaccination contre le virus d'Aujeszky (Tornyos et al., 2003). La FB1 affecte aussi la concentration srique en immunoglobulines totales, mais ceci ncessite des concentrations de toxines suprieures celles requises pour moduler la concentration en anticorps spcifiques. Par exemple, une ingestion de nourriture contamine par 8 mg/kg de toxine ne modifie pas les concentrations sriques d'IgM, d'IgG ou d'IgA chez le porc (Taranu et al., 2005). Par contre, des injections quotidiennes intrapritonales de 7,5 mg FB1/kg p.c. pendant 4 jours, augmentent les concentrations sriques en IgM et IgG chez le rat (Bondy et al., 1995). La consommation par des poulets d'une nourriture contamine avec un extrait de F. proliferatum contenant 61 mg de FB1/kg provoque une diminution des Ig totales et des IgG (Qureshi et al., 1995). Les effets de la FB1 ont galement t tudis sur la rponse immunitaire mdiation cellulaire chez l'homme, les rongeurs, le porc et les volailles. Une inhibition de la prolifration lymphocytaire a t observe en traitant directement in vitro les lymphocytes avec la toxine en prsence d'un agent mitogne ou en prlevant les lymphocytes d'animaux traits in vivo et en analysant in vitro leur prolifration en prsence d'un agent mitogne (Dombrink-Kurtzman et al., 1993 ; Li et al., 2000 ; Johnson et Sharma, 2001 ; Dombrink-Kurtzman, 2003 ; Marin et al., 2007). La synthse des cytokines inflammatoires et rgulatrices est aussi module par la FB1. Parmi des cytokines inflammatoires, la FB1 augmente la synthse du TNF-alpha15, une cytokine implique dans l'effet hpatotoxique de la toxine (Sharma, 2004). L'expression d'autres cytokines inflammatoires telles que les interleukines IL12, IL-1, IL-8 et IL-18 est galement augmente par la FB1 (Sharma, 2004). Cette induction de cytokines inflammatoires est corrle avec une augmentation de la synthse des cytokines de type Th116 (telle que l'IFN-g17) et d'une diminution concomitante de la synthse des cytokines du type Th2 (telles que l'IL-4 et l'IL-10). Le changement de la balance entre les cytokines Th1/Th2 pourrait expliquer la diminution de la rponse d'anticorps observe lors de vaccination (Taranu et al., 2005; Marin et al., 2006) et la sensibilit diffrentielle aux infections. Les consquences en termes de sensibilit aux infections et l'altration cause de la rponse immunitaire ont t documentes. Chez des porcelets ayant ingr de la FB1 (0,5 mg/kg p.c./j pendant 7 jours) on observe une augmentation de la colonisation intestinale par une souche pathogne d'Escherichia coli (Oswald et al., 2003). Chez des souris ayant ingr 15 ou 25 mg FB1/kg p.c./j pendant 14 jours, on observe galement une diminution de la clairance bactrienne de Listeria monocytogenes aprs infection intraveineuse (Tryphonas et al., 1997). Chez des porcs ayant reu la mme dose de toxine pendant 7 jours, on observe galement une diminution de la clairance de Pseudomonas aeruginosa (Smith et al., 1996c). Au contraire, l'ingestion de fortes doses de toxines (aliment contamin par des extraits de culture fungiques et contenant 150 mg FB1/kg) augmente la rsistance des souris l'infection par le parasite intracellulaire Tryponosoma cruzi (Dresden Osborne et al., 2002). Cet effet protecteur de la FB1 pourrait tre li sa capacit induire la synthse de cytokines pro-inflammatoires.

4.3.4 Effets sur le systme nerveux Le syndrome de leucoencphalomalacie quine est caractristique de l'ingestion de fumonisines (Voir paragraphe 6.1.1). Une tude de Kwon et al., (1997) indique galement que l'injection sous-cutane de FB1 chez des rats nouveau-ns entrane une lvation du rapport Sa/So dans les tissus crbraux et rduit le dpt de myline, ce qui pourrait retarder le dveloppement du systme nerveux. Cette tude suggre galement que le mtabolisme des sphingolipides dans le systme nerveux des rats nouveau-ns est trs sensible la FB1. En effet, aprs injection de 0,8 et 8,0 mg de FB1/kg p.v., le ratio entre l'aire sous la courbe en FB1 du plasma et celle du cerveau est de 0,02 chez les rats adultes, mais de 40 chez les rats nouveau-ns (Kwon et al., 1997). Plus rcemment, il a t montr qu'une injection intracrbrale de 100g de FB1 induit une neurodgnration avec une inhibition simultane de la synthse de novo de cramide, une stimulation des astrocytes et une augmentation des cytokines pro-inflammatoires (Osuchowski et al,. 2005).

15 16

Tumor Necrosis Factor T-helper 17 Interferon 159

4.3.5 Effets sur le systme cardiovasculaire Les premires dmonstrations d'une toxicit des fumonisines sur le systme cardiovasculaire ont t ralises chez des babouins nourris avec des aliments contamins par des extraits de F. verticillioides o un arrt du cur avec une congestion aigu a t observ (Kriek et al. 1981). Des tudes sur porcs nourris pendant 7 mois avec un aliment contamin (150 170 mg FB1/kg daliment) ont montr une hypertrophie ventriculaire du cur droit et une hypertrophie des artres pulmonaires (Casteel et al., 1994). Les effets cardiovasculaires dus une exposition court terme aux fumonisines ont t examins chez des porcs mles anesthsis et conscients. Les animaux ont t nourris avec des aliments exempts de fumonisines ou avec des aliments contamins par des extraits de cultures fongiques ( 20 mg FB1+ FB2/kg ). Chez les porcs ayant ingr des fumonisines, une augmentation significative de la pression artrielle pulmonaire, accompagne d'une diminution de la frquence et du dbit cardiaque a t observe. L'lectrocardiogramme (ECG) de ces animaux tait normal et ils ne prsentaient pas d'dme pulmonaire. Ces rsultats suggrent que l'hypertension pulmonaire provoque par la vasoconstriction hypoxique est un vnement prcoce dans le dveloppement de l'dme pulmonaire observ chez le porc (Smith et al., 1999). Les primates non-humains (singes Vervet) nourris avec un mas naturellement contamin par F. verticillioides (0,15 0,30 mg FB1/kg p.v./j) pendant une priode prolonge ont montr une rponse athrognique avec une hypercholestrolmie et des altrations hpatiques pouvant tre lies aux effets secondaires de la rponse vasculaire (Fincham, 1992; Nair, 1998). Ces altrations sont compatibles avec une inhibition des canaux calciques de type L provoque par l'augmentation de la concentration en sphingosine et/ou en sphinganine. L'oedme pulmonaire caractristique chez le porc d'une intoxication la fumonisine semble rsulter de l'arrt du coeur gauche provoqu par l'altration de la synthse des glycolipides. Des tudes rcentes semblent indiquer que l'encphalomalacie quine et l'oedme pulmonaire porcin seraient dus des effets secondaires de la toxicit cardiovasculaire de la FB1 (Constable et al., 2000).

4.4

Valeurs toxicologiques de rfrence

Les fumonisines sont classes dans la catgorie 2B par le CIRC. Pour la FB1, le SCF (2000, 2003) a tabli une dose journalire tolrable (DJT), de 2 g/kg p.c./j partir de la dose sans effet nfaste observ (NOAEL) de 0,2 mg/kg p.c./j estime dans des tudes de toxicit chronique chez le rat (effets sur les reins) et en appliquant un facteur scurit de 100. Le JECFA (2001) a tabli une dose journalire maximale tolrable provisoire (DJMTP) de 2 g/kg p.c/j pour le groupe des fumonisines FB1, FB2 et FB3, seules ou en combinaison, en se basant sur la mme NOAEL que le SCF.

5 5.1

Exposition de la population humaine aux fumonisines Effets sur la sant humaine (donnes pidmiologiques)

Peu d'tudes pidmiologiques sont disponibles et la plupart ne sont pas concluantes dans la mesure o les donnes quantitatives ne permettent pas de conduire une valuation du risque. Parmi ces tudes, celles ralises en Afrique du Sud et en Chine semblent tablir une corrlation entre la consommation de produits contamins par la FB1 et une augmentation de l'incidence de cancer de l'sophage, corrlation qui n'a pas t mise en vidence dans une tude ralise en Italie (CIRC, 1993).

5.2

Exposition de lHomme 5.2.2 Donnes de ltude TDS

Une tude de lalimentation totale (EAT, 2004) a t entreprise en 2000, afin de connatre le niveau de consommation et dexposition de la population franaise et vgtarienne aux fumonisines partir daliments prts consommer (Leblanc et al., 2005).

160

Tableau 2: Exposition alimentaire de la population franaise aux fumonisines (g/kg p.c./j) exposition moyenne (en g/kg pc/j) 0.014 0.046 0.04 0.05 0.10 exposition au p95 % de la DJT (en g/kg pc/j) au p95 0.064 0.175 0.13 0.12 0.29 3 9 1 1 15 % d'individus pouvant dpasser la DJT 0 0 0 0 0

type de population population gnrale population vgtarienne (15 ans et +) adultes (15 ans et+) enfants (3-14 ans) ovolactovgtariens lactovgtariens vgtaliens

Ces rsultats sont en moyenne moins importants dun facteur 10 20 que ceux estims lors de la dernire valuation franaise de la tche SCOOP publie en 2003. Pour lessentiel, la diffrence est due la prise en compte dans le calcul de la tche SCOOP de la catgorie daliments crales et produits craliers en tant que vecteur dexposition pour la fumonisine alors que dans ltude TDS celui-ci na pas t pris en compte. Lapport thorique est largement infrieur la DJT (2 g/kg p.c./j) pour lensemble des groupes tudis et quel que soit le mode destimation.

5.2.1 Donnes de la Tche Scoop Tableau 1: Exposition alimentaire de la population franaise aux fumonisines (g/kg p.c./j) (Tche Scoop, 2003) Fumonisine B1 type de population population totale adulte hommes adultes femmes adultes enfants Fumonisine B1 + B2

exposition moyenne exposition moyenne (en g/kg pc/j) (en g/kg pc/j) 0.219 0.227 0.211 0.355 0.265 0.282 0.264 0.445

Les aliments contributeurs lexposition de la population franaise aux fumonisines sont les produits issus du mas, du bl, du riz et autres produits craliers.

6 6.1

Exposition animale Effets sur la sant animale et transfert dans les tissus animaux

6.1.1 Les porcins Kriek et al. (1981) ont montr que des isolats de Fusarium verticillioides responsables de leucoencphalomalacie chez le cheval en Afrique du Sud taient capables dinduire un oedme pulmonaire chez le porc. Par la suite, des cas ddme pulmonaire ont t observs dans des levages porcins aux USA (Harrison et al., 1990; Colvin et Harrison, 1992; Osweiler et al., 1992). Dans tous les aliments incrimins, F. moniliforme et/ou F. proliferatum taient isols et produisaient de la FB1 et de la FB2 aprs leur mise en culture (Ross et al., 1990). Les aliments associs aux cas ddme pulmonaire avaient des teneurs en FB1 trs variables, entre moins de 1 et 330 mg de FB1/kg. La consommation de culture de F. moniliforme ou linjection de FB1 purifie permettait de reproduire ces symptmes chez des porcs (Harrison et al., 1990; Osweiler et al., 1992). Les expriences ralises par la suite ont surtout port sur de jeunes porcs aprs le sevrage.

161

* Effets sur les performances Dans la plupart des tudes, aucune consquence nest constate sur les performances des porcs pour des concentrations de FB1 dans laliment infrieures 100 mg/kg (Motelin et al., 1994; Zomborszky et al., 2000; Zomborszky-Kovacs et al., 2002a,b; Fodor et al., 2005, 2006). Cependant, une rduction de vitesse de croissance limite (Rotter et al., 1996, 1997; Dilkin et al., 2003) ou importante (Piva et al., 2005), ou au contraire son augmentation (Prelusky et al., 1996a), ont t observes pour des teneurs plus faibles. Hormis Harvey et al. (1996) qui ne notent pas deffet, la consommation daliment, la vitesse de croissance des porcs, et en gnral lefficacit alimentaire sont considrablement rduites pour un niveau de contamination dau moins 100 mg/kg (Haschek et al., 1992; Casteel et al., 1993; Osweiler et al., 1993; Motelin et al., 1994; Harvey et al., 1995, 2002; Meyer et al., 2003; Fodor et al., 2005). Il semble donc quen dessous dun seuil de lordre de 100 mg de FB1/kg daliment, les performances des porcs soient le plus souvent peu ou pas affectes, alors quelles sont considrablement rduites lorsque la concentration en FB1 est plus leve. Cette dgradation se manifeste gnralement chez des porcs qui prsentent des symptmes dintoxication ou des lsions tissulaires. * Symptmes Les symptmes dintoxication apparaissent avec des aliments qui renferment au moins 100 mg de FB1/kg. Les porcs apparaissent dprims. Ils manifestent une dyspne avec hyperpne, une faiblesse des membres postrieurs, leur rythme respiratoire sacclre, leurs muqueuses se cyanosent (Colvin et Harrison, 1992; Osweiler et al., 1992; Haschek et al., 1992, 2001; Casteel et al., 1994; Motelin et al., 1994; Fazekas et al., 1998; Gumprecht et al., 1998; Meyer et al., 2003). Ils prsentent parfois un ictre (Casteel et al., 1993, 1994; Colvin et al., 1993) et des diarrhes (Bane et al., 1992; Colvin et al., 1993). La mort peut intervenir quelques heures plus tard. Mais ces symptmes ont t observs avec un aliment moins contamin (Dilkin et al., 2003), alors que dans le cas dune teneur de 200 mg de FB1/kg, les porcs ne prsentaient pas de troubles du rythme respiratoire (Colvin et al., 1993). * Effets sur lhmatologie et certains paramtres sanguins En gnral, les paramtres hmatologiques ne sont pas affects par la fumonisine (Motelin et al., 1994; Harvey et al., 1995, 1996; Rotter et al., 1997; Zomborszky-Kovacs et al., 2002b; De Liguoro et al., 2004; Fodor et al., 2006). Une augmentation du nombre dhmaties et de leucocytes, de la teneur en hmoglobine et de lhmatocrite a cependant t observe avec un aliment renfermant 30 ou 100 mg de FB1/kg (Dilkin et al., 2003; Meyer et al., 2003). Lactivit de lASAT18, de la GGT19, de la PAL20, de lALAT21, de la LDH22, de la SDH23 et de la GOT24, enzymes rvlatrices deffets hpato-toxiques, augmente dans le srum sanguin des porcs auxquels on administre de la FB1 (Osweiler et al., 1992; Casteel et al., 1993; Colvin et al., 1993; Riley et al., 1993; Becker et al., 1995; Harvey et al., 1995, 1996, 2002; Gumprecht et al., 1998; ZomborszkyKovacs et al., 2000, 2002a,b; Dilkin et al., 2003; Meyer et al., 2003; De Liguoro et al., 2004; Piva et al., 2005). Cette augmentation est observe partir de teneurs de 20 40 mg de FB1/kg daliment. Lamplitude de la variation dpend du taux de contamination et de la dure de distribution de laliment (Guzman et al., 1997; Zomborszky-Kovacs et al., 2002b; Fodor et al., 2006). La cholestrolmie (Haschek et al., 1992; Casteel et al., 1994; Harvey et al., 1996; Guzman et al., 1997; Rotter et al., 1997; Gumprecht et al., 1998; De Liguoro et al., 2004; Piva et al., 2005) et le taux de bilirubine srique (Haschek et al., 1992; Riley et al., 1993; Casteel et al., 1994; Gumprecht et al., 1998) augmentent chez les porcs consommant un aliment contamin par au moins 100 mg de FB1/kg. Les fumonisines altrent la biosynyhse des sphingolipides et provoquent une accumulation de sphingosine (So), et surtout de sphinganine (Sa), dans le srum et les tissus du porc (Riley et al., 1993; Rotter et al., 1996; Gumprecht et al., 1998; Smith et al., 1999; Zomborszky-Kovacs et al., 2002a; Constable et al., 2003). Le rapport Sa/So srique augmente partir dune teneur de 5 mg de
18 19

ASAT : aspartate aminotransfrase GGT : - glutamyltransfrase 20 PAL : phosphatase alcaline 21 ALAT : alanine aminotransfrase 22 LDH : lactate deshydrognase 23 SDH : succinate deshydrognase 24 GOT : glutamic oxalacetic tansaminase 162

FB1/kg de laliment ds le 3me jour de consommation, bien avant laltration dautres paramtres biochimiques ou lapparition de lsions tissulaires (Zomborszky et al., 2000). Le rapport Sa/So sanguin est donc un marqueur dexposition prcoce et sensible de la contamination de laliment par les fumonisines chez le porc. Il augmente ds le taux de 5 mg de FB1/kg daliment, alors quon ne constate pas deffets pathologiques lorsque la teneur en FB1 de laliment est de moins de 25 mg/kg, ni daugmentation dactivits enzymatiques quand elle est infrieure 10 mg/kg. * Effets sur limmunit Dans plusieurs tudes, la FB1 affecte la fonction immunitaire chez le porc avec diminution du nombre de monocytes et de neutrophiles (Mller et al., 1999), de la prolifration des lymphocytes (Harvey et al., 1995, 1996; Marin et al., 2007) et modification de lquilibre entre les cytokines (Taranu et al., 2005 ; Marin et al., 2006). La FB1 a aussi des effets dose-dpendants fortement cytotoxiques sur les macrophages alvolaires de porcelets et altre leur activit phagocytaire (Liu et al., 2002; Piva et al., 2005). En prsence de FB1, la rponse Mycoplasma (Taranu et al., 2005) est diminue, mais pas la maladie dAujeszky (Tornyos et al., 2002). Lorsque des porcs reoivent 0,5 mg de FB1/kg pc/j, la colonisation de lintestin est beaucoup plus importante aprs inoculation dE. coli (Oswald et al., 2003) et les lsions de pneumonie sont plus tendues aprs inoculation de Pasteurella multocida (Halloy et al., 2005). Par contre, la FB1 na aucun effet sur la rponse immunitaire de porcs contamins par Salmonella typhimurium, ni sur le portage de Salmonella (Tanguy et al., 2006). La FB1 peut donc accrotre la sensibilit des porcs aux infections ou les risques dchecs de vaccinations. Elle a galement des effets cytotoxiques sur des cellules pithliales intestinales porcines en culture, ce qui pourrait favoriser la translocation des bactries pathognes travers lintestin (Bouhet et al., 2004, 2007). * Effets cliniques Le porc est plus sensible la FB1 que les volailles, les veaux ou les ruminants (Diaz et Boermans, 1994; Fazekas et al., 1998), mais il faut davantage de toxine pour induire un dme pulmonaire et/ou un hydrothorax chez le porc quune encphalomalacie chez le cheval (Palyusik et Moran, 1994). Effets sur le foie Des lsions hpatiques peuvent apparatre chez des porcs sans lsions pulmonaires (Osweiler et al., 1992; Ross et al., 1992; Colvin et al., 1993; Dilkin et al., 2003). Le foie est ferme, ple, et son poids relatif augmente (Casteel et al., 1993; Colvin et al., 1993; Harvey et al., 1996, 2002; Guzman et al., 1997; Zomborszky-Kovacs et al., 2002b; Dilkin et al., 2003; Fodor et al., 2005, 2006). On constate parfois une cholostase, une fibrose prilobulaire, une dgnrescence et une ncrose hpatocellulaire avec des figures de pycnose, de caryorexie ou de caryolyse, une vacuolisation cytoplasmique centrolobulaire (Haschek et al., 1992, 2001; Casteel et al., 1993; Colvin et Harrison, 1992; Colvin et al., 1993; Motelin et al., 1994; Gumprecht et al., 1998; Dilkin et al., 2003; Piva et al., 2005). Les cordons hpatiques apparaissent dsorganiss (Colvin et Harrison, 1992; Haschek et al., 1992; Motelin et al., 1994; Gumprecht et al., 1998). Laccumulation de matriel membranaire a t observe dans les hpatocytes et les cellules de Kupffer (Haschek et al., 1992). Des figures mitotiques sont galement prsentes (Haschek et al., 1992; Dilkin et al., 2003). La gravit des lsions et la proportion des porcs atteints augmentent avec limportance et la dure de lexposition (Riley et al., 1993; Motelin et al., 1994; Haschek et al., 2001). Riley et al. (1993) et Motelin et al. (1994) concluent que pour provoquer des lsions hpatiques, les aliments doivent contenir au moins 23 mg de FB1/kg. La rgnrescence hpatique peut tre rapide (Colvin et al., 1993). Effets sur les poumons La trache et les bronches contiennent un liquide mousseux blanc, et la cavit pleurale est plus ou moins remplie dun fluide jaune-dor qui coagule lair (Harrison et al., 1990; Haschek et al., 1992; Osweiler et al., 1992; Motelin et al., 1994; Fazekas et al., 1998; Dilkin et al., 2003). Les poumons ne collapsent pas (Haschek et al., 1992; Osweiler et al., 1992; Motelin et al., 1994; Zomborszky et al., 2000; Zomborszky-Kovacs et al., 2002b; Dilkin et al., 2003). Un dme inter- et intra-lobulaire grave se dveloppe, et les septums interlobulaires sont dilats, donnant un aspect rticul qui est d la dilatation des canaux lymphatiques et des capillaires sanguins et des infiltrations importantes entre les tissus conjonctifs (Harrison et al., 1990; Haschek et al., 1992, 2001; Osweiler et al., 1992; Colvin et al., 1993; Motelin et al., 1994; Palyusik et Moran, 1994; Fazekas et al, 1998; Dilkin, et al., 2003; Zomborszky-Kovacs et al., 2002a,b; Zomborszky et al., 2000). La prsence de corps multilamellaires dans le cytoplasme des macrophages intravasculaires pulmonaires (Haschek et al., 1992; Colvin et al., 1993; Gumprecht et al., 1998) et laccumulation de matriel fibrillaire dans les vaisseaux

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lymphatiques des alvoles (Osweiler et al., 1992) ou dans lendothlium des capillaires pulmonaires (Gumprecht et al., 2001) ont galement t rapportes. La consommation dau moins 16 mg de FB1/kg pc (Colvin et al., 1993; Fazekas et al., 1998; Gumprecht et al., 1998) ou dun aliment qui renferme plus de 100 mg de FB1/kg (Harrison et al., 1990; Haschek et al., 1992; Osweiler et al., 1992; Motelin et al., 1994; Meyer et al., 2003) semble ncessaire pour induire un dme pulmonaire. Cependant, lincidence des lsions aux faibles doses augmente avec la dure dexposition (Zomborszky-Kovacs et al., 2002a), et des altrations des poumons ont t dcrites lors dintoxications moins importantes (Zomborszky et al., 2000; Zomborszky-Kovacs et al., 2002b ; Dilkin et al., 2003; Piva et al., 2005; Fodor et al., 2005, 2006), alors quaucune anomalie pulmonaire nest constate avec prs de 200 mg de FB1/kg daliment (Casteel et al., 1993; Colvin et al., 1993). Effets cardiovasculaires La cible primaire de la toxicit de la FB1 semble tre le systme cardio-vasculaire (Smith et al., 1996a; Hsiao et al., 2005). Le ventricule gauche et la couche musculeuse des petites artres pulmonaires sont hypertrophis (Casteel et al.; 1994). La FB1 provoque une hypertension dans lartre pulmonaire, une diminution de la contractilit, de lefficacit mcanique et de la vitesse de changement de pression du ventricule gauche, une rduction du rythme cardiaque et du dbit sanguin, une baisse de la pression partielle en oxygne du sang et une acidose mtabolique (Smith et al., 1996a,b, 1999, 2000; Constable et al., 2000, 2003). Ces modifications interviennent en mme temps que laugmentation de Sa et So plasmatiques (Smith et al., 1999, 2000; Constable et al., 2003). Lhypotension systmique provoque par la fumonisine semble en partie mdie par laugmentation des concentrations de Sa et de So, et lhypertension pulmonaire par laugmentation des concentrations de So-1-P (Hsiao et al., 2005). Ldme pulmonaire qui rsulte de la consommation de FB1 par le porc est vraisemblablement provoqu par une dficience grave du cur gauche (Smith et al., 1996a, 2000; Constable et al., 2000). Des mcanismes faisant intervenir la stimulation par So de la libration des rserves intracellulaires de Ca++ dans les cellules des muscles lisses (Casteel et al., 1994), et leffet inhibiteur de So sur les canaux calciques de type L des myocytes cardiaques (Constable et al., 2000) ont t proposs. Effets sur dautres tissus ou organes Dautres lsions ont galement t constates la suite de la consommation de FB1: hyperkratose et parakratose de la muqueuse oesophagienne (Casteel et al., 1993), ptchies, ulcration et rosion de la muqueuse de la zone oesophagienne gastrique (Harvey et al., 1996; ZomborszkyKovacs et al, 2002b; Fodor et al., 2006), ncrose des tubules rnaux (Colvin et al., 1993; Harvey et al., 1996; Bucci et al., 1998; Fazekas et al., 1998; Dilkin et al., 2003; Fodor et al., 2005, 2006), ncrose, dissociation de cellules acineuses avec noyaux pycnotiques et prsence de corps multilamellaires, et dme entre les acini du pancras (Haschek et al., 1992; Osweiler et al., 1992; Palyusik et Moran, 1994), signes de ncrose de la rate (Fazekas et al., 1998). Un cas ddme crbral avec malacie de la partie caudale du cerveau a galement t rapport par Fazekas et al. (1998). Effets sur les reproducteurs De nombreux avortements de truies ont t constats lors des cas dintoxication par la FB1 dans des levages aux USA (Osweiler et al., 1992). En conditions exprimentales, les dmes pulmonaire et les lsions hpatiques constats chez des porcs nouveau-ns montrent que la FB1 traverse la barrire placentaire chez cette espce (Zomborszky-Kovacs et al., 2000). La mycotoxine est galement retrouve dans le lait une concentration infrieure 30 g/kg (Zomborszky-Kovacs et al., 2000). * Mtabolisme La FB1 est trs peu biodisponible chez le porc ; au maximum 4% de la toxine est excrte dans lurine (Prelusky et al., 1994b, 1996a). La FB1 est largement distribue dans lorganisme : son volume de distribution est de 2,4 0,55 L/kg. Sa clairance mtabolique est de 9,1 1,1 mL/min/kg. La recirculation entro-hpatique contribue augmenter la demi-vie de la FB1 ou de ses mtabolites et en accrotre la toxicit (Prelusky et al., 1994b, 1996b). Au cours des 72 heures suivant ladministration intra-gastrique de FB1, la toxine est principalement retrouve dans les fces [environ 90% daprs Prelusky et al. (1994) et Dilkin et al. (2003)]. La FB1 slimine lentement, et une quantit significative de rsidus de FB1 saccumule donc dans lorganisme du porc (Prelusky et al., 1996a). * Rsidus

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Les teneurs en FB1 des tissus sont trs variables entre les porcs dun mme lot (Meyer et al., 2003). Les teneurs en FB1 sont trs variables galement selon les tissus : les teneurs les plus leves de FB1 sont trouves dans le foie et les reins (Prelusky et al., 1996a,b; Hashek et al., 2001; Dilkin et al., 2003; Meyer et al., 2003; Fodor et al., 2005, 2006), des teneurs plus faibles dans la rate, le myocarde et les poumons (Meyer et al., 2003; Fodor et al., 2005, 2006), alors quelles sont extrmement faibles, et parfois mme non dtectables, dans les muscles et les graisses (Prelusky et al., 1996a; Meyer et al., 2003; Fodor et al., 2005, 2006). Son accumulation dans les organes augmente avec la dure de consommation de laliment contamin, et des taux levs de rsidus peuvent tre atteints chez des porcs exposs de faibles niveaux de FB1 pendant de longues priodes (Prelusky et al., 1996b). La gravit des effets de la FB1 et la teneur des tissus en rsidus semblent lies (Meyer et al., 2003). La FB1 capte par les tissus est relargue lentement (Prelusky et al., 1994b, 1996b). Un retrait dau moins 2 semaines dun aliment contamin par la FB1 est donc ncessaire avant labattage des porcs afin de sassurer dune teneur minime de rsidus dans les organes (Prelusky et al., 1996a). Compte tenu des trs faibles niveaux dans les muscles et les graisses, le risque de contamination pour le consommateur humain est cependant trs limit (Haschek et al., 2001; Dilkin et al., 2003).

6.1.2 Les volailles Diverses affections des volailles sont associes depuis 1973 la consommation de mas contamin par F. moniliforme ou F. proliferatum : refus de salimenter, diminution des performances, faiblesse, diarrhe, mortalit. Des cas de mortalit dus la consommation de grains contenant F. moniliforme ont aussi t rapports chez des oiseaux sauvages (Weibking et al., 1993b). Toutes ces pathologies ne sont sans doute pas imputables aux fumonisines, leur impact sur la production aviaire apparaissant exprimentalement surtout limit une altration de la croissance. Signalons quune embryotoxicit des fumonisines a galement t rapporte aprs administration directe des toxines dans les ufs (Javed et al., 1993, Henry et Wyatt, 2001). Ces tudes ne seront pas dtailles ici tant donne la trs faible absorption orale de ces composs (Bluteau, 2005) et leur faible passage dans les ufs depuis la circulation plasmatique (Vudathala et al., 1994). Comme pour les autres espces, les effets de la FB1 chez la volaille dpendent de la dose utilise et du temps de traitement. A court terme, de fortes doses (suprieures 100 mg/kg aliment) ladministration de FB1 peut provoquer une augmentation de la mortalit, et ce d'autant plus que ladministration est prcoce. Le plus souvent, la distribution dun aliment contamin hauteur de 10 300 mg/kg de FB1 ne se traduit toutefois que par une baisse de l'indice de consommation alimentaire, une diminution du poids moyen et diverses altrations du poids des organes. Une diarrhe noirtre et collante, qui serait due une diminution de la digestibilit de laliment, a galement t rapporte (Tableau 3). Paradoxalement, au moins chez le canard, les altrations de croissance seraient plus importantes lorsque la toxine est administre sur 1 7 semaines que lorsquelle est administre sur plus de 10 semaines. Ces rsultats suggrent une adaptation des animaux. A ces effets sur la croissance, assez homognes entre espces, sajoutent des modifications plus varies des paramtres biochimiques (Tableau 4). Dans toutes les tudes o il a t recherch, le rapport sphinganine sur sphingosine (Sa/So) plasmatique se rvle tre le biomarqueur le plus sensible et le plus prcoce dune exposition aux fumonisines. Pour ce qui est des marqueurs biochimiques plus conventionnels, une lvation de lASAT, de la GGT, de la LDH, des protines totales et du cholestrol est rapporte chez le poulet alors quune diminution de la cholestrolmie et une augmentation des activits de la LDH, de lASAT et de la GGT sont observes chez la dinde. De mme, chez le canard en croissance, on constate une lvation transitoire de lASAT, de lALAT, de la LDH, des PAL, des protines totales et du cholestrol lors dexposition aux fumonisines ; un retour progressif la normale se faisant lors dune exposition prolonge. Ces paramtres ne sont pas utilisables au cours du gavage en raison de limpact du gavage lui-mme sur la physiologie hpatique. Des altrations varies du systme immunitaire ont t rapportes in vivo ou in vitro : diminution de lpaisseur du cortex thymique, baisse de l'immunoglobulinmie, diminution de la viabilit des lymphocytes priphriques, modifications morphologiques et fonctionnelles des macrophages et altration de la capacit dlimination des bactries et diminution de la rponse vaccinale (Qureshi et Hagler, 1992, Dombrink-Kurtzman et al., 1993, Qureshi et al., 1995, Javed et al., 1995, Li et al., 1999). Mtabolisme et persistance ltat rsiduel

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Aucune donne nest disponible concernant un ventuel mtabolisme de la FB1 chez la volaille et de trs rares donnes concernent son devenir. Labsorption orale de la toxine serait trs modre chez la poule pondeuse (<1%) mais plus importante chez le canard en croissance (2,5 3,5%) et voisine des taux dabsorption dcrits chez les rongeurs, le porc et les primates non humains (Vudathala et al., 1994; Bluteau, 2005). Les teneurs musculaires seraient environ 10 fois infrieures aux teneurs plasmatiques, aucun transfert dans les ufs ntant constat. Comme dans les autres espces, le foie et les reins constitueraient les tissus marqueurs. La constatation dune faible prsence de FB1 dans les tissus, et les ufs conduit conclure que les rsidus de fumonisines dans des produits alimentaires d'origine animale sont trop faibles pour prsenter un risque alimentaire pour les consommateurs.

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Tableau 3 : Effets de la FB1 chez les volailles. Espce, ge Poussins, 1 jour Dose 8,5 mg/kg aliment 100, 300, 375, 450 et 525 mg/kg aliment 10, 40 et 80 mg/kg p.v./ 25 et 50 mg/kg aliment 100 et 200 mg/kg aliment 8, 16, 100 et 200 mg/kg aliment 25, 50, 100, 175, 200, 300, 325, 400 et 475 mg/kg aliment 25 et 50 mg/kg aliment 100, 200, 400 mg/kg aliment 2, 8, 32, 128 mg/kg aliment 5, 15, 45 mg/kg p.v./j 10, 20 mg/kg aliment Dure 15 jours 14, 19 et 21 jours 6 ou 21 jours 7 semaines 60, 120 180 min 30, 112 420 jours et et Symptmes et lsions aux plus fortes doses Diarrhes collantes noires ; rduction du poids vif Rduction de la croissance; augmentation du poids relatif du foie, du rein de la rate, des proventricules ; prolifration des hpatocytes avec hyperplasies Augmentation de poids relatif du foie et de la rate ; rduction de la matire grasse du foie Rduction du poids relatif des proventricules Diminution de la capacit dlimination dE. coli du systme circulatoire Diarrhes ; foies agrandis, friables et ples ; rduction de production des ufs pendant le premier cycle de 28 jours ; rduction du poids du rein Rduction du GMQ et du poids relatif de la rate ; augmentation de poids relatif du foie, pancras, gsier et proventricule ; augmentation de lhmoglobine et des hmatocrites ; hyperplasie biliaire ; hypertrophie des cellules de Kupfer; diminution du taux en anticorps Rduction de consommation Rduction de consommation et de GMQ ; augmentation de poids absolu du foie, du cur, du rein, du pancras et des proventricules ; hyperplasie hpatocystique et biliaire ; foie brun fonc Diminution transitoire du poids corporel, augmentation relative du poids du foie, de la rate, du gsier. Pas daltration histologique du foie et des reins. Diminution du gain de poids, augmentation de poids absolu du foie avec apparition de structures tubulo-acineuses. Induction de diffrents systmes enzymatiques. Diminution non significative du poids corporel, du poids du foie, et augmentation non significative de lindice de conversion alimentaire. Modification du type de statose hpatique. Rfrences (Prathapkumar et al., 1997) (Brown et al., 1992; Kubena et al., 1997a; Ledoux et al., 1992; Weibking et al., 1993a) (Espada et al., 1994; Henry et al., 2000) (Broomhead et al., 2002) (Li et al., 1999) (Kubena et al., 1999; Prathapkumar et al., 1997) (Kubena et al., 1997b; Kubena et al., 1995a, b; Ledoux et al., 1996; Li et al., 2000; Weibking et al., 1993b) (Broomhead et al., 2002) (Bermudez et al., 1995) (Tran et al., 2005) (Bailly et al., 2001 ; Raynal et al., 2001) (Tardieu et al., 2004)

Poussins, 7 jours Poulets, 21 jours Poules pondeuses, 21 et semaines Dindes, 1 jour

72

21 28 jours

Dindons, 7 jours Canetons, 1 jour Canetons, 7 jours Canards, 28 jours Canards, 12 semaines

14 semaines 21 jours 11 semaines 12 jours 12 jours

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Tableau 4 : Effets de la FB1 chez les volailles sur diffrents paramtres plasmatiques. Espce, ge Poussins, 1 jour Dose 30, 75, 100, 200, 300 et 400 mg/kg aliment 20, 40, 80 mg/kg p.v./j 200 mg/kg aliment 72 Dure 16, 19 et 21 jours 21 jours 112 jours Sa/So AS AS PROT ns ou AS ns AS CHOL AS ns AS ASAT AS GGT ns ou AS LDH ns ns PAL RS ns Rfrences (Espada et al., 1994, 1997; Kubena et al., 1997a; Ledoux et al., 1992; Weibking et al., 1993a) (Henry et al., 2000) (Kubena et al., 1999)

25 et 50 mg/kg 7 semaines AS ns ns ns ns ns (Broomhead et al., 2002) aliment 25, 75, 100, 200, 21 jours AS ns RS AS AS AS ns (Kubena et al., 1997b; Kubena et al., 300, 400 et 475 1995a, b; Ledoux et al., 1996; mg/kg aliment Weibking et al., 1993b) Dindons, 25 et 50 mg/kg 14 AS ns ns ns ns ns (Broomhead et al., 2002) 7 jours aliment semaines Caneton, 100, 200, 400 21 jours AS ns ns ns AS (Bermudez et al., 1995) 1 jour mg/kg aliment Canetons, 2, 8, 32, 128 mg/kg 11 AS AS AS ns ns AS AS (Tran et al., 2005) 7 jours aliment semaines Canards, 5, 15, 45 mg/kg 12 jours AS AS AS AS AS AS AS (Tran et al., 2003) 28 jours p.v./j Canards, 10, 20 mg/kg 12 jours AS ns ns ns ns ns ns (Tardieu et al., 2004) 12 semaines aliment AS: Augmentation significative; RS : Rduction significative ; ns: non significative ; Sa/So : sphinganine/sphingosine ; PROT : Protines totales ; CHOL : cholestrol ; CREA : cratinine ; ALAT ; alanine aminotransfrase ; ASAT : aspartate aminotransfrase ; GGT : - glutamyltransfrase ; LDH : lactate dhydrognase ; PAL : phosphatase alcaline

Poules pondeuses, 21 et semaines Poussins, 7 jours Dindes; 1 jour

168

6.1.3

Les ruminants

Action et devenir des fumonisines dans le rumen Les tudes ralises in vitro par Caloni et al. (2000) et par Gurung et al. (1999) concordent et montrent que lcosystme microbien ruminal peut dgrader de 10 18% de FB1 au cours dincubations de 72 heures. Les auteurs nont pas identifi la nature des mtabolites forms, mais ils nont pas dtect la prsence daminopolyols ou daminopentol dans le milieu ruminal. Ce taux de dgradation est faible et ne peut expliquer lui seul la sensibilit moindre des ruminants la toxicit de la FB1. Chez les vaches, l'absorption de la FB1 aprs ingestion orale est trs faible. En effet, aprs gavage oral avec 1 ou 5 mg FB1/kg p.v, aucune toxine ou mtabolite na pu tre dtect dans le plasma. De plus, aucun effet na pu tre mis en vidence sur la concentration en sphingolipides ou le rapport Sa/So du plasma (Prelusky et al., 1995).

