Hidrlisis enzimtica de aceite de hgado de bacalao para la produccin de cidos grasos

1.-introduccion En las ltimas dcadas, las lipasas han ganado la atencin de los investigadores en todo el mundo debido a sus aplicaciones en varias corrientes como sntesis de oleo-productos qumicos, productos qumicos finos, productos farmacuticos, fragancias y sabor, valor agregado para productos alimenticios con valores medicinales , etc. . Se han utilizado para la produccin de energa renovable debido a su capacidad para catalizar reacciones tales como hidrlisis y trans-esterificacin. Lipasas, se utilizan industrialmente y comercialmente en la ruptura del vnculo acilglicerol en presencia de la suficiente cantidad de agua y conducen a la formacin de los mono-glicridos, diglicridos, cidos grasos libres y el glicerol como subproductos. El mecanismo de la reaccin de hidrlisis conocida para los triglicridos de accin de la lipasa en aceite se da en la figura 1. Las lipasas son enzimas interfaciales permanecidas activadas en la interface de aceite- agua debido a la conformacin del sistema bifsico. El mecanismo actual representa el accesorio del grupo acilo (RCOO) de la cadena de lado positivo (NH3) e iones de hidrgeno (H) en la cadena lateral negativo (COO) en el sitio activo de la lipasa. Esto provoca la liberacin de cidos grasos libres (RCOOH) del solvente en el sistema bifsico y lipasa tambin pueden ser recuperados despus de la extraccin en la fase de solvente. La especificidad de las lipasas para la hidrlisis de diferentes cidos grasos depende del tipo de aminocido presente en su estructura para hacer un complejo con los respectivos sitios activos de los acidos grasos y por lo tanto, el uso de reacciones catalizadas con lipasa son ampliamente ventajosa debido a su alta especificidad, actividad, rendimiento mejorado, las condiciones de reaccin y leve reduccin del uso de productos qumicos y solventes. Muchos investigadores han reportado en sus estudios que las lipasas tienen diversos modos de accin para la hidrlisis de los cidos grasos presente en el aceite/grasas, dependiendo de si han originado de origen vegetal, animal o de microorganismos, por ejemplo en las posiciones especficas 1,3 , posicin especfica 2 y no especficas de las lipasas tambin se han divulgado. En la literatura, numerosos mtodos estn disponibles para la divisin grasosa, como la complejacin de urea, destilacin molecular, qumica, extraccin supercrtica a alta temperatura y presin , Pero la aplicacin de las lipasas es crucial para el estudio de las grasas y es preciso dividir los procesos debido a las siguientes razones: la especificidad de las lipasas para inicio de sustrato

causa de reacciones secundarias reducida, estructural y qumica, costo ptimo de extraccin debido a la activacin interfacial y fcil reciclado con suficiente actividad y separacin del producto. El presente estudio pretende determinar la fuerza comparativa de dos lipasas: Candida cylindreca (CCL) y Candida rugosa(CRL). Aceite de hgado de bacalao es conocido por tener gran cantidad de cidos grasos que puede ser hidrolizado para producir cidos grasos libres para uso farmacutico.

Figura 1. Mecanismo de la reaccin de la molcula de triglicridos mediante hidrlisis por la lipasa.

1. Materiales y mtodos

1.1.

Aceite de pescado y lipasas

Aceite de hgado de bacalao noruego de grado refinado de naturaleza suiza (500 ml) fue adquirido a mercado local de Saskatoon, Canad. Cndida cylindracea y lipasas de Candida rugosa fueron compradas de SigmaAldrich Co., Canad. Sus propiedades comerciales son dadas abajo en la tabla 1, segn lo informado por Lee y cancin y proporcionados por Sigma-Aldrich.com.

1.2.

Los productos qumicos

Productos qumicos de grado analtico como Isooctano, etanol, metanol, hidrxido de potasio e indicador fenolftalena y hexano, compr SigmaAldrich, Canad y fueron utilizados en el trabajo experimental. Mezcla estndar de cidos grasos metil ster de aceite de hgado de bacalao tambin fue comprado a SigmaAldrich, Canad.

1.3.

