/

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA

4a. EDICION Q.B.P. JUAN ANTONIO RODRIGUEZ ARZAVE

SCIENTIA iKxnntAiirunarr

FACULTAD

DE

CIENCIAS

BIOLOGICAS

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON

MONTERREY, N. L.

1987

1020111502
\j\m< I
f

MANUAL DE PRACTICAS DE BIOQUIMICA

4a. EDICION Q.B.P. JUAN ANTONIO RODRIGUEZ ARZAVE

FACULTAD

DE

CIENCIAS

BIOLOGICA

UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LE

tmnwmu txKw MONTERREY. N. L.

1987

 H 3.Z<-j

J-l**
C O N T E N I D O I.- DEDICATORIA II.-PREFACIO III.-PRACTICAS 1.-Preparacin de Soluciones Reguladoras 2.-Soluciones Reguladoras 3.-Capacidad Reguladora 4. -Pruebas Cualitativas para identificacin de Carbohidratos 5. -Cranatograf a en papel de Carbohidratos 6. -Polarimetra y Mutarrotacin de carbohidratos 7.-Determinacin de Azucares Totales por el Mtodo de Antrona 8.-Extraccin de Lpidos
fi.J, j U. .21 < f | ' : ; f \tM U f I sil B Sl's'fUj !

PAGINA
1 10 18

26 37 45 53
63

9.-Indice de Yodo e Indice de Saponificacin de una Grasa 10.-Separacin de Lipidos mediante Cromatografa en capa fina 11.-Reacciones de Identificacin de aminocidos y protenas 12.-Propiedades de las protenas (Dilisis, Desnaturalizacin y Equilibrio de Donnan 13.-Obtencin de Casena a partir de leche 14.-Obtencin de Acidos Nucleicos a partir de Levadura

71 82 91
103 113

'pj-is!
\

ff

120

MNDOUNtVBSTOMO

S-

IX - O I

CALIFICACIONES DE LOS REPORTES

1.-Preparacin de Soluciones Reguladoras 2.-Soluciones Reguladoras 3. -Capacidad Reguladora -

4.-Pruebas cualitativas para identificacin de carbohidratos 5.-Crematografa en papel de carbohidratos...... 3XD 6.-Polarimstr y Mutarrotacin de carbohidratos 7. -Determinacin de azucares totales por el Mtodo de Antrona.... 8.-Extraccin de Lpidos 9.-Indice de Yodo e Indice de saponificacin de una grasa 10.-Separacin de lpidos mediante eraratografia en capa fina 11.-Reacciones de Identificacin de aminocidos y protenas 12.-Propiedades de las protenas (Dilisis, Desnaturalizacin y Equilibrio de Donnan) 13.-Cbtencin de casena a partir de la leche 14.-Cbtencin de Acidos Nucleicos a partir de Levadura...

J f i C

P R E F A C I O

Los experimentos presentados en este Manual de Prcticas, han sido seleccionados partiendo de metodologas utilizadas por diferentes au tares, los cuales son citados en la bibliografa que se acaipaa al final de cada ensayo. Dichos experimentos se han modificado y adaptacfo al curso de Bioqumica para tratar de complementar los tpicos que sern cubier tos en la clase terica. Las diferentes secciones en que se encuentran divididos los experimentos son: INTRODUCCION OBJETIVO
FUNDAMENTO

MATERIAL Y REACTIVOS PARTE EXPERIMENTAL RESULTADOS DISCUSION CONCLUSIONES SECCION DE PREGUNTAS BIBLIOGRAFIA CONSULTADA En la INTRODUCCION prentendooos poner en contacto al alumrocon el tara a desarrollar, proporcionndole los antecedentes y la informa cin necesaria para una comprensin amplia de los OBJETIVOS fijados al realizar el experimento. El FNDAMBTTO de cada prctica ayudar a la interpretacin correcta de los acontecimientos que estn ocurriendo en cada uno de Iospasos mencionados en la PARTE EXPERIMENTAL. Para facilitar la rpida ejecucin del experimento, este De partamento de Bioqumica, les proporcionar todos los REACTIVOS necesarios ya preparados, pero es menester que el alumno conozca los clculos y procedimientos indispensables para la preparacin de los mismos. Tambin damos la lista del MATERIAL que se usar en el trans curso del ensayo,, tonando en cuenta que cada equipo de trabajo consistir de cuatro- alumnos. Parte importante de este manual son las CONTUSIONES a las que se llega al final del experimento, una vez hecha la DISCUSION de los RESULTADOS ocurridos durante el ensayo. las CONCUSIONES debern concor dar con los OBJETIVOS planteados al inicio' de la prctica.

d e d i c a t o r i a

Este Manual de Prcticas de Bioqumica lo dedico a mi esposa Q.B.P. POLA BECERRIL MONTES, a mis hijos CESAR RAUL y LILIA; as como a todos aquellos auxiliares e instructores del Area de Quit ca como un reconocimiento a su labor.

Incluimos una SECCION DE PREGUNTAS scbre el tema las cuales se referirn al procedimiento utilizado asi caro tanbin sern canplamentaras al tena. Para contestar dichas interrogantes, se podr con sultar diferentes textos, mismos que deber citar en el espacio denorr nado BIBLIOGRAFIA CONSULTADA. Al final de cada experimento hemos incluido una lista de fichas bibliogrficas revisadas para la elaboracin de cada uno de los experimentos que se presentan en este Manual, stas le sern de utilidad para consultar las preguntas que se le planteen. Esperamos que el Manual contribuya al mejor entendimiento de la Bioqumica y estimule a los estudiantes a interesarse en ella.

ATENTAMENTE

O.B.P. JUAN ANTONIO RODRIGUEZ ARZAVE Jefe del Laboratorio de Bioqumica

PREPARACION DE SOLUCIONES REGULADORAS INTRODUCCION las soluciones reguladoras pueden definirse como una mezcla en equilibrio de un par cido de Bronsted + Base Conjugada, la cual es capaz de resistir la adi cin de cidos bases fuertes, manteniendo el pH constante con cambios muy ligeros. OBJETIVO En este experimento pretenderlos preparar una solucin reguladora de acuer do a clculos qumicos previamente realizados, y verificar su pH en el potenci metro. FUNDAMENTO La preparacin de soluciones reguladoras a partir de sus materias primas, se puede -hacer anpleando cualquiera de los tres mtodos siguientes: a) Pesar los gramos de HA y A separadamente y luego disolverlos en el volumen apropiado de agua. b) Mezclar los volmenes necesarios de HA y A , y aforar con agua des tilada si se requiere . c) Pesar los gramos del compuesto que nos proporcionar tanto HA ccmo A , disolverlos en una pequea cantidad de agua; agregar el volumen nece sario de cido fuerte de base fuerte y conpletar con agua destilada hasta el volumen deseado.

