EXPERIMENTO 6 EXPERIMENTO 6 - CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) E CROMATOGRAFIA EM COLUNA

Objetivo: Utilizar a cromatografia em camada delgada para a identificao de diferentes compostos e a cromatografia em coluna para a separao de diferentes substncias orgnicas.

Fundamentao Terica: Normalmente trabalhamos em laboratrio com substncias quimicamente puras. Essa situao, no entanto, nem sempre a verdadeira. Reagentes ou solventes podem estar impuros ou sofrer contaminao. Reaes qumicas, por outro lado, geralmente conduzem a misturas mais ou menos complexas de produtos que devem ser visualizados, separados e purificados ao final das mesmas. Muitos so os mtodos existentes para a purificao/separao dos componentes de misturas. Entre os mais conhecidos podemos citar a catao, a dissoluo/cristalizao/ recristalizao fracionada, a extrao, a destilao e a sublimao. Estes mtodos so muito teis, so largamente empregados em laboratrios e em indstrias com bons/excelentes resultados e sero objeto de estudo detalhado nesta disciplina, nas prximas semanas. Eles falham, no entanto, quando os diversos componentes da mistura possuem constantes fsicas semelhantes, isto , pontos de fuso ou ebulio prximos, solubilidade semelhante em um mesmo solvente (ou mistura de solventes), etc. A cromatografia permite resolver este problema. A cromatografia um mtodo de separao de substncias baseado na distribuio seletiva dos diferentes componentes de uma mistura entre duas fases imiscveis. Os mtodos cromatogrficos permitem separar os componentes de uma mistura pois dependem da migrao seletiva e diferencial dos solutos atravs de um sistema constitudo de duas fases: uma slida (ou fixa) e outra fluida (ou

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EXPERIMENTO 6 mvel). A fase slida denominada adsorvente e estacionria. Adsoro a capacidade de uma substncia (o adsorvente) em deter ou concentrar seletivamente sobre a sua superfcie, gases, lquidos ou slidos, podendo ser arrastados por uma fase mvel, denominada eluente. A cromatografia muito utilizada para anlise, separao e purificao (em pesquisa e em escala industrial) de numerosos produtos naturais: antibiticos, vitaminas, hormnios, corantes, etc. Seu uso mais conhecido, no entanto, o da anlise, localizao e identificao de microgramas de substncias em meios biolgicos (exames "anti doping" e de medicina legal em geral). Cinco so os principais procedimentos cromatogrficos: a cromatografia em coluna, em papel, em camada delgada, em fase gasosa e em fase lquida.

Cromatografia em Papel

Esta tcnica cromatogrfica assim chamada porque utiliza para a separao e identificao das substncias ou componentes da mistura a migrao diferencial sobre a superfcie de uma tira de papel filtro de qualidade especial. Este tipo de cromatografia de execuo muito simples e necessita quantidades muito pequenas das substncias para realizar-se a anlise. A amostra aplicada na borda inferior de uma tira de papel filtro (cromatografia ascendente) ou na borda superior (cromatografia descendente). A seguir, a tira colocada em contato com o eluente escolhido, cuidando para que o mesmo no entre em contato direto com a amostra, deixando que ascenda ou descenda pela superfcie do papel filtro. A identificao das substncias pode ser feita por visualizao direta (quando possuem cor) ou pela utilizao de reveladores adequados. Este mtodo muito til para separar substncias muito polares como os acares e os aminocidos. No entanto, possui o inconveniente de se prestar somente a cromatografia de pequenas quantidades das substncias por vez.

Cromatografia em Camada Delgada (CCD)

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EXPERIMENTO 6 A cromatografia em camada delgada uma tcnica cromatogrfica muito parecida com a realizada em papel, porm que demanda menor tempo para sua execuo e que conduz a resultados muito mais eficientes e perfeitos de separao. Consiste em cobrir uma placa de vidro, alumnio ou plstico, com um adsorvente adequado e com uma granulao especial. A espessura da camada varia de 0,1 a 2,0mm e deve ser a mais uniforme possvel. O adsorvente misturado ou no com um aglutinante (geralmente gesso ou amido), suspenso em gua ou outro solvente adequado e depositado uniformemente sobre a placa (manualmente ou por intermdio de aplicadores apropriados). Ao secar, o adsorvente permanece aderido placa que, em geral, deve ser ativada por aquecimento em estufa. A revelao e identificao das substncias so feitas da mesma maneira que na cromatografia em papel. Possui a vantagem, no entanto, de poder utilizar reveladores mais agressivos, pois seu suporte mais resistente que o papel. A cromatografia em camada delgada utilizada habitualmente em anlise qualitativa e quantitativa devido sua grande sensibilidade e preciso. Pode ser utilizada, tambm, em escala preparativa para amostras de at 250mg. Para quantidades maiores prefere-se a cromatografia em coluna que ser vista mais adiante. Um dos aspectos mais importantes da cromatografia o de que em um determinado sistema cromatogrfico o movimento relativo de um composto em relao frente do solvente uma propriedade caracterstica e reprodutvel. Nas cromatografias em papel e em camada delgada expressa-se este movimento como um valor de "Rf" (Rate of flow). Este definido como a razo entre a distncia percorrida pela mancha e a distncia percorrida pelo solvente.