Effet des fumonisines sur la sant des ruminants Des tudes portant sur la rponse de diffrentes espces animales la toxicit des mtabolites secondaires de F. moniliforme ont montr que les ovins taient particulirement sensibles la FB1 (Kriek et al. 1981). Osweiler et al. (1993) ont observ que la distribution daliments naturellement contamins en FB1 aux doses respectives de 15, 31 ou 148 mg/kg pendant 31 jours, de jeunes taurillons de 230 kg, na pas modifi leur consommation alimentaire ni leur gain de poids vif. Une diminution de lapptence de la ration a toutefois t note avec la dose de 148 mg/kg. En outre, parmi les six bouvillons recevant cette dose, deux ont eu des lsions hpatiques bnignes accompagnes dune augmentation de laspartate amino transfrase, de la gamma glutamyl transpeptidase, de la lactate dshydrognase, de la bilirubine et du cholestrol, traduisant des troubles de la fonction hpatique. Transfert des fumonisines dans le lait Les rares mesures effectues montrent que les taux de transfert des fumonisines dans le lait sont nulles ou faibles (de lordre de 0,05%) (Scott et al., 1994 ; Richard et al., 1996 ; Hammer et al., 1996 cits par Spahr et al., 2000). De plus, une tude mene aux USA, indique une contamination par la FB1 d'un seul chantillon de lait, sur 165 chantillons tests, une concentration de 5 ng/ml (Maragos et Richard, 1994). Il ny a donc pas de risque avr des fumonisines pour le consommateur de produits laitiers de ruminants.

6.1.4 Animaux de compagnie et de loisirs Les quins Les quids rpondent la prsence de fumonisines dans leur alimentation (notamment la FB1, la plus toxique) gnralement sous la forme dun syndrome neurologique dnomm leucoencphalomalacie (LEM). Dcrit aux USA notamment suite au dcs de plus de 5000 chevaux lors de lhiver 1934-1935 (Graham, 1936), puis rgulirement par la suite dans de nombreux pays, dAmrique centrale et dAmrique du sud (Ono et al., 2004), ce syndrome a tu une vingtaine de chevaux en France, principalement dans le sud-ouest, entre 1994 et 1996 (Bailly et al., 1996). Le syndrome quin de LEM est caractris par la prsence de lsions ncrotiques liqufies dans lencphale. La maladie semble tre spcifique aux quids, bien que des lsions du cerveau aient t galement rapportes chez les lapins (Bucci et al., 1996), les porcins (Fazekas et al., 1998) et la carpe (Pepeljnjak et al., 2000). Cependant, les lsions du cerveau observes chez les lapins et les porcs n'ont pas t reproduites (T. Bucci, donnes non publies; Zomborszky et al., 2000), et l'tude sur la carpe n'a pas t rpte. En plus des lsions du cerveau, une atteinte hpatique grave peut tre observe (notamment lors de forte contamination) (Marasas et al., 1988). Des tudes rcentes suggrent que la FB1 est galement toxique pour le systme cardiovasculaire des chevaux (Smith et al., 2002), ainsi que pour les fonctions rnale et hpatique. Par contre, limplication suppose des fumonisines dans le syndrome duodnite/jjunite proximale du cheval na jamais t confirme. On pense que la LEM quine est le rsultat d'un dme crbral conscutif une dtrioration du fonctionnement des muscles lisses (par inhibition des canaux calciques) des sphincters du rseau

169

capillaire artriel crbral, do une incapacit moduler le flux sanguin vers le cerveau lorsque le cheval abaisse sa tte pour manger et boire (Smith et al., 2002 ; Foreman et al., 2004). L'analyse des aliments (gnralement du mas mal tri ou des aliments composs en contenant) provenant de cas confirms de LEM quine aux Etats-Unis montre que la consommation d'aliment contenant plus de 10 mg FB1/kg (quivalent 0,2 mg/kg p.v./j) est associe un risque accru de dvelopper la maladie, le risque restant trs limit si la concentration est infrieure 6 mg/kg (quivalent 0,12 mg/kg p.v./j) (Ross et al., 1992). Wilson et al. (1992) observent pisodiquement des troubles neurologiques chez des poneys consommant durant 122 jours ( raison de 0,8% du poids vif) puis durant 58 jours ( raison de 1,6% du poids vif) des concentrs contamins par 8 mg/kg de FB1 et 2,56 mg/kg de FB2. Aucune lsion encphalique visible ne fut cependant observe lautopsie. Dans les cas dintoxications naturelles rapportes au Brsil, la concentration en FB1+FB2 dans le mas consomm par les chevaux variait entre 2,1 et 10,5 mg/kg (Ono et al., 2004). Dans ceux observs dans le sud-ouest de la France, des concentrations de FB1 comprises entre 20 et 30 mg/kg daliment ont t retrouves (dans un cas, plus de 200 mg/kg ont t retrouvs) (Bailly et al., 1996). La LEM quine a t reproduite exprimentalement en administrant de la FB1 purifie par voie orale ou intraveineuse, mais galement en nourrissant les animaux avec des mas naturellement contamins par F. verticillioides ou avec des aliments fabriqus partir de cultures de F. proliferatum, contenant principalement de la FB1 et de la FB2, mais limplication de la FB2 dans la gense de la LEM nest toujours pas clairement dmontre (Ross et al., 1994). Quant la FB3, elle semble non toxique chez le cheval. Des tudes ralises avec des aliments naturellement contamins indiquent que la dose orale minimale de FB1 suffisante pour induire la LEM est comprise entre 15 et 22 mg/kg daliment (quivalent 0,30 mg/kg p.v./j de FB1 pendant 150 jours ou 0,44 mg/kg p.v./j de FB1 pendant 241 jours). Avec des aliments contamins avec du matriel de culture de F. moniliforme durant 27 jours et contenant 65, 130 ou 200 mg de FB1/kg, Goel et al. (1996) retrouvent systmatiquement des lsions neurologiques centrales lautopsie ainsi quune lvation du taux srique de sphinganine libre. La dose orale minimale de FB1 pure induisant une LEM chez le cheval na pas t dtermine. Foreman et al. (2004) ont administr durant 28 jours par voie intraveineuse des doses de 0 ; 0,01 ; 0,05 ; 0,10 et 0,20 mg de FB1 par kg p.v./j en vue de dterminer une courbe dose-rponse pour les signes neurologiques. Tous les chevaux qui ont reu une dose suprieure 0,05 mg/kg p.v./j ont prsent rapidement des signes neurologiques (baisse de tonicit de la langue, ataxie des membres antrieurs puis des postrieurs avec difficults de placement, puis dpression, hyperesthsie ) dont la gravit et la rapidit dapparition ont t dose dpendantes. Certaines altrations du liquide cphalorachidien ont galement t notes : lvation du taux de protines, dalbumine, des IgG et du ratio albumine/protines. La dose intraveineuse minimale de FB1 pure qui provoque des anomalies neurologiques est donc suprieure 0,01 mg/kg (qui est la dose sans effet) mais infrieure 0,05 mg/kg p.v./j. Si on fait l'hypothse que la dose intraveineuse reprsente 5% de la dose orale (Smith et al., 2002), la dose orale sans effet serait donc de 0,2 mg/kg p.v. (ce qui quivaut environ 8 mg/kg aliment). La dose orale qui provoque des anomalies neurologiques est comparativement infrieure 1,0 mg/kg p.v./j. Selon Smith et al. (2002) la dose sans effet pour des anomalies cardiovasculaires est de 0,2 mg/kg p.v./j, mais la dose sans effet pour des anomalies biochimiques sriques est infrieure ce seuil. Le changement du mtabolisme des sphingolipides est un indicateur prcoce de l'exposition des chevaux aux fumonisines. Par exemple, des poneys nourris avec des aliments contamins par des fumonisines ( 22 mg/kg, principalement de la FB1) ont tous montr une augmentation importante de leur concentration srique en sphinganine. Cette augmentation rversible de la concentration en sphinganine, ainsi que l'augmentation du rapport sphinganine/sphingosine se produisent avant que n'apparaissent les signes cliniques de la LEM ou l'augmentation des transaminases dans le srum. En dfinitive, les quins reprsentent un groupe cible particulirement sensible la prsence de fumonisines. Cependant, seule la responsabilit de la FB1 est actuellement clairement dmontre. Il est important de souligner que lvolution des manifestations cliniques est toujours aigu (24h), fatale

170

mme suite une exposition prolonge sans signe prcurseur. Aussi il convient de ne pas faire consommer aux chevaux des aliments dans lesquels le taux de fumonisines dpasse la recommandation europenne tablie 5 mg/kg. Il serait par ailleurs souhaitable dinterdire toute distribution dcarts de tri de mas grains aux chevaux.

Les carnivores domestiques Aucun trouble na jamais t rapport chez les carnivores domestiques en relation avec cette contamination qui ne semble pas poser de problme pratique lindustrie des aliments secs pour carnivores. Une seule enqute pidmiologique a t ralise et laisse cependant penser que les carnivores domestiques (chiens et chats) pourraient tre potentiellement exposs au risque toxicologique li la prsence de fumonisines dans les aliments secs contenant des crales ou des tourteaux. Un chantillon de 35 aliments secs pour chiens et de 35 aliments secs pour chats disponibles sur le march britannique a fait lobjet dune recherche des fumonisines B1 et B2 (seuil de dtection respectivement de 3 et de 8 g/kg). La FB1 a t identifie dans un seul aliment pour chiens (105 g/kg) et dans 3 aliments pour chats (90, 240 et 690 g/kg). La FB2 a galement t identifie dans le mme aliment pour chiens (30 g/kg) et dans 2 des 3 aliments pour chats dj contamins par la FB1 (80 et 60 g/kg) (Scudamore et al., 1997).

6.1.5

Les poissons

Toxicits la FB1 observes en levage A notre connaissance, aucun cas dune toxicit de la FB1 en levage de poissons na t rapport dans la littrature scientifique. Nanmoins quelques tudes exprimentales montrent un effet toxique des doses susceptibles dtre rencontres dans des aliments leur tant destins en aquaculture. Etudes exprimentales Les donnes disponibles concernent principalement le poisson chat (Ictalurus punctatus) et la carpe (Cyprinus carpio), car lalimentation qui leur est dlivre en aquaculture peut contenir du mas, matire premire susceptible dtre contamine par les fumonisines. Lge semble tre un facteur important de la sensibilit, les jeunes animaux tant plus sensibles que les plus gs. Chez le poisson chat, 20 mg FB1/kg daliment rduisent la vitesse de croissance des animaux dun an, alors que ceux gs de deux ans voient seulement leur gain poids rduit quand ils sont exposs 80 mg de FB1/kg (Lumlertdacha et al., 1995). Li et Robinson (1995) et Brown et al. (1994) ont galement rapport une forte tolrance des poissons chat adultes exposs aux fumonisines ( 40 et 313 mg/kg daliment respectivement). La sensibilit du poisson chat aux fumonisines est comparable celle du tilapia du Nil (Oreochromis niloticus) (Tuang et al., 2003). Les concentrations de fumonisines affectant le mtabolisme et le systme immunitaire des poissons sont plus faibles que celles affectant les performances. Chez la carpe, de faibles doses de FB1 (0,5 mg/kg daliment) affectent dj la fonction hpatique (lvation des activits de lalanine aminotransfrase (ALAT) et de laspartate aminotransfrase (ASAT) et des concentrations en bilirubine) et la fonction rnale (concentrations plus leves en cratinine) (Pepeljnjak et al., 2002). Chez la truite arc-en-ciel, Meredith et al. (1998) ont montr quune exposition de seulement 5 7 jours des aliments contenants de 5 500 mg de FB1/kg est suffisante pour faire voluer le ratio sphinganine/sphingosine, ce qui montre que la FB1 alimentaire est rapidement absorbe par les truites et affecte rapidement la biosynthse des sphingolipides. Le changement dans le mtabolisme des sphingolipides peut affecter la morphologie des rythrocytes. Pepeljnjak et al. (2002) suggrent que ces changements dans la membrane des rythrocytes pourraient expliquer laugmentation du nombre des petits rythrocytes observs lors dune exposition aux fumonisines. Le taux de plaquettes plus lev pourrait tre d une thrombocytose secondaire cause par un dommage cellulaire plus important li une infection. Chez la crevette blanche (Litopenaeus vannamei), les fumonisines affectent les activits de la trypsine et de la collagnase, indiquant un effet ngatif potentiel sur la fonction digestive et des modifications histologiques de leur hpatopancras (Burgos-Hernandez et al., 2005).

171

Le plus gros problme pos par les fumonisines en aquaculture semble tre leur capacit altrer la fonction immunitaire. Vingt mg de FB1 dans laliment suffisent rduire la production danticorps. Les modifications ce niveau naugmentent pas la mortalit chez le poisson chat lors dune infection exprimentale avec Edwarsiella ictaluri. Toutefois quand les poissons sont exposs 80 mg FB1/kg daliment, la rsistance ce pathogne est significativement rduite (Lumlertdacha et Lovell, 1995 ; Lumlertdacha et al., 1995). Sous diffrentes conditions exprimentales, les modifications immunologiques ont t observes des niveaux dexposition plus faibles. Pepeljnjak et al. (2002) a rapport quune exposition chronique de plus faibles doses de fumonisines prdispose la carpe des infections et maladies. Une incidence plus leve des infections dermatologiques dErythrodermatidis cyprini causes par Aeromonas salmonicidae subsp nova a t observe chez des carpes recevant 5 mg FB1/kg daliment compar des doses plus faibles. Les donnes exprimentales cites suggrent une dose sans effet infrieure 0,5 mg de FB1/kg daliment chez les poissons, mais cela mrite dtre confirm.

6.2 Calcul de lexposition animale en France La mthodologie gnrale est dcrite en annexe 2 6.2.1 Donnes de contamination Les donnes de contamination prsentes ci-dessous ne portent que sur la fumonisine B1. 677 valeurs de contamination ont t recueillies, rparties sur 12 types daliments. Pour quelques matires premires (rafles de mas, matires premires vgtales diverses) nous ne disposions que de moins de 5 donnes. Ces donnes ne sont pas prsentes dans le tableau 5, ni utilises pour le calcul de lexposition. Ainsi, une fois ces analyses retires, il reste 674 valeurs de contamination, regroupes en 10 types daliments. Tableau 5 : Rpartition des donnes de contamination en FB1 par type de matires premires (n>= 5) : Matire premire25 corn gluten feed issues de crales mas pois bl son gluten feed de bl orge remoulage fveroles Total nombre donnes 20 13 301 104 61 32 49 52 23 19 674 de % < LOD 0,0 0,0 7,9 12,8 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,8 23,4 % > LOQ 2,2 1,8 31,6 2,7 1,3 0,3 0,4 0,0 0,0 0,0 40,4

Ces donnes comportent 23,4% de valeurs infrieures la limite de dtection et 40,4% de valeurs quantifies (suprieures la limite de quantification). Les estimations moyenne et aux 75me et 95me percentiles des teneurs suprieure la LOQ (comme dcrit dans la mthodologie gnrale) sont comparer aux teneurs rglementaires pour les aliments complets (Recommandation 2006/576/CE). Le corn gluten feed, les issues de crales et le mas sont les trois matires premires les plus contamines.

25

le corn gluten feed et le wheat gluten feed sont les produits rsultant des grains de mas et de bl dont on a extrait lamidon dans les processus damidonnerie. 172

Les statistiques descriptives des niveaux de contamination selon les scnarii indiqus sont fournies en annexes. Ces rsultats sont prsents pour les niveaux de contamination en poids frais, tel que dans la rglementation. Les teneurs recommandes portent sur la somme FB1 + FB2 et on considre que la FB2 reprsente 20% du total (FB1 +FB2) (Shepard et al., 1996). Aux donnes de contamination doivent donc tre ajout 20% pour tenir compte de la FB2 et tre compares aux teneurs de la recommandation 2006/576/CE. 6.2.2. Calcul de lexposition Les calculs de contamination des rations sont les suivants (les tableaux dtaills des rsultats sont en annexe 2) : Pour les volailles

Tableau 6a : Calculs de contamination en FB1 des rations destines aux volailles

173

contamination minimale calcule % de en g/kg d'aliment ration 208,5 58,5 168,0 62,2 135,5 62,6 148,4 68,4 332,8 65,8 397,6 77,6 393,4 79,7 308,5 68,8 310,0 76,7 312,9 79,5 297,2 65,1 124,9 40,9 94,0 47,5 115,5 55,0 170,8 58,3 123,0 66,0 126,6 64,3 400,2 58,2 458,3 62,5 518,5 65,4 237,8 70,4 261,7 79,1 249,1 81,8 348,6 75,0 830,6 98,0 la

contamination des positifs en g/kg d'aliment valeurs limites FB1+FB2 la recommandes (13) en g/kg d'aliment 20 000 20 000 20 000 20 000 20 000 20 000 20 000 20 000 20 000 20 000 20 000 20 000 20 000 20 000 20 000 20 000 20 000 20 000 20 000 20 000 20 000 20 000 20 000 20 000 20 000

Espces Poulet standard

Poulet label

Poule pondeuse

Dinde

Pintade

Canard Barbarie

Phases dlevage dmarrage croissance finition retrait dmarrage croissance finition-retrait dmarrage croissance repro-entretien pondeuse dmarrage croissance 1 croissance 2 finition 1 finition 2 finition 3 dmarrage croissance finition-retrait canard dmarrage canard croissance canard finition levage gavage

Canard gaver

prt

au p75 206,3 141,9 94,2 103,4 375,9 450,3 467,8 371,2 364,6 382,3 330,7 114,0 78,5 103,8 152,1 109,8 78,4 491,0 561,0 643,4 229,4 249,7 227,0 382,1 1041,7

au p95 1151,4 897,1 698,1 764,9 1895,8 2266,6 2304,1 1820,7 1815,1 1867,2 1682,1 677,6 523,1 654,1 922,0 708,2 639,7 2380,9 2667,2 3028,7 1305,9 1433,7 1351,0 1972,2 4865,7

% de ration 58,5 62,2 62,6 68,4 65,8 77,6 79,7 68,8 76,7 79,5 65,1 40,9 47,5 55,0 58,3 66,0 64,3 58,2 62,5 65,4 70,4 79,1 81,8 75,0 98,0

174

NB : La part de la ration (exprime en pourcentage) susceptible dtre contamine par la fumonisine B1, utilise dans le calcul de lexposition varie selon les scenarii : dans le cas de la contamination minimale calcule, la part de la ration susceptible dtre contamine correspond aux matires premires incluses dans la ration pour lesquelles on a des donnes (mme si elles sont ND) dans le cas des scnarii de contamination aux p75 et p95 des teneurs positives, la part de la ration susceptible dtre contamine correspond aux matires premires incluses dans la ration pour lesquelles les teneurs en fumonisine sont suprieures la LOD.

La rglementation recommande une valeur limite de contamination de la ration pour les volailles de 20000 g/kg pour la somme des fumonisines B1 et B2. Les poulets standards ainsi que les dindes ont les plus faibles niveaux de contamination de la ration, avec ensuite les canards de Barbarie. Ces 3 catgories de volailles ont galement des valeurs de contamination au p75 infrieures au niveau moyen. Cela sexplique par la contamination du bl qui comporte de nombreuses valeurs gales la LOQ et quelques valeurs quantifies, ce qui lve la moyenne par rapport au 75me percentile. Compte-tenu de la contamination de la ration estime ici, en ajoutant 20% pour tenir compte de la FB2, on reste dans des niveaux de contamination trs infrieurs la valeur limite dfinie dans la recommandation. Le rgime le plus contamin (facteur 4 pour atteindre la valeur limite) est celui des canards prts gaver au p95 de la contamination des matires premires ( savoir le mas pour 98% de la ration). Les pourcentages de la ration pris en compte dans ces estimations varient de 40% pour les dindes 80 voire 98% pour les canards. Pour les porcs

Tableau 6b : Calculs de contamination en FB1 des rations destines aux porcs teneurs limites contamination des positifs FB1+FB2 Porcins en g/kg d'aliment recommandes (13) en g/kg % de la d'aliment % de la ration au p75 au p95 ration en g/kg d'aliment 1er ge 324,6 56,5 377,4 1863,7 56,5 5000 2me ge 180,7 78,0 199,0 1018,1 78,0 5000 croissance CORPEN 201,0 83,4 327,2 1389,3 83,4 5000 finition CORPEN 243,3 78,0 374,3 1622,1 78,0 5000 truies gestantes 200,9 84,8 306,8 1300,0 84,8 5000 truies allaitantes 136,2 79,5 215,8 889,9 79,5 5000 Il faut noter que pour la majorit des rgimes, une grande part de la ration (jusqu 85%) est pris en compte dans les calculs de contamination de la ration. Seuls les calculs de contamination ralises avec les aliments premier ge porcins ne prennent en compte que moins de 60% de la ration. La rglementation recommande pour les porcins une valeur limite de contamination de la ration de 5000 g/kg pour la somme des fumonisines B1 et B2.Les scnarii de contamination moyenne sont trs largement en de de la valeur limite. Mme au p75, la marge est encore trs importante. Au 95me percentile, la contamination de la ration calcule est toujours au moins 2,5 fois infrieure la teneur recommande en ajoutant 20% pour la fumonisine B2. contamination minimale calcule

7. Rglementation En alimentation humaine, dans le cadre du rglement 1126/2007/CE modifiant le rglement 1881/2006/CE (abrogeant le rglement 466/2001/CE et ses modifications) portant fixation de teneurs maximales pour certains contaminants dans les denres alimentaires, des teneurs maximales ont t fixes pour les fumonisines (tableau 7a).

175

En alimentation animale, aucune teneur maximale en fumonisines n'est fixe dans les matires premires et les aliments pour animaux par la Directive 2002/32. Nanmoins, la Commission recommande26 d'appliquer des teneurs maximales en fumonisines B1 + B2 dans les matires premires et aliments destins l'alimentation animale (tableau 7b). Tableau 7a : Teneurs maximales en fumonisines (somme B1+B2) dans les denres alimentaires exprimes en g/kg Produit Teneur maximale en g/kg Mas brut lexception du mas brut destin tre transform par 4 000 mouture humide (*) Mas destin la consommation humaine directe, aliments base de 1 000 mas destin la consommation humaine directe, lexception des aliments figurant aux points 3 et 4 Crales pour petit-djeuner base de mas et collations base de 800 mas Prparations base de mas et aliments pour bbs destins aux 200 nourrissons et enfants en bas ge Fractions de mouture de mas dont la taille des particules est > 500 1 400 microns auxquelles sapplique le code NC 1103 13 ou 1103 20 40 et autres produits de mouture de mas dont la taille des particules est > 500 microns ou destins la consommation humaine directe auxquelles sapplique le code NC 1904 10 10 2 000 Fractions de mouture de mas dont la taille des particules est 500 microns auxquelles sapplique le code NC 1102 20 et autres produits de mouture de mas dont la taille des particules est 500 microns ou destins la consommation humaine directe auxquelles sapplique le code NC 1904 10 10

(*) lexception sapplique uniquement au mas dont ltiquetage ou la destination, par exemple, font clairement apparatre quil est destin tre utilis dans un processus de mouture humide (production damidon)

Tableau 7b: Teneurs maximales dans les aliments pour animaux recommandes par lUE en fumonisines B1+B2 (14) Produits Matires premires entrant dans la composition des aliments pour animaux : Le mas et les produits base de mas Aliments complmentaires et complets pour : Les porcs, les quids, les lapins et les animaux familiers Les poissons La volaille, les veaux (<4mois), les agneaux et les chevreaux Les ruminants adultes (>4mois) et les visons Teneur maximale recommande en g/kg (teneur en humidit de 12%)

60000

5000 10000 20000 50000

26

Recommandation 2006/576/CE de la Commission du 17 aot 2006 concernant la prsence de doxynivalnol, de zaralnone, d'ochratoxine A, des toxines T-2 et HT-2 et de fumonisines dans les produits destins l'alimentation animale.

176

8. Surveillance et contrle en France Dans le cadre des plans de surveillance et de contrle des services de lEtat (Direction Gnrale de lAlimentation DGAL- et Direction Gnrale de la Concurrence, de la Consommation et de la Rpression des Fraudes- DGCCRF-), les teneurs en fumonisines B1 et B2 commencent tre apprhendes aussi bien sur les matires premires que sur les produits transforms. Dans les cas de non-conformit, les actions correctives sont entreprises telles qu'interdiction de mise le march et saisie ou refus de lots contamins l'importation. Bien que les denres prleves au sein des catgories daliments rglementes soient de nature et dorigine variables selon les annes, il peut nanmoins tre dgag les grandes tendances de conformit suivantes : Les plans conduits aprs les rcoltes de 2003 2006 ont surtout port sur le mas et depuis peu sur le bl et lorge. Ces plans confirment que la survenue de contamination est plus sur le mas que sur les autres crales, avec en moyenne 37,7 % des lots qui avaient une valeur suprieure 2000 mg/kg sur les 223 chantillons collects en silo. Ces plans montrent par ailleurs que cette teneur est variable dune anne sur lautre. Concernant les produits prts consommer base de crales, la contamination moyenne des farines et semoules de mas est de 233 g/kg daliment. Les crales pour petit djeuner et autres produits base de crales ont une teneur comprise entre 18 et 37 g/kg, avec plus de 90 % des chantillons non quantifiables. Sur 21 chantillons de produits base de crales destins aux enfants en bas ge prlevs avant lentre en vigueur de la rglementation communautaire, 3 chantillons dpassent la teneur de 200 g/kg. Il est signaler quen 2005 dans une farine de mas en provenance dEurope mridionale a t identifie une teneur leve en fumonisine B1 de 1600 g/kg, cet aliment mme savrant contenir de laflatoxine B1 7,5 g/kg, montrant non seulement lmergence de cette dernire toxine dans des productions europennes mais encore la possibilit de concomitance de plusieurs mycotoxines labores par des genres de moisissures diffrents.

9. Conclusions et recommandations Parmi les diffrentes fumonisines, les effets de la fumonisine B1 (FB1) sont les mieux caractriss : on assiste notamment une altration du mtabolisme des sphingolipides dont toutes les consquences toxicologiques ne sont pas connues. En terme d'effets cliniques majeurs, ldme pulmonaire porcin et la leucoencphalomalacie quine sont les principaux effets observs sur la sant animale. La population franaise est peu expose aux fumonisines en raison de la faible consommation de mas et du faible transfert de ces toxines dans les produits animaux. Cependant, les teneurs mesures dans le cadre des plans de surveillance et de contrle dans les produits base de crales destins aux enfants en bas-ge montrent quil conviendrait de renforcer les contrles sur ces produits. En revanche, la population animale est plus expose, le mas pouvant constituer un lment majeur de son alimentation. Particulirement contamines, les issues de mas utilises dans l'alimentation des animaux, notamment celle des quids, prsentent un risque particulier et devraient tre rglementes. D'une faon gnrale, les teneurs maximales recommandes (Recommandations de la Commission14 et de la FDA27) pour les mas destins aux animaux apparaissent trop laxistes au regard de la protection de la sant animale. La connaissance de la toxicit des fumonisines autres que la FB1 est trs limite et le diffrentiel toxique entre fumonisines n'est pas connu. Il faudra lavenir engager des recherches sur le danger toxique des fumonisines, notamment les dangers immunotoxique et cancrogne doses faibles. Outre la recherche sur les dangers toxiques des fumonisines, plusieurs voies damlioration sont considrer : du point de vue rglementaire, la rglementation devrait concerner non seulement la somme FB1+FB2 mais galement la seule FB1 ;

27

FDA. Background Paper in Support of Fumonisin Levels in Animal Feed, FDA 2001.

177

du point de vue analytique, des progrs sont attendus pour le dosage en routine des fumonisines dans les matires premires et produits finis ; du point de vue de la surveillance, la conduite des plans devra se poursuivre sur le mas afin de prendre en compte lvolution du climat. En effet, la contamination naturelle en fumonisines peut tre frquente selon les annes dans le mas du sud de l'Europe. Par ailleurs, les plans de surveillance devront tre tendus au sorgho.

Rfrences bibliographiques (voir document spcifique)

178

chapitr re 6

La patulin ne

coordin nateur : Pie erre Galtier r et Daniel Thouvenot t

Introdu uction
La patuline a t d couverte da ans les filtrat ts de culture e dAspergillu us clavatus p par Waksma ann et al. (1942). Identifie I pou ur ses proprits antibiot tiques enver rs les bactries Gram+ et t Gram -, cet tte toxine est poten ntiellement produite p par un grand nombre de moisissures app partenant au ux genres As spergillus, Penicilliu um et Byss sochlamys. De nos jou urs, elle suscite lintr t en raison n de son caractre c contamin nant naturel de certains fruits et not tamment de la pomme et ses produ uits drivs. Dautres substrats s naturels pe ermettent la toxinogense, il sagit de es crales (bl, ( riz), des s pulpes de betterave b ou de la paille.

P Proprits physiques s et chimiq ques

La patuli ine, illustre en figure 1, est une lacto one htrocy yclique insature de poid ds molculair re 154, et de form mule brute C7H6O4 rpondant la structur re 4-hydroxy y-2H-furo[3,2 2-c]pyrane-2 2(6H)-one (Woodw ward et Singh, 1949) (CAS S n149-29-1 1).

Figure 1 : structure molculaire e de la patu uline Caractr rise par un point de fus sion de 111C C et un max ximum dabso orption 275 5 nm, elle es st soluble dans lea au et la plupa art des solva ants organiqu ues, lexception du ben nzne et de lther de pt trole. Elle est stabl le en milieu acide a mais perd p son activ vit en milieu u alcalin (Win ndholz, 1983 3).

M Mthodes d danalyse ( (voir princi ipes gnr raux en Ann nexe 1)

Le rglement (CE) n n 401/2006 de la Comm mission du 23 3 fvrier 200 06 fixe les mo odes de prlvement d'chant tillons et les mthodes d'analyse po our le contr le officiel des teneurs en patuline dans les denres alimentaires s. Les prem mires mtho odes visant doser la contamination n des alimen nts en patulin ne se sont adresses au jus de d pomme. La premire e mthode rfrence tait celle approuve e en 1974 par lAOAC (Associa ation of Offic cial Analytica al Chemists). La prpara ation de lch hantillon tait alors limit e une simple extraction e liqu uide-liquide (LLE) de lc chantillon pa ar de lactat te dthyle e et une purific cation sur colonne de silice ; le e contenu de e lextrait tai it alors dter rmin par ch hromatograph hie sur couche mince (CCM). Aprs A dpt et migration n, la dtection de la patul line se trouva ait amliore e par pulvrisation de la plaque e par le 3-m methyl-2-benz zothiazolinon ne hydrazone e (MBTH). Depuis D 30 an ns, les techn niques de prparat tion de lcha antillon et les s mthodes de d mesure ont considrablement vo olu. La premire tape dextraction de lchantillo on liquide (jus s de fruit) res ste trs communment base b sur lutilisatio on de lacta ate dthyle (Roach et al a ., 2002, Sew wram et al., 2000, Gokm men et Acar, 1996 et 1999, Durakovic et al., 1993, Gertz et Bosc chemeyer, 19 980). Les pr rocds dex xtraction - pu urification utiliss ont o suivi les amlioration ns technique es successives qui ont concern globalement le domaine de lanal lyse des con ntaminants dans d les alim ments. Les ca artouches de extraction en n phase solid de (SPE) ont t utilises ds s 1991 avec c une grande e variabilit concernant les principes s de spara ation. Les

179

chromatographies ont utilis le principe de la phase normale avec des phases stationnaires de type silice pure (Young, 1979, Stray, 1978, Ware, 1975), silice-oxyde de magnsium (florisil : Koch et al. 1979), ou encore terre de diatomes (Leuenberger et al., 1978). La sparation des analytes selon le principe de la phase inverse a t gnralement applique ; les phases stationnaires ont t de type silice greffe octadcylsilyle (Eisele et Gibson, 2003), cyano (Hurst et al., 1987), ou copolymrique de nature styrne - divinylbenzne (Trucksess et Tang, 1999). De manire plus anecdotique, lutilisation originale de lexclusion strique peut tre souligne (Josefsson et Moller, 1977). La dialyse diphasique dordinaire peu rpandue dans le domaine des rsidus dans les aliments savre assez utilise dans ce domaine dactivit (Prieta et al., 1993, Sheu et Shyu, 1999). Beaucoup dauteurs ont continu dvelopper la CCM avec des phases stationnaires de nature diverse et des procds de rvlation originaux et varis ; la plupart des mthodes affichait des limites de dtection de lordre de 20 100 g/L. Cette technique sest vue supplante la fin des annes 1980 par la chromatographie liquide haute performance (CLHP). Cette dernire sest impose en permettant de diminuer nettement le temps danalyse, daugmenter la sensibilit de la mesure, damliorer la rsolution chromatographique donc la qualit de lanalyse et surtout en sparant la patuline dune interfrence omniprsente et rcurrente, le 5-hydroxymethylfurfural (HMF) (Gokmen et Acar, 1999). Les premires CLHP taient bases sur une sparation en phase normale alors que les travaux plus rcents sont bass pour lessentiel sur le principe de la phase inverse. Nanmoins, du fait de sa petite taille et de sa forte polarit, la patuline implique lutilisation de phase mobile faiblement luotrope (moins de 5-10% dactonitrile ou de mthanol). Les modes isocratiques ou gradients ont t indiffremment utiliss. La dtection UV est particulirement bien adapte la dtection de la patuline puisque cette toxine polaire possde un spectre dabsorption bien fourni. La dtection a t assure longueur donde fixe (selon les auteurs 254 nm, 273 nm, 276 nm ou 280 nm) ou variable par lintermdiaire de dtecteur barrettes de diodes. Pour amliorer la spcificit et la sensibilit de la dtection base su la spectromtrie enUV, dtection base sur la spectromtrie de masse a t envisagiseds 1986 avec lutilisation dune interface thermospray, puis ionisation chimique pression atmosphrique (APCI) et lectrospray (ESI) en polarit ngative ou positive. Les mthodes les plus performantes utilisent la spectromtrie de masse en tandem, mais sont encore peu appliques en routine . Selon la technique retenue, les limites de dtection pour la CLHP peuvent atteindre de 1 10 g/L dans le jus de pomme. Mme si les mthodes se basant sur la CLHP semblent prfres, des approches utilisant la CPG ont t rapportes. Elles impliquent gnralement au pralable la drivation de la patuline tant donns son faible poids molculaire et son apolarit rduite, mme si quelques rares applications relatent linjection directe de la patuline non drive. Deux principales approches de drivation peuvent tre releves : la silylation avec lintroduction dun groupe trimthylsilyle (TMS), et lacylation avec incorporation dun actyle (Sheu et Shyu, 1999). Limpact lectronique est souvent la mthode dionisation de choix. Les analyseurs de masse sont classiquement de simples quadriples ou des trappes ioniques mais lutilisation de secteur magntique avec acquisition haute rsolution du signal peut tre souligne ; dans ce dernier cas des sensibilits remarquables sont avances par les auteurs (jusqu 12 ng.L-1). Lorsque la spectromtrie de masse est utilise en dtection, des talons internes type patuline marque au deutrium (2H) ou au carbone 13 (13C) peuvent tre introduits dans la procdure technique et contribuent ainsi lamlioration de la qualit de lanalyse (Rychlik et Schieberle, 1999). La mthode reconnue et valide actuellement disponible est celle publie en 2002 par l'AOAC (AOAC 2000.02. Determination of Patulin in Clear and Cloudy Apple Juices and Apple Puree by HPLC) et reprise dans la norme CEN prEN 14177 (rf AFNOR V03-123).

3
3.1

Facteurs influenant la teneur dans les aliments


Moisissures toxinognes et contamination naturelle

La patuline est connue sous une grande diversit de noms (expansine, clavacine, claviformine, clavatine, mycoin C3, pnicidine). La patuline a t extraite de culture de P. patulum (aussi nomm P. griseofulvum, P. urticae, P. expansum, P. glandicola (aussi nomm P. granulatum), P. vulpinum (aussi nomm P. claviforme), P. paneum, P. carneum, Aspergillus clavatus, A. giganteus, A. terreus, Byssochlamys nivea et de B. fulva. Un rapport de Pittet (1998) recense le grand nombre de substrats susceptibles de transmettre la patuline dans lalimentation humaine et animale.

180

3.1.1. Fruits Parmi les espces fongiques toxinognes, Penicillium expansum, contaminant commun des pomaceae (pommes, poires) et particulirement de la pomme, est certainement l'espce la plus importante du point de vue conomique et sanitaire. En effet, ce champignon saprophyte de la pomme est responsable en majeure partie de la contamination des jus de fruits, compotes et autres produits de la transformation des pommes. La production de patuline est favorise par la blessure des fruits (choc, attaque dinsectes,). Les productions maximales ont t obtenues, sur la pomme, 13 14 jours aprs inoculation par le P. expansum. Bien que la filire "pomme" constitue la source principale de contamination du rgime alimentaire de l'homme, bien d'autres denres alimentaires peuvent tre contamines par la patuline. Outre les pomaceae, P. expansum est un saprophyte de bien d'autres cultures marachres et arboricoles. La patuline a t dtecte dans des bananes, pches, abricots, raisins, jus de raisin et vin, mais en gnral le taux de patuline demeure bien plus faible compar celui observ dans les produits issus de la filire "pomme". 3.1.2 Ensilages Les ensilages de mas et dherbe peuvent tre des sources de patuline. Une enqute pidmiologique ralise en France par Escoula (1977) a montr que 59% de 34 ensilages de mas tests contenaient de la patuline. Les espces de Paecilomyces taient responsables de la production de patuline dans les ensilages dherbe. La prsence simultane dacide byssochlamique montrait que Byssochlamys nivea tait lorganisme producteur de patuline dans les ensilages de mas. Cette moisissure nest dtecte que tardivement aprs la mise en silo, environ aprs une dure de six mois de conservation en silo (Le Bars et Escoula, 1974). Elle apparat frquemment dans les fronts de coupe des ensilages (Escoula, 1974). Des souches toxinognes de B. nivea peuvent galement se dvelopper dans les ensilages de pulpes de betteraves (Legrand 2003). P. granulatum a t identifi dans les ensilages contamins avec de la patuline (Escoula, 1977). 3.1.3 Autres substrats vgtaux Dautres ingrdients comme les rsidus dorge malte peuvent tre coloniss par des souches dA. clavatus et de P. urticae. La patuline a pu tre dtecte dans des pailles de crales contamines par A. clavatus. Les grains de crales conservs dans de mauvaises conditions peuvent galement tre des vecteurs de patuline (Forgacs et al., 1954). Enfin, il faut noter que des sous-produits de lindustrie agro-alimentaire comme ceux issus de la transformation des pommes peuvent tre contamins par la patuline. Leur recyclage dans lalimentation des ruminants constitue donc un risque supplmentaire de contamination. 3.2 Conditions de toxinogense et voie de biosynthse

La production de patuline par des Aspergillus et Penicillium est optimale entre 20 et 25C sur des milieux contenant des sucres et notamment du glucose. Le maximum de production dbute une deux semaines aprs la mise en culture de la moisissure. Deux espces de Penicillium proches phylogntiquement de Penicillium roqueforti (P. paneum, P. carneum) produisent la patuline. En revanche, aucune souche de P. roqueforti utilise dans l'industrie fromagre n'a jamais t trouve productrice de patuline, aussi bien en conditions de laboratoire quen industrie. Des exprimentations ont t ralises afin d'essayer de faire produire de la patuline sur le fromage par dautres espces de Penicillium (P. patulum, P. claviforme, P. roqueforti) rputes productrices. Ces exprimentations ont choues en dpit d'une bonne croissance de ces espces, probablement en raison de la pauvret du substrat en sucres, sa richesse en protines ainsi que son activit en eau (aw) bien infrieure l'activit optimale pour la production de la toxine (Puel, 2007). Concernant la biosynthse de la patuline, il a t montr que dans des cultures de P patulum (P. griseofulvum), la patuline tait drive de l'acide 6-mthylsalicylique. Dans une tude de cintique, dans laquelle de l'actate radiomarqu au carbone 14 avait t incorpor, six prcurseurs prsums (actate, acide 6-mthylsalicylique, m-crsol, m-hydroxybenzylalcool, m-hydroxybenzaldhyde, et gentisaldhyde) conduisaient la synthse de la patuline. Par contre, le toluquinol et le gentisylalcool, deux autres mtabolites secondaires de P. patulum n'taient pas convertis en patuline. Des travaux mettant en uvre la cration de mutants bloqus, ont permis d'identifier d'autres intermdiaires de la voie de biosynthse de la patuline, tel l'isopoxydon, la phyllostine, la nopatuline ainsi que l'ascladiol prcdemment isol de culture d'A. clavatus. L'ensemble de ces travaux a permis de dresser la voie quasi-complte de la biosynthse de la patuline. Un seul gne, celui codant pour la premire enzyme

181

de la voie de la biosynthse de la patuline, l'acide 6-mthylsalicylique synthtase (MSAS) a t identifi, isol et squenc chez P. patulum. La squence d'un gne homologue a t dtermine chez A. terreus (Puel, 2007). Chez Byssochlamys nivea, la production est optimale 12 jours aprs le dbut de la culture en milieu liquide puis elle rgresse lentement au cours du mois suivant. Chez cette espce, la squence du gne de l'acide 6-mthylsalicylique synthtase (MSAS) a t dtermine (Puel et al., 2007). Toutes les squences protiques de l'acide 6-mthylsalicylique synthtase ainsi dtermines prsentent de fortes homologies avec les acides gras synthtases de vertbrs. En effet contre toute attente, les acides gras synthtases de champignons (levures et P. patulum) ont beaucoup moins d'homologies avec l'acide 6-mthylsalicylique synthtase que leurs homologues des vertbrs. L'acide 6mthylsalicylique synthtase prsente la mme organisation structurale et fonctionnelle que l'acide gras synthtase l'exception de l'absence d'un site thio-estrase.