los clculos para la preparacin de dichas soluciones reguladoras son sen cilios si seguimos detenidamente los siguientes ejonplos: REGULADOR TIPO 1 Preparar 800 mi de un Regulador de Benzoatos 0.1 M pH=5, a partir de Acido Benzoico slido (P.M,= 122) y Benzoato de Sodio slido (P.M.= 144) . El pKa del Acido Benzoico es 4.18. ler PASO;DETERMINAR LA RELACION A~ / HA QUE HABRA EN EL REGULADOR, aplicando para ello la Ecuacin de Henderson-] flasselbach : pH = pKa + log l Al HA

LHAJ

antilog ( 5 - 4.18 )

pH - pKa = log A~3 [HA] = antilog (pH - pKa )

jiyy = antilog 0.82 JLl = CHA]

6.6

2o. PASO: CALCULAR DDS % DE CADA ODMPONENTE , Dado que en el regulador la relacin [A J / [HA] =6.6 entonces tendrsitos :
+

6.60 partes de A 1.00 partes de HA 7.60 partes totales

Si 7.60 partes totales es el 100% de partes que constituyen al regula dor, entonces los porcentajes de ambos ocsrponentes se pueden calcular directamente de la siguiente manera: % DE A-] 7.60 partes totales 6.60 partes de A~ 100% X % DE HA] 7.60 partes totales 1.00 partes de HA X= 100% X

X= (6.60 partes A~) ( 100 % ) (7.60 partes totales) = 86.8 % de A~

(1.00 parte HA ) ( 100 % ) (7.60 partes totales)

= 13.2 % de HA

3er PASO: TRANSFORMAR IOS % a moles/ litro r Si sbanos que [REGULADOR] = [HA] + [AJ ,entonces la concentracin del regulador se puede considerar como un 100%, y directamente poderos cal cular los moles/1 de cada especie, cano sigue: moles/1 de A~ 0.1 moles/I X 100% 86.8% de A~ moles/1 de HA 0.1 moles/1 X 100% 13.2% de HA

X= (0.1 moles/1 ) (86.8%) ( 100 % ) = 0.0868 moles/1 de |A~]

X = (0.1 moles/1 ) (13.2% )

( 100 % )

= 0.0132 moles/1 de [HA]

4o. PASO: TRANSFORMAR LOS moles/1 a GRAMOS. los gramos de cada componente se pueden calcular snpleando la frmula de Molaridad, cono se ilustra enseguida: g^-= ( M^J (P.M.a_) ( litro) g ^ = C M^) ( P-M.^) (litro) = (0.0132 mol/1) (122 g/nol) (0.8 1) = 1,2883 GRAMOS DE ACIDO BENZOICO

= (0.0868 mol/1) (144 g/itol) (0.8 1) = 9.9999 GRAMOS DE BENZOATO DE SODIO

5o. PASO: PREPARACION DEL REGULADOR En 100 mi de agua destilada disolver 9.9999 gramos de Benzoato de Sodio y 1.2883 gramos de Acido Benzoico, y aforar a 800 mi con agua destilada.

REGULADOR TIPO 2 Para la preparacin de un regulador del segundo tipo, por ejenplo: preparar 800 mi de un Regulador de Benzoatos 0.1 M pH=5 a partir de Acido Benzoico 1 M y Benzoato de Sodio 1 M? se siguen los primeros tres pasos mencionados en el problema anterior que fueron: 1.-CALCULAR LA RELACION_[ A "J / [HA} 2.-CALCULAR LOS % DE A Y HA 3.-TRANSFORMAR LOS % A moles/1 , y el 4o. PASO:CALCULAR LOS MILILITROS DE HA y A", utilizando para ello la siguiente ecuacin: V C 1 1 = V2C2
3b
:XHU

_^ Si sbenos que en el regulador la (j] = 0.0868 moles/1 y la - - [HA) = 0.0132 moles/1, entonces los mililitros requeridos de cada caiponente se calculan sustituyendo en la ecuacin anterior de la siguiente manera: mililitros de A" ( X mi ) ( 1 M ) = (800 mi) (0.0868 M) mililitros de HA (X mi) (1 M)= (80Gml) (0.0132M) X= (800 mi) (0.0132 M) (1 M )

D3Hj

eup aanadea i
I\?9

X=

LCOCJSr ,'"'.>fiO P-fJ

(800 mi) (0.0868 M) ( 1 M)

= 69.44 mi de BENZOATO DE SODIO

= 10.56 mi DE ACIDO BENZOICO

5o. PASO: PREPARACION DEL REGULADOR: Mezclar 69.44 mi de Benzoato de Sodio 1 M ~ y 10.56 mi de Acido Benzoico 1M y aforar a 800 mi con agua destilada. REGULADOR TIPO 3 Preparar 800 mi de un regulador de Benzoatos 0.1 M pH=5 si disponemos de Acido Benzoico cristalino, HCl 6M y NaOH 4M. Dado que solamente disponerlos del acido d&il, la base conjugada la pode nos formar agregando una base fuerte a la solucin de acido dbil, de acuerdo a la siguiente reaccin: CQOH + NaOH ler PASO:CALCULAR WS GRAMOS DE ACIDO BENZOICO. Cano el cido benzoico nos pro porcionar tanto HA coro A~ , entonces REGULADOR = ACIDO BENZOICO , por lo que los granos de cido benzoico se pueden conocer directamente a partir de la siguiente ecuacin: g = ( M ) (P.M.) (litro) = (0.1M) (122g/inol) C0.8 1 ) = 9.76 granos de ACIDO BENZOICO

i s.

tifi.

" j

. i . . :

jLiuyaa Lsb : s a b f c i .tei rat sh lioz'z&cp-xq si iq : 1 J " ? ' , 4, 0 s f c < . . . , o : . . : ? > - nu b . r , , x s t L s q e ' r : .
:- " r C'SO' er. v M 1 cc .. u .: x o . . ' . i -: . . mldoiq Is

2o. PASO: CALCULAR IOS MILILITROS DE BASE FUERTE Cano el volumen de NaOH depender directamente de la A que se necesita en el regulador, entonces tenorios que calcular los moles/1 de HA siguiendo los pasos anteriormente mencionados que fueron: 1.-DETERMINAR LA RELACION \a~] / [HA] 2.-CALCULAR EL % DE A_ 3.-TRANSFORMAR EL % A a moles/1 DE A De acuerdo a estos pasos, la [a~] = 0.0868 moles/1. Para formar esta cantidad de [A"], debern reaccionar estequiomtricamente 0.0868 moles/1 de Acido Benzoico con 0.0868 moles/1 de NaOH

-,
- .....L.

XTAJ irci:, AI > I u l q . I A ' > . i 3 T ' 1 : * -' " 0 . uuai/o- > i - il .^fl/OT- . .
: , '

f!Tq cbcBZiLiJu , A v AK 2 C 1 aOBT"' rL.UK G..