Estes valores so reprodutveis em condies idnticas de trabalho (temperatura, solvente, umidade constantes) e servem para caracterizar e
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EXPERIMENTO 6 identificar as substncias. A medida feita desde a linha de base (ponto onde foi aplicada a amostra) at o centro da mancha em estudo. O valor obtido comparado aos tabelados na literatura especializada podendo servir para identificar a substncia em questo.

Para aplicao das amostras utiliza-se tubos capilares ou micro conta-gotas de maneira que o dimetro das manchas no exceda 2mm. Caso a substncia se encontre em concentrao baixa repete-se a aplicao a intervalos de tempo suficientes para secar a aplicao anterior. Antes do desenvolvimento do cromatograma as manchas devero estar absolutamente secas. A cmara cromatogrfica deve ser um recipiente de vidro capaz de conter folgadamente a tira de papel filtro e possuir tampa. Aconselha-se colocar o eluente escolhido na cuba algum tempo antes de proceder anlise para permitir que o ambiente fique saturado com seus vapores (pode-se tambm agitar a cuba para facilitar a saturao).

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EXPERIMENTO 6

(a)

(b)

Figura 8: Cmaras cromatogrficas.

Cromatografia em coluna (vide experimento 4)

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL: PARTE 1: ANLISE DOS COMPONENTES DE UM ANALGSICO POR CCD COM O USO DE REVELADOR Separe 3 tubos de ensaio. No primeiro, coloque o cido acetilsaliclico proveniente de um medicamento (experimento 2). No segundo, coloque cido acetilsaliclico sintetizado e purificado em laboratrio (experimento 4) e no terceiro tubo coloque cido acetilsaliclico bruto proveniente do experimento 4. Coloque 2,5 mL de metanol nos trs tubos, macere o slido e agite cada tubo por 3-5 minutos. Em seguida, filtre e despreze o slido (se houver). Com a ajuda de um tubo capilar, aplique a uma distncia de 1 cm uma da outra as trs solues metanlicas em duas placas cromatogrficas distintas. Dependendo da

concentrao desta soluo, duas ou trs aplicaes sero suficientes. Prepare a seguir dois sistemas de eluentes: i) ii) acetona : clorofrmio 1:1 e tolueno : clorofrmio: cido actico glacial: metanol 12:5:1,8:0,1.

Prepare duas cubas cromatogrficas conforme instrues do professor, uma para cada sistema de eluentes. Coloque cada placa cromatogrfica dentro de uma cuba. Aps a eluio, retire as placas da cuba. Deixe-as secar. Aps a secagem, coloque-as em uma atmosfera de iodo para revelar as manchas. Em 1-3 minutos, aparecero manchas amareladas sobre as placas. Remova ento as

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EXPERIMENTO 6 placas de dentro da cuba de iodo, contornando cada mancha com o tubo capilar. Calcule o Rf. Em uma segunda placa cromatogrfica de slica aplique uma mistura de corante e elua em uma cuba contendo etanol, observe o resultado e proceda a montagem da coluna cromatogrfica da PARTE 2.

PARTE 2: SEPARAO EM COLUNA CROMATOGRFICA DE UM MISTURA DE CORANTES 1) Empacotamento da coluna: Prepare uma coluna para cromatografia utilizando slica gel como fase estacionria, da seguinte maneira: agite com um basto em um bquer, 3,0 g de slica gel em 10 mL de clorofrmio, at obter uma pasta fluida, homognea e sem bolhas de ar includas. Preencha a coluna cromatogrfica com a pasta com o auxlio de uma pipeta Pasteur, de modo que ela sedimente aos poucos e de forma homognea. Caso haja bolhas de ar oclusas na coluna, golpeie-a suavemente, de modo a expuls-las. Controle o nvel do solvente abrindo ocasionalmente a torneira da coluna. Terminada a preparao, o nvel de clofrmio deve estar 1 cm acima do topo da coluna de slica.

2)

Separao

dos

Componentes

de

uma

mistura:

Distribuir

homogeneamente sobre o topo da coluna de slica, com auxlio de uma pipeta ou conta-gotas, 0,5 mL de uma soluo etanlica de alaranjado de metila e azul de metileno. Aps a adsoro pela coluna, proceder a eluio com etanol, vertendo cuidadosamente o solvente pelas paredes internas da coluna, tomando cuidado para no causar distrbios ou agitao no topo da coluna (OBS.: utilize uma pipeta Pasteur para adicionar inicialmente o eluente pelas paredes da colna). Ao mesmo tempo, abrir a torneira para escoar o solvente. Eluir todo o primeiro corante com etanol. Recolha as fraes em tubo de ensaio, evitando deixar secar o topo da coluna. Terminada a eluio do primeiro corante, eluir o segundo corante retido na coluna com uma mistura de H2O:AcOH (1:1).

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