4.
4.1

Proprits toxicologiques
Toxicocintique

4.1.1 Devenir in vivo Dailey et al. (1977a) ont dcrit le devenir dune dose unique de 3 mg/kg de 14C-patuline administre par voie orale chez le rat. Sept jours aprs administration, 36 et 49 % de la radioactivit taient limins respectivement par lurine et les fces, majoritairement dans les 24 premires heures. Seuls 2 3 % sont retenus dans le sang et les principaux organes alors que 1 2 % sont excrts sous forme ultime de 14CO2. 4.1.2 Absorption Une tude in situ sur modle destomac perfus de rat a montr que 26 29 % de la patuline taient absorbs en 55 minutes. De cette quantit, 17 et 2 % taient transfrs vers la circulation alors que seulement 3 et 0,06 % se retrouvaient dans le tissu gastrique. La disparition de la plus grande partie de la toxine est attribue une raction avec le glutathion intracellulaire, dont la dpltion est forte lors de lexposition la forte dose de patuline (Rychlik et al., 2004). Utilisant un essai de dilution par isotope stable, Rychlik (2003) a mis en vidence labsence de patuline srique (< 200 ng/L) chez 5 consommateurs humains de jus de pomme contenant un taux maximal admissible en toxine. Une tude complmentaire in vitro sur le sang humain montre quaprs addition de 100 g de patuline 9 ml de sang, seulement 6,1 % de toxine taient dtects lissue de 2 minutes dincubation. Il est conclu que mme de fortes concentrations alimentaires en patuline seraient rapidement transformes avant datteindre dautres tissus que le tractus digestif. 4.1.3 Liaison de la patuline aux protines Trois tudes in vitro successives de Fliege et Metzler (1999, 2000a, 2000b) ont permis didentifier des produits daddition de la patuline divers rsidus amins de protines. Dabord, ces auteurs ont qualifi linduction par la patuline de liaisons croises (crosslinks) intra ou intermolculaires impliquant des chanes latrales de cystine, lysine ou histidine et des groupements alpha amins. Comme la patuline est cense exercer son effet de dommage chromosomique travers la formation dadduits covalents des thiols essentiels intracellulaires, les mmes auteurs ont identifi 16 adduits diverses molcules nuclophiles dont le 4-bromothiophnol. Enfin les proprits lectrophiles de la patuline ont t tudies par la raction non enzymatique avec le glutathion et son produit de dgradation, la Nactyl-L-cystine. Ainsi, trois adduits cycliques se forment avec le glutathion, provenant de lactivit nuclophile des groupements alpha amins des rsidus dacide glutamique et de cystine du tripeptide, induite lors de linteraction avec la patuline. 4.1.4 Interaction avec les protines de biotransformation Une tude a t entreprise chez la souris recevant la toxine par voie intrapritonale, soit en administration unique (1, 3 ou 4,5 mg/kg p.c.), soit par injection quotidienne de 1 mg/kg p.c. pendant 5 ou 14 jours (Siraj et al., 1980). Si ladministration chronique ne conduit aucune variation des activits hpatiques de biotransformation, certaines inductions apparaissent aprs injection unique. Ainsi, une augmentation de 12 % du cytochrome P450 total est releve 48 heures aprs ladministration de 3 ou 4,5 mg/kg p.c. Cette induction est dailleurs associe laugmentation de certaines activits comme

182

lhydroxylation de laniline, la dmthylation de laminopyrine et de lthylmorphine ou de la NADPHcytochrome C rductase. La patuline ne serait au plus quun faible inducteur enzymatique. Entreprise plus rcemment, ltude de Lewis et al. (1999) compare la cytotoxicit de huit mycotoxines sur des cellules recombinantes dorigine humaine exprimant divers cytochromes P450. Des neuf P450 introduits, les P450 1A2 et 3A4 savrent les plus propices entraner la formation de mtabolites cytotoxiques. La patuline comme la toxine T-2, lacide cyclopiazonique, la fumonisine B1 ou le doxynivalnol ne subit pas de dgradation en mtabolites cytotoxiques produits par ces P450. Seules les aflatoxines B1, G1 et lochratoxine A sont rellement bio-activables par ces hmoprotines. Considre sur les cellules tmoins non recombinantes, la patuline nest pas classe parmi les toxines les plus cytotoxiques.

4.2

Toxicit gnrale

4.2.1 Toxicit aigu Mesure chez les rongeurs, les DL 50 par voie orale se situent entre 29 et 55 mg/kg p.c. chez le rat, la souris ou le hamster. La volaille parat moins sensible avec une DL50 de 170 mg/kg p.c. chez le coq. Administre par voie intraveineuse, intrapritonale ou sous-cutane, la patuline savre 3 6 fois plus toxique pour les mmes espces. Chez tous les animaux, les signes toxiques correspondent une neurotoxicit (agitation, convulsions) associe une congestion pulmonaire avec ulcration et inflammation intestinales. Certains composs modulent ces proprits, ainsi les inhibiteurs de cytochrome P450 comme le SKF 525A augmentent fortement la toxicit de la patuline alors que les inducteurs (phnobarbital, 3mthylcholanthrne) ne la modifient pas (Hayes et al. 1979). En revanche, la cystine associe la patuline parvient annuler ses effets toxiques (Ciegler et al., 1976). 4.2.2 Toxicit subaigu Essentiellement tudie chez le rat, ladministration orale court terme de patuline conduit une perte pondrale, des altrations gastriques et intestinales avec perturbation de la fonction rnale. Une rptition de dose conduit des signes de neurotoxicit (tremblements, convulsions) et une inhibition caractrise denzymes (ATPase) dans lintestin et le cerveau avec des consquences notamment en terme de mtabolisme des lipides (Devaraj et Devaraj, 1987). Des tableaux cliniques comparables ont t dcrits chez la souris, le hamster ou le poulet. Chez le singe, aucun signe de toxicit na t observ aprs des traitements quotidiens par 0,005 ; 0,05 ou 0,5 mg/kg p.c./j. pendant 4 semaines. Seule ladministration orale de 5 mg/kg p.c./j. entrane un refus alimentaire au cours des trois derniers jours dexposition (Garza et al., 1977). Selmanoglu et Kockaya (2004) ont mesur diverses activits hormonales thyrodiennes et testiculaires chez le rat recevant la patuline par voie orale raison de 0,1 mg/kg p.c./j. pendant 60 ou 90 jours. Un traitement de 60 jours provoque une augmentation du niveau srique en testostrone (66%) et une diminution du taux en hormone T428 (17%) alors quil napparat aucun changement pour les T329, TSH30, LH31 et GH32. Quand le traitement est appliqu pendant 90 jours, des augmentations en testostrone (75%) et en LH (146%) sont observes sans autre perturbation clinique. Lexamen histologique des testicules montre un dme, une fibrose, une hyperplasie des cellules de Leydig et une dsorganisation de lpithlium des tubules sminifres. Au niveau de la thyrode, on enregistre une infiltration des cellules lymphodes et un largissement du tissu interstitiel interfolliculaire. Hors de cette dernire tude, la patuline est reconnue pour ne provoquer que des dsordres gastrointestinaux avec ulcrations, distension et hmorragies, voire des perturbations de la fonction rnale, plus forte dose. Le tableau 1 rsume les tudes de toxicit chronique de la patuline.

T4 : Ttra-iodothyronine T3 : Triiodothyronine 30 TSH : Hormone thyrostimuline 31 LH : Hormone Lutnisante 32 GH : Hormone de croissance


28 29

183

Tableau 1 : Etudes de toxicit de la patuline aprs administration rpte par voie orale espce Dose rythme dure observations dsordres intestinaux dsordres intestinaux auteurs Mc Kinley et Carlton (1980a) Mc Kinley et al (1982) Speijers et al (1985)

souris 24/36 mg/kg pc rat rat

1 ou 2 14 j jours 28/41 mg/kg pc 1 ou 2 14 j jours 25 295 mg/L dans quotidien 28 j leau de boisson

rat

0,1mg/kg pc

quotidien

30 j

Rduction pondrale Rduction Cl cratinine Ulcres gastriques fortes doses NOEL = 25 mg/L eau de boisson = 3,3 mg/kg rduction lipides Devaraj et rduction triglycrides Devaraj (1987) augmentation cholestrol
inhibition ATPase intestinale

rduction alimentaire rduction pondrale forte dose perturbation fonction rnale dose moyenne NOAEL = 6 mg/L eau boisson = 0,8 mg/kg/j rat 0,1 mg/kg pc quotidien 90 j augmentation testostrone et LH sriques atteinte testiculaire et thyrodienne rat 1 mg/kg puis 2,5 3 jours 4s pas effet sur le poids mg/kg pc 70 s absence de tumeurs rat 0,1/ 0,5/ 1,5 mg/kg pc 2 jours 104 s mortalit forte dose rduction pondrale aux doses moyenne et forte absence de tumeurs NOEL = 0,1 mg/kg (sur 2 jours) hamster 16/24 mg/kg pc 1 ou 2 14 j dsordres intestinaux jours poulet 100 g 2 jours 30 j dsordres intestinaux perturbation fonction rnale inhibition ATPase rnale et intestinale singe 5/ 50/ 500 g/kg pc et quotidien 30 j pas de toxicit 500 puis 5 mg/kg pc 45 j refus alimentaire forte dose perturbation fonction rnale dose moyenne rat

6 150 mg/L dans quotidien leau de boisson

13 s

Speijers (1986)

et

al

Selmanoglu et Kockaya (2004 Osswald et al (1978) Becci et al (1981)

Mc Kinley et Carlton (1980b) Devaraj et al (1986) Garza et al. (1977)

4.3

Gnotoxicit

La patuline, tout comme la citrinine ou lochratoxine A, ne provoque pas de mutations reverses pour Salmonella typhimurium TA102 (Wurgler et al., 1991). Teste parmi dautres mycotoxines par un test de SOS sur microplaque, la patuline apporte une rponse ngative en gnotoxicit (Sakai et al., 1992). Une comparaison entre la cytotoxicit et lactivit antitumorale de la patuline et de ses adduits la cystine a t conduite sur des cellules murines de leucmie (L1210 et P388). La cystine rduit de 2 4 fois les proprits antiprolifratives de la patuline par addition sur les positions chimiques responsables de cette activit (Krivobok et al., 1994). Les effets aneuplodognes et clastognes de la patuline ont t compars sur cellules V79 en mesurant linhibition de lassemblage des microtubules et linduction de larrt mitotique et des micronoyaux. La toxine inhibe la polymrisation des microtubules, et se lie de faon covalente aux thiols des microtubules. A des concentrations ninduisant pas de cytotoxicit, larrt de la mitose et la prsence de chromatides surs tmoignent de leffet aneuplodogne de la toxine. La patuline est reconnue clastogne car elle induit des micronoyaux contenant des fragments non centrs reconnus par coloration de CREST (Pfeiffer et al., 1998).

184

Sur les mmes cellules V79 et sur lymphocytes humains, Alves et al. (2000) ont montr linduction de dommages lADN par la patuline travers deux voies diffrentes, linduction des micronoyaux (lymphocytes) et lapparition daberrations chromosomiques (V79). Par ailleurs la prsence de 80 M dacide ascorbique permet dabolir la clastognicit de 0,8 M de patuline. Trois types cellulaires diffrents (CHO33, HEK34 et lymphocytes humains) ont t utiliss pour valuer les dommages oxydatifs et les risques gnotoxiques induits par la patuline (Liu et al., 2003). La toxine provoque une augmentation dose-dpendante de la frquence des chromatides surs en CHO et lymphocytes. Elle accrot aussi le nombre daltrations de lADN en CHO et induit des coupures de lADN en HEK au-del de 15 M. Ce travail montre aussi que la patuline est clastogne et peut provoquer des dommages oxydatifs sur lADN.

4.4 Cancrognicit Les rares tudes de toxicit long terme de la patuline (Oswald et al., 1978 ; Becci et al., 1981) ont mis en vidence labsence de tumeurs chez des rats exposs des doses orales trihebdomadaires de 0,1 2,5 mg/kg p.c./j. pendant 74 104 semaines. Concernant le caractre cancrogne de la patuline, cette toxine a t classe par le CIRC (1986) dans le groupe 3, o figurent les produits pour lesquels il est impossible de se prononcer quant la cancrognicit pour lhomme.

4.5

Autres effets

4.5.1 Cytotoxicit La cytotoxicit de la patuline a t mesure sur des hpatocytes immortaliss de rat en considrant la survenue de divers dsordres oxydatifs (Barhoumi et al., 1996). La toxine ajoute raison de 1, 2 ou 10 M pendant 20 minutes engendrait le tableau chronologique de rponses suivant : suppression des communications intercellulaires ( gap jonctions ) et dpltion en glutathion intracellulaire / gnration de radicaux oxygns / dpolarisation de la membrane des mitochondries / augmentation du calcium intracellulaire et acidification cytoplasmique / dpolarisation de la membrane cellulaire. Deux lignes cellulaires pithliales humaines dorigine intestinale (HT-29 et Caco-2) ont t exposes des concentrations micromolaires en patuline (Mahfoud et al., 2002). Une diminution rapide et importante de la rsistance transpithliale est enregistre sans signe apparent de cytotoxicit. Cet effet serait associ la ractivit de la patuline lgard des groupes thiols car la cystine ou le glutathion prviennent ce dsordre, lequel est potentialis par le sulfoximine de buthionine, un agent de dpltion du glutathion. De plus, cet effet est mim et potentialis par loxyde de phenylarsine, un inhibiteur spcifique de la protine tyrosine phosphatase (PTP) dont le site actif contient un rsidu cystine en position 215. En consquence, il est suggr que la patuline agit par inactivation de ce site enzymatique dont lactivit est essentielle dans la fonction de barrire de lpithlium intestinal. 4.5.2 Embryotoxicit et tratogense Dailey et al. (1977b) ont observ in vivo, une rduction de la taille des portes de rats soumis un traitement par la patuline, alors qu la deuxime gnration il y a diminution du poids des ftus sans apparition de malformations. Une observation similaire est effectue par Reddy et al. (1978) chez des rats recevant 1,5 mg/kg par voie intrapritonale ; la dose de 2 mg/kg provoque lavortement de tous les embryons. Chez la souris, une mme dose orale provoque la mort de la progniture avec des hmorragies crbrales, pulmonaires et cutanes (Oswald et al., 1978). Une plus forte dose orale (3,8 mg/kg/jour pendant 12 jours) ne modifie pas limplantation embryonnaire et nentrane aucune malformation, contrairement lintoxication intrapritonale qui se traduit par des fentes palatines et des nphropathies (Roll et al., 1990).
33 34

Chinese Hamster Ovary Human Embryonic Kidney 185

Injecte dans la poche dair de luf de poule, la patuline peut provoquer une embryotoxicit au-del de 24 g par uf, la cystine co-administre parvient limiter cet effet (Ciegler et al., 1976). Leffet embryotoxique de la patuline a t test in vitro sur des cultures dembryons de rat raison de 0 62 M pendant 45 heures dexposition (Smith et al., 1993). La plus forte concentration savre ltale au-del de 40 heures, entranant une diminution des protines, de lADN et du diamtre du sac vitellin ainsi quune augmentation du nombre de rsorptions embryonnaires. A de plus faibles concentrations, les anomalies incluent un retard de croissance, une hypoplasie du msencphale et du tlencphale ainsi quune hyperplasie des processus mandibulaires. 4.5.3 Immunotoxicit De nombreuses tudes in vitro dmontrent que la patuline inhibe de multiples fonctions des macrophages. Ainsi, Sorenson et al. (1986) ont montr que la synthse des protines tait inhibe dans des macrophages alvolaires de rat exposs in vitro et que la fonction membranaire tait aussi altre par la patuline. Dans les mmes cellules de souris, il a t prouv que la toxine diminuait significativement la production de radicaux oxygns (O2-), la fusion phagosome-lysosome et lactivit des lysosomes (Bourdiol et al., 1990). Plus rcemment, compare la citrinine et la gliotoxine, la patuline ne parvenait inhiber que trs modrment lexpression de linterfron ou de linterleukine 4 par les macrophages humains (Wichmann et al., 2002). Par ailleurs, Marin et al. (1996) utilisant des cellules EL-4 de thymome ont montr le caractre suppresseur de la patuline sur la production des interleukines 2 et 5, partir de concentrations de 500 ng/ml, ces effets intervenant toutefois pour des doses bien plus fortes que pour la toxine T-2 teste dans le mme essai. Des tudes in vivo chez la souris montrent des effets varis sur le systme immunitaire. Ces effets incluent une augmentation des lymphocytes T dorigine splnique associe une diminution des immunoglobulines sriques (Escoula et al., 1988b), une attnuation des rponses dhypersensibilit (Paucod et al., 1990) ou une augmentation des neutrophiles avec rsistance accrue linfection par Candida albicans passant dun taux de mortalit de 80 % chez les tmoins 50 % chez les traits (Escoula et al., 1988a). Une tude moyen terme sur la mme espce (0,08 2,56 mg de patuline /kg p.c./j. administre pendant 28 jours par voie orale) montre une diminution des leucocytes et notamment des lymphocytes du sang priphrique ( 1,28 et 2,56 mg/kg p.c./j.), une augmentation des monocytes et des cellules NK35 splniques (ds 0,08 mg/kg p.c./j.), une augmentation des lymphocytes T cytotoxiques ( 2,56 mg/kg p.c./j.) avec altration des taux en immunoglobulines et en CD3+, CD4+ CD8- et en CD4CD8+ dans la rate. Toutefois, ces variations nont pas de consquences fonctionnelles et il ny a pas de changement significatif dans la fonction immune des souris traites par la patuline pour des paramtres comme la rponse des anticorps aux globules rouges de mouton (SRBC) ou la fonction cellulaire dite natural killer . Les auteurs concluent que la patuline naltre pas la rponse immunitaire des niveaux correspondant lexposition alimentaire humaine possible (Llewellyn et al., 1998). Chez le rat comme chez le lapin, la patuline supprime lexplosion oxydative habituellement dcrite dans les macrophages pritonaux (Escoula et al., 1988b) alors que laugmentation des neutrophiles serait attribue par Mc Kinley et al. (1982) linflammation gastro-intestinale provoque par la mycotoxine. 4.5.4 Lusage thrapeutique de la patuline Les proprits antibiotiques de la patuline ont entran son introduction en thrapeutique vtrinaire et humaine. Elle fut ainsi utilise avec succs dans la brucellose bovine (Rossi et Bruyre, 1950) et contre les agents des rhumes et bronchites mais sa neurotoxicit la fait abandonner chez lhomme, en dpit de quelques succs dans le traitement local de plaies infectes et pour la cicatrisation des blessures de la corne (Dulong, 1952).

35

Natural Killer 186

4.6

Valeurs toxicologiques de rfrences

En 1990, le JECFA36 a dtermin une dose journalire tolrable provisoire (DJTP) de 7 g/kg p.c./j, fonde sur une dose sans effet de 0,1 mg/kg p.c./j obtenue dans une tude chez le rat (Becci et al., 1981) qui visait valuer les effets sur la reproduction, la toxicit long terme et la cancrognicit, ainsi que dans les conclusions du CIRC en 1986. La dose de patuline a t administre 3 fois par semaine pendant 2 ans. Les effets observs consistaient en une diminution pondrale des rats mles et une mortalit par inflammation pulmonaire et laryngotrachale accrue chez les animaux des deux sexes exposs 1,5 mg/kg p.c./j. En 1995, aucune nouvelle tude pertinente long terme n'tant disponible, le JECFA a reconsidr cette DJTP et a fix une dose journalire maximale tolrable provisoire (DMJTP) de 0,4 g/kg p.c./j. Cette DMJTP a t fixe en appliquant un facteur de scurit de 100 la dose sans effet de 43 g/kg p.c./j recalcule partir de l'tude chez le rat. En 2000, le Comit scientifique europen de l'alimentation humaine a confirm cette valeur, aucune nouvelle tude long terme ayant t ralise. Enfin, tant donn le caractre rcent et indit de ltude de Selmanoglu et Kockaya (2004) dcrivant des perturbations endocriniennes chez des rats recevant de faibles doses de patuline, ces rsultats devront tre confirms sur le long terme car ils pourraient constituer la base dune rvaluation des doses de rfrence de la patuline.

Exposition de la population franaise

Une tude de la ration alimentaire totale (EAT) a t entreprise en 2000, afin de connatre le niveau de consommation et dexposition de la population gnrale franaise et de la population vgtarienne la patuline partir daliments "prts consommer" (Leblanc et al., 2005). La patuline a t analyse dans 20 chantillons de ptisseries aux pommes, de pommes fraches, de compotes, de jus de pomme et de cidres. Les rsultats montrent que plus de 80% des produits analyss prsentent des niveaux de contamination en patuline infrieurs la limite de dtection. L'exposition moyenne et des forts consommateurs (95me percentile) adultes et enfants de la population gnrale a t estime ainsi que celle la population vgtarienne (tableau 2). Tableau 2 : Estimation des apports alimentaires moyens et des forts consommateurs (p95) pour diffrents types de population en patuline issus de lEAT
Apport moyen (g/kg p.c./j 0,018 0,030 0,044 0,050 0,034 % d'individus Apport au % de la pouvant P95 DJTP fixe dpasser la 1 (g/kg p.c./j par le SCF DJMTP 0,057 14 0 0,106 26 0 0,100 25 0 0,120 30 0 0,090 22 0

Type de population Population gnrale Population vgtarienne (15 ans et +)


1

Adultes (15 ans et +) Enfants (3-14 ans) Ovolactovgtariens Lactovgtariens Vgtaliens

Le JECFA a fix une DJMTP de 0,4 g/kg p.c./j

A titre de comparaison, les donnes de contamination utilise dans la Tche scoop europenne37 ralise en 2002 (tableau 3) pour la population franaise conduisent des niveaux d'exposition plus faibles que ceux observs dans l'tude de l'alimentation totale (EAT). Les diffrences observes peuvent s'expliquer par des limites de dtection leves et la prise en compte dans ltude EAT de produits base de pomme (ptisseries, fruits frais). Cependant, ces niveaux sont du mme ordre de
36 37

JECFA : Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives Scoop report 3.2.8 (2002). Assessment of dietary intake of patulin by the population of EU Member States

187

grandeur lorsque l'on considre lestimation de lexposition pour l'ensemble de la population de l'Union europenne.

Tableau 3 : Exposition alimentaire de la population franaise et de l'Union europenne (UE) la patuline (g/kg p.c./j) issue des donnes de la tche Scoop
Exposition de la population franaise (g/kg p.c./j) Moyenne p95 0,001 0,006 0,005 0,023 0,005 0,014 0,013 0,049 Exposition de la population de l'UE (g/kg p.c./j) Moyenne p95 0,003 0,022 0,028 0,093 0,021 0,057 0,064 0,199

Type de population Adultes Enfants Adultes Seuls consommateurs Enfants Population

Les aliments contributeurs lexposition de la population franaise la patuline sont le jus de pomme, le cidre et les compotes. La population franaise semble moins expose que lensemble de la population europenne, notamment lItalie, o la population est la plus expose.

6.
6.1

Exposition animale la patuline


Effets sur la sant animale et transfert dans les produits animaux

Les donnes disponibles ne concernent que les ruminants Accidents rapports chez les ruminants Comme dj mentionn, de nombreuses moisissures produisant de la patuline ont t isoles de lalimentation des ruminants et notamment des ensilages. Dailleurs, des accidents symptomatologie nerveuse ont t observs chez des ruminants qui recevaient des aliments contamins et attribus la prsence de patuline (Moreau et Moreau, 1960), notamment la mort de vaches recevant de lorge malte ou de lensilage (Ciegler, 1977). Si des syndromes hmorragiques ont t aussi rapports chez des bovins nourris avec des ensilages de mauvaise qualit contenant de la patuline, les manifestations toxiques ont t plutt rares chez les ruminants alors que la prsence de moisissures productrices de patuline dans les ensilages est frquente. Action et devenir de la patuline dans le rumen La patuline a t initialement utilise pour ses proprits thrapeutiques et antimicrobiennes lgard de nombreux microorganismes (Madhyastha et al,. 1994), mais sa toxicit a limit son dveloppement mdical ou vtrinaire. Elle inhibe la croissance la fois des bactries gram positif et gram ngatif, ainsi que celle des protozoaires. Bacillus brevis semble particulirement sensible laction antibiotique de la patuline (Wouters et Speijers, 2003). La patuline possde galement une action cytotoxique lgard des protozoaires libres comme Tetrahymena pyriformis (ID50 = 0,32 g/ml) (Nishie et al., 1989). Bien quaucune tude spcifique nait t ralise sur des microorganismes isols du rumen, sa prsence dans les aliments consomms par le ruminant est susceptible davoir un effet ngatif sur lcosystme microbien ruminal. Plusieurs exprimentations ont t conduites in vitro pour mesurer leffet de la patuline sur la digestion et la production de mtabolites fermentaires dans le rumen. Escoula (1992) a montr que la patuline avait un effet ngatif sur la production dacides gras volatils, dactate en particulier, et sur la synthse de protines microbiennes mesure avec des doses variant de 20 300 g/ml. Tapia et al. (2002) ont fait un bilan des effets de la patuline dans le rumen grce lutilisation de rumens artificiels flux continu qui sont censs reproduire assez fidlement les processus fermentaires in vivo. Les auteurs ont montr que la digestion dune ration mixte compose de foin de luzerne (38%), densilage de mas (28%), de mas grain (27%), de tourteau de soja (5%) et dun mlange minral, tait diminue de 27 43% lorsque la concentration de patuline dans la ration passait de 30 90 mg/kg. La rduction de la production dacides gras volatils ntait significative (p<0,05) qu la dose de 90 mg/kg. Parmi les acides, seule la production dactate tait diminue alors que celles du butyrate et du valrate taient augmentes. Les flux dazote microbien ont t plus

188

faibles dans les fermenteurs recevant la patuline, indpendamment de la dose, alors que lefficacit de la synthse microbienne (g dazote microbien/kg de matire organique fermente) na t diminue significativement (p<0,05) qu la dose de 90 mg/kg. Morgavi et al. (2003) ont montr que la dgradation du foin de luzerne tait diminue significativement ds la dose de 25 g/ml de patuline dans des fermenteurs de type batch . Cet effet a augment rgulirement jusqu la dose de 50 g/ml et sest stabilis ensuite jusqu la dose de 100 g/ml. Les auteurs ont indiqu que la production dacides et de gaz diminuait rgulirement lorsque la dose de patuline augmentait. Au niveau des acides synthtiss au cours des fermentations, ils ont confirm que leffet ngatif de la patuline se manifestait principalement sur lactate, ce qui confirme leffet ngatif sur la cellulolyse ruminale rvl au cours de la digestion de la luzerne. Voie dlimination de la patuline chez le ruminant : transfert dans le lait La patuline est une molcule polaire de petite taille qui est de ce fait rapidement absorbe et mtabolise. Elle est donc prioritairement excrte dans lurine (voir toxicocintique ). Ces caractristiques montrent quelle ne devrait pas tre stocke dans les structures cellulaires lipophiles, et que son excrtion dans le lait devrait tre rduite. Aucune tude dmontre la prsence de patuline ou de ses mtabolites dans le lait. Par ailleurs, la toxicit chronique de la patuline chez les ruminants nest pas connue. Les intoxications aigus qui ont t dcrites chez la vache laitire sous forme de manifestations nerveuses ou de syndromes hmorragiques sont rares. Procds limitant les effets de la patuline dans le rumen La patuline est une molcule lectrophile qui exerce ses effets dltres en se liant par covalence aux groupements sulfhydryles SH des protines et du glutathion (Ciegler, 1977 ; Riley et Showker, 1991). Cette affinit au groupement SH peut tre utilise pour dtoxifier la patuline (Lindroth et von Wright, 1990). Dautres agents rducteurs comme lacide ascorbique ont pu inactiver la patuline (Fremy et al., 1995 ; Brackett et Marth, 1979). Morgavi et al. (2003) ont test leffet dtoxifiant de plusieurs agents rducteurs dans leur systme in vitro. Seuls les composs ayant un groupement thiol actif, comme la cystine ou le glutathion, ont pu dtoxifier la patuline dans le rumen. Le glutathion la concentration de 4 mM a totalement limin les effets ngatifs de la patuline utilise la concentration de 50 g/ml. La cystine a t moins efficace puisqu 4 mM elle na pas permis de retrouver totalement la production initiale dacides gras volatils. La cystine, qui est un dimre de la cystine frquemment rencontr dans les cellules vivantes, na eu aucun effet protecteur lgard de la patuline. Dautres agents rducteurs comme lacide ascorbique ou lacide frulique qui sont prsents dans les aliments du ruminant, nont pas permis de protger la population microbienne ruminale contre la patuline. En conclusion, les auteurs recommandent dajouter de la cystine, qui est un acide amin non essentiel, la ration des ruminants pour les prserver dune action dltre de la patuline.

6.2 Calcul de lexposition des espces animales Il nexiste pas de donnes pouvant permettre de calculer lexposition animale la patuline.

Rglementation

Dans le cadre du rglement 1881/2006/CE (abrogeant le rglement 466/2001/CE et ses modifications) portant fixation de teneurs maximales pour certains contaminants dans les denres alimentaires destines lhomme, des teneurs maximales ont t fixes pour la patuline. Les teneurs maximales dans les produits sont de : - 50 g/kg pour les jus de fruits (y compris ceux reconstitus base de concentrs), les nectars de fruits, les spiritueux et les cidres et autres boissons produites base de jus de pommes et pommes, - 25 g/kg pour les produits solides base de pommes (compotes, pures), - 10 g/kg pour les jus et produits base de morceaux de pomme et

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10 g/kg pour les aliments (autres que ceux prpars base de crales) destins au nourrisson et lenfant en bas ge.

Surveillance et contrle

Des plans de surveillance et de contrle sont raliss chaque anne par les services de l'Etat ( Direction Gnrale de la Concurrence, de la Consommation et de la Rpression des FraudesDGCCRF-) pour rechercher la patuline dans les aliments destins la consommation humaine, y compris les aliments pour nourrissons et enfants en bas-ge. Dans les cas de non-conformit, les actions correctives sont entreprises telles qu'interdiction de mise sur le march, retrait du march et saisie. Bien que les denres prleves au sein des catgories daliments rglementes soient de nature et dorigine variables selon les annes, il peut nanmoins tre dgag les grandes tendances de conformit suivantes : Les rsultats rvlent que les contaminations en patuline des jus de pomme, des cidres et apritifs base de pomme sont infrieures mais souvent proches de la limite rglementaire avec 6 15% de non conformit selon les annes et les produits. Concernant les compotes de pomme pour adultes et enfants en bas-ge, ainsi que les jus de pomme destins aux enfants en bas-ge, la teneur en patuline na pas pu tre quantifie dans plus de 85% des 56 chantillons (LOQ = 5 g/kg) et sont tous conformes la rglementation.

Conclusion et recommandations

La patuline est une mycotoxine susceptible dtre retrouve ltat de contaminant naturel dun grand nombre daliments dorigine vgtale notamment issus des fruits et particulirement la pomme. A ce titre, la patuline fait lobjet dune rglementation drastique pour tous les aliments de cette filire et spcifiqueent pour les jus et compotes de pomme destins aux enfants et aux personnes ges. Nanmoins, de grandes incertitudes existent quant au devenir de cette mycotoxine dont le suivi analytique est difficile dans les matrices biologiques. En effet, la liaison avec les groupements thiols des peptides et des protines interdit toute dtection ultrieure de la toxine, de mtabolites ou de ses composs daddition. Les tudes entreprises concernant la toxicit chronique de la patuline, peu nombreuses et relativement anciennes, ont surtout dmontr, doses moyennes, des dsordres intestinaux et des perturbations de la fonction rnale. Les symptmes nerveux suspects dtre associs lors daccidents dlevage ne sont pas rapports dans les tudes exprimentales. Ces mmes tudes ne nont jamais rvl un pouvoir cancrogne in vivo chez lanimal. Cest la raison pour laquelle cette toxine a t classe par le CIRC (1986) dans le groupe 3 des produits pour lesquels il est impossible de se prononcer quant la cancrognicit pour lhomme. Nanmoins, une tude rcente de toxicit subaigu entreprise chez le rat expos la patuline durant 90 jours, rapporte des perturbations des hormones strodes circulantes corrles des atteintes testiculaire et thyrodienne. Cette information mriterait confirmation en raison du souci actuel des toxicologues statuer sur le caractre perturbateur endocrinien de tout constituant ou contaminant alimentaire. L'exposition alimentaire de l'homme reste trs infrieure pour les enfants comme pour les populations vgtariennes la dose journalire maximale tolrable provisoire fixe en 1995 par le JECFA 0,4 g/kg p.c./j. La rglementation en vigueur pour la prsence de patuline dans les aliments drivs de la pomme peut apparatre comme particulirement protectrice au regard des niveaux dexposition observs. Nanmoins les plans de contrle de la rglementation sont maintenir. L'exposition alimentaire des animaux d'levage est envisageableblable chez les ruminants par la consommation des ensilages ou des carts de tri de pommes. Toutefois, le danger rel chez l'animal demeure mal valu, compte tenu de la mconnaissance de la toxicit et du devenir de cette toxine. Il serait souhaitable de mettre en place un plan de surveillance sur les aliments conservs par voie acide (ensilages de fourrages ou de grains, fourrages enrubanns).

Rfrences bibliographiques (voir document spcifique)

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chapitre 7

Les autres mycotoxines

coordination : Philippe Guerre et Virginie Hossen

Il existe plusieurs mycotoxines qui, sans tre largement rpandues, prsentent une importance pour les populations humaines et animales. Le tableau 1 illustre ces mycotoxines ainsi que les moisissures qui les produisent.

Tableau 1 : Mycotoxines et moisissures productrices associes ayant des impacts ponctuels sur la sant humaine et la sant animale Mycotoxines Principales moisissures productrices Toxines de Claviceps (dit ergot de Claviceps purpurea, C. paspali, C. seigle) africana, C. fusiformis Citrinine Mycotoxines pouvant tre retrouves dans Toxines dAlternaria les denres alimentaires et Acide cyclopiazonique les aliments pour animaux Aspergillus terreus, A. carneus, A. niveus Penicillium verrucosum , P. citrinum, P. expansum Alternaria alternata, Alternaria solani Aspergillus flavus, A. versicolor, A. tamarii Penicillium dont P. camembertii et P. cyclopium

Toxines trmorgnes produites par Penicillium roquefortii, P. crustosum, P. Penicillium et Aspergillus puberrelum Aspergillus clavatus, A. fumigatus Sporidesmines Pithomyces chartarum Mycotoxines principalement retrouves en alimentation animale Toxines de Stachybotrys Toxines dendophytes Phomopsines Strachybotrys chartarum Neotyphodium coenophialum, N. lolii Phomopsis leptostromiformis

Le tableau 2 illustre les mycotoxicoses animales (le nom des maladies que ces mycotoxines entranent), les substrats les plus frquemment vecteurs dans ces affections et le(s) pays qui est (sont) le(s) plus svrement touch(s) par la maladie.

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Tableau 2 : Mycotoxicoses animales, substrats et pays touchs et mycotoxines responsables Substrats les Pays le(s) plus frquemment plus touch(s) frquemment contamins Alcalodes Etats Unis , Afrique du Sud, Crales Ergotisme (clavines, Nouvelle Zlande, Australie, Gramines ergotamine) Europe Sporidesmines Fourrages en fin Nouvelle Zlande, Afrique du de cycle (Dactyle, Sud, Australie, France Ray Grass, et Eczma facial des parfois Trfle ruminants blanc) et dbris vgtaux au ras des ptures Stachybotryotoxines Foins, pailles et Pays dEurope de lEst (Hongrie Stachybotryotoxicose (trichothcnes ensilages mal surtout) macrocycliques) stocks Alcalodes Gramines Nouvelle Zlande, tats Unis Fescue foot (ergovaline) fourragres du disease = Boiteries genre ftuque lors de consommation (Festuca de ftuque arundinacea) Rye-grass stagger Alcalodes (lolitrme Gramines Nouvelle Zlande, tats Unis disease = B) fourragres du tremblements lors genre Ray Grass consommation de Rayanglais (Lolium Grass perenne) Phomopsines Plantes Australie fourragres de la Lupinose famille des lupins (Lupinus spp.) Mycotoxicoses observe chez lanimal Des cas de maladies rsultant de lingestion de ces mycotoxines ont dj t rapports en France, lexception de la lupinose. Ces intoxications sont donc connatre dans notre pays, mme si elles sont considres comme exceptionnelles. Ce caractre exceptionnel est sans doute une des raisons pour lesquelles peu de donnes sont disponibles sur la prvalence naturelle de ces mycotoxines et la contamination des substrats incrimins. Mycotoxines

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1. Les toxines de Claviceps

La maladie de lergot ou ergotisme , est plus spcifiquement li lingestion dergot du seigle (C. purpurea). Celui-ci est connu pour tre responsable des feux de Saint Antoine ou mal des ardents observs chez lHomme surtout du 8me au 16me sicle en Europe o cette affection provoqua la mort de centaines de milliers de personnes. Les temps ont chang ensuite et les animaux sont aujourdhui les principales victimes de lergot. Les symptmes mais aussi les impacts de cette affection sont variables selon lespce de Claviceps contaminant la denre consomme. Les espces les plus frquemment rencontres sont : Claviceps purpurea, Claviceps paspali et Claviceps africana.