- -

a l . Y Asecsji 853Q.0 = L.A] b1 'xcsluiga-i le ne eup acrcedsa 18 r M : r^ V r Tri/io ;C ' , v 1 . J sb XIIBI^ NB-.o;^rae BI r : o b T s v x r J I ; : /s L O . . .<

por lo que en el regulador, la concentracin de NaOH ser de 0.0868M. Los milili tros de NaOH 4M que se debern tomar para preparar el regulador, se calcularn de acuerdo a la siguiente ecuacin:
V

(M'XCO 0) (Io]C")8)

. ; . )

. ,.

. , / ,-; > {

V *

: ! r > r > : i

1 =

. ' f Jr:u .

> M - ^800)
(M i )

( l . f l j 00 t; - ,

( X mi) (4 M) = (800 mi ) ( 0.0868 M ) X= ( 800 mi ) ( 0.0868 M ) ( 4M )

'>.'b

.o

loia Y s ?

textr^

" "r r

.vocA-uadha gj .im^i-Hi -.m -

- 17.36 mi de NaOH 4 M3er. PASO: PREPARACION DEL REGULADOR: Disolver 9.76 gramos de Acido Benzoico en 100 mi de agua destilada, aadir 17.36 mi de NaOH 4 M, y aforar a 800 mi con agua destilada.

- ofoiOA.

P'wnii) p

M r n ^NTSOSFJBFL . h -Tor-^IUP^T C I D eb Im 008' -I6ISQNC! MATERIAL POR EQUIPO DE CUATRO PERSONAS

; ., > . : ' j d > 3D

c c i : . . ; . ' > b ibxof./!c,I r , ^r^ii. e^s mvj obasr^iw, -ascao:: erx. 1 " " crft7 sneixfoxa E .
(q)

*-;; i

- ^
; (M) (MI.o x

^ ,
=p =

(tjl r A ; odruiv ixaaoxoJq

>. -I

2 vasos de precipitados 1 probeta graduada 1 pipeta de 5 mi 1 matraz de aforacin de 250 mi 1 agitador de vidrio 1 piceta con agua destilada PARTE EXPERIMENTAL l.-Cada equipo preparar 250 mi de una solucin reguladora de acuerdo con las indicaciones dada por el instructor. Haga los clculos necesarios en la siguiente hoja:

' "
&

'

F crpOA %a 3LMAHD 3QI HAICaiA..

/'
X ' " J i : , ! . v 3 -

(oxri.D (.4,q) i 8 . 0 ) (CT!\p.v;SI)

. i

- J/.-.J v ' D aanf-^) 2 ' I : 3 . r p . .. \jB, y3 -j^aohroie

; o r

l)\ P

C A L C U L O S

2.-Prepare su solucin reguladora de acuerdo a los resultados matemticos obtenidos.

3. -CALIBRACION DEL POTENCICMETRO: Conecte el potenci&netro, durante 10 minutos mantenga el botn de pH en la posicin stand-by. Saque los electrodos de la solucin donde se encuentran y lvelos con agua destilada. Squelos e introdzcalos en una solucin reguladora de pH conocido; mueva el botn a pH , y con el botn de estandarizar lleve la aguja hasta el pH deseado. Regrese el botn a stand by. Lave los electrodos, squelos y I Ya estn listos para usarse r 4.-Determine el pH de la Solucin Reguladora que prepar.

RESULTADOS En la siguiente tabla anote las cantidades de cada ccmponente empleado en la preparacin del regulador.

"

."

COMPONENTE A

COMPONENTE B

Anote el pH de la solucin reguladora determinado potenciaatricamente:

DISCUSION DE LOS RESULTADOS

B I

B L I

O G R

A F I A

1.- Bohinski, R.C. 1978. Bioqumica, la Edicin en espaol. Fondo Educativo Interamericano . pp 63 - 66 2.- Dawson, R.M.C, et al. 1972. Data for Biochemical Research. 2a. Edition. Oxford Universi ty Press, Ely House London W.I. 3.- Hamilton, L.F. y S.G. Siirpson. 1968.Clculos de Qumica Anali tica. Traduccin de la 6a. Edicin en Ingles. Ediciones Castilla,S.A. 4.- Plummer, D.T. 1981. Introduccin a la Bioqumica Prctica. Traducido de la 2a. Edicin en ingls. Editorial McGraw-Hill Latino americana, S.A. Bogot, Colombia.

SOLUCICNES REGUIADORAS INTECDUCCICN El funcionamiento correcto de los sistemas biolgicos requiere un control efectivo del pH, ya que los procesos metablieos se inactivan fuera de ciertos l mi tes de acidez. El pH ptimo de las enzimas es un factor Importante para estable cer el rango de pH que podra tener un compartimiento intra extracelular. Las clulas mantienen una concentracin de hidrgenos dada, an cuando puedan ser pro ducidos cidos bases internamente, o que el pH del medio ambiente pueda cambiar. Este control es efectuado por sistemas amortiguadores de pH deneminado "Buffers", "Amortiguadores" "Soluciones Reguladoras". OBJETIVO Determinar la actividad de las soluciones reguladoras frente a los cidos fuertes y bases fuertes, y adems prebar su efectividad en el control del pH, ccm parndola con una solucin no amortiguadora cato el agua solucin salina. FUNDAMENTO El par Acido de Rronsted + Base Conjugada que integran a una solucin reguladora, pueden formarse con un cido dbil y su sal una base dbil y su sal. El mecanismo cano funciona dicha solucin reguladora es el siguiente: Una solucin que contiene cantidades equinoleculares de benzoato de sodio y cido benzoico, reaccionar con cualquier cido base agre gados de acuerdo a las siguientes ecuaciones qumicas: AL ADICIONAR ACIDO: C00 H (del acido agregado) + ligeramente ionizado AL ADIONAR ALCALI : COOH OH (de la base agregada) + + 1^0 Electrolito Dbil se ioniza ligeramente

__

MATERIAL POR EQUIPO DE 4 PERSONAS 4 vasos de precipitados de 250 mi 2 vasos de precipitados de 100 mi 1 probeta graduada de 100 mi 2 pipetas de 5 mi 1 piceta con agua destilada 1 agitador magntico 1 barra magntica Kleenex REACTIVOS 1.- NaOH 0.1M : Disolver con agitacin 0.4 gramos de Hidrxido de Sodio en 50 mi de agua fra,y aforar a un volumen final de 100 mi con agua destilada fra. 2.- HCl 0.1 M : En 10 mi de agua destilada adicionar 0.83 mi de Acido Clorhdrico, mezclar., y aforar a 100 mi con agua destilada. 3.- Regulador de Acetatos 0.1 M pH= 4: Mezclar 580 mi de Solucin B y 420 mi de Solucin A, y a justar el pH si es necesario. SOLUCION A: Acetato de Sodio 0.1 M: Disolver 0.860 granos de acetato de sodio en agua y aforar a 100 mi con agua destilada SOLUCION B: Acido Actico 0.1 M : Transferir 5.8 mi de Acido Actico concen trado a 100 mi de agua destilada, mezclar, y aforar a 1 litro. 4.- Regulador de Fosfatos 0.1 M pH =7: Mezclar 386.9 mi de Solucin A con 613.Iml de Solucin B. SOLUCION A: K2HP04 0.1 M: Disolver 17.4 gramos de anhidro en 100 mi de agua destilada y aforar a 1 litro con agua. SOLUCION B: KH2P04 0. 1M : Disolver 13.8 granos de KH2P04 anhidro en 100 mi de agua y aforar a 1 litro con agua des-ilada. 5.- Regulador de TRIS-HCl 0.1M pH= 8 : Mezclar 100 mi de solucin A con 111.6 mi de solucin B y aforar a 1 litro con agua destilada. SOLUCION A: Trishidroximetil-aminometano 2 M : Disolver 24.23 gramos de TRIS en agua, y aforar a 1 litro. SOLUCION B: HCl 1 M: transferir 83 mi de Acido Clorhdrico concentrado a 100 mi de agua destilada , mezclar, y aforar a 1 litro. 6.- Regulador de pH conocido para calibrar el potencimetro