Procedimiento experimental

Se estudiaron las condiciones de reaccin adecuado para la hidrlisis del aceite de hgado de bacalao con Candida cylindracea y lipasas de Candida rugosa a diferentes pH, temperatura, aceite al agua y aceite al solvente en un agitador orbital con iso-octano. Para los experimentos de hidrlisis, aceite de pescado fue disuelto en solvente y cantidad apropiada de la lipasa se agreg junto con el agua destilada para preparar la mezcla de reaccin en el tornillo tope del matraz Erlenmeyer. Hidrlisis del aceite de pescado se ha estudiado a velocidad constante de agitacin (350 rpm) y la concentracin de enzima (20 mg/g de aceite) usando ISO-octano como solvente en sistema solvente bifsico. Para la comparativa cintico y estudio de la energa de activacin, la reaccin se llev a cabo continuamente en el agitador orbital durante 4 h en la reaccin ms adecuada condiciones estimada experimentalmente en estudiar una hora y luego se detuvo por adicin de 1 ml de metanol (50 C) caliente. 1.4. Anlisis

La caracterizacin de aceite de hgado de bacalao ha sido realizada sobre HPLC (Agilent 1100 modelo de Serie) equipado con el detector de ndice de refraccin (modela G1362A). Phenogel 100 A , 300 7.8 mm la columna de 5 micrmetros (modela G1316A) protegido con la columna de guardia y equipado con la estacin Chem para LC3D y usado para el anlisis HPLC para determinar la composicin de glicrido. El sistema Agilent de Cromatografa De gas (el modelo 7890A) ha sido usado, equipado con el detector de ionizacin de llama (FID, 260 C) y columna capilar DB-23 (dimensiones: 60 m de longitud, 0.25 mm ID, 0.25 micrmetros de pelcula), para anlisis de cidos grasos en forma de ster de metilo (FAMAS) . En todas partes de la experimentacin, el GC fue manejado en condiciones constantes (el portador: gas de hidrgeno con caudal 20 cm/minutos y 23.148 psi de presin; horno: 140-240 C a 4C/min e inyeccin: 1 micro litro de muestra, 260 C y hendidura: 20:1). La calibracin de ambos los instrumentos analticos ha sido hecha con normas autnticas.

Tabla 1 : propiedades comerciales de lipasas N 1

LIPASA FORMA ORIGEN MICROBIANO FABRICANTE

Candida cylindracea (CCL) Polvo amarillo marrn,

levadura

fluka

Candida rugosa lipase (CRL) TIPO VII solido

levadura

sigma

El rea superficial, volumen del poro y dimetro de poro promedio de lipasas fueron medidos por fisisorcin N2 a 77 K utilizando un 2000 Micromeritics lo antes posible. Aproximadamente 0,2 g de muestra se utiliz para cada anlisis. La humedad y otros gases adsorbidos presente en la muestra fueron retirados antes del anlisis de desgasificacin de la muestra en 60 C por 1 h y menor a 66.7 Pa (500 mmHg). La muestra fue evacuada luego a 2.67 Pa (20 mmHg) antes de la adsorcin de N2 . Espectros de robo-IR de lipasas en estudio se obtuvieron por granulacin de KBr ,por el mtodo Perkin-Elmer, espectro de FT-IR GX en el IR con un rango de 4004000 centmetro1 . Se determin la distribucin del tamao de partcula de lipasas con analizador maestro de tamao de partcula calibradores banco largo suministrado por instrumentos Melvern, Canad. El instrumento fue proporcionado con mnima HeNe lser (onda de 633 nm), las vigas dimetro 18y 42 matrices de detector de estado slido compuesto de elemento. Para este anlisis, el analizador de tamao de partcula se ajust con la lente en el rango de tamao de 300 RF (reserva de Fourier) para la medicin de partculas de tamao 0.05 900 m. Con respecto al dimetro de la partcula en micrmetros se registr el porcentaje de volumen de partculas. Mtodo estndar AOCS y AST fueron utilizados para estimar el grado de acidez de las muestras recolectadas en diferente tiempo de reaccin para

determinar la cantidad de cidos grasos libres (FFAs) formado. La actividad de la lipasa se ha expresado como micromoles de FFAs formados /ml de mezcla de reaccin. Los experimentos fueron realizados en juegos repetidos y una variacin en la tasa de formacin FFAs de < 3% fue observado. El porcentaje de hidrlisis (%H) se calcul con [{(cido evaluado en el tiempo t) (grado de acidez en el tiempo t = 0)} / valor de saponificacin] 100%.