1.1. Prsentation et biologie Le genre Claviceps attaque les inflorescences ou pis de la plupart des gramines et forme des sclrotes ou ergots (Cole et al., 1977). Ces derniers sont des amas mycliens durs, dont les formes, dimensions et couleurs varient selon les espces et les gramines atteintes. Ils remplacent la graine et contiennent des alcalodes, toxines responsables des maladies observes aussi bien chez lHomme que chez lanimal (EHC 105). Dans les rgions tempres comme la France, cest lespce Claviceps purpurea qui est la plus souvent rencontre et contamine les gramines cralires : seigle principalement mais aussi bl, orge et avoine et de nombreuses espces de gramines fourragres et gazons cultivs en France (ray-grass, ftuque, dactyle, flole). Les sclrotes de cette espce sont allongs, noirs lextrieur, blancs violacs lintrieur. Dans certaines crales, la taille des sclrotes peut tre jusqu' 10 fois plus grande que celle des grains qu'ils remplacent: ils sont facilement reprables dans le grain non nettoy. Au contraire dans les gramines fourragres, les sclrotes restent petits et lancs. Claviceps paspali possde la mme biologie que C. purpurea mais ne contamine que les gramines du genre Paspalum. Ses sclrotes diffrent de ceux de C. purpurea ; ils sont globuleux, de petite taille et de teinte beige clair ou rose. Il pose problme dans les rgions chaudes des Etats-Unis, dAfrique du Sud, de Nouvelle Zlande et dAustralie o des cas apparaissent frquemment mais de faon sporadique. Il a t signal pour la premire fois en Europe, en Italie, au Portugal et en Yougoslavie dans les annes 1950. En France un cas a t rapport, en 1991, en Camargue (Raynal, 1992). Enfin, et depuis les annes 1990, la contamination du sorgho par C. africana, sobserve dans tous les pays o cette crale est cultive. En 1997, C. africana a t identifi en Afrique mais aussi, en Asie du Sud en Australie, au Mexique et aux Etats-Unis alors quon pensait que sa prvalence tait uniquement africaine. 1.2. Facteurs favorisant le dveloppement Il sagit surtout des conditions climatiques. La formation dergot est favorise par des tempratures voisines de 20 C et par une humidit relative de 100% (Lorenz, 1979). Les printemps frais et humides favorisent la germination des sclrotes (Duval, 1994). Les conditions agronomiques, comme un faible apport d'engrais, peuvent retarder la maturit des cultures et contribuer la formation de fleurs plus ouvertes, donc plus vulnrables l'infection (Pearse, 2006).

1.3. Proprits physico-chimiques et mthodes danalyse Lergoline, molcule ttracyclique illustre en figure 1, constitue la structure de base de tous les alcalodes de lergot. La quantit dalcalodes contenue dans une sclrote varie de 0,01 0,5 % (Lorenz, 1979).

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Figure 1 : Structure e chimique de d lergoline e Plus de 40 alcalodes ont t isols i des sclrotes s de Claviceps. Ils peuvent tre diviss s en trois classes (Lorenz, 197 79): - les clavines - les ergopept tides (ergota amine par ex xemple, synthtise ga alement par les endophy ytes), qui s sont des dr rivs de lacid de lysergique e - les drivs de d lacide iso olysergique (e ergotaminine e par exempl le). C. africa ana produit majoritaireme m ent des alcalodes de la classe des clavines c et d de la dihydro oergosine (Bailey et e al., 1999). C. purpurea a synthtise majoritairement des ergo opeptides tels que lergot tamine et lergocry ystine. Enfin, , C. paspali synthtise des d clavines s mais aussi des toxine es trmorgn nes de la classe des indoles diterpnodes s (CAST, 200 03). Il sagit de d la paspalinine et des paspalitrme es A et B (Lacey et e al., 1991). La plupa art des alcalo odes de lerg got forme de es cristaux in ncolores solu ubles dans d de nombreux x solvants organiqu ues, et trs peu soluble es voire ins solubles en solution aqu ueuse. Ces alcalodes sont s trs instables s aux UV et la chale eur. Leur tox xicit diminu ue au cours s de stockag ge prolong. . Ils sont extrmement sensibles loxyda ation photolyt tique, lhydra atation et lp pimrisation du cycle erg golne en position C8, qui peu ut se produir re aussi bien en conditi ions acides que basique es (Komarov va et al., 2001). Bien que la rglementation soit t uniquemen nt fonde su ur la quantit t relative d de sclrotes dans un prlvem ment de grains (qui peut tre value e par triage manuel ou par p flottaison n en solution n saline ), cest la nature n et la quantit q en alcalodes a qu ui lui confre e sa toxicit (Bailey ( et al. ., 1999) or la a quantit totale da alcalodes nest pas prop portionnelle au a nombre de e sclrotes. Il existe de nombreu uses procdu ures dextrac ction, isolement et identif fication des alcalodes dergot d de ps (Porter et al., 1995). Les L techniques analytiques usuelles telles que la a CCM38, lHPLC39 ou Clavicep la GC/MS40 ont t mises m en u uvre aprs extraction e des s alcalodes par des solv vants organiques tels que le benzne b (Ko omarova et al a ., 2001, Po orter,1995). Des mthod des spcifiqu ues propes chaque matrice donne d ont t mises en n place, notamment pour lanalyse de es alcalodes de C. purpu urea dans les cra ales, les pro oduits base e de crale es et le lait, mais m aussi dans d le plasm ma humain et e animal (Mantle, 1996). dvelopp p et perme et lanalyse spcifique de d la dihydr roergosine, alcalode Un test ELISA a t on du sorgho o par C. afric cana (Molloy et al., 2003) ). caractristique de la contaminatio Dautres s mthodes ont o galeme ent t mise es en uvre e ; tel, le bioessai sur co obaye ralis afin de mettre en e vidence la l prsence de toxines trmorignes s synthtise es aussi par C. paspali (M Mantle et al., 1977 7).

1.4. Proprits toxic cologiques Les alca alodes de C. C purpurea tels t que lerg gotamine ou lergomtrin ne, provoque ent la stimula ation des muscles lisses en in nhibant les rcepteurs r et adrne ergiques. Ce ela entraine une vasoco onstriction des tissu us priphriq ques. Le flux x sanguin ch hute alors br rutalement do d une gan ngrne frqu uente des extrmit s. De plus, les ergopep ptides, en ag gissant comme des ago onistes de la dopamine, induisent une diminution du ta aux de prolac ctine srique e. Ceci entra ane diffrent ts effets (cf c chapitre sur la Rye38 39

Chrom matographie su ur couche minc ce Chrom matographie liq quide haute pe erformance 40 Chrom matographie ga azeuse couple e une spectro omtrie de ma asse 194

grass stagger disease et la Fescue foot disease), notamment une agalactie et une diminution du gain de poids corporel chez lanimal nouveau-n (Environmental Health Criteria 105, OMS, 1990). Les alcalodes trmorgnes de C. paspali se fixeraient au niveau des canaux chlorures des rcepteurs GABAA du systme nerveux central, inhibant de ce fait leur fonctionnement (Grant et al., 1998). Linhibition des canaux chlorures en modifiant le potentiel membranaire rendrait les cellules plus excitables ce qui pourrait expliquer les convulsions observes. Exprimentalement, des tremblements svres sont observs sur des bovins ayant ingr 1g dergot/kg p.c./j pendant au moins 4 jours (Mantle et al., 1977). Les trois groupes dalcalodes synthtiss par le genre Claviceps entranent des effets toxiques sur les fonctions de reproduction chez des visons : lingestion de 3 mg/kg p.c. provoque un allongement de la dure de gestation et une diminution du taux de prolactine srique (Sharma et al.,, 2002). Chez les animaux gestants, certains ergopeptides comme lergotamine peuvent galement activer la contraction des muscles utrins et provoquer un avortement (Komarova et al., 2001). Peu dtudes ont t menes concernant les effets de la dihydroergosine, principal alcalode synthtis par C. africana (>90 % des alcalodes totaux). Cette toxine cause des pertes de production significatives ds 1 mg/kg dans lalimentation animale (Molloy et al., 2003). Sur de jeunes porcs, cette toxine, ingre durant 28 jours 9 mg dalcalodes/kg daliment (0,6% du poids en ergot), diminue le taux de prolactine srique (Blaney et al., 2000a). Toutefois, 15 mg/kg p.c../j de dihydroergosine apports par un rgime contenant 50 % dergot de C. africana ne semblent pas induire deffets chez la souris (Bandyopadhyay et al., 1998 ; Blaney et al., 2000a,b,c). Il semblerait que les alcalodes dshydrogns soient moins actifs que les alcalodes parents (Blaney et al., 2000a,b,c). Les diffrences deffets observs exprimentalement et sur le terrain pourraient donc tre lies une diffrence de mtabolisme entre les monogastriques et les ruminants. Enfin, lagroclavine, synthtise par C. paspali et dans une moindre mesure par C. africana, augmente lactivit NK (Natural Killer) lors de tests in vitro mais aussi in vivo sur souris. Ceci suggre un effet immunomodulateur de cette toxine (Starec et al., 2001). Cet effet pourrait tre li laction dopaminergique de lagroclavine puisque ladministration dhalopridol (qui inhibe les rcepteurs la dopamine), provoque une diminution de lactivit NK.

1.5 Ergot et effet sur la sant humaine La maladie de lergot ou ergotisme , est connu pour tre responsable des feux de Saint Antoine ou mal des ardents observs chez lHomme depuis le Moyen Age en Europe o cette affection provoqua la mort de centaines de milliers de personnes du 8me au 16me sicle. Mais cest depuis le XIXe sicle quune relation a t faite entre cette maladie et lingestion de sclrotes produits par le genre Claviceps contenant des mycotoxines de type alcalodes pour en faire une mycotoxicose aigu et depuis le XXe sicle que des alcalodes responsables contenus dans lergot ont t identifis. Les maladies lies la prsence dergot apparaissent surtout lautomne. Les symptmes comprennent un ralentissement de la circulation sanguine, qui provoque l'alternance d'une sensation de grande chaleur et de grand froid, puis de la gangrne aux extrmits du corps. Des convulsions nerveuses se produisent parfois pouvant entraner la mort. Mme si ce type de mycotoxicoses est devenu rare, des cas dintoxications aigus survenus au XXe sicle sont rapports : en France un pisode se serait produit en 1951 Pont Saint-Esprit, dans le Gard, aprs la consommation de pain, mais qui est rest non confirm. Les derniers pisodes mentionns dans la littrature se sont produits : - Dune part en Ethiopie en 1978 suite la consommation dun mlange de crales contenant 0,75% dergot de C. purpurea , 93 personnes ont t intoxiques dont 47 moururent. Lalcalode ergomtrine fut dtecte dans les sclrotes (IPCS, 1990) - Dautre part dans un village en Inde en 1975 suite la consommation de millet contenant 1,517,4% dergot de C. fusiformis. Le groupe des alcalodes clavines fut dtect dans les sclrotes une teneur totale de 15-199 mg/kg. Dans un village voisin o la population a consomm du millet contenant 0,1-3,8% dergot avec une teneur en mme type dalcalodes de 15-26 mg/kg, aucun cas dintoxication na t rapport(IPCS, 1990). LAESA/EFSA, dans son avis davril 2005 (EFSA, 2005), indique qu aujourd'hui, les donnes sur les proprits toxicologiques des alcalodes de l'ergot pris individuellement sont trop limites pour

195

slectionner des marqueurs toxiniques individuels permettant de surveiller l'tendue de la contamination.

1.6. Ergot et effet sur la sant animale Selon les espces animales, limportance des effets est variable, quelle que soit lespce de Claviceps. Une diminution de la prise alimentaire associe une rduction de gain de poids corporel sont les symptmes communs. Les porcins, ovins, bovins et caprins sont les plus exposs mais les volailles, les chevaux, voire les carnivores domestiques peuvent tre affects. 1.6.1 Ergotisme du C. purpurea On distingue deux formes dintoxications lies la consommation daliments contamins par lergot de C. purpurea. La forme convulsive se caractrise par hyperexcitabilit, titubations, spasmes, ttanies, paralysies, suivis parfois de la mort. Elle sobserve le plus souvent lors dintoxications aigus. La forme gangreneuse dont les signes (poil terne, gangrne sche ou humide) apparaissent dabord aux extrmits du corps, sobserve lors dune exposition chronique aux toxines. La vasoconstriction entraine une ncrose des tissus, extrmits des pattes, oreilles et queue, qui peuvent tomber dans certains cas. Ceci sobserve dautant plus que la temprature est basse. Chez les porcins, dans les cas les plus graves, on rapporte un arrt de lactation conduisant une mortalit leve des porcelets. Chez les bovins, la lactation est diminue, une enflure des pieds et une boiterie peuvent tre les premiers signes visibles de toxicoses. En outre, les animaux prsentent une diarrhe, et une hypersalivation excessive accompagne de soif intense. Chez les ovins, des difficults respiratoires, une hyper-salivation, des diarrhes voire des saignements digestifs sont rapports. Le taux de gestation est galement diminu. Chez les volailles, on observe une diminution de la croissance et du taux de ponte ainsi quune forte mortalit des poussins. Une gangrne de la crte, de la langue et du bec peut galement se produire. Chez les chevaux, les intoxications sont rares mais souvent aigus. Les principales manifestations observes sont agalactie et morti-natalit. Deux pisodes ont t dcrits au Brsil (Riet-Correa et al., 1988 ; Copetti et al., 2001). Dans lpisode le plus rcent, un groupe dune douzaine de juments gestantes a consomm un lot davoine contamin par des sclrotes de C. purpurea hauteur de 0,22% en masse des grains prsents. Le signe le plus vident fut une absence de prparation de la mamelle suivi dagalactie. Les juments ont donn naissance des poulains faibles, dpourvus de rflexe de succion. Les poulains sont dcds en quelques heures. Mme les carnivores domestiques peuvent tre concerns. Brosig (1993) rapporte un cas dergotisme chez un chat ayant mch des gramines (Ray grass anglais) contamines par C. purpurea. Ce chat a prsent un syndrome gangreneux (queue, nez). Aprs euthanasie, lautopsie a rvl la prsence dun sclrote rest coinc entre les prmolaires. 1.6.2 Ergotisme du C. paspali Les toxicoses dues C. paspali sont plus frquentes chez les bovins que chez les ovins et les chevaux (Mantle et al., 1977). Le btail consommant rgulirement des gramines du genre Paspalum infectes est atteint de douleurs abdominales, de diarrhes, se nourrit peu et cesse de produire du lait. Les symptmes gangreneux semblent absents (Raynal, 1992). Les intoxications aigus induisent des degrs varis de tremblements, dhyperexcitabilit et dataxie. Dans les cas dintoxications sub-aigus, des convulsions peuvent entraner la mort de lanimal, le plus souvent accidentellement (Selala et al., 1991). Il semblerait que les altrations nerveuses soient rversibles en cas darrt dexposition (Botha, et al., 1996 ; Grant et al., 1998). 1.6.3 Ergotisme du C. africana Lergot du sorgho d C. africana peut avoir des effets variables sur les performances zootechniques des animaux intoxiqus. Aux Etats-Unis, les quantits dalcalodes retrouves dans le sorgho sont

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assez faibles et nont jamais entran deffets nfastes sur les animaux consommateurs, contrairement lAustralie, do proviennent les cas dcrits ci-aprs (Stack, 2000). Chez les porcins et le btail laitier, la consommation de sorgho contamin par des ergots de C. africana entrane un refus alimentaire et une agalactie. Ces symptmes saccompagnent dune forte diminution de prolactine srique, dont limportance est corrle la concentration dalcalodes dergot dans la ration. Des diarrhes sont galement rapportes dans ces deux espces. Chez les porcins, en ce qui concerne lagalactie, le niveau de tolrance semble se situer entre 1 et 5 mg dalcalodes par kilogramme daliment pendant 28 jours. Chez le btail laitier, un niveau de 0,2 mg/kg p.c. permet dobserver ce mme effet (Blaney et al., 2000a,b,c). Chez les volailles, des difficults respiratoires et des diarrhes, pouvant entraner la mort, sont rapportes pour des niveaux de contamination allant de 2,5 5 % de sclrotes dans la ration. Avec des taux de 1,25 %, seule une faible diminution de la croissance et de la prise alimentaire est observe (Blaney et al., 2000a,b,c). 1.6.4 Autres effets dus lergotisme Les pertes conomiques occasionnes par les diffrentes formes de lergotisme ne peuvent tre ngliges. Aux pertes directes lies une dvalorisation de la qualit de la rcolte sajoutent les pertes lies une altration de la production (Bacon et al., 1982, Bandyopadhyay et al., 1998). A titre dexemple, un cas a t rapport en 2000 en Australie, dans lequel il est mentionn que la production laitire, aprs consommation de grain de sorgho contenant 17% dergot de C. africana, a brutalement diminu de 850 650 L/jour sur lensemble du troupeau de bovins affect. De mme, un troupeau de bovins laitiers recevant une alimentation contenant du seigle ergot 0,15% par C. purpurea pendant 10 jours, a vu sa production laitire diminuer de 16,7 12,4 L/jour (Blaney et al., 2000a,b,c). Ainsi, lergot coterait chaque anne 4 millions deuros lindustrie cralire (Bandyopadhyay et al., 1998).

1.6.5 Persistance ltat rsiduel Bien quaucune donne spcifique ne soit disponible concernant le transfert des alcalodes de lergot dans les tissus, ces composs sont retrouvs dans le lait danimaux consommant des gramines contamines. En effet, chez les porcelets allaits par des truies exposes, on observe parfois une gangrne des extrmits des oreilles et de la queue (Duval, 1994). Par ailleurs, en tant qualcalodes, ces molcules prsentent les caractristiques physico-chimiques (composs basiques dont la forme non ionise est liposoluble) trs favorables leur passage dans le lait (Guerre, 2000).

1.7 Rglementation En Europe, en alimentation humaine, comme en alimentation animale, les mycotoxines de Claviceps sont rglementes indirectement par une limite sur la proportion pondrale dergot. En alimentation humaine, cette limite est de 0,5 g par kg de bl tendre et de bl dur et uniquement pour les lots destins lintervention41 (rglement europen 824/2000 modifi). En alimentation animale, la directive europenne 2002/32 et larrt franais du 12 janvier 2001 limitent 1 g dergot par kg daliment pour animaux contenant des crales non moulues. En Australie, face limportance croissante de lergot du sorgho, les autorits (Queensland Stockffod Regulations) ont introduit en octobre 1997, une valeur limite de 0,3% dergot dans le sorgho et ses drivs en alimentation animale (Blaney et al., 2001). Cette valeur pourrait tre toutefois modifie au regard de lavance des recherches concernant les alcalodes produits par cette espce de Claviceps et tre prise en compte lors dimportation de sorgho. Au Canada, des seuils en ergot tablis par la Commission Canadienne des Grains (CCG) dans les crales sont aussi exprims en pourcentage du poids des ergots par rapport au poids net de l'chantillon: ils sont 0,04%-0,05% pour la plupart des crales destines la consommation humaine. Les crales sont dclasses pour lalimentation animale pour une valeur comprise entre ces taux et celui de 0,10%, au del duquel elles sont interdites aussi pour lalimentation animale.
41

intervention = exportation de crales dcide par les autorits europennes avec aide financire permettant au lot dtre commercialisable sur le march mondial un cours moins cher que le cours du march intrieur 197

Conclusion Les champignons du genre Claviceps peuvent entraner la formation dergots sur toutes les gramines. Leur prsence diminue les rendements des crales et la valeur nutritive du grain et entrane des risques pour la sant humaine et animale. Les problmes dergotisme, aussi bien convulsif que gangrneux, surviennent chez des animaux consommant librement des aliments contamins au pturage ou qui des crales non contrles sont fournies. Chez lhomme, les alcalodes de C. purpurea ne semblent plus constituer un risque sanitaire majeur pour la sant, tant donn que la problmatique est bien connue et que loccurrence dune contamination au champ est bien visible et quun tri slectif peut soprer. En Europe, loccurrence de lergot de C. purpurea est rglemente en alimentations humaine et animale mais de manire indirecte puisque base sur une limite de proportion pondrale en ergot. Les donnes sur les proprits toxicologiques des alcalodes de l'ergot pris individuellement restent encore limites. Nanmoins au regard de lvolution la fois des pratiques culturales visant diminuer les intrants (engrais et/ou traitements fongicides), et des conditions climatiques, favorables la survenue dpisodes de contamination par le genre Claviceps, linformation auprs des producteurs de crales et la surveillance par les autorits comptentes devraient tre renforces. De plus la rglementation actuelle pour lalimentation humaine concerne le seul bl et devrait voluer pour sappliquer toutes les crales, et aprs acquisition des connaissances toxicologiques sur les toxines, prendre en compte la teneur en quelques alcalodes au lieu de la teneur pondrale dergot dans un lot de crales ou daliment.

2. La citrinine La citrinine a t dcrite pour la premire fois en 1931 (Phillips et al., 1980). Cette mycotoxine, produite par diffrentes espces de Penicillium (P. citrinum, P. verrucosum coproducteur dOTA associe et P. expansum coproducteur de patuline associe) et dAspergillus (A. terreus, A. carneus, A. niveus) est susceptible de contaminer certaines denres alimentaires. Elle a t retrouve dans du mas, du riz, de lorge, de lavoine, du seigle, du bl, des noix, des arachides, des graines de tournesol, des fruits secs, du jus de pomme, des produits secs de salaisonnerie et du fromage (IARC monographs, 1986). Elle a galement t isole despces de ferments fongiques du genre Monascus utiliss des fins industrielles pour produire un colorant rouge alimentaire et couramment utilis en Asie (Bennett et al., 2003 ; Blanc et al., 1999 ; Sabater-Vilar et al., 1999). La citrinine, au mme titre que lOTA, est suspecte dtre lun des facteurs impliqus, dans ltiologie de la nphropathie endmique des Balkans chez lHomme et dans les nphropathies porcine et aviaire. Effectivement, la citrinine est connue pour tre nphrotoxique chez toutes les espces animales testes, mme si des lsions dautres organes ont pu tre observes. Bien que la citrinine soit rgulirement associe aux aliments, son impact sur la sant humaine et celle des animaux dlevage reste mconnu (Bennett et al., 2003).

2.1

Facteurs influenant la teneur en citrinine dans les denres

Une tude a t mene afin de dterminer si les souches de Penicillium synthtisant de la citrinine en culture taient capables de produire galement ces toxines sur du fromage. Les rsultats de cette tude montrent quune contamination accidentelle du fromage par Penicillium citrinum et P. expansum conduit la synthse de citrinine lors dun stockage 20 C, mais pas 4 C. La toxine serait stable dans ce milieu, plus de 70% du contenu initial en citrinine est encore prsent dans le fromage de chvre utilis dans ltude aprs 8 jours de stockage (Bailly et al., 2002). Une autre tude permet de mettre en vidence linfluence de lactivit en eau (aw) sur la croissance de Penicillium citrinum et laccumulation de citrinine dans le bl. La citrinine nest pas dtecte pour une aw infrieure 0,8. En revanche, quand law augmente la citrinine est produite plus prcocement et des teneurs plus leves (on passe dun niveau de production de 65 g/kg pour une aw de 0,81 22 mg/kg pour une aw de 0,885) (Comerio et al., 1998).

198

La temprature optimale de croissance de Penicillium expansum est de 25C, il ne peut plus se dvelopper au del de 37C. Les spores peuvent infecter les pommes et germer mme lors dun stockage 0C. En milieu liquide, 38 % des souches de P. expansum produisent de la citrinine des taux allant de 0,07 9 mg/kg (Pepeljnjak et al., 2002).

2.2

Proprits physico-chimiques de la citrinine et mthodes danalyse

La citrinine (C13-H14-O5) est un benzopyrane phnolique acide de poids molculaire 250, rpondant la structure 3,4-dihydro-8-hydroxy-3,4,5-trimthyl-6H-6-oxobenzo(c)pyran-7-acide carboxylique. La figure 2 ci-dessous illustre sa structure molculaire (IARC monographs, 1986).

Figure 2 : structure chimique de la citrinine (C13-H14-O5) Caractrise par un point de fusion 172C, cette mycotoxine est relativement insoluble dans leau mais elle est totalement soluble dans la plupart des solvants organiques tels que le mthanol, lthanol et lactonitrile (Betina, 1984). La citrinine est thermolabile en solution acide ou basique. Elle se lie facilement aux protines. Son instabilit relative implique des protocoles dextraction complexes (Harwig et al., 1977). Diffrentes mthodes danalyse sont utilises afin de dtecter la citrinine dans les denres alimentaires. Une mthode rapide de multidtection par CCM permet de dtecter des concentrations minimales en patuline et en citrinine de 120 130 et 15 20 g/kg respectivement (Martins et al., 2002). Des techniques immunologiques par ELISA ont t galement dveloppes et sont caractrises par une bonne sensibilit (Abramson et al., 1995). LHPLC permet destimer les teneurs en citrinine dans les crales, les fluides biologiques (urine et bile) et les milieux de fermentation (Abramson et al., 1995). Il faut noter que lefficacit des mthodes HPLC dpend tout particulirement de ltape dextraction qui ne doit pas dgrader le compos. La dtection seffectue en UV 254 ou 366 nm (Betina, 1984). Une limite de dtection de lordre de 10 g/kg est ainsi obtenue dans les crales. Une mthode semi-quantitative fluorimtrique a galement t mise au point pour analyser la citrinine produite par des cultures fongiques isoles de fromage (Vasquez et al., 1997).

2.3 Proprits toxicologiques de la citrinine Lorgane cible de la citrinine est le rein. Toutefois, lors dexposition des taux levs, des lsions hpatiques sous forme dinfiltration lipidique ont t observes (Braunberg et al., 1994a). 2.3.1 Mcanisme daction de la citrinine : Des tudes utilisant des cellules rnales de hamsters et des cellules hpatiques de rats ont permis de dterminer le mcanisme daction de la citrinine. Cette mycotoxine est capable de pntrer dans les mitochondries en modifiant la fluidit membranaire puis dinterfrer avec le systme de transport dlectrons mais aussi avec les dfenses enzymatiques des cellules du fait de linhibition de la glutathion rductase et de la transhydrognase. De ce fait, la toxine provoque une augmentation de la formation despces ractives de loxygne, notamment danion superoxyde. La respiration cellulaire est inhibe par la toxine qui est donc susceptible dentraner une ncrose cellulaire par un mcanisme de stress oxydatif (Ribeiro et al., 1997). Enfin, une tude mene sur explants tissulaires de cortex rnal de porc et sur cellules en culture (ligne V79) a montr que la citrinine est capable dinhiber la

199

synthse dARN, surtout les ARNr (ds la concentration de 200 M) de faon dose- et tempsdpendante, mais aussi les synthses dADN et de protines (Braunberg et al., 1994a,b; Wasternack et al., 1992). Dautres effets de la citrinine ont t rapports. Par administration intra-pritonale la dose de 15 35 mg de citrinine/kg pc des souris la toxine provoque une diminution de lutilisation du glucose, une inhibition de lactivit de laniline hydroxylase hpatique et une augmentation du taux de cytochrome P450 (Braunberg et al., 1994a). 2.3.2 Toxicocintique : Il semblerait que la citrinine (25-50 mg/kg pc) soit faiblement absorbe lors de son administration par voie orale. Cette absorption se ferait au niveau du tractus gastro-intestinal chez le rat, voire ds la muqueuse buccale chez le chat (IARC monographs, 1986). Une tude dcrit le devenir dune dose unique de 3 mg/kg pc de citrinine marque au 14C administre par voie intra-veineuse chez le rat. Trente minutes aprs son administration, 14,7 et 5,6 % de la radioactivit sont respectivement distribus dans le foie et dans les reins. Aprs 6 heures, ces valeurs sont respectivement 7,5 % et 4,7 %. La concentration plasmatique en 14C est de 9,2 % aprs 30 minutes et 4,7 % aprs 6 heures. Aprs 24 heures, environ 80 % de la radioactivit est retrouve dans lurine et les fces (Phillips et al., 1979). Deux phases dlimination successives ont t dtermines : elles sont caractrises par des demi-vies de 2,6h et 14,9h. Aprs administration sous-cutane de 35 mg/kg pc de citrinine 14C des rats femelles CD-1 Charles River au 12me jour de gestation, une limination biphasique a galement t observe avec des demivies de 2h et 40h. Cette tude a permis de montrer que la citrinine 14C traverse la barrire placentaire (IARC monographs, 1986; Reddy et al., 1982b). Enfin, la citrinine serait fortement fixe aux protines plasmatiques, cette fixation tant saturable. Dans une tude in vitro, 95 % de la toxine serait fix pour une concentration de 1 mg/100 ml, ce taux de liaison diminuant 82 % de liaison pour 5 mg/100 ml (Phillips et al., 1980).

2.3.3 Toxicit gnrale Toxicit aigu : La citrinine est nphrotoxique chez toutes les espces animales mais sa toxicit aigu varie en fonction de lespce teste : la DL50 par voie orale chez le rat est de 50 mg/kg pc, chez le canard de 57 mg/kg pc, chez le poulet de 95 mg/kg pc et chez le lapin de 134 mg/kg pc. Lexamen ncropsique faisant suite ladministration de doses ltales de citrinine des lapins, des cobayes, des rats et des porcs rvle une augmentation du volume des reins et une ncrose tubulaire. Ces effets dpendent de la dose et de la dure dexposition (Betina, 1984). Une mortalit voisine de 30% avait galement t rapporte au cours de ltude de toxicocintique de Phillips et al. (1979) lors dadministration de 50 mg/kg pc de citrinine par voie intra-pritonale des rats. Parmi les survivants, aprs un dlai de 4 jours, deux groupes ont pu tre identifis. Certains taient atteints de protinurie et de glucosurie tandis que pour dautres les effets nphrotoxiques de la citrinine avaient cess dans ce mme laps de temps (Phillips et al., 1979). On peut ainsi supposer que la sensibilit individuelle joue un rle dans limportance des effets toxiques de la citrinine. Toxicit chronique : De faibles doses de citrinine (0,02 mg/kg p.c.) administres par voie intra-gastrique des porcs pendant 57 jours nont pas entran deffets cliniques ni de lsions histologiques. La concentration plasmatique moyenne en citrinine chez ces porcs a t dose en fin dtude : elle est de 0,11 mg/L (Keblys, 2004 ; Pepeljnjak et al., 2002). 2.3.4 Toxicit spcifique : Nphrotoxicit : Chez le chien de race Beagle, une dose de citrinine de 10 mg/kg pc entrane des lsions rnales au niveau des tubules proximaux et distaux. Chez le rat, ladministration dune dose de citrinine de 50 mg/kg pc induit des dommages au niveau des cellules pithliales des tubules proximaux.

200

Ces dommages des tubules proximaux se traduisent par une disparition de la bordure en brosse, une rarfaction cytoplasmique, une condensation mitochondriale ainsi quune azotmie, une acidose, une hypokalimie, une glycosurie, une augmentation de la cratinine srique et une diminution de sa clairance chez le lapin pour des doses de 67 et 130 mg/kg p.c. (Pfohl Leszkowicz et al., 2002). Une diminution de la clairance de linuline a galement t mise en vidence chez des rats ayant reu 5 et 50 mg/kg pc de citrinine par voie intra-pritonale (Phillips et al., 1980). Cytotoxicit : Le test de cytotoxicit cellulaire utilisant le MTT montre que la citrinine est toxique pour une concentration suprieure 50 g/ml sur ligne cellulaire SK. Le test dexclusion au bleu trypan indique que la concentration en citrinine permettant un taux de survie de 90 % des cellules est de 60 M aprs 6h dincubation (Pfeiffer et al., 1998). Immunotoxicit : Une exposition de forte doses de citrinine provoque une lymphopnie mais galement une stimulation des rponses contre les antignes (Sharma et al., 1992). Une seconde tude in vitro mettant en uvre un test de prolifration lymphocytaire de porc a permis de montrer que la citrinine entrane bien une inhibition de la prolifration, mettant en vidence un effet immunosuppresseur de la toxine : lIC50 estim est de 10 mg/L. Cette valeur correspond celle obtenue lors de linhibition de production des interfrons gamma par des lymphocytes T humains en culture (IC50 = 8,3 mg/L) (Wichmann et al., 2002). Il faut noter que ces valeurs sont 100 fois plus leves que la concentration plasmatique moyenne de 0,11 mg/L obtenue chez le porc aprs administration intra-gastrique de 0,02 mg/kg pc de citrinine pendant 57 jours (Keblys, 2004). Reprotoxicit: Chez la souris, la citrinine est embryotoxique et ftotoxique aprs injection de doses maternotoxiques. Chez le rat, elle induit des effets similaires et de fortes doses sont galement tratognes (Reddy et al., 1982a). La citrinine est retrouve inchange dans des ftus de rats dont la mre avait reu de la toxine radiomarque, ce qui suggre que les effets embryo et ftotoxiques de la citrinine sont dus au compos parent et non un de ses mtabolites (Reddy et al., 1982b). La citrinine dtermine galement des effets tratognes sur embryons de poulet avec une malformation des extrmits et du bec, une exencphalie et une exophtalmie. La relation dose effet est linaire (Ciegler, et al., 1977). Une tude ancienne montre que le niveau de dose de citrinine entranant une embryotoxicit chez le poulet stend de 1 10 g par uf embryonn (Vesel et al., 1983). Gnotoxicit: Des rsultats aussi bien positifs que ngatifs ont t obtenus lors du rec-assay sur Bacillus subtilis. La citrinine nest pas mutagne chez Salmonella typhimurium (souches TA98, TA100, TA1535, TA1538 et TA97) en absence ou en prsence dun systme dactivation mtabolique. Elle ninduit pas de recombinaisons chez Saccharomyces cerevisiae et le test in vitro de rparation non programme de lADN sur cellules de mammifres est ngatif. Des aberrations chromosomiques structurales ont t rapportes sur cellules de hamster V79 aprs activation mtabolique (IARC monographs, 1986). Une tude de Pfeiffer et al. en 1998 a permis de mettre en vidence le potentiel aneuplodogne dosedpendant de la citrinine sur ce mme type cellulaire car des concentrations ninduisant pas de cytotoxicit, larrt de mitose et la prsence de chromatides surs ont t observs. Le mcanisme de laneuplodognicit de la toxine est encore mconnu mais il semblerait que la citrinine interagisse de faon non covalente avec les protines ou dautres constituants des microtubules. Sans activation mtabolique, la citrinine nest pas considre comme clastogne car elle ne provoque pas lapparition de micronoyaux contenant des fragments non centrs reconnus par coloration de CREST (Pfeiffer et al., 1998). Pour de fortes concentrations, la citrinine induit des cassures simple brin dans lADN dE. coli et de cellules CHO. In vivo, des aberrations chromosomiques ont t dtectes sur des cellules de moelle osseuse de souris traites (Pfohl Leszkowicz, et al., 2002 ; Sabater-Vilar, et al., 1999). Enfin, une tude in vitro rcente montre que la citrinine napparat pas gnotoxique pour des cellules embryonnaires de reins humains HEK, mais quelle augmente le niveau des ARN messagers (heat shock proteins70) (Liu et al., 2003).

201

Une tude de cancrogense a t mene en administrant par voie orale 1 g de citrinine / kg pc des rats Fischer 344 durant 80 jours. A la fin de lexprimentation, 70% des animaux traits portaient des tumeurs bnignes des reins (adnomes cellules claires) (Liu et al., 2003). Aussi, le CIRC a considr cette mycotoxine comme inclassable quant sa cancrognicit pour l'homme malgr la prsence d'indications limites de sa cancrognicit pour l'animal (groupe 3) (IARC monographs, 1986).

2.4

Exposition humaine

2.4.1. Effets sur la sant humaine (donnes pidmiologiques) Aucune indication nest disponible en ce qui concerne les effets de la citrinine chez lHomme. Toutefois, la citrinine pourrait tre implique au mme titre que lOTA dans la nphropathie endmique des Balkans (NEB). Celle-ci est caractrise par une dgnrescence tubulaire, une fibrose interstitielle et une hyalinisation des glomrules accompagne par une enzymurie, des maux de tte frquents, des douleurs lombaires, une asthnie mais aussi anmie, perte de poids, xanthodermie et polyurie sans hypertension. Des changements de la biochimie urinaire et srique sont galement rapports : diminutions de la protinurie (0,15 0,5 g/24h), de la glucosurie et augmentation de la cratine srique. Ces troubles saccompagnent dune infiltration rnale par des cellules mononuclaires (20 250 leucocytes/mm3) (Pfohl-Leszkowicz et al., 2002). Nanmoins, la piste mycotoxines nest pas la seule avance, dautres options tant envisages, pour expliquer ltiologie de la NEB (voir chapitre Ochratoxines , 5.1). 2.4.2. Exposition de lHomme au travers des denres brutes et des produits finis ou transforms et impact des procds technologiques sur la prsence ou la rduction dans les aliments tels que consomms La citrinine a t retrouve des teneurs allant de 0,07 80 mg/kg dans de lorge, de lavoine, du seigle, du bl (Allen et al., 1984). Elle a galement t retrouve dans du mas, du riz, des noix, des arachides, des graines de tournesol, des fruits secs, du jus de pomme et du fromage (Ribeiro, et al., 1997). Toutefois, la citrinine se dgrade rapidement dans les crales en prsence dhumidit ou deau. (Harwig et al., 1977). Dans les fromages, bien que de la citrinine puisse tre produite au cours de laffinage, et quelle soit stable pendant plusieurs jours, la contamination serait accidentelle et le retrait de la couche superficielle du fromage de chvre (0,5 cm) permettrait de rduire de 96% la quantit de citrinine produite (Bailly et al., 2002). Une tude rcente a permis de dterminer la teneur de patuline et de citrinine dans des pommes au Portugal (Martins et al., 2002). Le pourcentage de contamination par la patuline est plus important que celui de la citrinine (68,6% contre 3,9%) mais ces deux mycotoxines sont prsentes simultanment dans 19,6 % des chantillons tests. Les diffrentes varits de pommes prsentent un faible taux de contamination en citrinine puisque la gamme stend de 0,32 0,92 mg/kg.