PARTE EXPERIMENTAL Cada guipo trabajar solamente con una solucin amortiguadora, llevando a cabo los siguientes experimentos: I.- SOLUCION REGULADORA + BASE FUERTE a)Transferir 100 mi del regulador indicado a un vaso de precipitados de 250ml y adicionar cuidadosamente la barra magntica. b) Coloque el vaso de precipitados sobre una base magntica cercana al poten ci&netro, e introduzca los electrodos en la solucin. c)Determine el pH de la solucin, moviendo el botn de stand-by a la posicin pH, registre este valor ya que es el pH inicial. Deje el botn en esa posicin, y encienda la agitacin en la base magntica \CUIDADO, PUEDE ROMPER LOS ELECTRODOS I d)Aada 5 mi de NaOH 0.1 M en alcuotas de 0.5 mi, determinando el pH de la solucin despus de cada adicin de lcali, registre sus lecturas. e)Al finalizar el experimento, apague los aparatos, lave los electrodos nuevamente, squelos y continu con el siguiente experimento. II.- SOLUCION REGULADORA + ACIDO FUERTE a)Repita los pasos a, b y c anteriores d)Aada 5 mi de HC1 0.1 M en alcuotas de 0.5 mi, determinando el pH de la solucin reguladora despus de cada adicin de cido.Registre sus datos. e)Apague los aparatos, lave y seque los electrodos y prosiga con el siguiente ensayo. III.- AGUA DESTILADA O SOLUCION SALINA + BASE FUERTE a) Transfiera 100 mi de agua destilada solucin salina a un vaso de precipi tados de 250 mi, y adicione cuidadosamente la barra magntica. b)Coloque el vaso de precipitados sobre la base magntica cercana al potencimetro e introduzca los electrodos en la solucin. Determine el pH inicial y regstrelo. Encienda la agitacin en la base magntica y luego: c)Aada 5 mi de NaOH 0.1 M en alcuotas de 0.5 mi, determinando el pH tras cada adicin. Arte los datos. d)Al terminar, lave y seque los electrodos y continu con el ultimo ensayo. IV.- AGUA DESTILADA O SOLUCION SALINA + ACIDO FUERTE Repita los pasos a y b del experimento III c)Adicione 5 mi de HCl 0.1M en alcuotas de 0.5 mi haciendo determinaciones del pH tras cada adicin. Anote sus valores. Al finalizar, apague los aparatos, lave y seque los electrodos, y sumergalos en agua destilada limpia.

RESULTADQS Tabule los datos obtenidos en sus experimentos I.II.-

IV.-

los resultados de las tablas anteriores exprselos en forma de 4 grficas en elpapel milimtrico de la hoja siguiente.

SECCION DE PREGUNTAS

o:

BIBLIOGRAFIA 1.- Baum, S.J. 1981. Introduccin a la Qumica Orgnica y Biolgica. Ccrrpaa Editorial Continental, S.A., Mxico, la. Publicacin, pp: 172-175, 531. 2.- Bohinski, R.C, 1978. Bioqumica, la Edicin en espaol. Fondo Educativo Interamericano, pp:63-66. 3.-Bruening,G. and R. Criddle et al . 1970. Biochemical Experiments. John Willey & Sons, Inc. la.Edi tion. pp: 31-70. 4.-Conn, E.E. and P.K. Stunf. 1972. Outlines of Biochanistcy. 3a. Edition. Willey International Edition. pp : 3-22. 5.-Harailton, L.F. y S.G. Simpson. 1968. Clculos de Qumica Analtica. Traduccin de la 6a. Edicin en ingls. Ediciones Castilla, S.A. 6.-Famsey Bronk, J. 1980. Biologa Qumica, una introduccin a la bioqumica, la Edicin en Espaol. Corpaa Editorial Continental,S.A. pp:72-74.

CAPACIDAD REGUIADOPA INTRODUCCION Comunmente en la investigacin biolgica, se utilizan soluciones amor tiguadoras para mantener un control estricto del pH; ya que las variaciones hacia uno u otro lado del pH deseado, afectarn grandemente la funcionalidaddel sistema bajo estudio. Generalmente, las soluciones amortiguadoras deben estar constituidas por un cido de Bronsted cuyo pKa sea cercano igual al pH deseado , pero adems, deben ser solubles en agua, resistentes a la degradacin qumica y biolgica, atxicas, no formar conplejos con iones en solucin y no deben absorber luz en la regin del ultravioleta visible del espectro electrcmaqntico. Pero tambin, una de las caractersticas que deben presentar las solu ciones reguladoras, es tener una buena eficiencia amortiguadora del pH, puesde ella va a depender la funcionalidad del regulador, puesto que una solucin reguladora muy eficiente ser acuella que tolere cantidades equivalentes de cido fuerte y de base fuerte.
OBJETIVO

Pretendemos en este experimento, seleccionar aquel recriador cuya eficiencia amortiguadora sea mxima, aprendiendo as a tener un criterio bien definido para cuando sea necesario seleccionar un regulador adecuado .
FUNDAMENTO

La capacidad reguladora eficiencia amortiguadora se considera cala cantidad de cido fuerte o de base fuerte que debe ser adicionada a una so lucion reguladora, para que sta sufra un desplazamiento del pH en una unidac. La eficiencia amortiguadora est regida por dos factores muy importan tes que son: a) la concentracin total del regulador ; es decir, la suma de las concentraciones del cido dbil y de la base conjugada. Asi, cuanto ms concentrado sea un regulador ms tolerante ser a la adicin de cidos bases fuer tes. b) La relacin existente entre [ A~ ] / [HA]:Cuando esta relacin es igual a 1, la solucion reguladora tiene su mxima eficiencia, y este valor se alcanza cuando el pH del regulador es igual al pKa del cido de Bronsted. Bajo es tas condiciones, la solucin amortiguadora tolerar la adicin de cantidades equivalentes de cido fuerte de base fuert-e para cambiar su pH en una unidad.