2. RESULTADOS Y DISCUSION

2.1.

Caracterizacin del aceite de pescado

La caracterizacin del aceite de hgado de bacalao se ha realizado por primera vez para las siguientes propiedades fisicoqumicas: densidad: 928 kg/cm3; grado de acidez: 0,0561 mg KOH/g de aceite; valor de saponificacin: 181,1 mg KOH/g de aceite y yodo valor: 142,82 g I2/100 g de aceite. Adems, se determin la composicin de glicridos de aceite de hgado de bacalao con HPLC para medir el contenido de triglicridos ante la reaccin de hidrlisis. El aceite de hgado de bacalao fue inyectado en HPLC despus diluyndolo con solvente de tetrahidrofuron en una proporcin de 1:19. La muestra de aceite de hgado de bacalao se analiz con detector de ndice de refraccin en 35 C, 3.7 MPa y el flujo de 1 ml/min de mvil fase hasta 30 min. El anlisis con HPLC indic que el aceite de hgado de bacalao contiene en total 99% en peso de los triglicridos. La estimacin cuantitativa de los grupos de cidos grasos presentes en la columna vertebral de glicerol en el aceite de hgado de bacalao se realiz por cromatografa de gases. Por lo general, los grupos de cidos grasos pueden ser presentes en la gama de C13 a C24 dependiendo del tipo de aceite. Segn el anlisis de GC, el hgado de bacalao fue encontrado para contener principalmente siguientes cidos grasos , como el cido tridecanoico 2 wt % (C13:0), 10.5 wt % de cido esterico (C18: 0), 5.5 wt % de cido oleico (C18:1n9c), 0.5 wt % de cido linolnico (C2018:3n3), 5.5 wt % de cido behnico (C22:0), 0,05 wt % de cido araquidnico (C20:4n6), 1,0 wt % de cido tricosanoico (C23:0), 1 wt % cis-5, 8, 1114, 17-cido eicosapentaenoico(C20:5n3), 0,03 wt % de cido nervnico (C24:1), 10 wt % de cis-4, 7, 10, 13, 16, 19-docosahexaenico (C22:6n3) y 0.003 wt % cido Lignocrico (C24:0) en un total 36,1% en peso. La composicin de cidos grasos de aceite de hgado de bacalao en el anlisis tambin est de acuerdo con la literatura. 2.2. Caracterizacin de las lipasas

Tanto cylindracea Candida y lipasas de Candida rugosa se caracterizaron por sus propiedades fisicoqumicas usando varios mtodos instrumentales

analticos estndar tales como anlisis de tamao de partcula para las propiedades de superficie y FT-IR para detectar la presencia de grupos funcionales en las lipasas. Se encontr que tanto las enzimas son diferentes unos de otros con respecto a sus propiedades caractersticas superficiales como se indica en la tabla 2. Resultados de los anlisis demuestran que el dimetro de zona y poro superficial del CCL es aproximadamente dos veces con respecto a la enzima de la CRL. La mayor superficie de cualquier lipasa en comparacin con otro representa mayores posibilidades de colisin de sustrato a los sitios de Unin presentan en la superficie de la lipasa. Por lo tanto, aumentar el nmero de colisiones por segundo aumenta la velocidad de la reaccin. Tabla 2 : Caractersticas superficiales de las lipasas analizadas por el mtodo BET Numero 1 2 3 caractersticas
rea superficial BET (m /g) Dimetro de poro () Volumen total del poro monopunto (cm3/g)
2