2.5

Exposition animale

En raison de sa prsence conjointe avec lOTA, la citrinine a t implique dans la nphropathie porcine observe au Danemark, en Sude, en Norvge et en Irlande, et dans les nphropathies aviaires. Des symptmes similaires ont t obtenus chez des porcs consommant une nourriture contenant 200 400 mg/kg de citrinine pendant 1 2 mois (Krogh et al., 1973). Toutefois, limplication de la citrinine seule dans la survenue de nphropathies semble mineure en raison de sa faible prvalence naturelle dans les aliments (Harwig et al., 1977). Une synergie OTA-citrinine a t dmontre exprimentalement (injection intrapritonale conjointe dOTA et de citrinine) dans lespce canine. Les chiots sont particulirement sensibles cette synergie. Alors que la dose de 0,1 mg/kg pc dOTA administre seule par voie intrapritonale est bien supporte, son association avec 5 mg/kg pc de citrinine induit une mortalit rapide en moins de 2 semaines suite une dtrioration de la fonction rnale (Kitchen et al., 1977a,b). La toxicit rnale induite par la citrinine chez le porc est caractrise par des lsions et une desquamation des cellules pithliales rnales. Le volume urinaire excrt peut tre jusqu 2,5 fois suprieur la normale (Pfohl-Leszkowicz et al., 2002).

202

Les volailles sont, au mme titre que les porcs, sensibles la citrinine : ladministration de mas contamin par P. citrinum provoque la mort de 58 % des poulets en 2 semaines. Microscopiquement, on observe une dpltion des tissus lymphode et cardiaque, une myopathie squelettique, une ncrose des hpatocytes centrolobulaires, une atrophie glomrulaire et une hyperplasie. Les facteurs toxiques contenus dans le mas contamin par P. citrinum ne sont pas identifis (Roberts et al., 1978). Toutefois, ladministration orale de 130 260 mg/kg de citrinine des jeunes poulets pendant 6 semaines nentrane pas de mortalit mais provoque une toxicit aigu avec une augmentation de la consommation en eau et des diarrhes. A lautopsie, on observe des hmorragies digestives (au niveau du jjunum) pour ces deux doses ainsi quune augmentation du volume rnal. Mme de plus faibles doses (33 et 65 mg/kg aliment), des infiltrations lipidiques sont constates au niveau du foie, des reins et du pancras. De plus, des zones danaplasie au niveau des reins et du pancras ainsi quune augmentation des mitoses des cellules pithliales tubulaires rnales observes la dose de 260 mg de citrinine/kg daliment montrent que la toxine pourrait tre carcinogne chez le poulet. Une autre tude mene sur des poulets adultes a montr que ladministration de 0, 50 et 250 mg/kg de citrinine dans laliment pendant 3 semaines na pas eu deffet sur le poids corporel de lanimal, sa consommation alimentaire, la production dufs, leur poids et la qualit de leur coquille. Une diarrhe a t observe trois jours aprs administration de la forte dose (250 mg/kg daliment) (Ames, et al., 1976). Une tude exprimentale de toxicit aigu mene sur des dindons et des canards mles gs de 7 jours a mis en vidence une nphrotoxicit chez les deux espces. Les lsions rnales taient plus importantes chez le dindon et se caractrisaient par une ncrose de lpithlium tubulaire. Chez cette mme espce, des lsions ont galement t observes dans le foie o des ncroses hpatocytaires et une hyperplasie biliaire ont t rapportes. Aussi bien chez le dindon que chez le canard, une ncrose lymphode avec dpltion a t observe tant sur le thymus que sur la bourse de Fabricius. Ces dernires lsions sont prdominantes chez le canard. Une autre tude a permis de montrer que ladministration pendant 15 jours de 250 ou 500 mg/kg de citrinine dans laliment par gavage des canards mles gs de 1 jour provoque une nphropathie (Mehdi et al., 1984). En 1991, chez la vache, la citrinine a t suspecte dtre lorigine de prurit, de pyrexie et dhmorragie sur 8 individus dun troupeau de 175 ttes ayant consomm de la pulpe de citrus pendant 21 jours. Celle-ci tait visiblement moisie et contenait 30 40 ng/kg de citrinine. Ce rapport indique aussi que 5 veaux de vaches ayant consomm ce fourrage sont ns avec un prognathisme suprieur (Griffiths et Done, 1991). Conclusion Il est peu probable que la citrinine seule prsente un risque pour lhomme dans les conditions dexposition connues actuellement. Toutefois son association lOTA pouvant engendrer une synergie, la surveillance de la contamination simultane de ces deux toxines en particulier dans les produits tels que consomms mriterait dtre ralise. En alimentation animale, le risque dintoxication provient surtout de la consommation de crales contamines utilises ltat brut, en particulier chez les porcs et les volailles.

3. Les toxines dAlternaria Les moisissures du genre Alternaria ont une rpartition mondiale aussi bien dans les cultures que dans le sol et les dchets alimentaires mnagers (Visconti et al., 1994). Bien que les spores de ces moisissures soient connues pour tre fortement allergisantes lors de leur inhalation (Downs et al., 2001), ce chapitre se limitera aux toxines dAlternaria pouvant avoir un impact sur la sant humaine et animale par ingestion. Alternaria alternata et Alternaria solani sont les champignons les plus frquemment retrouvs dans les denres alimentaires contamines par les toxines dAlternaria Les mycotoxines produites sont principalement : alternariol, alternariol mthyl ether, acide tnuazonique, altenune, altertoxines (1 3 avec prdominance de laltertoxine 1 dans les aliments) et quelques toxines particulires Alternaria alternata f. sp. lycopersici (toxines AAL). Il est important de mentionner demble que la prsence de ces toxines dans les aliments est trs faible : lexposition de lhomme et des animaux est donc limite. Toutefois, les tudes toxicologiques

203

exprimentales prouvent la toxicit de certaines dentre elles, certains travaux suggrant leur implication dans le cancer de lsophage en Chine et dans une maladie hmatologique en Afrique, lOnyalai. 3.1. Facteurs favorisant le dveloppement Les fruits et les lgumes sont susceptibles dtre contamins par Alternaria aussi bien au champ quaprs la rcolte : il sagit surtout des produits drivs de la pomme et la tomate, mais la moisissure a galement t identifie sur des graines de tournesol, olive et colza. Alternaria se dveloppe beaucoup plus facilement sur les fruits abms ou lors dun stress d au froid par exemple. Sur les tomates contamines par A. alternata, on retrouve majoritairement de lAOH et de lAME (Da Motta et al., 2001). Les Alternaria ont besoin dun taux dhumidit de28 34 % pour prolifrer, mais elles peuvent se dvelopper basse temprature. Ainsi les fruits et les lgumes rfrigrs durant le transport ou lors du stockage peuvent tre contamins (Magan et al., 1984 ; Stack et al., 1986). La prsence de moisissure a t rapporte dans le bl o elle se dveloppe sous le pricarpe. La moisissure peut contaminer le sorgho, lorge, lavoine, le riz et le tabac (Meronuck et al., 1972). Il semblerait que la principale toxine synthtise par A. alternata dans les crales soit lacide tnuazonique. Toutefois, si la contamination par la moisissure est importante et que la denre est altre, dautres toxines telles que lalternariol et lalternariol mthyther peuvent tre synthtises (Meronuck et al., 1972 ; Webley et al., 1998). Une tude a permis de dterminer les conditions de toxinognse dA. alternata en culture et sur des grains de bl au laboratoire. Il semblerait quaussi bien lhumidit que la temprature affectent la production dALT, AOH et AME. Les trois toxines sont produites de faon optimale 25C pour une aw de 0,98, aussi bien sur les grains de bl quen culture. La production est toutefois fortement variable selon la temprature et lhumidit (Magan et al., 1984). Les altertoxines sont prsentes des quantits bien moindres dans les aliments, mais ces mycotoxines font partie des plus dangereuses de par leur effet mutagne (Visconti et al., 1994). Il nexiste pas de donnes concernant la prvalence des toxines AAL dans les aliments. 3.2. Proprits physico-chimiques et mthodes danalyse Les espces dAlternaria produisent environ 30 mtabolites secondaires de structures varies. La classe la plus importante est celle des dibenzopyrones, appels galement polyketides. Lalternariol (AOH), lalternariol mthyther (AME) et laltenune appartiennent entre autre cette classe de toxines. Lacide tnuazonique (TeA) est un acide ttramique tandis que laltertoxine 1 (ATX-1) est un driv prylne. Dautres mtabolites isols appartiennent aux classes des quinones, des peptides ou des composs htrocycliques. La plupart de ces autres mtabolites sont phytotoxiques. Les structures de certaines de ces toxines sont illustres en figure 3.

TOXINES AAL

Figure 3 : structure chimique de quelques toxines dAlternaria

204

Le poids molculaire de ces toxines est trs variable du fait de leur nature chimique trs diffrente : TeA : 197 AOH : 258 AME : 272 ATX1 : 352 AAL : 679 (Visconti et al., 1994). Les alternariols (AOH, AME) et les altertoxines peuvent tre analyss par CCM - UV (254 ou 360 nm). La GC associe un dtecteur ionisation de flamme (FID) a galement t mise en uvre pour dtecter et quantifier ces toxines (laltnune doit tre pralablement driv en trimthylsilyl ALT). Cette technique permet dobtenir une limite de dtection de 20 g/kg. Toutefois, lHPLC ne ncessitant pas dtape de drivation pralable est prfre pour lanalyse de ces toxines. Bien que diffrentes mthodes soient disponibles, la grande majorit dentre elles fait tat dune sparation sur colonne en phase inverse C18 suivie dune dtection en UV. Une extraction sur phase solide destine purifier lchantillon peut tre ralise avant son analyse par HPLC-UV (Fente et al., 1998 ; Delgado et al., 1998). Les limites de dtection pour les diffrentes altertoxines, lAOH et lAME varient de 3 10 ng/g. Une mthode par HPLC-DAD (dtection par barrettes de diodes) a t mise au point afin de quantifier lAOH et lAME dans les produits base de tomates. Leurs LOQ respectives sont de 5 ng/g et 2 ng/g (Da Motta et al., 2000). Lanalyse de lacide tnuazonique fait appel aux mmes outils pour que les toxines prcdentes. La LOD obtenue par GC FID est de 1 mg/kg tandis que la dtection par spectromtrie de masse permet dobtenir une meilleure sensibilit avec une LOD de 10 g/kg. La CCM, la GC-MS et lHPLC en phase inverse permettent danalyser les toxines AAL. Il faut noter quaucun kit rapide de type ELISA na t mis en uvre pour tester la prsence de toxines dAlternaria, lexception des toxines AAL o des essais ont t mens (Szurdoki et al., 1996 ; Webley et al., 1998 ). Ce manque de mthodes rapides disponibles contribue certainement la raret des informations concernant la prvalence des toxines dAlternaria (John et al., 1989).

3.3. Proprits toxicologiques Diverses activits biologiques : phytotoxique, cytotoxique, insecticide, antivirale, antifongique, antibactrienne, mutagne, tratogne, ou ftotoxique, ont t mises en vidence pour les diffrentes mycotoxines synthtises par Alternaria (Harvan et al., 1976). Lacide tnuazonique est le mtabolite le plus tudi en raison de la disponibilit des techniques permettant sa production et son isolement partir de cultures fongiques. De plus, il sagit du mtabolite le plus toxique en terme de DL50 (John et al., 1989). Les toxines AAL sont galement particulirement tudies de par leurs similarits structurales avec la fumonisine B1 (Wang et al., 1996) . 3.3.1 Mcanisme daction Etant donn les diffrences structurales des toxines dAlternaria, leurs mcanismes daction sont extrmement varis. Lacide tnuazonique entrane une inhibition de lincorporation des acides amins dans les protines, qui interfre avec le relargage de protines no-formes par les ribosomes (Davis et al., 1977). La cible principale des toxines dAlternaria alternata f. sp. Lycopersici (toxines AAL) dans les cellules de mammifres est lenzyme sphinganine (sphingosine) N-actyl transfrase encore appele cramide synthase. Cette cible est galement celle des fumonisines (cf. chapitre spcifique). In vivo, linhibition de la cramide synthase conduit une accumulation des bases sphingodes libres. Aussi, laugmentation des taux de sphinganine libre et le rapport sphinganine/sphingosine peuvent servir de marqueur dexposition aux toxines AAL et aux fumonisines (Abbas et al., 1994). De plus, ces deux sphingolipides ont t rapports comme ayant des rles critiques dans la communication cellulaire et la transduction du signal. Une tude de Wang (1996) indique en effet que les toxines AAL aussi bien que les fumonisines induisent lapoptose dans des cellules rnales de singe (CV-1). Cependant, si la FB1 provoque un arrt des cellules en phase G1, ceci nest pas le cas des toxines AAL, ce qui suggre des diffrences daction entre les deux familles de toxines (Wang et al., 1996).

3.3.2 Toxicit gnrale : Toxicit aigu :

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Linjection intra-pritonale dextraits bruts purifis dAlternaria 300 mg/kg est ltale chez la souris. Cette dose est galement ltale lors de ladministration par voie orale des rats (Harvan et al., 1976). Les DL50 (voie intra-pritonale) de lAME et lAOH chez la souris sont suprieures 400 mg/kg pc. Celle de lALT varie de 75 100 mg/kg pc. Les animaux prsentent des spasmes gastriques occasionnels et des haltements priodiques (Da Motta et al., 2000). Les altertoxines ATX-I et ATX-II sont ltales pour la souris la dose de 200 mg/kg pc. Elles entranent une inactivit, des hmorragies sub-endocardiques et sub-arachnodiennes. A lautopsie, du sang est retrouv au niveau des ventricules cervicaux. La DL50 de lacide tnuazonique (voie orale) est de 174 mg/kg pc chez le rat et de 37,5 mg/kg pc chez le jeune poulet Au cours des diffrentes tudes de toxicit menes chez le rat, le cobaye, la souris, le lapin, le chien et le singe rhsus les animaux prsentent hypersalivation, vomissements, anorexie, hmorragies intestinales et convulsions. Chez le poulet, des doses quotidiennes de 1,25 mg/kg de TeA dans la nourriture provoquent une diminution du gain de poids corporel. En revanche, les AAL toxines purifies ont t administres des rats par voie intra-gastrique la dose de 100 mg/kg pc sans produire deffets toxiques (Visconti et al., 1994). Toxicit sub-aigu : Aucun signe de toxicit na t mis en vidence chez le rat ou chez le poulet qui lon a administr de lAME, AOH et ALT pendant 21 jours aux doses respectives de 24, 39 et 10 mg/kg pc. Labsence de toxicit de lAME chez le poulet a t confirme dans une tude de Griffin et al. (1983) aprs administration de toxine pure dans la nourriture des doses allant jusqu 100 mg/kg pendant 4 semaines. Des chiens ayant reu chaque jour 10 mg/kg dacide tnuazonique par voie orale sont morts 8 9 jours aprs le dbut de ltude (Visconti et al., 1994).

3.3.3 Toxicit dorgane : Cytotoxicit : Des tudes in vitro sur cellules de bactries et de mammifres ont permis de classer les diffrentes toxines dAlternaria quand leur cytotoxicit. Il ressort de ces travaux une cytotoxicit dcroissante suivante : ATX-II > AOH > AME > ATX-I > ALT. En revanche, lAME nest pas cytotoxique (Visconti et al., 1994). Dautres tudes rvlent galement une grande htrognit dans la sensibilit des lignes utilises. Ainsi, sur les 15 lignes cellulaires utilises, seules les cellules pithliales de reins de chien MDCK taient sensibles aux toxines AAL (Shier et al., 1991). Reprotoxicit : Ladministration dAOH seule et conjointe avec de lAME (1 :1 25 mg/kg) par voie sous-cutane est ftotoxique et tratogne chez la souris. LAME entrane une toxicit maternelle et savre galement ftotoxique chez le hamster aprs administration intra-pritonale de 200 mg/kg pc au 8me jour de gestation. Aucune mortalit ni effet tratogne nont t rapports aprs injection dAME, dAOH et dALT travers la vsicule ombilicale dembryons de poulet gs de 7 jours respectivement 0,5, 1,0 et 1,0 mg/uf. En revanche, lacide tnuazonique prsente une DL50 de 0,55 mg/uf (Griffin et al., 1983 ; Visconti et al., 1994). Gnotoxicit : Un des aspects de la toxicit des Alternaria est la mutagnicit de certaines des toxines synthtises, principalement les altertoxines (ATX). LAOH et lacide tnuazonique nentranent pas de mutation gnique sur Salmonella typhymurium TA98 et TA100 avec et sans activation mtabolique. Plusieurs tudes ont en revanche montr que lAME est fortement mutagne sur la souche TA98 et sur E. coli ND-160 sans activation mtabolique (Visconti et al., 1994 ; Scott et al., 1980). Cependant, dautres travaux semblent prouver que lAME nest pas mutagne ni sur TA98 ni sur TA100 avec et sans activation mtabolique et que les rsultats positifs obtenus prcdemment sont dus la prsence de traces dautres toxines mutagnes telles que les ATX (Davis et al., 1994). En effet, lATX-III, lATX-II et lATX-I entranent des mutations gniques sur S. typhymurium TA98, TA100 et TA1537 avec et sans activation mtabolique, lATX-III tant la plus mutagne suivie de ATX-II puis ATX-I (Davis et al., 1994 ; Stack et al., 1986).

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3.4. Exposition humaine Une surveillance de la patuline, de lAOH et de lAME dans les jus de pomme et produits base de pomme a t mene par la FSA (Food Standard Agency) en 2003. Les rsultats montrent que, sur 300 chantillons analyss, la patuline a t retrouve dans 3 chantillons des teneurs infrieures la limite rglementaire, lAOH a t retrouve dans 2 chantillons faibles taux (dans un jus et un concentr), tandis quaucun chantillon ne contenait dAME (FSA, 2003). Une tude plus restreinte a t mene afin de dterminer la prvalence dAOH et AME dans des jus de pomme concentrs dorigine espagnole. Ces deux toxines ont t dtectes sur la moiti des 32 chantillons analyss : les niveaux de contamination en AOH varient de 1,35 5,42 ng/ml tandis que lAME est prsent le plus souvent ltat de traces ; le maximum de contamination tant de 1,71 ng/ml dans un chantillon (Delgado et al., 1998). Les graines de tournesol sont galement susceptibles dtre contamines par les toxines dAlternaria. En effet, la surveillance de 150 chantillons de graines de tournesol a mis en vidence que 85 % contenaient de lAOH (avec une moyenne de contamination de 187 g/kg), 47 % de lAME (moyenne : 194 g/kg) et 65 % de lacide tnuazonique (moyenne : 6,7 g/kg). De plus, lAME et lacide tnuazonique ont t retrouvs dans lhuile (Chulze et al., 1995). En revanche, une surveillance des olives et de lhuile dolive destines la consommation humaine mene en Italie na pas mis en vidence de toxines (Bottalico et al., 1993). Les moisissures du genre Alternaria posent un problme en sant humaine par inhalation car ce sont de puissants allergnes qui peuvent augmenter la svrit de lasthme principalement chez les enfants qui y sont fortement exposs (Downs et al., 2001). En revanche, aucun cas avr de mycotoxicose humaine du lingestion daliments contamins par des toxines dAlternaria na t rapport. Certaines tudes suggrent toutefois quelles pourraient tre impliques dans certaines affections humaines notamment le cancer de lsophage au Linxian, en Chine. En effet, Alternaria alternata est frquemment retrouve dans les grains provenant du Linxian, une rgion Chinoise prsentant une incidence leve de cancer de lsophage. Une tude de Dong et al. (1987) a rapport que des extraits d A. alternata isols de mas au Linxian induisaient des effets mutagnes sur des cellules de mammifres (V79, fibroblastes murins NIH/3T3) sans ncessiter dactivation mtabolique pralable. Les auteurs suggrent donc que la consommation de crales contamines par A. alternata pourrait contribuer la forte incidence de ce type de cancer. De plus, une tude de Liu et al. (1992) a confort cette hypothse en montrant que lAOH et lAME pouvaient se combiner avec lADN isol dpithlium sophagien de ftus humain, activer les oncognes c-H-ras et c-mys de ces cellules et promouvoir la prolifration de celles-ci in vitro. Un rapport sur la prvalence naturelle des toxines dAlternaria dans le bl en Chine rvle que la frquence moyenne dinfection par A. alternata est de 87,3 % (Li et al., 2000). Sur les 22 chantillons analyss, 20 contenaient de lAOH de 116 731 g/kg (moyenne : 335 g/kg) et 21 contenaient de lAME de 52 1426 g/kg (moyenne : 443 g/kg). Dans tous les chantillons analyss, de lacide tnuazonique a t dtect une concentration moyenne de 2419 g/kg (teneur maximale : 6432 g/kg). Il convient de noter que les chantillons contenant de fortes teneurs en AOH et AME contenaient galement des teneurs leves en acide tnuazonique. Toutefois, aucun des 22 chantillons ne contenaient daltenune ou daltertoxine. Signalons enfin que lacide tnuazonique est une des causes possibles de lOnyalai, une maladie hmatologique endmique de lAfrique surtout des rgions au Sud du Sahara. Cette atteinte aigu se caractrise par des lsions hmorragiques buccales (Davis et al., 1977 ; John et al., 1989).

3.5. Effets sur la sant animale Trs peu de cas de mycotoxicose naturelle dus aux toxines dAlternaria ont t rapports. Cependant en 1997, elles ont t suspectes dtre la cause de locosme chez un troupeau de bovins au Mexique. Peu de donnes sont disponibles sur ce cas (Braun et al., 1997). Ladministration de nourriture artificiellement contamine par 100 mg dAME par kg pendant 4 semaines des poulets gs de 1 jour na eu aucune consquence zootechnique (Griffin et al., 1983).

Conclusion

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Au vu des donnes disponibles, il nexiste pas actuellement de raisons objectives de considrer le danger des toxines labores par Alternaria comme une priorit en scurit sanitaire des aliments destins lhomme ou aux animaux dlevage. Toutefois, les tudes toxicologiques essentiellement ralises in vitro laissent apparatre des caractres mutagnes qui devront tre confirms ou infirms par des tudes in vivo ralises chez des animaux recevant des doses compatibles avec les donnes de contaminations existantes. De plus la vigilance doit tre maintenue sur la qualification du caractre contaminant naturel de ces toxines, au travers denqutes voire de plans de surveillance.

4. Lacide cyclopiazonique Lacide cyclopiazonique (CPA) est une mycotoxine produite par diffrentes espces dAspergillus, notamment Aspergillus flavus et A. tamarii, et de Penicillium, notamment Penicillium camembertii et P. cyclopium. Elle peut tre produite avec dautres mycotoxines comme les aflatoxines (produites par A. flavus), ou la camembertine (produite par P. camemberti et P. cyclopium). Bien que lacide cyclopiazonique ait t identifi dans de nombreux aliments (crales, lgumineuses, viande, lait, fromages ) trs peu de mycotoxicoses animales lui sont attribues en raison de sa faible toxicit et de sa faible teneur dans les denres contamines. Cependant, il faut noter quen raison de sa prsence conjointe avec les aflatoxines, son implication relle peut tre sous-estime. Cette hypothse a notamment t avance pour expliquer les symptmes observs au cours des cas de Turkey X disease qui se sont produits en Angleterre au dbut des annes 1960 (Cole, 1986). Par ailleurs, un seul cas de mycotoxicose humaine a t associ cette toxine.

4.1. Prsence dacide cyclopiazonique dans les denres La prsence commune dacide cyclopiazonique et daflatoxine B1 a t rapporte dans de nombreuses denres, particulirement le mas et les arachides, contamins par A. flavus (Smith et al., 1992) . Ainsi, sur 45 souches dA. flavus isoles partir d aliments pour volailles commercialiss au Portugal et testes quant leur potentiel toxinogne in vitro, 19 taient capables de produire du CPA et 23 de lAFB1, alors que 10 isolats co-produisaient du CPA et de lAFB1. Ltude a rlv dailleurs que le CPA tait prsent dans 5 cas sur 80 (teneur moyenne de 0,16 mg/kg) contre 36 sur 80 pour lAFB1 (teneur de 0,001 0,016 mg/kg) (Martins et Martins, 1999). Des rsultats similaires ont t observs sur des arachides en provenance dArgentine (Fernandez Pinto et al., 2001) et diffrents aliments en provenance dInde (Bamba et Sumbali, 2005, Balachandran et Parthasarathy, 1996). Lacide cyclopiazonique est galement synthtis par Penicillium camembertii qui est une moisissure frquemment utilise lors de laffinage du fromage. Ainsi, la prsence de CPA a t mise en vidence dans 11 crotes de fromages commerciaux (sur 20 analyss), des niveaux de 0,05 0,2 g/g dans 8 chantillons et 0,4 ; 1 et 1,5 g/g dans les 3 autres. Toutefois, la toxine na pas t dtecte dans la pte (Le Bars, 1979). Bien que toutes les souches de P. camembertii isoles de ces fromages semblent aptes produire du CPA en culture, le niveau de production dpend largement de la souche et des paramtres environnementaux (milieu de culture, temprature, temps dincubation). Le pourcentage de souches productrices augmente avec le temps et atteint 100% aprs 22 jours dincubation 25 C ou aprs 33 jours 13 C et 4 C (Le Bars, 1979).

4.2. Proprits physico-chimiques et mthodes danalyse de lacide cyclopiazonique Lacide cyclopiazonique (C20H20N2O3) est un acide indole ttramique de poids molculaire 336 g/mol, rpondant la structure 9H-Pyrrolo(1',2':2,3) iso-indolo (4,5,6-cd) indol-9-one,10-actyl2,6,6a,7,11a,11b-hexahydro-11-hydroxy-7,7-dimethyl-, (6a alpha,11a beta,11b alpha)-(8Cl)(9Cl). La figure 4 ci-dessous illustre sa structure molculaire.

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Figure 4 : structure chimique de lacide cyclopiazonique Lacide cyclopiazonique est synthtis par la voie des acides amins : cette toxine drive du tryptophane, du mvalonate et de deux molcules dactate (Betina, 1989). Diffrentes mthodes danalyse sont utilises afin de dtecter le CPA dans les denres alimentaires et les fluides biologiques. La chromatographie sur couche mince (CCM) est largement utilise afin de dtecter et de quantifier le CPA dans les crales et les produits laitiers (Martins et Martins, 1999). Pour lanalyse dans le lait, des mthodes ont t mises au point : llectrophorse capillaire micellaire, la chromatographie liquide en phase inverse (Prasongsidh et al., 1998a) et en, une mthode par LCESI/MS-MS42 (Losito et al., 2002). Diffrents dosages par chromatographie en phase liquide associs une dtection UV ont galement t dvelopps pour la dtection dans les fromages (Zambonin et al., 2001), les produits base de tomates (Da Motta et al., 2001) et les crales et produits drivs, notamment les cornflakes, o la mthode permet en outre la quantification simultane de lOTA et des acides mycophnoliques (Aresta et al., 2003). Des techniques ELISA permettent danalyser le CPA dans le mas, les muscles et le plasma (Byrem et al., 1999) mais aussi le foin, lensilage et les fourrages (Yu et al, 1999).

4.3. Proprits toxicologiques de lacide cyclopiazonique 4.3.1 Mcanisme daction : Lacide cyclopiazonique est un inhibiteur spcifique et rversible de la pompe Ca2+ ATP-ase du rticulum sarcoplasmique et endoplasmique (Seidler et al., 1989 ; Burdock et Flamm, 2000). Cette enzyme rgule le cycle de contraction / relaxation dans le muscle via le transport de Ca2+ du cytoplasme jusquau lumen du rticulum sarcoplasmique coupl lhydrolyse dATP. Une tude mene sur diaphragme de souris a montr que des concentrations entre 3 et 10 M de CPA provoquent une contraction initiale rapide suivie dune forte augmentation du tonus musculaire (Hong et al., 2003). Ces effets sont inhibs par le retrait du calcium extracellulaire mais pas par des bloqueurs des canaux calciques de type L (dpendants dun potentiel daction) ou des bloqueurs des canaux calciques dpendants dun rcepteur (par exemple la nicardipine) (Hong et al., 2003). Une autre tude sur des fibroblastes gingivaux humains en culture dmontre que le CPA diminue les stocks de calcium intracellulaire ce qui induit un influx de calcium travers la membrane plasmique (Matsumoto et al., 2003). Il semble galement que le CPA agisse en diminuant laffinit de la pompe Ca2+ ATP-ase pour le calcium en rduisant son activit spcifique (Martinez-Azorin, 2004).

4.3.2 Toxicologie gnrale : Les principaux organes cibles de lacide cyclopiazonique chez les mammifres sont le tractus gastrointestinal et les reins (Cole, 1986). Toxicit aigu et sub-aigu : Les principaux symptmes rapports la suite une intoxication aigu par le CPA chez les mammifres sont des signes nerveux caractriss par une ptose des paupires par paralysie du muscle releveur, de lhypokinsie, de lataxie avec hypothermie mais aussi des tremblements, des convulsions et une diminution de la prise alimentaire (Burdock et Flamm, 2000). Les DL50 par voie orale du CPA exprimes en mg/kg de p.c. sont les suivantes : 64 chez la souris femelle, 36 chez le rat mle contre 63 chez le rat femelle et 12 chez le poulet et la poule.
42

Chromatographie liquide couple la spectromtrie de masse tandem aprs ionisation

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Les effets aigus du CPA semblent rversibles si la dose ingre nest pas trop leve. Chez les rats mles ayant reu de 8 50 mg de CPA/kg par voie intrapritonale, la mort survient en deux heures avec des symptmes neurologiques tels que lapathie, lataxie et des spasmes. Les animaux ayant reu 2,5 et 4,5 mg/kg meurent en 1 3 jours. En revanche, la dose de 0,8 mg/kg, les animaux se rtablissent des symptmes neurologiques (Burdock et Flamm, 2000). Aprs administration unique ou ritre de 50 mg/kg de p.c. de CPA chez le rat, il a t observ une augmentation importante des activits enzymatiques des GPT (glutamate pyruvate transaminase) et GOT (glutamate oxaloactate transaminase), ainsi que des GGT (gamma glutamyl transpeptidase). Ces altrations confirment lhpatotoxicit du CPA et suggrent son implication dans lapparition de lsions pr-noplasiques du foie chez le rat (Antony et al., 2003). Une tude de toxicit sub-aigu a t conduite sur 16 porcs pendant 14 jours : chaque groupe de 4 animaux a reu du CPA par voie orale aux doses respectives de 0 ; 0,1 ; 1 ou 10 mg/kg p.c./j. Les auteurs indiquent la prsence de signes cliniques de toxicit partir du 7me jour chez les porcs ayant reu la forte dose : il sagit de faiblesse, dinactivit, danorexie, de pelage rche et de perte de poids. Des diarrhes apparaissent partir de la 2me semaine de traitement. Les animaux traits la dose de 1 mg de CPA /kg p.c./j montrent galement des signes dinactivit et un pelage rche partir de la 2nde semaine. A lautopsie, seuls les animaux ayant reu les doses de 1 et 10 mg/kg p.c./j montrent des lsions. Les lsions macroscopiques sont domines par une atteinte digestive : ulcres gastriques, hypermie des muqueuses et hmorragies intestinales chez les animaux traits par la forte dose et un cas dulcration gastrique chez un des 4 animaux ayant reu 1 mg/kg p.c./j. Les lsions microscopiques sont les suivantes : ncrose tubulaire rnale et infiltration lipidique des lobules hpatiques priphriques chez les animaux traits par 10 mg CPA/kg p.c./j et gastro-entrite ncrosante dont la svrit est fonction de la dose pour les animaux traits par 1 et 10 mg CPA/kg p.c./j. On observe galement une ncrose des muqueuses et une inflammation de lestomac chez 2 des 4 porcs traits la dose de 0,1 mg/kg p.c./j (Lomax et al., 1984). Toxicit chronique : Chez la plupart des espces animales, les premiers signes de toxicit chronique du CPA se caractrisent par une diminution de la prise alimentaire et du gain de poids corporel. Ils apparaissent pour des niveaux dexposition compris entre 1 et 5 mg/kg p.c./j, avec des variations selon lge, la voie et la dure dadministration (Byrem et al., 1999). Une tude a t mene sur 25 chiens recevant pendant 90 jours 0 ; 0,1 ; 0,5 ; 1 et 2 mg de CPA /kg p.c./j par voie orale. Tous les animaux ayant reu les doses de 1 et 2 mg/kg p.c./j et un chien ayant reu la dose de 0,5 mg/kg p.c./j sont morts ou ont t abattus avant la fin de lexprience. Entre 0,5 et 2 mg/kg p.c./j, les signes cliniques dintoxication sont lis la dose. Ils se caractrisent par de lanorexie, des vomissements, de la diarrhe, une perte de poids et de labattement. Ltude lsionnelle rvle des dommages vasculaires (hypermie, hmorragies focales) et des ulcrations au niveau du tractus gastro-intestinal, des reins, du foie, de lpididyme et des tissus lymphodes. Aucun signe na t rapport chez les animaux traits 0,1 mg/kg p.c./j (Nuehring et al., 1985). Une autre tude a t conduite sur des primates non humains (singes Vervet) : un mle a reu par voie intra pritonale 1 mg CPA/kg p.c./j et cette dose a t double tous les trois jours jusqu atteindre 60 mg/kg p.c./j. Par ailleurs, 20 mg CPA/kg p.c./j ont t administrs par voie orale deux mles et trois femelles pendant 60 et 120 jours respectivement. Les rsultats de ces tudes ont montr que le CPA est faiblement toxique chez le primate non humain ; seules des altrations histologiques modres du rticulum endoplasmique rugueux des hpatocytes et des vaisseaux du myocarde sont observs (Jaskiewicz et al., 1988). Reprotoxicit : On ne peut pas conclure quant la reprotoxicit du CPA car de nombreuses donnes concernant la toxicit pri- et post-natale et linterfrence potentielle avec la fertilit ne sont pas disponibles. Toxicologie gntique et cancrogense : Les rsultats concernant la mutagnicit de lacide cyclopiazonique sont contradictoires et ont fait lobjet dune revue (Burdock et Flamm, 2000). Certaines tudes de mutation gnique sur S. typhimurium TA 98 et TA 100 (Ames) donnent un rsultat positif avec activation mtabolique alors que des rsultats ngatifs avec et sans activation mtabolique ont t obtenus sur ces mmes souches.

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Des impurets ou des diffrences de doses pourraient expliquer ces diffrences. Ainsi, la mutagnicit de laflatoxine B1 sur test dAmes avec activation mtabolique est diminue en prsence de CPA, probablement en raison dune inhibition de sa bioactivation (Kuilman-Wahls et al., 2002). Comme le CPA inhibe galement la formation de certains mtabolites de la cafine et de la testostrone, il a t suppos quil pouvait inhiber lactivit des cytochromes P450 3A4 (Sabater-Vilar et al., 2003). 4.3.3 Toxicocintique : Lacide cyclopiazonique est lipophile sous forme non ionise. Il est donc susceptible de subir une absorption rapide et une distribution dans les tissus (Byrem et al., 1999). Ladministration de doses croissantes de CPA chez le poulet semble dmontrer que plus lanimal souffre des dommages induits par la toxine, plus llimination de cette dernire dans la viande est lente (Norred et al., 1988). Les paramtres toxicocintiques cits ci-dessous, obtenus le plus souvent avec de fortes doses de CPA, ne peuvent donc pas tre directement utilisables pour apprcier le taux de transfert et le risque de persistance ltat rsiduel de la toxine dans les conditions naturelles dexposition. Du CPA marqu au 14C t administr des rats Sprague-Dawley par voie intragastrique (5 mg/kg p.c.) et intra pritonale (1 mg/kg p.c.) (Norred et al., 1985). Les concentrations sanguines maximales ont t rapportes 6 heures aprs administration intragastrique et 1 heure aprs administration intra pritonale. Les temps de demi-vies du CPA sont de 33 12 heures lors dinjection par voie intrapritonale et de 43 25 heures lors dadministration orale. Les organes qui concentrent le plus de radioactivit sont les poumons, le cur, les reins, le foie et le muscle squelettique. Douze heures aprs ladministration, 45 50 % du CPA ou de ses mtabolites marqus sont retrouvs dans le muscle. 72 heures aprs administration, 17 23 % de la radioactivit est limine dans les urines et 37 48 % dans les fces. A cette chance, le foie contient moins de 1 % de la dose administre, quelle que soit la voie dadministration. Le devenir du CPA a t tudi chez le porc (Byrem et al., 1999). Une concentration plasmatique moyenne de 464 ng/ml a t dtecte chez 3 porcs adultes ayant consomm un aliment contenant 10 mg de CPA/kg pendant 6 jours. A la fin de lexprimentation, les muscles longissimus et semitendinosus contenaient en moyenne la mme concentration en CPA que le plasma. Il convient de noter que la prsence de CPA dans lalimentation des porcs na pas affect leur prise alimentaire quotidienne. Ladministration intraveineuse unique de 20 mg de CPA 3 porcs adultes a par ailleurs permis de dterminer un temps de demi-limination de 24 heures. Chez le poulet, la prsence de CPA a t recherche dans la viande, aprs administration orale de 0,5 ; 5 et 10 mg/kg p.c. (Norred et al., 1988). Les niveaux de toxine les plus importants ont t trouvs dans le muscle 3 heures aprs administration. Pour les animaux recevant 0,5 et 5 mg/kg p.c., le CPA est limin rapidement de la viande en 24 48 heures. Les auteurs indiquent galement une corrlation significative entre la perte de poids et le taux de CPA dans la viande 48h aprs administration de 10mg de toxine /kg pc mais pas aux autres niveaux de doses ou temps de sacrifice (24 et 96h). Deux tudes ont t menes chez la poule recevant 0 ; 2,5 ; 5 et 10 mg/kg/j p.c. pendant 9 jours et 0 ; 1,25 et 2,5 mg/kg/j p.c. pendant 4 semaines (Dorner et al., 1994). Les ufs de tous les animaux, quel que soit le groupe, contenaient du CPA ds le premier jour dexposition. Les auteurs montrent que la concentration en toxine est plus leve dans les blancs que dans les jaunes (en moyenne 100 ng/g et 10 ng/g respectivement). Des signes de toxicit ont galement t rapports. La totalit des animaux ayant reu 10 mg/kg p.v./j et 4 animaux sur les 5 ayant reu 5 mg/kg/j p.v. pendant 9 jours sont morts aprs avoir prsent une diminution de lingr, du poids corporel et de ponte. Les principaux autres signes observs sont une rduction de la production dufs et de la qualit des coquilles. Afin de dterminer la prsence de CPA dans le lait, 3 brebis ont reu 5 mg CPA/kg pv/j. pendant 2 jours (Dorner et al., 1994). La concentration moyenne en CPA retrouve dans le lait est de 236 ng/g (maximum 568 ng/g), ce qui correspond un taux de transfert infrieur 0,6%. Aucune trace de toxine nest dtecte 9 jours aprs larrt de lexposition. Il convient de souligner que le CPA a un effet important sur les performances zootechniques des brebis puisque ds les premires 24h, la production laitire et la consommation alimentaire des animaux chutent brutalement. Aprs 48h, la production laitire est de 20% par rapport la production normale, la frquence respiratoire ainsi que

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la temprature corporelle des animaux sont augmentes. Le niveau de production laitire redevient normal aprs 7 10 jours. Ainsi, sur la base de ces tudes exprimentales, la toxicocintique de lacide cyclopiazonique rvle une persistance assez importante de la molcule et un tropisme musculaire. Cela est mettre en relation avec la fixation de la toxine par les ATPases calcium dpendantes. Mais ces rsultats ont t obtenus partir de doses exprimentales levesde plusieurs mg/kg pv/j et ne peuvent donc pas tre directement utilisables pour apprcier le risque de persistance ltat rsiduel de la toxine dans les conditions naturelles dexposition.