Tcmando la Ecuacin de Henderson-Hasselbach: pH = pKa + log [BASE CONJUGADA] [ ACIDO DEBIL J~

Si BASE CONJUGADA

= ACIDO DEBIL; entonces: BASE CONJUGADA] ACIDO DEBIL ]

=

Sustituyendo lo anterior en la ecuacin de Hender son Hasselbach, tendremos: pH = pKa + log 1 pH = pKa Cuando el pH de la solucin reguladora es mayor que el pKa del Acido de Bronsted, sta solucin ser eficiente en amortiguar la adicin de cidos fuertes, pero muy poco eficiente en amortiguar la adicin de bases fuertes, porque en solucin habr mayor cantidad de base conjugada que de cido dbil. Por lo contrario, cuando el pH es menor que el pKa, la solucin ser muy eficiente en tolerar la adicin de bases fuertes, pero muy poco eficiente en amortiguar la adicin de cidos fuertes, ya que en solucin existe ms ci_ do dbil que base conjugada.

MATERIAL POR EQUIPO DE CUATRO PERSONAS 2 vasos de precipitados de 400 mi 1 vaso de precipitados de 100 mi 1 Probeta graduada de 100 mi 1 Pipeta graduada de 10 mi 1 Pipeta graduada de 5 mi 1 Piceta con agua destilada 1 Agitador Magntico 1 Barra magntica Kleenex REACTIVOS 1.- NaOH 0.1M : Disolver con agitacin 0.4 gramos de Hidrxido de Sodio en 50 mi de agua destilada fra, y aforar a un voldmen de 100 mi. 2.- HC1 0.1 M : Transferir 0.83 mi de HC1 concentrado, a 50 mi de agua destilada, mezclar y aforar a 100 mi con agua.

- 2 0 -

2.- HCl 0.1M : Transferir 0.83 mi de acido clorhdrico concentrado a 50 mi de agua, mezclar y luego aforar hasta 100 mi con agua destilada. 3.-SOLUCION A: ACETATO DE SODIO 0.1M: Disolver 0.860 gramos de acetato de sodio en agua y aforar a 100 mi. 4.-SOLUCION B: ACIDO ACETICO 0.1 M : Tonar 5.8 mi de acido actico concentrado, y aforar a 1 litro con agua destilada. 5.-Regulador de Acetatos 0.1 M pH=3: Mezclar 980 mi de Solucin B con 20 mi de la Solucin A. 6.-Regulador de Acetatos 0.1M pH=4: Mezclar 850 mi de la Solucin B con 150 mi de la solucin A. 7.-Regulador de Acetatos 0.1M pH=4.76:Mezclar 500 mi de la Solucin B CON 500 mi de la Solucin A. _

8.-Regulador de Acetatos 0.1M pH=5: Mezclar 630 mi de la Solucin A con 370 mi de la Solucin B. 9.-Regulador de Acetatos 0.1M pB=6 :Mezclar 940 mi de la Solucin A con 60 mi de la Solucin B. PARTE EXPERIMENTAL I.-ADICION DE HCl 0.1 M 1.-CADA EQUIPO TRABAJARA CON UNA SOLUCION REGULADORA. Primeramente calibre el potencimetro siguiendo las instrucciones dadas previavente. 2.-En un vaso de precipitados de 400 mi, coloque 100 mi del Regulador, y determine el pH inicial. Antelo. # 3.-Adicione cuidadosamente la barra magntica, y coloque el vaso sobre una base magntica. Encienda la agitacin. 4.-Introduzca cuidadosamente los electrodos del potencidrnetro. 5.-Empiece a adicionar alcuotas de HCl 0.1M determinando el pH de la solucin despues de cada adicin. D por terminado el experimento cuando el pH de la solucin haya descendido en una unidad. Anote el voldmen de HCl 0.1M gastado exactamente en disminuir el pH en una unidad . II.-ADICION DE NaOH 0.1 M 1.-Repita los pasos 1, 2 , 3 y 4 anteriores 2.-Ahora adicione alcuotas de NaOH 0.1M determinando el pH del regulador tras cada adicin, "hasta que el pH del mismo se haya incrementado en una unidad. REGISTRE EL VOLUMEN EXACTO DE NaOH 0.1 M GASTADOS . III.-Recabe los resultados obtenidos por sus ccsipaeros y reprtelos en la tabla siguiente.

IV.- Con los datos de la Tabla, construya una Grfica, colocando en las abscisas el pH de los reguladores utilizados y en las ordenadas el volumen de HC1 0.1 M gastados, y el volumen de NaOH 0.1 M gastados. V.- Una vez hecho la grafica anterior, elija el regulador mas eficiente. RESULTADOS Anote los datos obtenidos por usted y los de sus ccarpaeros :

pH de la solucin reguladora

mi de NaOH 0.1 M gastados

mi de HZ1 0.1 M gastados

*
f

En la hoja de papel milimtrico grafique los datos anteriores Cual fu el regulador iras eficiente?

DISCUSION DE SUS RESULTADOS

-25-

BIBLIOGRAFIA

1.- Bohinski, R. C. 1978. Bioqumica, la Edicin en espaol. Fondo Educativo Interamerica no. 2.- Jimenez Vargas, J. y J.M. Macarulla. 1975. Fisi coquimica Fisiolgica. Editorial In== teramericana. 4a. Edicin, pp:175-198 B.~ Lehninger, A. L. 1972. Bioqumica. 5a.Reedicin. Ediciones Onega,S.A. pp: 46-53. 4.- Plummer, D.T. 1981. Introduccin a la Bioqumica Prctica. Traducido de la 2a. Edicin en ingls. Editorial McGraw-Hill Latino americana, S.A. Bogot, Colarbia. 5.- Skoog, D.A. y D.M. West. 1978. Introduccin a la Qumica Analtica. Editorial Revert,S.A pp: 282-286.

PREBAS CUALITATIVAS PARA IDENTIFICACION CE CARBOHIDRATOS INTRODUCCION Los carbohidratos constituyen un grupo de compuestos que desempean papeles estructurales y funcionales, as como tairbien son la principal fuente de carbono y energa para los organismos hetertrofos. Qumicamente, son con siderados caro aldehidos cetonas polihidroxiladas productos derivados de ellos por reacciones de oxidacin, reduccin, esterificacin, sustitucin polimerizacin. Existen diferentes tipos de reacciones qumicas que nos permiten de terminar cualitativamente la presencia de carbohidratos (monosacaridos, oligo sacridos polisacridos). Estas reacciones se basan, por ejoriplo, en la reduccin del cobre y la oxidacin simultnea del azcar con el Reactivo de Fehling; y as ccmo sta existen variadas formas de identificar la naturaleza qumica de un carbohidrato.
T.