CCL
17.9 - 0.07 66.3 0.03
+

CRL
7.8 0.02 48.7 0.09

El anlisis granulomtrico se realizan para lipasas tanto CCL y CRL , y averiguar su granulometra comparativos como se indica en la figura 2. Del estudio, se comprob que CCL enzima tiene el dimetro de la partcula uniforme en el intervalo de 90120 micrmetros mientras que en el caso de CRL el dimetro de la partcula no es uniforme y vara de 10 a 180 micrometros . Por lo tanto, para la enzima CCL se espera tener ms especificidad de triglicridos que tambin fue confirmado por el dimetro de las partculas regulares de la enzima CCL de los datos experimentales de hidrlisis. La forma o conformacin del sitio activo de la lipasa juega papel importante en la especificidad de la lipasa de su sustrato. Por lo tanto, la unin perfecta de sustrato depende de la uniformidad en la forma y el tamao de las lipasas porque las partculas uniformes de la lipasa slo podran proporcionar mejor atascamiento del substrato en la estructura de abrir la tapa de la lipasa en sus sitios activos. La constante KM por MichaelisMenten cintico es una medicin matemtica que representa la especificidad de las lipasas. El menor valor de la constante KM indica mejor especificidad de lipasa para el enlace con el sustrato. La composicin de la tapa que cubre el sitio activo, la geometra de la trada cataltica, la estructura y la dinmica de la abertura de la tapa del sitio activo son las caractersticas que imparten las lipasas con caractersticas nicas en su estructura-funcin.

Figura 2. Distribucin de tamao de partcula de las lipasas CCL y CRL.

Los espectros FT-IR de enzimas CCL y CRL se registraron como se muestra en la figura 3. Como enzimas CCL y CRL se originaron de una misma fuente microbiana como la levadura y por lo tanto, tienen patrn similar de grupo funcional en espectro FT-IR. Segn Fig. 3, el amplio pico presente en la gama de 35003200 centmetro1 representa el grupo hidroxilo libre de cido carboxlico. El pico agudo fuerte a 1700 centmetros1 corresponde al grupo carbonilo del grupo funcional cido carboxlico. El pico mediano a 2900 centmetros1 es el pico caracterstico para estirar la vibracin mientras pico fuerte a 1500 cm1 es para la vibracin flexin de Amina libre presente en la enzima.

Figura 3. Patrn de FT-IR de enzimas CCL y CRL.

2.3.

Optimizacin de parmetros

El efecto comparativo de parmetros tales como pH, temperatura, velocidad de agitacin, concentracin y solvente cantidad de agua sobre la actividad de CCL y CRL para hidrlisis de aceite de hgado de bacalao en sistema solvente bifsica se muestran en las figuras 4-8. Segn Fig. 4, CCL y CRL han mostrado actividad mxima de 118,6 y 87,1 micromoles FFAs formado/ml a pH 6.5 y 7.0 respectivamente. Esto demuestra que la reaccin de hidrlisis puede llevarse a cabo en el rango de pH 6.57.0 neutral porque las lipasas suelen contener residuos de aminocidos con un sitio activo y genera mxima afinidad por el sustrato en el rango de pH neutro. Por lo tanto, para el resto del estudio que ha sido seleccionado como ptimo pH = 6,5 para CCL y 7 para CRL. Dong et y Jing et han reportado la hidrlisis ptima con valores de pH neutro que inmoviliza a la lipasa Candida Antractica. Actividades mximas de 115,7 y 92,9 micromoles de FFAs formado/ml se han obtenido de CCL y CRL respectivamente, a la misma temperatura de 35 C en 1 h y las actividades de estas dos lipasas varan mucho en el rango de temperatura de 25 C como se muestra en la figura 5. Ambas lipasas eran vulnerables a la temperatura ms alta (> 50 C) que indica una fuerte reduccin en la actividad enzimtica con aumento de la temperatura porque da lugar a la desnaturalizacin de las protenas de la lipasa. Lee and Song han informado

de la actividad hidroltica de las Enzimas CCL y CRL en las temperatura de rango de 30 a 60 C y observaron una fuerte reduccin en la actividad de la lipasa tras un nuevo aumento de la temperatura por encima de los 45 C.

Fig.4. Efecto del pH sobre la actividad de CCL y CRL a 350 rpm, 35 C, 4:1 (w/w) relacin de agua al aceite y relacin (w/w) 1:1 de solvente para la hidrlisis de aceite de hgado de bacalao en 1 h.

Fig. 5. Efecto de la temperatura sobre la actividad de la CCL (pH 6.5 ) y CRL (pH 7.0) de 350 rpm, 4: 1 (w/w) relacin de agua al aceite y relacin 1:1 (w/w) de solvente para la hidrlisis del aceite de hgado de bacalao en 1 h.