4.4. Exposition humaine 4.4.1 Effets chez ltre humain Lacide cyclopiazonique est suspect dtre impliqu dans une mycotoxicose aigu chez lHomme appele le Kodua, qui se caractrise par une somnolence, une perte dquilibre et des troubles nerveux. Elle rsulte de la consommation de millet, et est particulirement frquente chez les habitants du Nord de lInde. Les graines de cette crale sont souvent contamines par Aspergillus tamarii Kita, une espce de moisissure capable de synthtiser du CPA (Lalitha Rao et Husain, 1985). Cest le seul cas suspect connu. 4.4.2 Voies et niveaux dexposition LHomme pourrait treexpos directement lacide cyclopiazonique travers la consommation de crales, mas et arachides (cf. ci-dessus) mais aussi de certains fromages ou produits de salaisonnerie affins par des moisissures productrices de CPA (Tabuc et al., 2004) et indirectement travers la consommation de viande, de lait et dufs danimaux ayant consomm des aliments contamins. Lventualit de la prsence de CPA a aussi t mise en vidence dans des produits base de tomate au Brsil (Da Motta et Valente Soares, 2001) ou de citrons en Inde (Bamba et Sumbali, 2005). Aucune donne nest disponible pour estimer lexposition du consommateur franais.

4.5. Exposition animale 4.5.1 Cas cliniques : Cette toxine a t suspecte en Indonsie, chez des cailles ayant consomm une alimentation contenant jusqu 9 mg/kg de CPA (Smith et al., 1992). En Angleterre, Harrison en 1971 attribue la mort de 10 veaux ayant montr des tremblements puis des convulsions la prsence de CPA dans lorge consomme (Burdock et Flamm, 2000). Par ailleurs, lanalyse de 63 chantillons daliments destins aux animaux (25 chantillons de foins et 38 chantillons densilages, dont un ensilage de mas, et de fourrages) rvle que 87,3 % contenaient du CPA, avec une moyenne de contamination de 0,34 mg/kg (Yu et al., 1999). Bien que lon ignore si cette analyse est reprsentative du niveau moyen de contamination des fourrages et ensilages en France, il semble que du CPA puisse frquemment tre mis en vidence dans ce type de produit sans problme apparent de sant. De ce fait, peu de cas dintoxications naturelles dues lingestion de CPA ont ainsi t rapports, ce rsultat tant mettre en relation avec les niveaux modestes de contamination observs dans les aliments et les doses leves ncessaires lapparition de signes cliniques.

4.5.2 Etudes exprimentales menes sur animal dlevage : Chez le poulet de 3 semaines, ladministration de 50 mg CPA/kg daliment pendant 3 semaines, entraine une diminution significative du gain de poids ds la 1re semaine dexposition. Cette diminution laisse suggrer une toxicit cumulative : le gain de poids diminue de 22,5 % la 1re semaine, de 30,5 % la 2nde semaine et de 32,6 % la 3me semaine. Il est galement observ une augmentation du poids relatif du foie, des reins et du proventricule ainsi quune diminution significative du poids de la bourse de Fabricius. Le poids relatif des gsiers ne semble pas affect par le traitement. Une augmentation significative de lacide urique et du cholestrol srique est galement observe (Smith et al., 1992).

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Les mmes observations ont t faites partir dune seconde tude sur des poulets gs de 1 3 semaines recevant 34 mg CPA/kg daliment pendant 3 semaines (Gentles et al., 1999). Par ailleurs, une analyse rtrospective de lpidmie de Turkey X disease en 1960 en Angleterre, qui avait t impute aux seules aflatoxines, a t ralise en 1986 par Cole. Lauteur suggre que les signes cliniques observs lpoque ntaient pas tous typiques dune aflatoxicose. Aussi, tend-il montrer limplication de lacide cyclopiazonique dans ltiologie de cette affection. Il voque par exemple la posture mortuaire des animaux (opisthotonos et pattes tendues) qui est reproduite chez le poussin de 1 jour par administration dune dose unique de CPA (12 mg/kg p.c.) mais pas daflatoxine (4 mg/kg p.c.) (Cole, 1986).

4.5.3 Transfert dans les produits animaux : Une enqute ralise au Brsil sur du lait commercial a montr que le CPA tait prsent aux doses de 6,4 et 9,7 g/L dans 2 chantillons sur les 48 analyss (Oliviera et al. 2006). Les auteurs concluent que la prsence simultane dAFM1 et de CPA doit inciter plus de vigilence lgard de cette mycotoxine. Spahr et al. (2000) considrent, dans leur revue bibliographique consacre au risque de transfert des mycotoxines dans le lait, que le CPA est une des rares mycotoxines dont le transfert est possible dans le lait. Mais ce taux est faible, infrieur 1% (voir 4.3.3) Peu de donnes sont disponibles sur le transfert du CPA dans les tissus, en dehors des donnes de toxicocintique pralablement cites. Par ailleurs, en raison des trs fortes doses utilises au cours de ces tudes (doses souvent toxiques, plusieurs mg/kg de p.c.) les paramtres de transfert observs ne peuvent pas tre directement extrapols dans les conditions naturelles dexposition.

4.5.4 Effets du stockage et des procds de transformation : Le CPA semble stable au cours du stockage du lait cru basse temprature ainsi que lors de sa transformation en poudre (Prasongsidh et al., 1997). De mme, lautoclavage du lait contamin nentrane quune diminution de la teneur en CPA de 33-36 % (Prasongsidh et al., 1998b). La transformation du lait en yaourt entrane une diminution de 70% de la concentration en CPA ds le premier jour qui sexplique en partie par lacidification du milieu (Prasongsidh et al. 1998c). Une concentration rsiduelle gale 12% de la concentration initiale subsiste aprs 21 jours de conservation du yaourt. La teneur en CPA est environ 2 fois plus importante dans le caill que dans le lait lors de sa transformation en fromage selon Prasongsidh et al. (1999). Cette contamination initiale sajoute donc une production possible de CPA pendant la maturation de certains fromages. Un taux de transfert du CPA de 5% du lait vers du beurre (Prasongsidh et al., 1999).. Par ailleurs, du CPA peut tre produit au cours du stockage des produits de salaisonnerie ; la toxine est alors stable dans le temps (Bailly et al., 2005).

Conclusion Il est peu probable que lacide cyclopiazonique prsente un risque sanitaire majeur pour lHomme dans des conditions normales. Le risque dexposition pourrait provenir surtout de la consommation de crales contamines alors que celui provenant des produits laitiers est trs hypothtique. En Amrique du Nord, la prsence de ce co-contaminant de laflatoxine B1 est considre sans consquence nfaste car le CPA est suppos participer lattnuation du danger des aflatoxines en participant leur inhibition mtabolique.

5. Les toxines trmorgnes dAspergillus et de Penicillium De nombreuses mycotoxines (plus dune vingtaine) produites par Aspergillus et Penicillium possdent des proprits trmorgnes. Ces mycotoxines sont qualifies de trmorgnes car elles entrainent comme manifestation principale des symptmes neurologiques qui vont des tremblements des crises de type pileptique pouvant conduire la mort. A ces symptmes sont associs chez lhomme une confusion mentale. Parmi les diffrentes toxines trmorgnes, certaines posent problme tant en sant humaine quen sant animale. Des cas dintoxications ont t rapports chez les animaux

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dlevag ge mais surto out chez les s animaux de d compagni ie. Les toxin nes les plus souvent inc crimines dans ces intoxicatio ons sont le penitrem p A et e la roquefo ortine. Daut tres toxines trmorgnes s comme laflatrem m, les fumitr morgnes et e le verruculo ogne sont galement t tudis. Le ve erruculogne e apparat comme tant la plus s toxique et la plus tudi e de ce gro oupe de myc cotoxines. Le es connaissa ances sur les myco otoxines trm morgnes sont encore pa arcellaires. prits phys sico-chimiques et mth hodes danalyse 5.1. Prop Les mycotoxines tr rmorgnes sont des indoles i diterpnes de structure va arie dont quelques exemple es sont donn s en figure 5 . es de quelqu ues toxines trmorgne es Figure 5 : Structure

aflatrem

tremorgne eA fumit

Roquef fortine

Penit trem A

La CCM M et aussi la LC-MS permettent de dtecter d et de d quantifier r le penitrem m A et la roq quefortine dans des s aliments (N Naude et al., 2002). 5.2. Fact teurs favoris sant le dve eloppement De nomb breuses esp pces de moisissures son nt capables de synthtis ser des myco otoxines trm morgnes comme lillustre l le tableau suivan nt : xine M Moisissures es productrice Mycotox Penitrem mA P Penicillium cy yclopium, Pe enicillium ver rruculosum, Penicillium P cr rustosum Penitrem mE P Penicillium cr rustosum Aflatrem m A Aspergillus fla avus, Asperg gillus clavatu us Roquefo ortine, PR Penicillium P c commune, P Penicillium palitans, p Pe enicillium cru ustosum, Pe enicillium toxine roqueforti ro Verrucul logne P Penicillium v verruculosum m, Penicilliu um simplicis ssimum, Pe enicillium cr rustosum, A Aspergillus ca aespitosus Verrucos sidine P Penicillium ve erruculosum var. cyclopiu um Fumitrm morgne Penicillium P brasilianum m, Aspergill lus fumiga atus, Asper rgillus cae espitosus, A, B N Neosartorya fischeri

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Des mycotoxines trmorgnes peuvent tre produites par diffrentes espces de Penicillium en culture des tempratures allant de 4C 28-30 C et aprs 7 120 jours dincubation. Une large varit de milieux de culture peut tre utilise pour des pH initiaux allant de 3,9 6,8. Bien que cette gamme de situations suggre que les conditions de culture ne sont pas restrictives, elles affectent le niveau de production. Ainsi, la production de toxines serait maximale entre 20 C et 26 C, augmenterait avec le temps dincubation et serait rduite lorsque la culture se fait sous agitation (Di Menna et al., 1986). Certaines mycotoxines trmorgnes ont t isoles sur du mas, des ensilages et diffrents fourrages (Valdes et al., 1985), galement dans de la bire, du fromage frais, des noix et sur de la viande fermente (Sabater-Vilar et al., 2003). La roquefortine et la PR toxine (pour P. roqueforti toxin ) sont deux mycotoxines trmorgnes produites par Penicillium roqueforti, des souches de cette moisissure sont utilises dans la maturation des fromages bleus type roquefort ou gorgonzola. La PR toxine est instable dans le fromage bleu et ragit avec lammoniaque et les acides amins libres, composs prsents fortes concentrations dans cette matrice alimentaire (Arnold et al., 1978). La slection des souches non toxinognes utilises en technologie fromagre vite la prsence de toxines. Bien que P. roqueforti soit prsent sur les crales conserves dans des conditions acides et dans les ensilages ferments, il semblerait que la roquefortine nait pas t isole de crales ou daliments destins lanimal (Haggblom, 1990).

5.3. Proprits toxicologiques Les mycotoxines trmorgnes sont neurotoxiques. Les symptmes caractristiques dune intoxication sont des tremblements musculaires et une hyperexcitabilit (Valdes et al., 1985). 5.3.1 Mcanisme daction : Les mcanismes dactions des mycotoxines tremorgnes sont complexes et incompltement connus. Le verruculogne et le penitrem A augmenteraient la libration spontane de glutamate et daspartate (neurotransmetteurs excitateurs) sur des synaptosomes isols partir de diffrentes rgions cervicales de rats et de moutons. Elles diminuent par ailleurs la libration de GABA, neuromdiateur inhibiteur. Ces effets apparaissent dans les tissus sub-corticaux et sont totalement rversibles. Laflatrem modulerait galement la libration de neurotransmetteurs mais serait aussi capable faible dose dinduire une dgnrescence du processus neuronal au niveau des systmes de neurotransmetteurs de lhippocampe (Norris et al., 1980 ; Valdes et al., 1985 ; Bradford et al., 1990). Une anesthsie aux barbituriques bloque les effets de doses ltales de trmorgnes tandis que le diazpam diminue les tremblements sans les arrter totalement. Ce dernier rsultat montre que cet anxiolytique anticonvulsif na pas daction spcifique sur les trmorgnes. En effet, les barbituriques auraient un effet pr synaptique sur l'inhibition GABA-ergique tandis que le diazpam augmente lefficacit des synapses au neurotransmetteur GABA en agissant sur ses rcepteurs. Ainsi, en se liant une sous-unit spcifique du rcepteur GABA, les benzodiazpines ne stimulent pas directement le rcepteur mais le rendent plus efficace do la diminution et non linhibition complte de lactivit nerveuse (Peterson et al., 1982). 5.3.2 Toxicocintique : Peu dtudes sur la toxicocintique des toxines tremorgnes sont disponibles. Chez le rat, le verruculogne radiomarqu se distribuerait dans de nombreux tissus, notamment les reins, le cur, les intestins et diffrentes rgions cervicales mais saccumule prfrentiellement dans le foie avant de subir une excrtion biliaire (Perera et al., 1982). Chez le mouton, 2 heures aprs ladministration intra-veineuse de 75 g/kg p.v. de verruculogne radiomarqu au 14C un animal pr-trait au barbiturique afin dviter les tremblements et les convulsions, 28 % de la toxine ont t retrouvs dans le foie et lintestin grle, 0,5 % tant excrt dans les urines. Quelques traces de radioactivit ont t dtectes dans le cortex et le corpus striatum (Perera et Mantle, 1982). Le verruculogne est mtabolis dans le foie en quatre mtabolites plus hydrophiles, qui sont ensuite excrts par voie biliaire. Aucun compos glucuronoconjugu nest retrouv (Laws et al., 1987).

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5.3.3 Toxicit aigu et sub-aigu : Le tableau suivant illustre la toxicit aigu de certaines mycotoxines trmorgnes (daprs Peterson et al., 1982) : Mycotoxine Toxicit Penitrem E 2,25 mg/kg ip* souris : tremblements Aflatrem 0,5 mg/kg ip* souris : tremblements Penitrem A 250 g/kg ip* souris : tremblements DL50 souris = 1,05 mg/kg 24 25 g/kg vo mouton: ltal 2,2 4,4 g/kg iv* mouton : tremblements Roquefortine 1/10me de lactivit du penitrem A Verruculogne 3,04,0 g/kg vo* mouton : tremblements 13,3 g/kg vo* mouton : ltal DL50 = 2,4 mg/kg ip* Fumitrmorgne 1/10me de lactivit du verruculogne * administrations par voie : intra-pritonale : ip, intra-veineuse : iv , orale : vo. Chez le rat, 2,5 mg/kg pc de verruculogne administrs par voie intra-veineuse entranent des tremblements et de lincoordination motrice dans les 6 25 minutes suivant linjection. Les symptmes deviennent plus svres aprs 25 minutes. Chez le veau, les principaux troubles observs sont: tremblements, ataxie, rigidit musculaire et pisodes convulsifs. Des augmentations significatives des concentrations plasmatiques dacide lactique, acide pyruvique, de glucose et de lactivit de la cratine phosphokinase sont rapports. Ces modifications plasmatiques ont t interprtes comme tant le rsultat deffets secondaires de lintoxication. Le seul changement microscopique observ dans les tissus est une accumulation de lipides au niveau du foie (Cysewski, 1975). Chez le chien, aprs administration intrapritonale de penitrem A, aucun trouble nest observ la dose de 0,125 mg/kg alors que des tremblements et une crise convulsive apparaissent en 10 minutes la dose de 0,5 mg/kg (Hayes et al., 1976). Une ncrose hpatique massive est note chez les chiens recevant de 2,5 5 mg/kg. Un traitement aux barbituriques fait rgresser rapidement les signes cliniques, les paramtres plasmatiques retrouvant galement leur valeur normale. Une tude comparative a t mene sur des moutons et des porcs ayant reu respectivement du verruculogne et du penitrem A. Des doses orales de verruculogne allant de 3,0 4,0 g/kg induisent des tremblements moyens forts chez le mouton. Ce mme degr de tremblements est observ chez le porc pour des doses de 6,0 8,2 g/kg (Peterson et al., 1982). La dose de verruculogne la plus leve, 13,3 g/kg, est ltale pour le mouton par dfaillance respiratoire et circulatoire faisant suite aux convulsions. En revanche, chez le porc, cette dose provoque des tremblements svres mais lanimal commence se rtablir aprs 2 heures. Le penitrem A apparat comme moins toxique puisquil faut des doses de 24 g/kg chez le porc et de 25 g/kg chez le mouton pour produire des tremblements de mme svrit que ceux observs avec 13,3 g/kg de verruculogne. Ladministration ritre de cette toxine ne permet pas de mettre en vidence une augmentation des effets observs (Peterson et al., 1982). La roquefortine provoque des crises dpilepsie lorsquelle est administre par voie intra-pritonale des souris mais des doses trs leves, de 50 100 mg/kg pc. La PR toxine a une DL50 de 11 mg/kg chez le rat et de 5,8 mg/kg chez la souris. La PR toxine ragissant avec lammoniaque et les acides amins libres, prsents fortes concentrations dans le fromage bleu, les drivs forms partir de cette toxine ont galement t tudis : leur toxicit aigu par voie intra-pritonale est considrablement plus faible que celle du compos parent (Arnold et al., 1978). 5.3.4 Toxicologie gntique : La gnotoxicit de 5 mycotoxines trmorgnes (fumitrmorgne B, paxilline, penitrem A, verruculogne et verrucosidine) isoles de viandes fermentes a t value par des tests de mutations gniques (sur S. Typhimurium et MLA/TK sur cellules de mammifres) ainsi que par un test daltration primaire de lADN (comte sur lymphocytes humains) (Sabater-Vilar, 2003). A lexception du penitrem A, toutes les mycotoxines analyses prsentaient un certain niveau de gnotoxicit :

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la verrucosidine est apparue comme ayant le potentiel gnotoxique le plus important : les rsultats du test dAmes sur souche TA1538 aprs activation mtabolique et du test de comte sur lymphocytes humains sont positifs, - le verruculogne est positif sur test dAmes, avec les souches TA1537, TA1535, TA1538 et TA98 aprs activation mtabolique et sur souches TA1537, TA1535, TA1538 et TA100 sans activation mtabolique, - le fumitrmorgne B a donn des rsultats positifs sur le test comte. Seul le verruculogne a t tudi in vivo. Cette mycotoxine ninhibe pas la rplication cellulaire dans la moelle osseuse de souris NMRI (Sabater-Vilar, 2003). -

5.4. Exposition humaine 5.4.1. Effets sur la sant humaine (donnes pidmiologiques) Un cas dencphalopathie chez un jeune homme expos de fortes concentrations de poussires issues dun ensilage de crales moisies a t rapport (Gordon et al., 1993). Les symptmes observs consistaient en une dmence et des tremblements caractristiques. Ces troubles ont disparu en une semaine. En labsence dautres hypothses de source(s) pouvant induire ces symptmes, les auteurs ont conclu une intoxication due linhalation de mycotoxine(s) trmorgne(s). Cest le seul cas rapport de mycotoxicose susceptible dtre reli ces toxines. 5.4.2. Exposition de lHomme La roquefortine a pu tre retrouve dans les fromages de type bleu des concentrations pouvant atteindre 6,8 mg/kg (Scott et al., 1977). Lutilisation de souches non toxinognes en technologie fromagre vite la prsence de cette toxine. Certaines autres toxines trmorgnes (penitrem A en particulier) peuvent tre synthtises la temprature du rfrigrateur et/ou temprature ambiante habituelle sur de nombreux substrats : pain, fromages frais, noix et cacahutes, ptes et riz cuits, dchets alimentaires divers Nanmoins il ny a pas de donnes rcentes suffisantes pour estimer lexposition humaine.

5.5. Exposition animale La plupart de ces intoxications naturelles dues aux mycotoxines trmorgnes produites par Penicillium et Aspergillus concernent les animaux de compagnie et plus particulirement les chiens. 5.5.1 Chez le chien Le penitrem A et la roquefortine sont le plus souvent incrimins. La sensibilit de lespce canine la toxicit aigu du Penitrem A est connue depuis de nombreuses annes. En labsence de traitement, une dose de 0,5 mg/kg pc est mortelle en quelques heures (Hayes et al., 1976), et les nombreux cas dintoxication naturelle dcrits dans la littrature soulignent la frquence leve de lexposition (lie au comportement dtritivore) et la particulire sensibilit des chiens cette toxine. La premire description (Arp et Richard, 1979 ; Richard et Arp, 1979), se rfre au cas de deux jeunes chiens (gs de 3 mois et un an) ayant consomm du fromage frais, qui aprs avoir t conserv trop longuement au rfrigrateur, et jet (car moisi), fut rcupr dans la poubelle par les deux chiens puis consomm par eux. Sen sont suivis des vomissements et dun syndrome neurologique avec tremblements et crise convulsive. La seconde description se rfre un cas dintoxication faisant suite la consommation de noix moisies (car laisses sur le sol tout lhiver aprs la rcolte et envahies de moisissures) (Richard et al., 1981). Les mmes dsordres neurologiques sont observs. Dans ces 2 observations initiales faites aux Etats-Unis, la moisissure responsable (Penicillium crustosum) et la toxine (penitrem A) ont t identifies mais aucune quantification de cette dernire na pu tre ralise. Un troisime cas a t rapport (en Australie) chez un jeune chien ayant consomm un petit pain moisi (Hocking et al., 1988). Le mme tableau clinique de type convulsif est observ. Une concentration de 35 g/g de penitrem A y a t retrouve dans le reliquat de pain, mais pas de verruculogne. La quantit globale de penitrem A consomme par ce chien a t estime 3,5 mg soit environ 175 g/kg p.c. La consommation dun fromage pte bleue altr a galement conduit un tableau clinique voisin (tremblements, spasmes ttaniformes, opisthotonos) associ la prsence de roquefortine (Puls et Ladyman, 1988).

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Un cas faisant suite la consommation de riz contamin par Penicillium crustosum a t rapport chez deux chiens en Afrique du Sud en 2002. Lanalyse de cet aliment a rvl la prsence de 2,6 g/g de penitrem A et 34 g/g de roquefortine. Le riz incrimin tait rest durant un temps indtermin dans un rfrigrateur et tait couvert de moisissures gris-vert. Les deux chiens intoxiqus ont dvelopp des signes caractristiques peu de temps aprs lingestion : vomissements, salivation, tremblements, ataxie. Cependant aucune quantification prcise de la quantit de mycotoxine effectivement consomme par chaque animal na pu tre ralise (Naud et al., 2002). Un cas dintoxication concernant 4 chiens provenant dun mme foyer a t observ aux Etats-Unis. Un tableau clinique domin par des manifestations convulsives a t dcrit suite la consommation de dchets mnagers altrs. Le diagnostic a t confirm par lanalyse du contenu stomacal dun des chiens. Du penitrem A ainsi que de la roquefortine C ont pu tre identifis (Boysen et al., 2002). Un cas dintoxication assez similaire (avec polypne, tachycardie et ataxie) a t dcrit au Canada (Walter, 2002). Young et al. (2003) ont dcrit lintoxication de 2 chiens ayant consomm des aliments trouvs dans les ordures mnagres et contenant de la roquefortine et du penitrem A. Suite lingestion, les chiens ont dvelopp des tremblements musculaires et des crises dpilepsie. La roquefortine C a t retrouve majoritairement dans le fromage frais (37 g/g et seulement 3,5 g/g de penitrem A) consomm par le premier chien et seul le penitrem A a t retrouv dans les macaronis et le fromage (20 50 g/g) consomms par le second. Les signes cliniques dintoxication ont rgress en 24 48 heures. En dfinitive, du fait de leur comportement dtritivore, cest--dire de consommateurs occasionnels de denres alimentaires familiales altres et limines sans prcaution, de dchets ou de restes alimentaires laisss disposition, les carnivores domestiques, et notamment le chien, sont particulirement exposs au risque li la prsence de ces mycotoxines. Le syndrome convulsif qui domine le tableau clinique rtrocde facilement en moins de 48h la suite dun traitement sdatif (pentobarbital) mis en place prcocement, associ un ventuel lavage destomac et une fluidothrapie. 5.5.2 Chez les ruminants Les intoxications avec des effets trmorgnes chez les animaux de rente sont le plus souvent dues aux mycotoxines trmorgnes produites par Neotyphodium (toxines dendophytes) et Claviceps (cf.chapitres spcifiques). En fvrier 1975, une neurotoxicose trmorgnique a dcim un troupeau de bovins au Transvaal du nord (rgion du nord-est de l'Afrique du Sud). Les symptmes de la maladie ont t une incoordination, une dmarche raide des postrieurs, des trmulations gnralises des muscles stris accompagnes de parsie ou paralysie et de constipation. A lautopsie, une dgnrescence et une ncrose dans certains muscles stris, des hmorragies des sreuses et une stase gastro-intestinale ont t observes. Aprs analyse du contenu de la nourriture de ces animaux, la prsence dAspergillus clavatus dans des rsidus de sorgho utiliss dans le brassage de la bire, a t mise en vidence sans dterminer toutefois la nature exacte de la toxine responsable. Les auteurs notent que celle-ci nest ni la patuline, ni la tryptoquivaline, ni aucune autre substance trmorgne connue (Kellerman et al., 1976). Aspergillus clavatus a galement t incrimin dans une neurotoxicose ltale (96 % de mortalit) chez un troupeau de moutons ayant consomm des grains dorge contamins. Les signes cliniques rapports sont des tremblements, une boiterie, une dmarche anormale, une paralysie puis la mort de lanimal dans les 17 jours (Shlosberg et al., 1991).

Conclusion Les intoxications par des mycotoxines trmorgnes produites par Aspergillus et Penicillium sont principalement observes chez le chien. Chez les ruminants, la toxicit aigu de ces composs est importante, mais peu dinformations existent quant leur toxicit chronique ou au risque de transfert dans les productions. Chez lhomme, si les intoxications aigus sont rares en raison du caractre trs altr des aliments contamins de fortes teneurs, il est difficile destimer un niveau rel dexposition.

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Il serait donc important de : i) prciser les dangers dune exposition chronique ces composs et leur caractre gnotoxique, ii) disposer de donnes sur leur transfert dans les productions, principalement lors dexposition des ruminants de faibles teneurs, iii) estimer les niveaux de contamination des produits connus pour leur contamination possible par ces moisissures.

6. Les sporidesmines Les sporidesmines sont synthtises par Pithomyces chartarum. Elles contaminent lherbe destine la pture et sont lorigine de la sporidesmiotoxicose, maladie communment appele eczma facial des ruminants car elle touche les ovins, les bovins et moins frquemment les caprins. Cette affection est endmique au Pays Basque en France et dcrite dans diffrents pays dont la Nouvelle Zlande, lAustralie, lAfrique du Sud, lUruguay, lArgentine, les les des Aores Portugaises (Bezille, et al., 1984 ; Bonnefoi et al., 1988 ; Cheeke et al.,1995 ; Guerre et al., 1998 ; Le Bars et al., 1996 ; Pinto et al., 2002). Dun point de vue clinique, elle volue en deux phases, latteinte cutane est postrieure une insuffisance hpatique brutale. Elle entrane une diminution des performances (chute de production de lait et de la vitesse de croissance des agneaux, augmentation du taux de rforme) dont limportance est difficile valuer en France. Par contre, limpact conomique de leczma facial en Nouvelle Zlande, pays le plus touch par la maladie, tait estim en 2003, 100 millions de dollars par an (Media Statement Of Association of Crown Research Institute, 2003). Les moyens de lutte contre la maladie reposent essentiellement sur une prophylaxie dfensive, relativement onreuse et ne permettant pas son radication totale.

6.1. Facteurs favorisant le dveloppement Les sporidesmines apparaissent avec les premires pluies dautomne faisant suite un t chaud et sec, sur des prairies dites risque. Il sagit le plus souvent de Dactyle, de Ray Grass, et parfois de Trfle blanc. Labsence de fauche au cours de lanne et le surpturage en septembre sont des facteurs additionnels de risque (Bezille et al., 1984 ; Bonnefoi et al., 1988 b). Lherbe morte o se dveloppe la moisissure, que lon trouve au ras du sol dans les ptures, constitue le seul mode dintoxication des ruminants. Jusqu prsent, la maladie na pourtant t observe que dans un nombre restreint de pays dans lesquels les souches toxinognes sont probablement plus frquentes. De plus, Pithomyces chartarum se dveloppe particulirement dans des conditions de dhumidit leve (100 %) temprature optimale de 20 25 C et (Le Bars et al., 1990). La production de toxines est gnralement proportionnelle la sporulation du champignon ; ainsi la contamination des ptures est estime en comptant les spores rcoltes par divers moyens mcaniques (Bonnefoi et al., 1988 b). Ces dernires sont noires ou brun noirtres, rugueuses, de 8 20 m x 10 30 m. Au laboratoire, le champignon montre de fortes variations morphologiques en culture, ce qui rend parfois dlicate son identification. Cependant, certaines souches ne produisent pas de toxines bien quayant une intense sporulation. Un rsultat suprieur 200 000 spores par gramme dherbe humide est considr comme niveau dexposition aigu entranant un syndrome tandis quun rsultat allant de 80 100 000 spores est considr comme niveau dangereux. Lexposition chronique doit galement tre prise en considration car un animal nourri par lherbe dune pture contenant 40 000 spores par gramme sur une longue priode est susceptible de dvelopper un eczma facial (Dinger et al., 1999).

6.2. Proprits physico-chimiques et mthodes danalyse La synthse des sporidesmines passe probablement par la condensation du L-tryptophane avec la Lalanine qui conduit diverses molcules (sporidesmines A, B, C, D, E, F, G, H, I et J de masses molculaires comprises entre 450 et 500) dont les proportions relatives peuvent varier dun isolat lautre. La sporidesmine A reprsente gnralement plus de 80 % de la production totale (Bonnefoi et Sauvagnac, 1988).

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Les sporidesmines sont des dictopiprazines aromatiques chlores contenant un pont disulfure, en relation probable avec une toxicit membranaire qui sobserve facilement in vitro et exprimentalement chez les animaux de laboratoire. La figure 6 illustre la structure molculaire de la sporidesmine A (masse molculaire : 473,05 g/mol). Ces toxines sont trs hydrophobes et particulirement instables en solution alcoolique ou aqueuse.

Figure 6 : structure chimique de la sporidesmine A La spectrophotomtrie UV 254 nm permet de doser la sporidesmine A en solution pure tandis que la spectroscopie infra-rouge permet de diffrencier les diffrentes sporidesmines entre elles (Ronaldson et al., 1981). Des mthodes sont utilisables pour identifier et doser les sporidesmines partir de culture pure de Pithomyces chartarum. Toutefois, aucune mthode ne permet de les dtecter directement dans un prlvement dherbe.

6.3. Proprits toxicologiques 6.3.1 Mode daction Leczma facial se caractrise par une photosensibilisation et un ictre secondaires dimportantes altrations hpatiques. Les sporidesmines sont parmi les molcules les plus hpatotoxiques pour les ruminants. Laspect biphasique de la pathologie a t facilement reproduit dans des conditions exprimentales chez le mouton aprs administration orale dune dose unique de toxines (Bonnefoi et Sauvagnac, 1988). La ractivit molculaire de ces toxines est lie une raction dchanges dlectrons avec dautres thiols, suivie de lauto-oxydation de leurs thio-drivs. Les sporidesmines sont capables, aussi bien in vitro quin vivo, dinitier une srie de ractions radicalaires aboutissant la gnration danion superoxyde et de radical hydroxyde. La raction est active par de faibles concentrations dions Cu2+ ou Fe2+ ; alors que le Zn2+ est inhibiteur. Il a t montr que le fer et surtout le cuivre catalysent fortement lauto-oxydation de la sporidesmine rduite in vitro. Le zinc, au contraire, se fixe un mtabolite de la sporidesmine, empchant ainsi son auto-oxydation. Il rduit en outre labsorption du cuivre et ainsi la quantit de cuivre disponible dans le foie pouvant catalyser loxydation de la toxine (Bonnefoi et Sauvagnac, 1988 ; Bonnefoi et al., 1988 b; Dinger et al., 1999). 6.3.2 Toxicocintique et cibles principales La sporidesmine A est absorbe au niveau du tractus digestif et limine par voie biliaire et urinaire. Les concentrations biliaire et urinaire sont respectivement 100 et 10 fois suprieures la concentration plasmatique. La forte excrtion biliaire explique probablement latteinte hpatique. Les sporidesmines dtruisent les membranes cellulaires avec lesquelles elles entrent en contact par un mcanisme de peroxydation lipidique. Les membranes canaliculaires des hpatocytes et les membranes apicales des cellules paritales des canaux biliaires sont les plus touches. Les mmes observations ont t rapportes au niveau des reins, mais un degr moindre. La cholestase, rsultant de latteinte hpatique, empche llimination de la phyllorythrine, produit de dgradation de la chlorophylle par la microflore du rumen, qui saccumule alors dans lorganisme. Ce compos circule donc dans le sang jusqu'aux vaisseaux capillaires de la peau. Comme il sagit dun pigment photodynamique, il devient ractif aprs exposition aux rayonnements ultra-violets du soleil et provoque de ce fait la destruction des membranes des cellules cutanes et des muqueuses exposes (Bonnefoi et Sauvagnac, 1988 ; Dinger et al., 1999, Phua et al., 1998).

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6.3.3 Autres actions Des tudes de toxicologie gntique in vitro et in vivo ont t menes en 1992 par Ferguson et al. Les rsultats ont dmontr labsence de pouvoir mutagne de la sporidesmine A purifie dans le test dAmes sur les souches TA98, TA100, TA102 et TA1537. En revanche, la sporidesmine A est considre comme un clastogne potentiel in vitro (sur cellules hamster chinois, CHO). Ces derniers rsultats nont pas t confirms in vivo par le test de micronoyaux chez le mouton. Les auteurs ont ainsi conclu que la sporidesmine nest pas clastogne pour cette espce (Ferguson et al., 1992). Elle ne lest pas non plus pour la souris (Munday et al., 1993). Il semble que le mtabolisme jouerait un rle dans la protection des effets clastognes de la sporidesmine A sur lanimal vivant. En 1990, Waring et al. ont rapport que la sporidesmine A pouvait induire de lapoptose in vitro sur des macrophages et des lymphocytes T de souris. Cependant, aucune tude na montr quelle induit ce mme processus dans les hpatocytes et il nest pas certain que ce phnomne se produise in vivo. A ce jour, aucune donne nest disponible concernant les effets cancrognes des sporidesmines ni chez les ruminants, ni chez les animaux de laboratoire. 6.4. Exposition humaine Le risque sanitaire pour lhomme est trs mal connu, puisque peu dinformations sont disponibles sur le passage dans les produits animaux.

6.5. Exposition animale 6.5.1. Effet sur la sant animale : leczma facial des ruminants Un eczma facial a t observ sur des moutons, des vaches, des chvres, des daims et des lamas ayant ingr de lherbe contamine (Bonnefoi et Sauvagnac, 1988 ; Coulton et al., 1997). Les ovins et les bovins sont les animaux les plus touchs par leczma facial. Lespce la plus sensible est le lama, suivi du daim et du mouton. Le btail laitier, les bufs et les chvres sont moins sensibles la maladie. La morbidit est extrmement variable (0 100 %) en fonction du troupeau et de lanne ; il en est de mme pour la mortalit. Dans certains cas, 18 % des animaux dun troupeau sont affects, avec 31 % des animaux prsentant des signes cliniques et 14 % de mortalit (Pinto et al., 2002). Dans dautres circonstances, le taux de pertes peut atteindre 70 %. Le taux de mortalit chez les agneaux est couramment 20 % (Dinger et al., 1999). Diverses hypothses sont avances pour expliquer les divergences observes : htrognit des habitudes alimentaires, htrognit de la distribution de la moisissure dans les ptures, existence dun facteur de rsistance dorigine gntique Dun point de vue clinique, linflammation dmateuse faisant suite lapparition de lrythme dbute gnralement par les oreilles pour stendre toutes les rgions dpigmentes : les paupires, les orifices nasaux. La respiration est bruyante et difficile, la prise de nourriture est douloureuse. Linconfort de lanimal est dautant plus important que la vulve et les mamelles peuvent galement tre touches, ce qui gne parfois la miction et interdit la traite mcanique. Ces symptmes rgressent lorsque les animaux sont mis labri de la lumire, avec ou sans traitement mdical. En labsence de traitement, la deuxime phase de la maladie se met alors en place aprs quelques jours. Elle se caractrise par lapparition dune dermatite croteuse prurigineuse et dune surinfection bactrienne qui produit des scrtions plus ou moins purulentes. La cicatrisation est trs lente. Les activits des enzymes hpatiques telles que la phosphatase alcaline (PAL) et la gamma-glutamyl transpeptidase (GGT) peuvent tre multiplies par plus de dix. La recherche dune trs forte augmentation de la GGT, permettant dvaluer la svrit des atteintes hpatiques, a dailleurs t propose comme un test de dpistage des animaux atteints sans photosensibilisation. Dans un troupeau, la frquence des signes cutans peut naffecter que 1 10 % des animaux tandis que la biochimie srique rvle que plus de 50 % prsentent des lsions hpatiques. Cet lment se traduit par des pertes de production particulirement insidieuses (Bonnefoi et al.,1988a). La production de laine diminue chez le mouton de mme que la production de lait chez les brebis et les vaches. Aucun

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avortement na t constat lors de ces deux phases ; en revanche, on note une diminution de la fertilit et de la fcondit (Bonnefoi et al., 1988ab). En prsence dune enzootie dclare, lleveur peut traiter ses animaux ou les abattre. Le traitement est non spcifique. Il consiste retirer lanimal du pturage et le placer lombre, puis lui fournir une alimentation forte digestibilit afin de faciliter la rgnration hpatique. Un traitement symptomatique des lsions cutanes et du prurit est mis en place. Il est recommand de tarir les animaux en lactation afin de prvenir lapparition de mammites. Ladministration orale de sulfate de zinc est efficace pour limiter la toxicit des sporidesmines. En Nouvelle Zlande la slection dindividus gntiquement rsistants a t propose (Morris et al., 1995 ; Phua et Crawford, 1998 ; Phua et al., 1998). 6.5.2. Persistance ltat rsiduel Aucune donne concernant lventuelle excrtion lacte des toxines ni une ventuelle persistance ltat rsiduel dans les tissus nest disponible ce jour. Cependant, les proprits physico-chimiques des sporidesmines (composs basiques, trs peu hydrosolubles) suggrent quelles pourraient tre retrouves dans le lait danimaux consommant des aliments contamins. Bien quaucune preuve nexiste, il convient toutefois dliminer de la distribution tout lait issu danimaux prsentant une suspicion de toxicose (Guerre et al., 2000).