OBJETIVO Observar el comportamiento de una serie de carbohidratos al someter los a varias pruebas cualitativas. Y basados en estas observaciones identificar el o los carbohidratos presentes en una solucin desconocida.
BOLitSSgO.1 hxoJt&a

IS

FUNDAMENTO t PRUEBA DE MQLISCH: Esta prueba se basa en la accin hidrolizante y deshidratan te del cido sulfrico concentrado sobre los carbohidratos. En esta prueba el acido fuerte cataliza la hidrlisis de cualquier enlace glucosdico presenteen la muestra y la deshidratacin de los monosacridos resultantes para for mar furfural (pentosas) hidroximetilfurfural (hexosas). Estos furfurales se condensan con el alfa-naftol del Reactivo de Molisch, y originan un produc to de color violeta. Esta prueba es para identificar azcares en general. PRUEBA DE LUGOL: Se basa en la formacin de un ccsrplejo entre el in y la molcula de amilosa del almidn; la cual tiene una conformacin helicoidal. Al introducirse el 13" dentro de la hlice, nos forma un producto de condensa cin color azul negra dependiendo de la concentracin del azcar. Otros polisacridos cono la amilopectina producen un color prpura rojizo, y el gluc geno un color pardo rojizo. PRUEBA DE BARFOED: Nos permite distinguir monosacaridos de disac^ridos. los monosacridos reducen rpidamente en un tienpo de 2 minutos al Cu 2 del reac tivo de Barfoed a Cu+ el cual precipita como CU20 color rojo en solucin cido dbil. En cambio, los disacridos reducen el Cu+2 en un tiempo mayor, generalmente de 7 a 12 minutos.

sifinlo:

PRUEBA DE SKT.TiTWANOF; Es una reaccin coloreada que nos permite identificar las cetosas. En solucin de HC1 concentrado, las cetosas son deshidratadas mas rpidamente que las aldosas produciendo derivados del furfural. Estos corn puestos forman complejos con el resorcinol presente en el reactivo de Selliwa nof, produciendo un color rojo cereza. En las condiciones en las que se efecta el ensayo, todas las ceto sas que puedan estar unidas por enlaces glucosdioos, quedarn en libertad y darn una reaccin positiva como ocurre con el residir de fructosa derivado de la sacarosa. PRUEBA DE BIAL: Es una reaccin coloreada especfica para pentosas v ciertos cidos urnioos que se descomponen al calentarse con cidos fuertes formandopentosas. Bajo condiciones cuidadosamente controladas de temperatura, ti arpo y concentracin de HC1, las pentosas son rpidamente convertidas a furfural, mientras que el hidroximeti lfurfural se genera a partir de las hexosas presen tes. En presencia del in frrico (Fe+3) y orcinol (5- metil resorcinol) , el furfural se condensa rpidamente para producir un ocnplejo de color verde al calentar. P R j i F T R A DEL ACIDO MCICO : Esta prueba permite diferenciar la galactosa de las dems aldohexosas por formacin de un cido sacrico que es el cido mcico. El cido sacrico cristalino es insoluble en cido ntrico diluido'. El cido ntrico concentrado oxida los dos carbones terminales delas aldohexosas formando los correspondientes cidos sacricos. En general,los cidos sacricos son solubles en cido ntrico diluido, pero el cido m cico es insoluble en estas condiciones, por lo que precipita caro cristales transparentes si la solucin se enfra rpidamente.

PRUETRA DE LAS OSAZONA5: Este ensayo se basa en que los azcares reductores se condensan con reactivos caro- la feni lhidracina en fro formando una fenilhidrazona. A 100 C y en presencia de un exceso de f eni lhidracina, se lleva a cabo otro tipo de reaccin en donde participan los tomos de carbono 2 de las aldosas y los ataros del carbono 1 en las cetosas, dando lugar a la formacin de una osa zona como se ilustra enseguida: CHO i CHOH i R AIDCSA Oi = N- NH- C 6 H 5 + H2N - NH - C 6 H 5 FENI LHIDRACINA -p CHOH
+ H

R FENHHIDRAZCNA

CH =N- NH-6H5
I

CH =N- NHC = N- NH-CJH,- + CgH^-NH^ + NH V'5 ' "6"5 ""2 ' ""3 R OSAZONA

CHCH R FENIIHIDRAZONA

+ H2N-NH-C6H5

Algunos cristales de osazona presentan una forma lo sufici entemente diferenciada para identificar al carbohidrato del cual provienen. Asimismo, el tiempo de formacin de la osazona es diferente para cada azcar, y su punto de fusin es especfico. los carbohidratos cono la fructosa y la glucosa, forman la misma osazona debido a su arreglo espacial semejante. La maosa no forma osa zonas en solucin acuosa, pero en su lugar forma una fenilhidrazona insoluble. MATERIAL POR EQUIPO CE CUATRO PERSONAS 21 tubos de ensaye de 18 x 150 1 vaso de precipitados de 500 mi 2 gradillas, 1 mechero, 1 tripi y 1 tela de asbesto 1 agitador de vidrio 1 vidrio de reloj 2 pipetas de 10 mi 5 portaobjetos 1 pinzas para tubos de ensaye 1 microscopio i REACTIVOS 1.-REACTIVO DE MOLISCH: Disolver 10 gramos de alfa-naftol en 100 mi de etanol al95% 2.-REACTIVO DE LGOL: Moler finamente en un mortero 50 gramos de yodo y 100 gramos de yoduro de potasio. Disolver con agua destilada y aforar a un litro. 3.-REACTIVO DE BARFCED: Disolver 13.3 gramos de acetato cprico con 200 mi de agua y filtrar si es necesario. Aadir 1.9 mi de acido actico concentrado. 4.-REACTIVO DE BIAL: Disolver 1.5 gramos de orcinol en 500 mi de HC1 concentrado, y aadir de 20 a 30 gotas de una solucin acuosa de FeCl^ al 10%. 5.-REACTIVO DE SEELIWANQFF: Disolver 0.05 gramos de resorcinol en 100 mi de Acido Clorhdrico 6M. 6.- FeCl^ al 10%: Disolver 10 gramos de FeCl3 en 100 mi de agua y adicionar unas gotas de acido clorhdrico concentrado para asegurar la solubilizacin del FeCl 7.-Acido Sulfrico Concentrado 8.-Acido Ntrico concentrado 9.-Acido Clorhdrico concentrado 10- 0.4 granes de clorhidrato de fenilhidracina 11- 0.6 gramos de acetato de sodio 12.-Soluciones al 1% de los carbohidratos a prueba.