Conclusion Bien que laffection observe en France soit moins grave que celle couramment rencontre en Nouvelle Zlande, Afrique du Sud ou Australie, la prsence de sporidesmines dans lalimentation animale prsente un rel problme sanitaire pour certaines productions, notamment les ovins. Le risque sanitaire pour lhomme est trs mal connu, puisque peu dinformations sont disponibles sur le passage dans les produits animaux. Il serait donc important de connatre le devenir des sporidesmines chez lanimal et notamment de mettre en place des recherches sur le transfert dans le lait.

7. Les stachybotryotoxines

Les stachybotryotoxines sont des mycotoxines synthtises par Stachybotrys chartarum (synonymes Stachybotrys atra, S. alternans) appartenant la famille des trichothcnes macrocycliques. Il sagit des satratoxines, isosatratoxines F, G, H, roridine E et verrucarine J. Ces toxines sont responsables de la stachybotryotoxicose, observe principalement chez les chevaux, qui sont les animaux les plus sensibles, suivis des bovins, des porcins et des ovins. Cette affection est dcrite dans de nombreux pays mme si elle sobserve surtout en Europe de lEst, en Hongrie notamment. La stachybotryotoxicose est galement prsente en France, en particulier au sud de la Loire. Chez les quids, des signes cutano-muqueux de ncrose, limits la face, sont suivis par des signes systmiques graves, associs une neutropnie et une thrombopnie. Dans sa forme chronique la plus typique, la maladie volue en un mois vers la mort. Dans les cas dintoxications aigus, la mort peut survenir en quelques heures. En sant humaine, Stachybotrys chartarum est responsable de troubles pulmonaires, secondaires linhalation de spores. Cet aspect sanitaire de la toxicit de la moisissure hors voie alimentaire ne sera pas trait dans ce rapport.

7.1. Facteurs favorisant le dveloppement Stachybotrys chartarum est un champignon saprophyte qui se dveloppe sur les matriaux riches en cellulose tels que les ensilages, le foin et surtout la paille mal stocks. Cette dernire source est dailleurs responsable de la plupart des stachybotryotoxicoses animales. La moisissure a t galement identifie sur orge, bl, canne sucre, pois, coton et ray grass. Bien que la contamination survienne le plus souvent dans les climats continentaux (Europe de lEst surtout), elle sobserve galement dans les rgions climat doux et chaud : cas rapports au Sud Ouest de la France et plus

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rcemment au Maroc (Tantaoui-Elaraki et al., 1994). Stachybotrys chartarum est donc thermotolrant, il sporule de 2 40 C, mais ne se dveloppe que lorsque lhumidit est suprieure 80%. Les satratoxines, toxines majoritairement produites, ne sont synthtises que lorsque lhumidit atteint 100 % (Nikulin et al., 1994). La frquence des souches toxinognes est variable selon les pays et relativement faible en France (15%) (Le Bars et al., 1991). Ces diffrences expliquent les diffrences de toxicit observes (Andriienko et al., 1997). Stachybotrys chartarum est une moisissure noire verdtre ; les brins de paille contamins apparaissent de ce fait beaucoup plus foncs que les brins sains. Un diagnostic diffrentiel doit tre ralis avec lanthracnose, il nest possible que par examen la loupe binoculaire. Une dtection spcifique de S. chartarum dans des cultures pures peut tre ralise par PCR quantitative (CruzPerez et al., 2001). Les rsultats dune tude rcente ont montr que deux chemotypes de S. chartarum existent : cha-A et cha-S. Leur phylognie et leurs profils mtaboliques permettent de les diffrencier : en effet, seul le chemotype S (cha-S) produit des trichothcnes macrocycliques (Andersen et al., 2003). Une tude ancienne a montr que 80 % des souches isoles de cas de stachybotryotoxicose observs chez les animaux de ferme en Europe de lEst en produisaient (Jarvis et al., 1986).

7.2. Proprits physico-chimiques et mthodes danalyse En 1973, Eppley et Bailey ont t les premiers isoler les trichothcnes macrocycliques produits par Stachybotrys chartarum. Cette moisissure labore une large varit de molcules : principalement des satratoxines F, G et H et en quantit moindre des isosatratoxines F, G et H, roridine E, et verrucarine J. Gnralement les souches de S. chartarum produisent 40 70 % de satratoxine H pour 30 40 % dautres trichothcnes macrocycliques (Bata, et al.,1985). Les satratoxines sont donc considres comme les plus dltres des toxines produites par la moisissure mme si la quantit totale de toxines synthtise est relativement faible : infrieure 10 mg/kg (Jarvis et al., 1986 ; Nelson et al., 2001). Un nouveau mtabolite, lhydroxyroridine E, a t identifi rcemment (Andersen et al., 2003). S. chartarum produit en outre des trichothcnes simples, notamment la trichodermine et le trichodermol, qui sont des prcurseurs des trichothcnes macrocycliques. La figure 7a illustre la structure de ces deux molcules.

Figure 7a : structures des prcurseurs des trichothcnes macrocycliques Les trichothcnes macrocycliques sont des lactones poxydes. Ce sont des molcules neutres, liposolubles et trs peu hydrosolubles. La satratoxine H est la plus polaire des toxines produites. Elle est insoluble dans leau et soluble en solution alcoolique et dans des solvants organiques polaires tel que le mthanol. La figure 7b illustre notamment sa structure (masse molculaire : 528l).

Figure 7b : Structures de la satratoxine G, satratoxine H, et isosatratoxines F et G

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Les trichothcnes macrocycliques de S. chartarum possdent un maximum dabsorption dans lUV compris entre 255 et 262 nm, caractristique du butadine conjugu (Harrach et al.,1981et 1982). Lhydrolyse des trichothcnes macrocycliques conduit lobtention dun alcool unique, le verrucarol. Bien quil nexiste aucune mthode de rfrence et quaucune technique de dosage ne permette lidentification directe dans les aliments ou la recherche de rsidus, de nombreuses mthodes sont utilisables pour identifier et doser les stachybotryotoxines partir dun extrait mthanolique concentr de culture de Stachybotrys chartarum. La chromatographie sur couche mince permet de dtecter les diffrentes toxines synthtises tout en les sparant (Bata et al., 1985 ; Jarvis et al., 1986). La chromatographie liquide haute performance et la chromatographie en phase gazeuse couples une dtection par spectromtrie de masse ou barrette de diodes permettent de les quantifier (Bata et al., 1985 ; Jarvis, et al., 1998). Les trichothcnes macrocycliques peuvent tre dtects par GC-MS et GC-MS-MS, aprs drivation de lextrait pralablement hydrolys en verrucarol. Lextraction liquideliquide des extraits fongiques permet dviter les pics interfrents lors de lanalyse (Niels and Thran 2001). Il est noter que lHPLC-UV ne permet pas la dtection des trichothcnes simples tels que le trichodermol et le verrucarol (Jarvis et al., 1998). Des tests de toxicit biologique sont souvent raliss dans un premier temps, afin de cribler les chantillons. Il en existe diffrents types dont le test de dermatotoxicit sur lapin (Andriienko et al., 1997), le test de cytotoxicit utilisant une ligne de cellules ftales de flin (valuation de linhibition de croissance cellulaire) (Nikulin et al., 1994) ou le bioessai sur Artemia salina. Ce dernier est facile mettre en uvre du fait de son faible cot et bnficie de plus dune bonne sensibilit. Il sagit en fait dobserver leffet des toxines sur la mortalit et la mobilit de larves dArtemia salina maintenues en solution saline et tout juste closes (Tantaoui-Elaraki et al., 1994).

7.3. Proprits toxicologiques 7.3.1 Mcanisme daction Les trichothcnes macrocycliques sont les lments les plus cytotoxiques de la famille des trichothcnes. Ce sont des inhibiteurs de synthse protique qui ont pour cible principale les cellules prsentant une activit mitotique leve, telles que les leucocytes et les cellules des pithliums (Chung et al., 2003). Le mode daction primaire des trichothcnes est une interaction directe avec les ribosomes, qui conduit une inhibition de linitiation et de llongation lors de la traduction (Lee et al., 1999). Les relations dose-effet des trichothcnes de Stachybotrys chartarum sont encore mconnues du fait des difficults de production et disolement de ces toxines sous forme purifie (Rao et al., 2000 ; Servantie et al., 1985). Les DL50 chez la souris dpendent de la nature de la toxine et de la voie dexposition. Elles peuvent aller de 1 7 mg/kg pc. La satratoxine H est la plus cytotoxique des trichothcnes macrocycliques aussi bien par voie orale que par inhalation (Bata et al., 1985). Les effets toxiques des trichothcnes macrocycliques pourraient galement rsulter dune modification de production de cytokines, notamment de linterleukine 2. Les satratoxine G, isosatratoxine F, satratoxine H, roridine A et verrucarine A, faibles doses, stimulent fortement la production dinterleukine 2 et diminuent la viabilit cellulaire des EL-4 thymoma (modle murin de lymphocytes T4), tandis qu fortes doses, aussi bien la production de cytokines que la viabilit cellulaire sont inhibes. La roridine A et la verrucarine A semblent tre les plus immunotoxiques suivies par la satratoxine G puis la satratoxine H et lisosatratoxine F. Ltude montre par ailleurs que les trichothcnes macrocycliques sont au moins 100 fois plus toxiques que le doxynivalnol (Lee et al., 1999). Une tude de Yang et al. (2000) a montr que la cytotoxicit des trichothcnes macrocycliques est induite par un processus dapoptose, dans lequel lactivation des MAPK (mitogen-activated protein kinases) jouerait un rle. Toutefois, les mcanismes par lesquels les trichothcnes activent ces protines restent mal connus. Une tude de Chung et al. (2003) a montr que la satratoxine G induit lexpression de la MIP-2 (Macrophage inflammatory protein-2) ainsi que la transcription de son ARNm. La MIP-2 est une

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chemokine responsable du chemotactisme des neutrophiles sur le lieu de linflammation. Laugmentation de lexpression de MIP-2 et laccumulation des neutrophiles provoquent des dommages tissulaires ainsi quune inflammation. 7.3.2 Effets cliniques Une immunosuppression et une hmorragie des organes cibles sont les symptmes caractristiques dune intoxication quelle que soit lespce animale tudie ou la voie dexposition (Forgacs et al., 1958). En effet, S. chartarum synthtise non seulement des trichothcnes macrocycliques mais aussi des spirolactones, des spirolactames et des cyclosporines, qui sont des agents immunosuppresseurs (Jarvis et al., 1995). Une tude mene par Korpinen et al. (1974) a mis en vidence une embryotoxicit des toxines de Stachybotrys chartarum sur des souris auxquelles une prparation purifie de toxines a t administre per os. Les rsultats de cette tude rvlent que les stachybotryotoxines peuvent affecter le droulement normal de la gestation de femelles exposes, lors de sa phase prcoce, de faibles doses de ces toxines : augmentation significative des mortalits intra-utrines, rsorptions ou malformations ftales. De plus, lanalyse histopathologique rvle des hmorragies utroplacentaires et des membranes ftales (Korpinen et al., 1974).

7.4. Exposition humaine Chez lhomme, les affections dues Stachybotrys chartarum ne sont connues que lors dexposition par inhalation ou par contact. Il ny a en revanche aucune information concernant le transfert dans les denres alimentaires dorigine animale. De ce fait lexposition de lhomme par voie alimentaire ne peut tre estime.

7.5. Exposition animale 7.5.1. Effet sur la sant animale : la stachybotryotoxicose Toutes les espces animales peuvent tre atteintes de stachybotryotoxicose : des cas ont t rapports surtout chez les chevaux, mais nanmoins chez les moutons, les porcs, les daims, les chvres et les vaches. Le cheval est lespce la plus sensible la maladie et cest galement la plus frquemment touche : lingestion de 200 g 1 kg de paille naturellement contamine provoque la mort dun cheval en 17 heures, tandis que la dose ltale pour les bovins est trois fois suprieure, la mort survenant dans les 17 jours (Forgacs et al., 1958). Les bovins semblent plus rsistants que les autres espces aux effets des toxines (Forgacs et al., 1958). Cest en juillet 1975, en France, au parc zoologique de Paris, que le premier cas aigu de stachybotryotoxicose en Europe de lOuest a t rapport chez 52 daims ayant consomm de la paille contamine : 28 dentre eux prirent (Le Bars et al., 1977). La stachybotryotoxicose quine est dcrite comme tant une maladie saisonnire, existant sous deux formes : typique et atypique. La forme typique sobserve lors de lingestion prolonge de faibles quantits daliments contamins. Elle volue en trois stades, prcds dune phase asymptomatique durant laquelle les performances des animaux sont rduites. Le stade asymptomatique est parfois accompagn dune hyperesthsie, de rhinite avec lgre conjonctivite et des squames sur les lvres. Le premier stade clinique dure 8 30 jours ; la gorge, le nez et la muqueuse buccale montrent les premiers signes de ncrose et dulcration. Si rien nest fait, le second stade de la maladie sinstalle et dure 15 20 jours. Il se caractrise par le dveloppement progressif dune leucopnie et dune thrombopnie, avec diminution des facteurs de coagulation. Des lsions ncrotiques sont frquemment observes au niveau des membranes des muqueuses orales. Enfin, la troisime et dernire phase dure 1 6 jours et se termine la plupart du temps par la mort de lanimal. Cette phase se caractrise par une forte fivre, des diarrhes frquentes, une agranulocytose. La mort survient par surinfection bactrienne. On constate une dgnrescence hpatique, rnale et myocardique, ainsi quune atrophie des organes lymphodes avec hypoplasie mdullaire (Drobotko et al., 1945). La forme atypique, suraigu, sobserve aprs ingestion de fourrages fortement contamins et peut durer de 1 3 jours. Cette forme se caractrise par un dysfonctionnement nerveux dont les symptmes apparaissent dans les 10 heures suivant lingestion : hyper irritabilit, perte des rflexes, tremblements. Cela conduit rapidement un tat de choc, puis le plus souvent la mort de lanimal (Forgacs et al., 1958). Dans les cas dintoxications les plus graves, les animaux peuvent mourir dans

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les 15 heures aprs lingestion suite une dfaillance cardiaque, sans prsenter les symptmes caractristiques prcdemment dcrits. A titre dexemple, en novembre 1991, au Maroc, plus de 200 quins (chevaux, nes, mules) ont trouv la mort suite un cas de stachybotryotoxicose aigu (Tantaoui-Elaraki et al., 1994). Toutefois, la maladie nest pas irrversible : si elle est diagnostique temps, les animaux gurissent en quelques jours aprs le retrait de laliment incrimin sans squelle apparente (Forgacs et al., 1958 ; Le Bars et al., 1977). Ainsi, la prophylaxie passe par le contrle des conditions de stockage des pailles et des aliments. Chez les autres espces animales, les signes cliniques sont similaires. Une hypotonie du rumen et des diarrhes sont dcrites chez les ovins et les bovins. Aucune baisse significative de la production laitire chez les bovins et les ovins et de la laine chez les ovins nest dplorer. Chez les porcins, des cas rapports font aussi tat davortements. Le taux de mortalit est lev chez les porcelets : il peut atteindre 65 % (Wyllie et al., 1978). 7.5.2. Persistance ltat rsiduel Aucune donne concernant lventuelle excrtion lacte des trichothcnes macrocycliques ni une ventuelle persistance ltat rsiduel dans les tissus des animaux consommant des aliments contamins nest disponible ce jour.

Conclusion Les stachybotryotoxines et en particulier les satratoxines, synthtises par Stachybotrys chartarum, sont les mycotoxines les plus cytotoxiques de la famille des trichothcnes. Elles sont responsables de la stachybotryotoxicose principalement observe chez les quids. Cette maladie est reconnue en Europe de lEst o des cas sont rapports chaque anne. Cette affection est galement dcrite dans de nombreux autres pays, y compris la France mais sa prvalence est difficile valuer. Chez lhomme, les affections dues Stachybotrys chartarum sont bien connues lors dexposition par inhalation ou par contact. Il ny a en revanche aucune information concernant le transfert dans les denres alimentaires dorigine animale. De ce fait lexposition de lhomme par voie alimentaire ne peut tre estime.

8. Les toxines d'endophytes Les micromyctes endophytes du genre Neotyphodium peuvent contaminer certaines gramines fourragres telles que la ftuque et le ray-grass anglais. Ces champignons vivent en symbiose avec la plante et synthtisent des alcalodes durant la croissance de leur hte. Neotyphodium coenophialum contamine la ftuque Festuca arundinacea et synthtise des alcalodes ergopeptidiques. Lergovaline est considre comme la principale mycotoxine responsable de la toxicose de la ftuque plus connue sous son appellation anglo-saxone : fescue toxicosis. Neotyphodium lolii contamine quant lui le ray-grass anglais Lolium perenne. Il synthtise galement de lergovaline mais surtout du lolitrme B, alcalode trmorgne responsable de la maladie connue sous le nom anglo-saxon de rye-grass staggers disease que lon pourrait traduire par tournis du ray-grass. Les alcalodes synthtiss par les endophytes du genre Neotyphodium naffectent pas laspect extrieur de la plante infecte, mais sont susceptibles dentraner des troubles graves chez les ruminants consommateurs, aussi bien au pturage que dans les foins. De nombreux pays sont touchs par les maladies lies aux toxines dendophytes. Une tude franaise a notamment montr que plus de la moiti des lots de ftuque commerciale tait infecte par des endophytes des taux relativement levs (Emile et al., 2000). Limpact conomique et sanitaire de ces toxines peut tre important. Aux Etats-Unis, les pertes dues la baisse de productivit sont estimes 1 milliard de dollars par an (Panaccionne et al., 2001). En Europe, cependant, trs peu de cas de toxicoses ont t rapports et les effets sur les performances des animaux sont mal connus (Emile et al., 2000).

8.1. Facteurs favorisant le dveloppement

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Les gramines dans lesquelles on trouve des endophytes sont plus rsistantes que celles qui en sont dpourvues. En effet les champignons endophytes croissant lintrieur de la plante sans lui nuire et en raison de la production de toxines, lui confrent une rsistance aux agressions extrieures : insectes et autres invertbrs herbivores, ainsi quune tolrance accrue la scheresse (Powel et al., 1992). Pour une mme varit de gramine contamine par des mmes niveaux de Neotyphodium, les taux dergovaline peuvent varier en fonction des saisons et/ou de lanne. Les maladies dherbage qui touchent les ruminants sont plus frquentes au printemps, lorsque lherbe crot rapidement (Hussein et al., 2001). Les ptures fertilises par des niveaux levs dazote ou dont les sols en sont naturellement riches constituent un facteur additionnel de risque. En ce qui concerne la contamination du ray-grass, il a t montr que les concentrations en toxines, et le lolitrme B en particulier, augmentent avec lge de la plante et/ou de la feuille. Le dveloppement de ray-grass contamin par des endophytes bnficiant dune bonne rsistance aux insectes (forte production de pramine) mais prsentant une faible toxicit pour les ruminants consommateurs (faible taux de synthse dergovaline et de lolitrme B) a t mis au point par une quipe no-zlandaise (Ball et al., 1999). La viabilit de Neotyphodium dans les graines de ftuque et de ray-grass est diminue lors de stockage prolong (de 18 mois ou plus). Ainsi, le taux dinfection dans les graines ges et les plantes issues de ces dernires est rduit. Cependant, lergovaline est stable pendant plusieurs annes ; ni le stockage, ni lensilage ne diminuent la toxicit de la gramine qui en contient. La Nouvelle Zlande et les Etats-Unis sont particulirement atteints par les consquences toxicologiques, zootechniques et conomiques de la consommation par les ovins, bovins et chevaux, de ftuque ou de ray-grass contamins (Cheeke et al., 1995 ; Powell et al., 1992). Par ailleurs, cette contamination est susceptible de sobserver partout o ces gramines sont utilises pour la pture. En Europe, des cas de mycotoxicoses associes lingestion de toxines au pr ont t rapports aux Pays-Bas, au Royaume-Uni, en Allemagne et en France. Dans notre pays, elles sont surtout dcrites dans le Limousin et la rgion Midi-Pyrnes, lAquitaine et le Nord lors de pturages excessifs lt, quand lherbe est courte.

8.2. Proprits physico-chimiques des toxines dendophytes et mthodes danalyse Les ergopeptides sont des drivs de lacide lysergique. Ils appartiennent aux alcalodes galement connus pour tre synthtiss par le genre Claviceps. Toutefois, aucun sclrote (formation caractristique de la contamination par Claviceps) nest prsent sur les gramines contamines par des Neotyphodium. La toxine majoritairement synthtise par Neotyphodium coenophialum se dveloppant sur la ftuque est lergovaline, un alcalode ergopeptidique trs rare (Bacon et al., 1995 ; Bony et al., 2001 ; Porter et al., 1995). La figure 8a illustre sa structure chimique.

Figure 8a : Structure chimique de lergovaline Dautres alcalodes ont galement t isols de ftuques infectes par Neotyphodium coenophialum dont un autre ergopeptide, lergotamine et un amide driv de lacide lysergique, lergonovine (Hill et al., 2001). Ce dernier compos semble tre galement associ de faon non ngligeable la toxicose de la ftuque (Browning et al ., 1997 et 2000 ).

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Le lolitrme B est lalcalode trmorgne majoritairement produit lors de la contamination du ray-grass par Neotyphodium lolii. Sa structure chimique est illustre en figure 8b.

Figure 8b : Structure chimique du lolitrme B N. lolii synthtise lui aussi de lergovaline, en quantit moindre cependant, et de la paxilline, qui semble tre le prcurseur des lolitrmes et des trmorgnes associs (Miles et al., 1998 ; Porter et al., 1995). Le lolitrme B et la paxilline sont, comme tous les autres composs trmorgnes, des indoles diterpnodes neurotoxiques (Hussein et al., 2001). Dautres alcalodes ont t isols des htes de Neotyphodium : il sagit dalcalodes de la famille des lolines, principalement la N-acetylloline et de la N-formylloline dans la ftuque et de la pramine, dans le ray-grass et la ftuque. Bien que ces composs soient davantage impliqus dans la lutte contre les insectes que dans les toxicoses animales, ils peuvent contribuer augmenter la toxicit des mycotoxines alcalodiques vis vis des ruminants. Les alcalodes ergotiques sont extrmement sensibles loxydation photolytique, lhydratation et lpimrisation du cycle ergolne en position C8, qui peut se produire aussi bien en conditions acides que basiques. Les solutions dergovaline se conservent pendant plusieurs mois 4C, dans des flacons opaques. Toutefois, cette molcule se dgrade rapidement lorsquelle est extraite de tissus vgtaux frais. Aussi bien lergovaline que le lolitrme B ont t isols de cultures pures et de gramines contamines par Neotyphodium. Il existe de nombreuses procdures dextraction, disolement et didentification des alcalodes de N. coenophialum. Le plus souvent lextraction des toxines est ralise en solution aqueuse dacide tartrique ou dacide lactique, cette dernire permettant un meilleur rendement dextraction de lergovaline. Suivent alors la chromatographie de partage avec du chloroforme ou du dichloromthane, la purification sur colonne de silice, alumine ou rsine changeuse dions, et enfin, lidentification et lanalyse par CCM ou encore HPLC-UV ou fluorimtrie (utilise en routine). La spectromtrie de masse (MS utilisant lionisation par impact lectronique, ionisation chimique ou MS/MS) permet galement le dosage des alcalodes de la famille des ergopeptides (Porter et al., 1995). Les lolines sont prsentes dans les plantes contamines par N. coenophialum, mais nont pas t identifis dans celles infectes par N. lolii. La GC-FID ou GC-MS constitue la mthode de choix pour le dosage des alcalodes de cette famille. Un systme dextraction biphasique permet lanalyse simultane de la pramine et du lolitrme B (Porter et al., 1995).

8.3. Proprits toxicologiques Peu dtudes sont disponibles sur les effets toxiques de ces composs car il est difficile disoler des quantits suffisantes dalcalodes purifis en dpit de la mise au point de systmes par fermentation immerge (Powell et al., 1992). 8.3.1. Toxicocintique et mtabolisme Peu de donnes concernant la biodisponibilit ou le mtabolisme des ergopeptides chez les ruminants sont disponibles. Labsorption est faible, llimination rapide. Chez les bovins, 94 % des alcalodes absorbs seraient excrts dans lurine dans les 12 h suivant lingestion et environ 6 % dans la bile. En raison de cette excrtion rapide, lhypothse dune absorption ruminale a t avance (Hill et al., 2001). Les ergopeptides peuvent tre hydroxyls ou dalkyls par les cytochromes P450 et par consquent, leur hydrosolubilit et les possibilits de conjugaison et excrtion sont augmentes (Hussein et al., 2001). Il a galement t prouv que les ergopeptides interagissent avec la PgP (Pglycoprotine), qui pourrait participer leur excrtion (Yasuda et al., 2002).

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8.3.2. Effets musculaires et neurologiques Les ergopeptides provoquent la stimulation des muscles lisses en inhibant les rcepteurs et adrnergiques et en entranant une vasoconstriction des tissus priphriques. Le flux sanguin chute brutalement, aussi bien vers les tissus centraux que priphriques. Il en rsulte une diminution de la dissipation thermique do une augmentation de la temprature corporelle (Browning et al., 1997). Ce phnomne est amplifi lorsque la temprature ambiante augmente et provoque alors une augmentation de la frquence cardiaque (Browning, et al., 1997 ; Rhodes, et al., 1991). Une concentration de 50 ng dergovaline par gramme de plantes infectes suffirait entraner des premiers signes de toxicoses chez des bovins soumis un stress thermique (Porter et al.,1995). Le lolitrme B affecte les muscles lisses et les muscles stris du tractus gastro-intestinal (Reed, et al., 2002) mais le mcanisme exact de son action na pas encore t identifi. Des hypothses possibles suggrent une inhibition des neurotransmetteurs des acides amins, des rcepteurs GABA de type A, ou une stimulation des rcepteurs cholinergiques (Hussein, et al., 2001). Les signes de ttanie sobservent chez les bovins et les ovins, lorsque les concentrations de lolitrme B atteignent 2 2,5 g/g de matire sche tandis que chez les quins, il faut une teneur suprieure 5,3 g/g. Il faut noter toutefois que les tremblements peuvent tre dus dautres toxines trmorgnes telles que le janthitrem, synthtis par Penicillium spp., qui se dveloppent sur les dbris vgtaux morts des ptures de ray-grass. 8.3.3. Effets endocriniens Lergovaline induit une forte diminution de la prolactine srique, neurohormone dont la concentration varie en fonction de la photopriode (Cheeke et al., 1995 ; Porter et Thompson, 1992). La prolactine est implique dans la lactation mais aussi la croissance, les rponses immunitaires et losmorgulation (Browning et al., 1997). Sa scrtion est inhibe par la dopamine (Paterson et al., 1995). Or, il semblerait que lergovaline stimule les rcepteurs dopaminergiques : le cycle ergolne, qui se trouve dans tous les alcalodes ergopeptidiques, prsente une similarit structurale avec la dopamine mais aussi avec la noradrnaline et la srotonine, qui jouent un rle dans la synthse et la scrtion de mlatonine, autre neurohormone photodpendante dont le taux est galement diminu lors de lingestion de plantes contamines (Paterson et al., 1995 ; Porter et Thompson 1992). Le drglement neuro-hormonal de la prolactine mais aussi de la mlatonine, la restriction du flux sanguin vers les organes internes et lhyperthermie, semblent tre les causes principales des effets observs chez les ruminants : perturbation de ladaptation physiologique aux saisons, effets sur la reproduction, la pousse du poil ou de la laine, la production laitire et la prise alimentaire (Porter et Thompson, 1992). Des effets sur les hormones thyrodiennes et le cortisol ont galement t observs. Chez les bovins, lergotamine pourrait altrer les concentrations plasmatiques de la triiodothyronine (T3) et du cortisol (Browning et al., 1997) et contribuer aux effets de ces toxines sur la thermorgulation et le mtabolisme des nutriments. Les ergopeptides sont galement impliqus dans laltration des concentrations plasmatiques de certaines hormones hypophysaires importantes chez les bovins, telles que lhormone de croissance et lhormone lutinisante, LH, ce qui pourrait expliquer galement les effets nfastes des alcalodes dendophytes sur la reproduction des bovins (Browning et al., 1997). De plus, lergotamine et lergonovine retrouves dans la ftuque infecte par Neotyphodium (E+) stimulent la contractilit utrine en induisant une libration de prostaglandine par lutrus (Browning et al., 1998). 8.3.4. Effets zootechniques Les maladies dherbage ne sont pas irrversibles si elles sont diagnostiques temps. Les animaux gurissent en quelques semaines aprs le retrait des aliments incrimins (Emile et al., 2000). Cependant, limpact conomique des gramines infectes par Neotyphodium (E+) est considrable. Par exemple, les vaches consommant des ptures E+ produisent 25 % de lait en moins que celles ayant consomm des ptures E- (dpourvues dendophytes). La perte de production laitire est estime 0,15 l par jour pour chaque augmentation de 10 % du niveau dinfestation de la pture. De mme, le taux de gestation est estim 96 % pour les vaches consommant de lherbe E- et 55 % seulement pour celles consommant de lherbe E+ (Porter et Thompson, 1992). Une tude conduite sur moutons a montr que la digestibilit de la ftuque (Festuca pratensis) nest pas modifie par la prsence dendophytes (Daccord et al., 1995). Ce rsultat tend montrer que la population microbienne ruminale est peu ou pas sensible aux toxines dendophytes. Les leveurs de btail et les producteurs de fourrages europens sinterrogent de plus en plus sur les effets, aussi bien positifs que nfastes de linfection des gramines par Neotyphodium sp. En France,

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une tude grande chelle a permis de mettre en vidence que plus de la moiti des chantillons de ftuque taient infests par des endophytes (Emile et al., 2000). Il faut noter que des essais sont mens afin de dterminer une ventuelle rsistance gntique de certaines races de bovins vis vis des alcalodes dendophytes (Browning, 2003). 8.3.5. Autres effets Chez les moutons atteints de ttanie due au ray-grass infect, une augmentation de la concentration en Aspartate Amino Transfrase (ASAT) a t rapporte, ce qui suggre une atteinte hpatique. Cette lvation des taux dASAT est accompagne dune augmentation du taux de cratine kinase srique, ce qui suggre une fuite enzymatique des cellules musculaires (Cheeke et al., 1995).

8.4. Exposition humaine Le risque de contamination du consommateur humain par le lait danimaux nourris avec un fourrage contamin par des endophytes apparat trs limit (voir plus loin). Nanmoins lapport de donnes afin de confirmer labsence de risque, principalement statuant le cas dexposition chronique ou dexposition conjointe dautres toxiques ayant des effets reprotoxiques, seraient bienvenues.

8.5. Exposition et effets sur la sant animale 8.5.1. La Fescue toxicosis Le terme de toxicose de la ftuque est utilis pour dcrire lensemble des syndromes associs lingestion par les ruminants de ftuque contamine par Neotyphodium coenophialum. En effet, la manifestation clinique de ces diffrents syndromes varie avec la temprature ambiante. Il existe trois formes de maladies ; 1) la toxicose de la ftuque sensu stricto, qui se caractrise par une agalactie et autres dsordres tels que diminution de la croissance, pelage rche, salivation excessive, lvation de la temprature corporelle et du rythme respiratoire, et rduction de la capacit de reproduction. Ces signes sont observs dans chacune des formes de la maladie, mais sont amplifis par des lvations de temprature ambiante. Ainsi, ce syndrome est plus frquent en t et porte de ce fait, le nom de summer syndrome 2) le mal de pied (fescue foot disease), qui consiste en une gangrne sche des extrmits pattes, oreilles et queue - ressemblant lergotisme. Il sobserve le plus souvent en hiver, mais cette forme de la toxicose est assez rare mme si la chute de lextrmit de la queue est assez frquente. Plusieurs cas ont t rapports en France (Bony et al., 2001). 3) la ncrose adipeuse (fat necrosis syndrome), caractristique dune exposition chronique, quelle que soit la saison : des masses graisseuses se dposent dans la cavit abdominale de lanimal atteint, et peuvent interfrer avec la digestion et la parturition (Browning, 2003). Chez les bovins, on observe pour ces trois formes une diminution de la prise alimentaire et donc une baisse du gain de poids corporel, une chute des performances de reproduction, une rduction du cholestrol et de mlatonine ainsi quune diminution de la tolrance au stress thermique et la lumire (Rhodes et al., 1991). Il a galement t montr que le volume ruminal augmente proportionnellement lingestion dergovaline (Aldrich, et al ., 1993). De mme, chez les ovins, les performances de reproduction sont rduites (chute de la fertilit), les taux de cholestrol et la production laitire sont diminus. Cependant, les ovins ne sont pas aussi svrement affects que les bovins, la consommation alimentaire et leur vitesse de croissance restent normaux (Aldrich et al ., 1993 ; Bacon et al., 1995 ; Porter et Thompson, 1992). Les chevaux sont les seuls animaux chez lesquels les effets rsultant de leur consommation de ftuque E+ sont presque exclusivement relis une atteinte de la fonction de reproduction. Chez la jument, on observe une augmentation de la dure de la gestation, un paississement du placenta, des avortements, des poulains immatures et plus fragiles ainsi quune agalactie (Cross et al., 1995 ; Porter et Thompson, 1992). Contrairement aux vaches et aux brebis, les juments gestantes ne prsentent pas daugmentation de leur temprature corporelle lorsquelles sont exposes aux toxines dendophytes et ceci en raison de leur capacit rguler leur temprature par une augmentation de la sudation (Bony et al., 2001 ; Cross et al., 1995).

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Chez toutes les espces animales touches, leffet le plus important de la toxicose de la ftuque est la diminution du taux de prolactine srique. Cette diminution est indpendante des conditions environnementales et survient dans les trois formes de la maladie. Les antagonistes de la dopamine tels que lhalopridol, la phnotiazine, le spiprone ou la mtoclopramide ont t valus en tant que traitements pharmacologiques permettant de diminuer la toxicit de la ftuque : ils se sont avrs efficaces pour augmenter le taux de prolactine mais nont eu que des effets limits sur la capacit de lanimal dissiper sa chaleur corporelle. Ceci implique donc un double mcanisme daction de lergovaline (Aldrich et al., 1993 ; Paterson et al., 1995). Enfin, la toxicose la ftuque est le plus souvent sub-clinique, les ruminants atteints prsentant des altrations de performances (Browning, 2003). 8.5.2. La Rye-grass staggers disease Les Etats Unis et la Nouvelle Zlande sont rgulirement affects par la maladie, des cas ont galement t rapports dans dautres pays tel que lArgentine (Cheeke et al.,1995). En raison de la prsence du lolitrme B dans les plantes contamines, le syndrome du tournis du ray-grass se caractrise par des signes neurologiques tels que de lincoordination, des tremblements, des mouvements de tte et un collapsus. Aucun signe prcurseur nest visible avant que la maladie ne soit dclenche. Lors dexposition de faibles doses, les effets neurologiques sont temporaires, lanimal gurit dans un temps court. Pour des doses suprieures, de la mortalit peut tre observe, un taux de 20% ayant t rapport par les leveurs No-Zlandais chez les moutons qui sont particulirement sensibles la ttanie due au ray-grass. En ce qui concerne les bovins, seuls 0,2 % des animaux meurent. Les quins semblent les plus sensibles la maladie. Dans toutes les espces, la mort survient le plus souvent par blessures accidentelles (Reed et al., 2002). Comme pour la toxicose de la ftuque, les agonistes de la dopamine peuvent servir de traitements, mais leffet trmorgne du lolitrme B impose un traitement supplmentaire : le plus souvent base de benzodiazpine (Scrivener et al., 2002). 8.5.3. Persistance ltat rsiduel Trs peu de donnes chiffres concernant lventuelle excrtion lacte des toxines dendophytes et lventuelle prsence de rsidus dans les tissus ont t publies. Cependant, les proprits physico-chimiques des alcalodes, qui sont des composs basiques, suggrent quils pourraient tre retrouvs dans le lait danimaux consommant des gramines contamines. En effet, le lait tant plus acide que le plasma, ces composs peuvent sy trouver concentrs. En ce qui concerne le lolitrme B, il apparat en quantits dtectables dans le lait environ 4 h aprs ladministration dans le rumen de la chvre mais les concentrations maximales obtenues aprs 24 h sont faibles (3 ng/ml). En ce qui concerne lergovaline, aucun passage ni dans le sang ni dans le lait na t mis en vidence (Grancher et al., 2004). En labsence de certitude il convient dliminer de la consommation tout lait issu danimaux prsentant des signes de toxicose (Guerre et al., 2000 ; Panter et al., 1990).

Conclusion Les toxines dendophytes, principalement lergovaline prsente dans la ftuque et le lolitrme B prsent dans le ray-grass, sont toxiques pour les ruminants et responsables de pertes de productivit importantes. Bien que les mcanismes dactions de ces toxines soient complexes, leur interaction avec la scrtion de prolactine semble lorigine des principaux troubles observs. Bien que le risque de contamination de lhomme soit trs faible via notamment le lait danimaux exposs, des recherches devraient tre menes afin de confirmer labsence de risque, principalement lors dexposition chronique ou dexposition conjointe dautres toxiques ayant des effets reprotoxiques.

9. Les phomopsines Les phomopsines sont des mycotoxines synthtises par Phomopsis leptostromiformis (galement connu sous le nom de Diaporthe toxica). Ces mycotoxines contaminent les lupins qui constituent lhte principal du champignon. Ces lgumineuses sont utilises en alimentation animale o les phomopsines sont lorigine de la lupinose, maladie qui affecte principalement les ovins mais aussi

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les bovins, les caprins, les porcins et les quins. Il sagit de toxines hpatotoxiques entranant une cholangite oblitrante, une fibrose et une prolifration des canaux biliaires qui, dans certains cas peuvent donner lieu une photosensibilisation secondaire. Elles sont connues pour tre de puissants inhibiteurs des microtubules cellulaires. Des cas cliniques de lupinose animale ont t rapports partir de 1900 en Allemagne, en Europe centrale, aux Etats-Unis, en Nouvelle Zlande, en Afrique du Sud et plus rcemment en 1988, en Espagne (Lacey et al., 1987 ; Soler Rodriguez et al., 1991). LAustralie est atteinte quasiment chaque anne par la lupinose ovine depuis 1950 (Gardiner et al., 1967). Bien quaucun cas nait t rapport en France, les importations de graines provenant de pays divers tant en constante progression, il est utile de faire le point sur ltat des connaissances concernant ces toxines et leurs effets chez lanimal. Chez lhomme, lAgence Australienne et No-Zlandaise de Scurit Alimentaire (Australia New Zealand Food Authority) a tabli en novembre 2001 une limite rglementaire de 5 g de phomopsines par kilogramme daliment destin lhomme. En effet, bien que la majorit des graines de lupin soit destine lalimentation animale, elles sont introduites de plus en plus dans alimentation humaine pour leur qualit nutritive (bonne teneur protique, en fibres et acides gras essentiels). Ces toxines ont t values dans ces pays qui sont particulirement concerns par les consquences de la lupinose chez lanimal : dficit de la productivit voire la mort de lanimal.