PARTE EXPERIMENTAL Con todas las soluciones de carbohidratos proporcionadas realizar los siguien tes ensayos: 1.- PRUEBA DE MOLLSCH: Coloque una serie de tubos de ensaye de 18 x 150 en una gradilla, y a cada uno de ellos adales 2 mi de las soluciones a prueba. Enseguida adicione 5 gotas del Reactivo de Mslisch y agite. Luego incline cada tubo y deposite cuidadosamente por las paredes del tubo 2 mi de cido sulfrico concentrado. No agite. OBSERVE SI HAY FORMACION DE UN ANILLO COLOREADO EN LA INTERFASE,Y DE SER ASI ANOTE EL COLOR DEL MISMO. 2.- PRUEBA PEI, LUGOL: Transfiera 2 mi de cada una de las soluciones a prueba a una serie de tubos de ensaye de 18 x 150. Acidifique las muestras con 5 gotas de cido clorhdrico 1M. Despus de mezclar adicione 1 gota de lugol y agite. OBSERVE Y ANOTE EL COIOR DESARROLLADO. 3.- PRUEBA DE BARFOED: Coloque 5 mi del Reactivo de Barfoed en una serie de tu bos de ensaye, luego aada 1 mi de los carbohidratos a prueba a cada uno ellos. Caliente los tubos en un bao de agua hirviendo durante 2 minutos. Saque sus tubos, djelos reposar 3 minutos . OBSERVE SI HAY FORMACION DE UN PRECIPITADO Y SU COLOR. ANOTE. 4.- PRUEBA DE BIAL: Prepare una serie de tubos de ensaye conteniendo 5 mi delReactivo de Bial. Adicione 2 mi de la solucin de carbohidrato, mezcle y caliente suavemente las soluciones en un mechero hasta que las primeras burbujas alcancen la superficie. ANOTE EL COLOR QUE TOMA IA SOIDCION EN CADA CASO.

ti i : ||

5.- PRUEBA DE SFT.T.TVANQFF: En una serie de tubos de ensaye coloque 2 mi del Reactivo de Selliwanoff y adicione a cada uno 0,5 mi de las diferentes solu ciones de azcar. fezcle bien. Introduzca los tubos en un bao de agua hirviendo durante 1 minuto. REPORTE SUS OBSERVACIONES 6.- PREPARACION DE OSAZONAS: CADA EQUIPO TRABAJARA SOLAMENTE CCN UNA SOLUCION DE AZUCAR, PERO DEBERA DIBUJAR IOS CRISTALES DE OSAZONAS OBTENIDOS POR SUS COMPAEROS. Acidifique 5 mi de la solucin de carbohidrato con 10 gotas de cido actico glacial, y adicione 3 gotas de fenilhidracina ( 0.4 gramos de clorhidrato de fenilhidracina) , y una pequea porcin de acetato de sodio slido. Disuelva con agitacin y caliente en bao de agua hirviente durante 5 minutos. Enfrie los tubos y observe los cristales formados al microscopio.

7.- PRUEBA DEL ACIDO MUCICO; ESTA PRUEBA SE EFECTUARA SOIAMENTE CCM SOLUCICMSS DE (3VIACT0SA AL 3% Y LACTOSA AL 3%. 1o l m l d e l a s s o l u c i o n e s mencionadas en dos tubos de ensaye de 18 x 150, agregeles 2 ml de cido ntrico concentrado, mezcle, y caliente los tubos en bao de agua hirviente durante 60 a 90 minutos, con agitacin ocasional para eliminar el gas amarillo generado. Finalmente, introdzcalos tubos en bao de hielo induciendo la cristalizacin raspando las Dar ~ des internas de. los tubos con una varilla de vidrio. CBSERVE AL MICROSCOPIO IOS CRISTALES FORMADOS, Y DIBUJELOS.

RESULTADOS 1.- PRUEBA DE MOLISCH: En la siguiente tabla registre sus resultados

*

SOLUCION

REACCION (+) (-)

OBSERVACIONES

2.- PRUEBA DEL UJGOL: Anote sus observaciones no

3.-PRUEBA DE BIAL: Registre sus resultados enseguida:

6.- PREPARACION DE QSAZQNAS: Haga los dibujos respectivos de la osazona pre parada por usted, asi ccmo las de sus compaeros

7.- PRUEBA DEL ACIDO MUCICO: Dibuje los cristales de los cidos sacaridos obtenidos a partir de galactosa y lactosa:

DISCUSION: DISCUTA POR SEPARADO CADA UNA DE LAS PRUEBAS REALIZADAS TCM&MX) SN~~ CCNSIDERACICN ID OCURRIDO CCN LAS SOIDCIONES A PRUEBA Y CCN EL AZU CAR PRCBIEMA.

CCNCLUS IONES

CUAL FUE EL CARBOHIDRATO PRESENTE EN SU SOLUCION PRCBIEMA?

BIBLIOGRAFIA 1.- Baum, S.J. 1981. Introduccin a la Qumica Orgnica y Biol gica. Carpaa Editorial Continental, S^A. Mxico. la. Publicacin, pp: 313 - 317. 2.- Cantarow, A y B.Schepartz. 1969. Bioqumica. Editorial Inter americana, S.A. 4a. Edicin, pp 1 -30. 3.- Clark, J.M., 1964. Experimental Biochemistry. W.H. Ereeman and Corpany. la. Edition. pp 1 -22. 4.- Domnguez, X.A. 1968. Experimentos de Qumica Orgnica. Editorial Limusa Wiley. la. Edicin, pp 88. 5.- Harper, H.A. 1980. Manual de Qumica Fisiolgica, Editorial El Manual Ifoderro, S.A. 7a. Edicin, pp: 112-118. 6.- Harrow, B. y A. Mazur. 1973. Bioqumica Bsica. Editorial Interamericana. 10 Edicin, pp:227-246. 7.- Plummer, D.T. 1981. Introduccin a la Bioqumica Prctica. Traducido de la 2a. Edicin en ingls. Editorial McGraw-Hill Latinoamericana,S.A. Bogot pp: 164-170, 8.- Thorpe, W.V. et al. 1967. Bioqumica para estudiantes de Medicina. Carpaia Editorial Continental,S.A. 8a Edi cin. pp 66-87. 9.- Wingrove, A.S. y R. L. Caret. 1984. Qumica Orgnica. Editorial Hara, Harper & Rcw latinoamericana. Traduc cin de la la. Edicin en Ingls, pp: 1444- 1474.

CROMATOGRAFIA EN PAPEL DE CARBOHIDRATOS

INTRQIXJCCICN Entre los mtodos cualitativos y cuantitativos para determinacin de carbohidratos, se encuentra la cromatografa. Esta tcnica es de considerable importancia ya que su efectividad radica en hacer separaciones de sustancias mucho muy sane jantes entre s estructuralmente, como son los ismeros y los estereoismeros; as ccsno separar sustancias diferentes. la cromatografa se define coro un mtodo de anlisis adecuado para la separacin de los componentes de una muestra por percolacin de un lquido sobre un material poroso (papel) finamente dividido (slica gel) , producindose as un intercambio entre las fases. De esta forma, los constituyentes de la mezcla se separarn debido a la diferencia en sus velocidades de migracin. Se conocen distintos tipos de cromatografa: a)DE ADSORCION: Equilibrio entre un slido adsorbente y una solucin b)DE PARTICION: Particin entre dos solventes entre un gas y un solvente c) de INTERCAMBIO IONICO: Utilizando resinas intercairfoiadoras de cationes de aniones, y un eluente. Para identificar las sustancias en el papel, se ha introducido una relacin conocida caro "Rf" Relacin de Frentes, que es una relacin entre la distancia recorrida por una sustancia y la distancia migrada por el sol vente. El Rf es un valor caracterstico de cada compuesto, y depende tanto del solvente utilizado cono de las condiciones empleadas para la cromatografa. OBJETIVO Pretendemos en este experimento aprender el procedimiento para trabajar la tcnica de cromatografa en papel, y al mismo tiempo identificar l los azcares presentes en una ipuestra que les ser proporcionada. Se emplear la cromatografa descendente y ascendente para tal propsito.