9.1. Facteurs favorisant le dveloppement Phomopsis leptostromiformis contamine les plantes fourragres de la famille des lupins, Lupinus spp., lorsque celles-ci sont en phase de croissance. Ce champignon saprophyte continue de se dvelopper, sporule et synthtise des phomopsines sur les lupins morts qui constituent le vecteur dintoxication principal des ruminants au pturage. La lupinose sobserve galement chez des ruminants ayant consomm des ensilages ou du foin contenant des tiges, des gousses ou des graines de lupin contamins par Phomopsis leptostromiformis. Il semblerait que le dveloppement de la moisissure soit favoris par une humidit importante et une temprature voisine de 25C, tandis que la temprature optimale de sporulation se situerait autour de 18C (Van Warmelo et al., 1972). Cependant, les conditions de croissance et de toxinogense de Phomopsis leptostromiformis ne sont pas encore bien dfinies. Les premires pluies dautomne faisant suite un t sec favoriseraient lincidence de la maladie. Par ailleurs, la sensibilit la contamination par Phomopsis leptostromiformis diffre selon les espces de lupins. Lupinus luteus et L. albus sont particulirement sensibles tandis que L. mutabilis est plus rsistant (Lacey et al., 1991). Enfin, L. angustifolius, commercialis pour la consommation humaine, est aussi susceptible dtre contamin (Casey et al., 2001). Pour les varits de lupins les plus sensibles, les niveaux de phomopsines peuvent atteindre 217 mg/kg (DMello et al.,1997). En Australie, o la lupinose cause le plus de pertes conomiques, des essais ont t mens afin de dvelopper des varits de lupin rsistantes la contamination par Phomopsis. Dans ces varits, les taux de phomopsine A ne dpassent pas 88 mg/kg soit prs de trois fois moins quune varit sensible (DMello et al.,1997). Pourtant, mme si cette slection permet de rduire considrablement les risques de lupinose, elle ne permet pas lradication totale de la maladie. La prsence de Phomopsis leptostromiformis sur les graines de lupins peut tre rvle aprs isolement sur bote de glose (Ali et al., 1982), la toxicit dun chantillon dpend toutefois de la quantit de phomopsines prsentes.

9.2. Proprits physico-chimiques et mthodes danalyse Les phomopsines appartiennent la famille des hexapeptides macrocycliques (Tnsing et al., 1984). La phomopsine A (C36H45ClN6O12, poids molculaire : 789,2) reprsente plus de 80 % de la production totale de toxines. Sa structure chimique est illustre en figure 9.

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Figure 9 : Structure chimique de la phomopsine A Les autres phomopsines, notamment la phomopsinamine A, loctahydrophomopsine A, la phomopsine B et la phomopsine C sont produites en quantit moindre (DMello et al., 1997 ; Lacey et al., 1987). La phomopsine A nest soluble que dans leau alcaline. Les phomopsines sont relativement solubles dans les solutions alcooliques. Par ailleurs, elles sont stables la chaleur (Australia New Zealand Food Authority). Le dosage des phomopsines seffectue par chromatographie aprs extraction mthanolique de feuilles ou de graines de lupin (Shankar et al., 1999). La CCM (chromatographie sur couche mince) permet la dtection des diffrentes toxines (Petterson et al., 1985). LHPLC permet de sparer les phomopsines A, B et C entre elles. Toutefois, sil existe des solutions talons de phomopsine A, on ne dispose pas lheure actuelle de solution talon des phomopsines B et C (Allen, et al., 1989), ce qui empche leur quantification dans un extrait. Un test ELISA a t labor, il permet galement la dtection et la quantification de la phomopsine A (Shankar et al., 1999). Enfin, des bioessais visant dtecter une hpatotoxicit prcoce sur jeunes rats (Culvenor et al., 1977 ; Peterson et al., 1978) et sur moutons (Hancock et al., 1987) ont t largement utiliss par le pass. Ils sont bass sur l'observation de la dgnrescence des cellules hpatiques et du nombre de cellules bloques en mtaphase (Petterson et al., 1985).

9.3. Proprits toxicologiques La lupinose se caractrise par dimportantes altrations hpatiques peuvant donner lieu une photosensibilisation secondaire. Cette maladie est principalement due la phomopsine A, produite en majorit par Phomopsis leptostromiformis, et 5 fois plus toxique que la phomopsine B (Allen et al., 1983). Toxicocintique et mtabolisme Peu de donnes sont disponibles concernant labsorption, le mtabolisme, la distribution et les voies dexcrtion des phomopsines chez lanimal (Australia New Zealand Food Authority). Mcanisme daction hpatotoxique La phomopsine A inhibe la polymrisation des microtubules et de la tubuline, et induit la dpolymrisation des microtubules prforms de faon dose-dpendante aussi bien in vivo chez les rongeurs, le porc ou le mouton, quin vitro sur diffrentes lignes cellulaires HeLa humaines, CV1 de singe et hpatocytes de rats (Lacey et al., 1987 ; Tnsing et al., 1984). Cet effet conduit une inhibition du transport intracellulaire des lipides provoquant leur accumulation dans les cellules du parenchyme hpatique ainsi quune perturbation de lexcrtion biliaire. La bilirubine, produit de dgradation de lhmoglobine normalement limin par voie biliaire, saccumule entranant un ictre. Le blocage des microtubules et de la tubuline entrane galement une inhibition de la formation du fuseau mitotique lors de la division cellulaire. Le blocage des hpatocytes en mitose provoque une ncrose cellulaire (Australia New Zealand Food Authority). On observe alors une cholangite oblitrante avec une fibrose associe une prolifration des canaux biliaires. Dans certains cas, cette atteinte hpatique provoque une photosensibilisation par diminution de llimination de la phyllorythrine (produit de dgradation de la chlorophylle par la microflore du rumen) qui saccumule alors dans lorganisme. Ce compos circule dans le sang jusqu'aux vaisseaux capillaires de la peau. Ce pigment photodynamique devient ractif aprs exposition aux rayonnements ultra-violets du soleil provoquant alors la destruction des membranes des cellules cutanes et des muqueuses exposes (Bonnefoi et Sauvagnac 1988, DMello et al., 1997).

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Les tudes exprimentales montrent que la dose minimale ltale chez le mouton par injection souscutane unique de phomopsine A est de 10 g/kg p.c. Une dose de 37,5 g/kg p.c. provoque la mort de 100% des animaux. La dose sans effet sur le poids corporel semble tre de 1,25 g/kg p.c. dans ces conditions (Jago et al., 1982). On note que la perte de poids nest pas corrle la dose de toxine administre (Jago, et al., 1982). Autres effets Une toxicit embryonnaire a t observe aprs administration par voie intra-pritonale de phomopsine A des rates gestantes. La dose de 90 g/kg p.c./j pendant 4 jours est associe la mort de 40 % des rates gestantes et une forte mortalit des embryons, galement observe lors de linjection dune dose unique de toxine de 400 g/kg p.c. Les embryons qui survivent prsentent un retard de croissance et une ossification irrgulire (Peterson et al., 1983). Deux tudes de mutagnse in vitro ont t menes en 1986. Elles rvlent que la phomopsine A purifie ninduit pas de mutations gniques sur bactries (Australia New Zealand Food Authority) mais quelle agit comme un clastogne potentiel sur cellules de mammifres (Brown et al., 1986). A ce jour, aucune donne concernant les effets cancrognes in vivo des phomopsines chez les ruminants ni chez les animaux de laboratoire nest disponible.

9.4. Exposition humaine En alimentation humaine, lutilisation de lupin est plus restreinte quen alimentation animale, bien que lintroduction de farine de lupin dans le pain et autres denres ainsi que la consommation directe de graines semblent en augmentation. Devant labsence de donnes suffisantes, il est impossible de conclure lheure actuelle sur la possibilit de transfert de ces toxines dans les produits animaux (Casey et al., 2001). LAgence Australienne et No-Zlandaise a jug prudent de sassurer que lexposition humaine soit la plus basse possible en fixant une limite de 5 g de phomopsine A / kg daliment, pour tous aliments.

9.5. Exposition animale 9.5.1. Effet sur la sant animale La lupinose est une maladie affectant toutes les espces de ruminants et les chevaux mais ce sont les ovins qui sont les plus svrement et les plus frquemment touchs. Les bovins sont plus rsistants que les ovins (Hough et al., 1994). La gravit de la maladie dpend de la quantit de toxines contenues dans le lupin consomm, de la dure de consommation ainsi que de la sensibilit individuelle de lanimal (Gardiner et al., 1967). En Australie et en Nouvelle Zlande la lupinose ovine est responsable de pertes zootechniques considrables : diminution de la capacit de reproduction, de la production de lait, de laine (Barnes et al., 1996). Le taux de mortalit d la lupinose est le plus souvent lev (Casey et al., 2001). A titre dexemple, un cas de lupinose a t dclar en 1988 en Espagne ; sur un troupeau de 80 moutons, 12 ont t affects aprs une semaine de pturage et 5 en sont morts (Soler Rodriguez et al., 1991). Les ovins et les bovins atteints de lupinose prsentent une inapptence, un des premiers signes cliniques de la maladie, qui volue rapidement vers une anorexie mortelle (Jago et al., 1982). Ils peuvent galement prsenter un atonie ruminale variable (Allen et al., 1989). On note en outre une augmentation de la temprature corporelle. La photosensibilisation des parties non recouvertes de laine ou sans poil selon lespce animale touche, sobserve dans certains cas dintoxications chroniques, lorsque latteinte hpatique est dj importante. Chez les chevaux, lictre semble tre le seul signe clinique spcifique de la lupinose. Lintoxication aigu se caractrise par le dveloppement rapide dune infiltration lipidique intense des cellules hpatiques. Lanalyse biochimique, rvle chez les moutons atteints une forte augmentation de la bilirubine srique et de lactivit de la phosphatase alcaline. Cette dernire augmentation sobserve principalement lors datteinte chronique (Rodriguez et al., 1991). La mort peut survenir dans ce cas 3 11 jours aprs lingestion de lupin fortement contamin (Gardiner et al., 1967).

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A lautopsie, on constate un ictre prononc, le foie est friable, augment de volume, dcolor et jaune avec des foyers hmorragiques (Allen et al., 1983). Dans les cas dintoxications chroniques, les analyses histo-pathologiques rvlent une fibrose hpatique pri-portale qui se dveloppe 10 30 jours aprs lingestion de lupins contamins (Jago et al., 1982). 9.5.2. Persistance ltat rsiduel Les donnes pharmacocintiques disponibles ne permettent pas de conclure quant la prsence de rsidus de phomopsines dans les produits dorigine animale. Toutefois, certaines tudes exprimentales suggrent que des rsidus toxiques peuvent se retrouver dans les abats danimaux ayant consomm des lupins contamins (Australia New Zealand Food Authority). De plus, aucune mthode analytique na t mise au point afin de dtecter les phomopsines dans la viande ou le lait. Ainsi, il est impossible de conclure lheure actuelle sur la possibilit de transfert de ces toxines dans les produits animaux (Casey et al., 2001). Bien quaucune preuve nexiste, il convient dliminer de la distribution tout lait issu danimal et tout animal prsentant une suspicion de toxicose (Guerre et al., 2000).

Conclusion Lutilisation de graines de lupin dans lalimentation animale est en constante progression depuis les annes 1970. Le risque serait optimal pour les animaux qui consomment le lupin en tant que matire premire. Chez les ruminants, en particulier les ovins, la maladie se caractrise par une forte hpatotoxicit, le plus souvent mortelle. Aucun cas na t rapport en France mais la vigilance doit tre maintenue en raison de limportation croissante de graines provenant de divers pays et de leur utilisation en alimentation animale. En France, il est peu probable que les phomopsines prsentent un risque pour lhomme. Toutefois, lintroduction de farine de lupin dans le pain et autres denres ainsi que la consommation directe de graines semblent en augmentation. Par ailleurs, en raison du profil toxicologique de ces toxines, il conviendrait de raliser des tudes de transfert dans les productions animales.

Rfrences bibliographiques (voir document spcifique)

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Conclusions et recommandations gnrales

En 1998, le Conseil Suprieur d'Hygine Publique de France avait rdig un rapport faisant le point des connaissances sur les mycotoxines. L'impact des mycotoxines sur l'alimentation et la sant animales n'avait pas t dvelopp dans ce document. Depuis cette date, de nombreuses publications et l'acquisition de donnes de contamination au travers de la surveillance ont permis de mieux connatre certaines mycotoxines, leur impact sur la sant humaine et animale et d'estimer les niveaux d'exposition alimentaire. LAgence franaise de scurit sanitaire des aliments a dcid de procder une revue des connaissances disponibles sur les mycotoxines ayant un impact sur la sant humaine et/ou animale, d'valuer les risques lis aux mycotoxines entrant dans les chanes alimentaires humaine et animale et d'mettre certaines recommandations.

Concernant les mycotoxines en gnral Les mycotoxines sont des produits du mtabolisme secondaire de moisissures pouvant se dvelopper sur la plante au champ ou en cours de stockage, et dous de potentialits toxiques lgard de lhomme et des animaux. Ces toxines se retrouvent ltat de contaminants naturels de nombreuses denres dorigine vgtale, les crales mais aussi les fruits, les fourrages ainsi que les aliments manufacturs et composs issus de ces filires destins lalimentation humaine et animale. Les produits d'origine animale tels que le lait ou les abats peuvent tre galement contamins par certaines toxines au travers de l'alimentation animale. Les mycotoxines sont gnralement thermostables et ne sont pas dtruites par les procds habituels de cuisson et de strilisation. Les groupes de mycotoxines considrs comme importants du point de vue agro-alimentaire et sanitaire sont les aflatoxines, lochratoxine A, les trichothcnes et tout spcialement le doxynivalnol, les fumonisines, la zaralnone et la patuline. D'autres mycotoxines, moins tudies quant leurs effets toxiques mais susceptibles d'avoir des effets sanitaires chez l'homme et/ou l'animal ont t galement prises en compte. Caractrisation du danger D'une faon gnrale, les mycotoxines traites sont des contaminants alimentaires et prsentent un danger pour la sant humaine et/ou animale. La caractrisation du danger est fonde sur des donnes toxicologiques la plupart du temps incompltes. De plus certaines tudes exprimentales mettent en avant des effets toxiques obtenus par des voies dadministration sans rapport avec les conditions relles de lexposition du consommateur, rendant difficile toute transposition lhomme. Mme si certaines mycotoxines ont t mieux tudies que d'autres du point de vue de leurs proprits toxicologiques et de leurs effets sur la sant humaine et animale, la caractrisation du risque doit tre affine l'aide de nouvelles donnes sur les effets toxiques obtenues partir d'tudes qui devront tre ralises selon des lignes directrices reconnues internationalement. Il est noter que les donnes toxicologiques disponibles concernent principalement les toxines prises individuellement et non les effets rsultant de lassociation de mycotoxines alors quelles peuvent tre prsentes simultanment sur la mme denre ou dans une mme ration. En effet, une mme espce de moisissure peut produire plusieurs types de toxines, selon les souches et les conditions climatiques. Ce sont par exemple le cas dAspergillus flavus produisant les aflatoxines mais aussi lacide cyclopiazonique, la strigmatocystine, ou laflatrem ; le cas dAspergillus clavatus produisant la patuline mais aussi laflatrem ; le cas de Penicillium verrucosum produisant lochratoxine mais aussi la citrinine ; ou encore le cas de Fusarium graminearum produisant la zaralnone mais aussi certains trichothcnes, si lon est en prsence de souches toxinognes places dans des conditions favorables leur dveloppement. Par ailleurs, la prsence simultane de plusieurs mycotoxines peut provenir du fait quune mme ration, ou un rgime alimentaire sont composs de divers types de denres ou daliments simples dont chacun deux peut tre susceptible de contenir une mycotoxine particulire. Ces cas de multi contamination modifient ils les toxicits individuelles rendant difficile la

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caractrisation de ces risques associs? Cette question, tant une relle proccupation, mriterait lengagement dtudes exprimentales spcifiques pour y rpondre, les donnes disponibles actuellement tant fragmentaires. Caractrisation du risque La caractrisation du risque doit tre affine laide de donnes nouvelles sur les effets toxiques comme recommand ci-dessus et sur les niveaux de contamination recueillis dans le cadre de plans de surveillance et de contrle conduits sur plusieurs annes. En effet lvolution des objectifs et des pratiques de lagriculture constate au dbut du XXIe sicle lie notamment lextension de lagriculture biologique, lmergence de production des biocarburants et au changement climatique doit tre suivie avec attention en matire dvolution de la qualit et la nature des matires premires utilises en alimentation humaine et animale : Le cas de linfluence de lagriculture biologique excluant lutilisation dinsecticides et fongicides sur le risque mycotoxinique des produits, par rapport celui de lagriculture conventionnelle, bien quil nait pas t repris ici puisque trait dans un rapport de lAfssa en 2003, est suivre laune de lorganisation des plans de surveillance et de contrle considrerant les denres issues des deux modes de production. Des plans seraient aussi envisager en fonction du devenir des sous produits des vgtaux ayant servi la production de biocarburants. De mme, la modification des pratiques culturales due la prise en compte de critres conomiques et au changement climatique se traduisant par une extension de la culture de certains vgtaux du sud vers le nord et conscutivement du risque associ doit tre considre lors de la rvision annuelle des plans de surveillance et de contrle. En outre, la possibilit de rencontrer des conditions climatiques favorables lmergence de nouveaux risques en Europe mridionale, connus jusqualors en rgion sub tropicale, comme lors de canicules, est considrer.

En matire dalimentation animale, quelle que soit la mycotoxine, lutilisation dans la ration des poussires et dchets de crales, tant donn leur probabilit leve dtre hautement contamines est problmatique en matire de risque dintoxication et quelle que soit lespce animale. Cette matire alimentaire correspond des dchets de crales provenant de diverses sources (fond de silo ou de bateau ou de camion, issues des filtres poussires). Il serait donc recommand de ne pas les utiliser pour alimenter les animaux. Les donnes de contamination sont souvent trs disparates en raison des difficults d'chantillonnage, et des difficults de dosage. En effet, les mycotoxines sont souvent distribues dune manire trs htrogne dans les produits vgtaux. La qualit de l'chantillonnage a une influence primordiale sur le rsultat analytique. L'Afssa recommande d'tablir des plans dchantillonnage sur la base de protocoles normaliss ou valids qui dbouchent sur un chantillon final aussi reprsentatif que possible de la salubrit globale d'une denre. De plus, le dosage des mycotoxines dans les denres doit mettre en jeu des mthodes analytiques sur la base de modes opratoires normaliss ou valides, et ralises au sein de laboratoires placs au moins, sous assurance qualit ou au mieux, accrdits. La dmarche de normalisation est ainsi poursuivre aussi bien pour ltablissement de normes dchantillonnage que de normes analytiques.

Evaluation du risque Bien que l'exposition moyenne du consommateur soit gnralement faible, en raison notamment des mesures de gestion prises pour limiter la contamination des aliments, il convient d'mettre un certain nombre de recommandations gnrales pour amliorer la connaissance et conscutivement la matrise des risques lis la prsence de ces mycotoxines dans les aliments pour l'homme et l'animal. Si la mise en place de rglementations est dj intervenue propos des aflatoxines et de l'ergot (il serait dailleurs souhaitable de considrer la teneur en alcalodes de lergot plutt que lergot luimme) en alimentation humaine et animale, de lochratoxine A, de la patuline, du DON, de la zaralnone et des fumonisines en alimentation humaine, elle est en prparation pour lochratoxine A, le DON, la zaralnone et les fumonisines en alimentation animale.

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Lvaluation du risque mycotoxique demeure dlicate. En effet, ce risque est dorigine naturelle, lhomme nen matrisant pas la survenue (notamment lie aux conditions climatiques), il est pernicieux car la contamination fongique est difficilement contrlable. La contamination peut tre multiple en raison de la prsence possible de plusieurs mycotoxines dans le mme produit ou la mme ration alimentaire. Devant ce constat, il convient de mettre en place des moyens de prvention incluant des stratgies agronomiques (bonnes pratiques agricoles incluant le choix des varits, les pratiques culturales, lutilisation raisonne des traitements phytosanitaires), lamlioration des conditions de rcolte et de stockage et du suivi tout au long de la chane alimentaire. Il est enfin ncessaire de poursuivre une activit de recherche soutenue afin damliorer encore les connaissances sur la toxicit des mtabolitess et la toxicit lors dassociations de mycotoxines, ou de mycotoxines et agents pathognes infectieux, ou encore de mycotoxines et autres contaminants La suite de cet avis reprend les conclusions et recommandations par mycotoxine ou groupe de mycotoxines

Aflatoxines Le groupe des aflatoxines et son reprsentant principal laflatoxine B1 (tant en terme de teneur et de frquence dans les aliments risque que dimpact toxique) est le groupe de mycotoxines le mieux tudi et le plus rglement. Laflatoxine B1 est ce jour la seule mycotoxine identifie comme cancrogne chez lhomme. Par ailleurs, il a t mis en vidence que laflatoxine B1 tait retrouve sous la forme de son mtabolite M1 dans le lait. Les mesures rglementaires en vigueur dans lUnion Europenne sont des plus svres. Mme si ces tudes et ces rglementations ont permis de diminuer le risque un niveau trs faible, ces mesures doivent tre poursuivies pour maintenir une matrise de ce risque un niveau faible. Plus prcisment, la conduite des plans de contrle visant vrifier lapplication des mesures lgislatives prises au sein de lUnion europenne est maintenir et cela aussi bien au stade des matires premires vgtales notamment fruits secs et arachides - quau stade des produits finis ou drivs tels que le lait. En ce domaine, la provenance des chantillons est une information dintrt maintenir pour linterprtation des donnes issues de ces plans. De plus il est recommand au niveau de la surveillance : Un programme de surveillance orient sur le mas, en ciblant par exemple une rgion suivie sur plusieurs annes, permettra de relier les teneurs en aflatoxines en fonction des conditions climatiques. En effet, lvolution climatique observe en Europe pourrait conduire des conditions de temprature et dhumidit favorables la prolifration despces toxinognes avec possibilit de production daflatoxines dans certaines rgions mridionales de la France. au niveau de la prvention : les mesures rglementaires peuvent tre contraignantes pour certains acteurs professionnels notamment pour ceux des pays en voie de dveloppement qui abritent une grande part des zones "risque aflatoxines". De ce fait, ces mesures sont accompagner par ltablissement de guides de bonnes pratiques appliquer la production et la transformation. Cest laccent que mettent certaines instances internationales dans leurs travaux actuels. Ceux-ci doivent donc tre encourags. au niveau des connaissances relatives au devenir chez les animaux dlevage : il serait intressant de raliser des tudes de transfert dans les ufs et les abats chez les volailles, dans les abats chez les autres animaux, ainsi que dans le lait chez les petits ruminants. En outre, des tudes complmentaires chez les vaches fortes productrices viseront confirmer le taux de transfert dans le lait

Ochratoxines

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LOTA est une mycotoxine qui prsente des effets nphrotoxiques dmontrs chez l'animal et suspects chez l'homme. En 2006, la DHT a t revue la hausse 120 ng/kg p.c./sem par l'EFSA. Cette rvaluation se fonde notamment sur la dmonstration de labsence de gnotoxicit directe de lOTA. Des techniques analytiques plus sensibles sont dvelopper de faon affiner les estimations d'exposition du consommateur, pour deux raisons majeures. Dune part, le nombre de donnes de contamination par lOTA des denres alimentaires infrieures la limite de dtection est important et la mthode de calcul conduit vraisemblablement une surestimation de lexposition du fait de la multiplicit des denres susceptibles dtre contamines. Les farines de seigle et de sarrasin paraissent les plus contamines ; aussi conviendrait-il de renforcer les plans de surveillance et de contrle de lOTA dans ces produits. Les donnes de contamination relies la consommation montrent que les forts consommateurs franais sont exposs 3,5 ng/kg p.c./j (20% de la DJT) pour les adultes et 7,8 ng/kg p.c./j (45% de la DJT) pour les enfants. Cependant, il est souligner que les calculs dexposition ne prennent pas en compte les nourrissons, et de ce fait que des donnes supplmentaires seraient ncessaires afin dvaluer les taux dexposition de cette population de consommateurs avec prise en compte de leurs prfrences alimentaires. Des interrogations subsistent quant l'origine et la signification toxicologique de la prsence dOTA faible concentration dans le sang humain et dans le lait maternel. Des tudes complmentaires associant les donnes dexposition et la prsence de cette toxine dans les liquides biologiques humains, sont ncessaires pour clairer cet aspect afin de mieux estimer le risque pour l'homme.

Les trichothcnes Les TCT sont des mycotoxines produites principalement par des Fusarium dans les pays au climat tempr et humide. Les TCT sont une famille de plusieurs centaines de molcules, mais seules quelques unes dentre elles sont retrouves sur les matires premires cralires et les produits finis craliers en raison de la grande stabilit de ces molcules aux fortes tempratures. Parmi ces mycotoxines, cest le doxynivalnol (DON) qui est le plus frquemment retrouv sur les crales en France, des taux variables qui dpendent principalement des conditions climatiques lors de la priode floraison-rcolte. Dautres TCT mritent dtre suivis en raison du risque potentiel quils reprsentent (notamment toxicit, prvalence): le nivalnol (NIV), le diacetoxyscirpnol (DAS), et les toxines T-2 et HT-2. Parmi les TCT, le DON est le plus souvent retrouv sur les denres alimentaires vgtales mais est le moins toxique, alors que la toxine T-2 est moins souvent retrouve mais est plus toxique que le DON. Les principaux effets toxiques des trichothcnes du groupe A (T2, HT2, DAS), hmatotoxicit et immunotoxicit, se manifestent par une diminution du nombre de cellules sanguines circulantes, principalement des globules blancs et des plaquettes et un affaiblissement des dfenses immunitaires de trs faibles niveaux de contamination. Les principaux effets toxiques des trichothcnes du groupe B (DON, NIV) se traduisent par une diminution de la consommation alimentaire et du gain de poids. Chez les animaux de production, ceci conduit une perte conomique pour l'leveur. Toutefois, l'exposition humaine via la consommation de produits animaux provenant d'levages exposs est faible. Les animaux de compagnie, et plus particulirement les flids, sont galement sujets des troubles hmatologiques et immunologiques induits par la consommation d'aliments contamins par des TCT. Le consommateur franais est expos des doses infrieures aux doses considres comme sans risque de survenue des effets toxiques ; ces doses sont respectivement : les Doses Journalires Tolrables (DJT) sont pour le DON : 1 g/kg pc /j, le NIV : 0,07 g/kg pc /j et les toxines T-2 et HT-2 : 0,06 g/kg pc /j. Il faut noter cependant que ces valeurs toxicologiques de rfrence ont t fixes partir d'tudes chez l'animal dont la qualit et la quantit sont insuffisantes. Les agences internationales en charge de fixer les DJT ont soulign la carence en tudes toxicologiques de rfrence. Il est donc pertinent de suivre les recommandations de ces agences visant la mise en place d'tudes subchroniques (1/10 de la dure de vie de lanimal, 90 jours chez le rat) et chroniques (2 ans

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chez le rat) menes suivant les lignes directrices OCDE, sur les espces les plus sensibles afin de fixer des valeurs toxicologiques de rfrence plus prcises. Les TCT n'ont pas t assez pris en compte au cours du sicle dernier en tant que contaminants alimentaires. Il est indispensable de disposer de donnes suffisamment solides la fois en toxicologie conventionnelle et en exposition humaine pour caractriser le risque pour l'homme, mais galement en termes d'chantillonnage et de dosage dans l'alimentation humaine et animale compte tenu des consquences de leur prsence potentielle dans les produits craliers. La Commission europenne a publi un rglement fixant des limites maximales en DON dans les matires premires et les denres destines l'alimentation humaine. Toutefois, il convient de dvelopper des mthodes de multidtection rapides et compatibles avec les limites rglementaires, utilisables dans les auto-contrles. Ainsi, dans le cadre des plans de surveillance et de contrle, il conviendrait de rechercher les teneurs en toxines T-2 et HT-2, conjointement aux teneurs en DON et en NIV dans les produits craliers avec des limites analytiques permettant lestimation de lexposition. Il est important galement de prendre en compte la possibilit de multicontaminations par des TCT diffrents, ou des TCT et d'autres mycotoxines comme la zaralnone, voire les fumonisines. Des tudes subchroniques sont entreprendre pour valuer les consquences toxicologiques de telles multicontaminations. Zaralnone Leffet toxique le plus proccupant de la zaralnone est son caractre de perturbateur endocrinien activit strognique. Leffet sur lhomme nest pas avr. En revanche, les porcins sont sensibles la zaralnone et plus particulirement les jeunes femelles. Chez cette espce, la zaralnone subit une bioactivation en -zaralnol, dont lactivit strognique est suprieure celle du compos parental. Cette bioconversion pourrait intervenir dans le tube digestif des ruminants, mais le risque dune contamination du lait reste dmontrer. La prsence de la zaralnone et de ses mtabolites, notamment l-zaralnol, dans les produits animaux, devrait ainsi faire lobjet dtudes complmentaires afin dvaluer la ralit du transfert dans les denres dorigine animale. La DJTP fixe par le SCF en 2000 a t retenue pour la caractrisation du risque pour le consommateur. Lexposition alimentaire humaine est infrieure la dose journalire tolrable sauf pour 2,5% des enfants de 3 14 ans, et pour 31% de la population vgtalienne. Les principaux aliments vecteurs sont les crales (mas) contamines au champ par des Fusarium producteurs. Les plans de surveillance devraient tre conforts par la prise en compte des produits craliers base de bl destins lalimentation humaine et animale. Les animaux dlevage peuvent tre exposs la zaralnone contaminant les crales et coproduits craliers des teneurs leves capables dinduire un risque dapparition deffets strogniques, notamment chez le porc. Il serait souhaitable de disposer de plus de donnes de contamination dautres matires premires, et notamment de fourrages et densilages. Compte tenu de la part prpondrante prise par les aliments secs dans lalimentation des carnivores domestiques, et de la contribution notable de certaines crales risque (mas notamment) dans la formulation de ces aliments, des essais devraient tre entrepris afin dvaluer scientifiquement le niveau de rceptivit et de sensibilit des femelles reproductrices de ces deux espces. Il serait souhaitable que des tudes toxicologiques soient ralises selon les lignes directrices reconnues internationalement afin de rviser les doses journalires tolrables provisoires fixes en 1999 et 2000 sur le fondement dtudes insuffisantes. Il serait aussi intressant dtudier les interactions de la zaralnone avec les autres perturbateurs endocriniens. Des tudes devraient galement tre conduites pour amliorer les connaissances toxicologiques des associations de toxines fusariennes, notamment de la zaralnone avec des trichothcnes et des fumonisines.

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Fumonisines Parmi les diffrentes fumonisines, les effets de la fumonisine B1 (FB1) sont les mieux caractriss : on assiste notamment une altration du mtabolisme des sphingolipides dont toutes les consquences toxicologiques ne sont pas connues. En terme d'effet clinique majeur, ldme pulmonaire porcin et la leucoencphalomalacie quine sont les principaux effets observs sur la sant animale. La population franaise est peu expose aux diffrentes fumonisines en raison de la faible consommation de mas et du faible transfert de ces toxines dans les produits animaux. Cependant, les teneurs mesures dans le cadre des plans de surveillance et de contrle dans les produits base de crales destins aux enfants en bas-ge montrent quil conviendrait de renforcer les contrles sur ces produits. En revanche, la population animale est plus expose, le mas pouvant constituer un lment majeur de son alimentation. Particulirement contamines, les issues de mas utilises dans l'alimentation des animaux, notamment celle des quids, prsentent un risque particulier et devraient tre rglementes. D'une faon gnrale, les teneurs maximales recommandes (Recommandations de la Commission et de la FDA43) pour les mas destins aux animaux apparaissent trop laxistes au regard de la protection de la sant animale. La connaissance de la toxicit des fumonisines autres que la FB1 est trs limite et le diffrentiel toxique entre fumonisines n'est pas connu. Il faudra lavenir engager des recherches sur le danger toxique des fumonisines, notamment les dangers immunotoxique et cancrogne doses faibles. Outre la recherche sur les dangers toxiques des fumonisines, plusieurs voies damlioration sont considrer : du point de vue rglementaire, la rglementation devrait s'appliquer non seulement la somme FB1+FB2 mais galement la seule FB1. du point de vue analytique, des progrs sont attendus pour le dosage en routine des fumonisines dans les matires premires et produits finis. du point de vue de la surveillance, la conduite des plans devra se poursuivre sur le mas afin de prendre en compte lvolution du climat. En effet, la contamination naturelle en fumonisines peut tre frquente selon les annes dans le mas du sud de l'Europe. Par ailleurs les plans de surveillance devront intgrer le shorgo.

La patuline La patuline est une mycotoxine susceptible dtre retrouve ltat de contaminant naturel dun grand nombre daliments dorigine vgtale issus des fruits et notamment de la pomme. A ce titre, elle fait lobjet dune rglementation drastique pour tous les aliments de cette filire et notamment pour les jus de fruits et compotes destins aux enfants et aux personnes ges. Nanmoins, de grandes incertitudes existent quant au devenir de cette mycotoxine dont le suivi analytique est difficile dans les matrices biologiques. En effet, la liaison avec les groupements thiols des peptides et des protines interdit toute dtection ultrieure de la toxine, de mtabolites ou de ses composs daddition. Les tudes entreprises concernant la toxicit chronique de la patuline, peu nombreuses et relativement anciennes, ont surtout dmontr, doses moyennes, des dsordres intestinaux et des perturbations de la fonction rnale. Les symptmes nerveux suspects dtre associs lors daccidents dlevage ne sont pas rapports dans les tudes exprimentales. Ces mmes tudes ne mentionnent jamais de pouvoir cancrogne in vivo chez lanimal. Cest la raison pour laquelle cette toxine a t classe par le CIRC (198644) dans le groupe 3 des produits pour lesquels il est impossible de se prononcer quant la cancrognicit pour lhomme.

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FDA. Background Paper in Support of Fumonisin Levels in Animal Feed, FDA 2001. IARC (1986) International Agency for Research on Cancer. Monographs on the evaluation of carcinogenic risk of chemicals to man: Vol. 40 Some naturally occurring and synthetic food components, flurocoumarins and ultraviolet radiation, p83-98

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Nanmoins, une tude rcente entreprise chez le rat expos la patuline durant 90 jours, rapporte des perturbations des hormones strodes circulantes corrles des atteintes testiculaire et thyrodienne. Cette information mriterait confirmation en raison du souci actuel des toxicologues statuer sur le caractre perturbateur endocrinien de tout constituant ou contaminant alimentaire. Plus gnralement, des recherches sur le danger toxique rel de la patuline devraient tre engages. L'exposition alimentaire de l'homme reste trs infrieure pour les enfants comme pour les populations vgtariennes la dose journalire maximale tolrable provisoire fixe en 1995 par le JECFA 0,4 g/kg p.c./j. La rglementation en vigueur pour la prsence de patuline dans les aliments drivs de la pomme peut apparatre comme particulirement protectrice au regard des niveaux dexposition observs. L'exposition alimentaire des animaux d'levage est vraisemblable chez les ruminants par la consommation des ensilages ou des carts de tri de pommes. Toutefois, le danger rel chez l'animal demeure mal valu, compte tenu de la mconnaissance de la toxicit et du devenir de cette toxine. Il serait souhaitable de mettre en place un plan de surveillance sur les aliments conservs par voie acide (ensilages de fourrages ou de grains, fourrages enrubanns).

Les toxines de Claviceps purpurea Les champignons du genre Claviceps peuvent entraner la formation dergot sur toutes les gramines. Sa prsence diminue les rendements et la valeur nutritive du grain et entrane des risques pour la sant humaine et animale. En Europe, les toxines de C. purpurea sont indirectment rglementes en alimentation humaine et en alimentation animale ( puisque base sur une limite de proportion pondrale en ergot), limitant ainsi les risques dintoxications. Les problmes dergotisme, aussi bien convulsif que gangreneux, surviennent sur des animaux consommant librement des aliments contamins au pturage ou qui des crales non contrles sont fournies. Chez lhomme, les alcalodes de C. purpurea ne semblent plus constituer un risque sanitaire majeur pour la sant, tant donn que la problmatique est bien connue, que loccurrence dune contamination au champ est bien visible et quun tri slectif peut soprer. Nanmoins au regard de lvolution la fois des pratiques culturales visant diminuer les intrants (engrais et/ou traitements fongicides), et des conditions climatiques, favorables la survenue dpisodes de contamination par le genre Claviceps, linformation auprs des producteurs de crales et la surveillance par les autorits comptentes devraient tre renforces. De plus la rglementation actuelle pour lalimentation humaine concerne le seul bl et devrait voluer pour sappliquer toutes les crales, et ainsi, aprs acquisition des connaissances toxicologiques sur les toxines, prendre en compte la teneur en quelques alcalodes au lieu de la teneur pondrale dergot dans un lot de crales ou daliment.

La citrinine Il est peu probable que la citrinine seule prsente un risque pour lHomme dans les conditions dexposition connues actuellement. Toutefois son association lOTA pouvant engendrer une synergie, la surveillance de la contamination simultane de ces deux toxines en particulier dans les produits tels que consomms mriterait dtre ralise. En alimentation animale, le risque dintoxication provient surtout de la consommation de crales contamines utilises ltat brut, en particulier chez les porcs et les volailles.

Les toxines dAlternaria Au vu des donnes disponibles, il nexiste pas actuellement de raisons objectives de considrer le danger des toxines labores par Alternaria comme une priorit en scurit sanitaire des aliments destins lhomme ou aux animaux dlevage. Toutefois, les tudes toxicologiques essentiellement ralises in vitro laissent apparatre des caractres mutagnes qui devront tre confirms ou infirms par des tudes in vivo ralises chez des animaux recevant des doses compatibles avec les donnes

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de contaminations existantes. De plus la vigilance doit tre maintenue sur la qualification du caractre contaminant naturel de ces toxines, au travers denqutes voire de plans de surveillance.

Lacide cyclopiazonique Il est peu probable que lacide cyclopiazonique prsente un risque sanitaire majeur pour lHomme dans des conditions habituelles. Le risque dexposition pourrait provenir surtout de la consommation de crales contamines alors que celui provenant des produits laitiers est trs hypothtique. En Amrique du Nord, la prsence de ce co-contaminant de laflatoxine B1 est considre sans consquence nfaste car il est suppos participer lattnuation du danger des aflatoxines en participant leur inhibition mtabolique.

Les toxines trmorgnes dAspergillus et de Penicillium Les intoxications par des mycotoxines tremorgnes produites par Aspergillus et Penicillium sont principalement observes chez le chien. La toxicit aigu de ces composs est importante, mais peu dinformation existent quant leur toxicit chronique ou le risque de transfert dans les productions. Chez lhomme, si les intoxications aigus sont rares en raison du caractre trs altr des aliments contamins de fortes teneurs, il est difficile destimer un niveau rel dexposition. Il serait donc important de : i) prciser les dangers dune exposition chronique ces composs et leur caractre gnotoxique, ii) disposer de donnes sur leur transfert dans les productions, principalement lors dexposition des ruminants de faibles teneurs, iii) estimer les niveaux de contamination des produits connus pour leur contamination possible par ces moisissures. Les sporidesmines Bien que laffection observe en France soit moins grave que celle couramment rencontr