FUNDAMENTO La cromatografa consiste en efectuar una particin de la muestra (en este caso carbohidratos), en dos fases,; la fase estacionaria que es el papel y la fase i t r f v i l que es eluente donde se desarrolla el crorvatograma. El agua del solvente forma corplejos con las fibras de celulosa del papel ; y a estos cotplejos formados se pueden unir los azcares meaiante -interacciones no c u e n t e s cono son los puentes de hidrgeno, fuerzas de Van der Waals intercambio de iones. A este processe le considera Adsorcin, -

por este motivo en la cromatografa en papel intervienen dos ferrrosnos, la adsorcin y la particin. la fase mvil migra por capilaridad sobre la fase estacionaria, se parando los componentes de la muestra. Una vez que sto ha terminado, se utl liza un revelador apropiado, que reacciona especficamente con los azcares ~ ponindolos de manifiesto en forma coloreada, obtenindose de esta manera un croara tograma..

MATERIAL POR EQUIPO DE 4 PERSONAS 6 tubos de ensaye de 13 x 100 1 gradilla 6 tubos capilares etiquetados Cuba para cromatografa Atomizador Papel Whatman No. 1 Lpiz, regla e Hilo Cinta Scotch

REACTIVOS 1.-SOLUCIONES al 1% DE DIFERENTES AZUCARES: Pesar 1 gramo del azcar, y disolverlo en 100 mi de agua destilada. 2.-ELUENTES RECOMENDADOS: Mezcle las partes indicadas de los componentes: a)Butanol: Acetico; Agua (4: 1: 5 ) b)Iscpropanol: Actico: Agua (3: 1: 1) c)Butanol: Piridina: Agua d)Cloroformo: Actico: Agua (30: 35: 5) 3.-REVELADORES: a)Disolver 0.1 mi de anilina ( 093 gramos) , y 1.7 gramos de cido ftlico en 100 mi de butano!. Calentar a 100C por 10 minutos y dejar enfriar. b)Mezclar 80 mi de solucin I, y 20 mi de Solucin II SOLUCION I: NaI04 al 2% : Disolver 2 granos de peryodato de sodio en 100 mi de agua SOLUCION lis KMn04 al 1% en Na2CO al 2%: Disolver 1 gramo de permanganato de potasio en 100 mi de carbonato de sodio al 2% el cual previamente se pre par disolviendo 2 gramos de Na, CO., en 100 mi de agua.

PARTE EXPERIMENTAL

PARA IA CROMATOGRAFIA ASCENDENTE: 1.-Corte el papel Whatman no. 1 en un cuadro de 25 an x 25 cm 2.-A 2.5 cm del margen de uno de los lados, trazar con el lpiz una delgada lnea tranversal, y marcar 6 puntos separados entre s por una distancia de 3.5 cm. 3.-A 4 cm de la parte superior de la hoja, trace otra lnea horizontal, la cual nos indicar la distancia hasta donde deber migrar el solvente. PARA LA CROMATOGRAFIA DESCENDENTE: 1.Corte la hoja de papel Whatman No. 1 en un rectngulo de 25 an x 50 an 2.- Con un lpiz trazar 3 lineas horizontales separadas por una distancia de 2.5 an , y en la tercera lnea colocar 6 puntos equidistantes.

UNA VEZ HECHO DO ANTERIOR, LOS CROMATOGRAMAS DEBERAN APARECER CQMD SE MUESTRA EN IA SIGUIENTE FIGURA; Y LUEGO CONTINUE CON DOS SIGUIENTES PASOS PARA AMBOS CASOS. RRRRRRRN

CROMATOGRAFIA ASCENDENTE

CROMATOGRAFIA DESCENDENTE

I.-Sobre cada uno de los puntos coloque 5 gotas de las soluciones de carbohidratos utilizando un capilar para cada azcar. Antes de aplicar la gota si guiente, espere que la anterior se haya secado. El tamao de la gota debe ser pequeo por lo que se debe evitar que la gota tome un dimetro muy gran de. En cada ocasin que aplique su muestra, limpie la punta del capilar. II.-En una cuba para cromatografa ascendente, colocar 100 mi del eluente uti lizado, y tpela hermticamente, dejndola en estas condiciones durante 15 minutos para saturar la atmosfera interna. Para la cromatografa descendente,deposite eluente en la tapa de una caja de petri colocada en el fondo de la cuba., tape hermticamente y deje saturar como se indic anteriormente

III.-Cuando termine de colocar los esta reares y la muestra problana, introduz ca el papel para la cromatografa ascendente dentro de la cuba respectiva, doblando la parte superior y sosteniendo el doblez con un hilo sujetado con cinta scotch a la cuba. Tenga cuidado de que el eluente no lie gue a la linea trazada con el lpiz en el memento de introducir el papel.

La hoja para cromatografa descendente dblela siguiendo las indicaciones del instructor, colquela en el receptculo especial, adaptelas varillas de vidrio, y adicione cuidadosamente el eluente. IV.- Deje migrar el eluente durante varias horas, luego saque el'papel, sque lo a tanperatura ambiente. V.- Una vez que el papel est seco rocelo con el revelador, dejelo secar, ycoloquelo en una estufa a 80C durante 15 minutos. VI.-Cuando se utiliza el revelador de anilina, los azcares aparecen con manchas caf oscuras, que debern ser delineados por los mrgenes con un l piz , colocando un punto en el centro de cada mancha. Cuando se emplea el revelador de Peryodato-Permanganato, los carbohidratos aparecen oemomanchas amarillas sobre un fondo rosado. VII.-Mida la distancia desde el origen hasta el frente del solvente, y las distancias entre el origen y el centro de cada mancha. Determine el Rf con la frmula que se d enseguida, y regstrelos en la tabla que aparece en la seccin de resultados.

Rf

Distancia desde el punto de partida al centro de la mancha Distancia desde el punto de partida hasta el frente del eluente

VIII. -Adjunte el crcmatograma , o en su defecto fotocopielo y adjunte la copia con su reporte. RESULTADOS 1,-UTILICE LA SIGUIENTE TABLA PARA ANOTAR SUS DATOS: centmetros

Distancia recorrida por: ELUENTE

2.-Con los datos anteriores, y utilizando la frmula citada, clcule los Rf de los estndares y de la muestra.

3.-En la siguiente tabla anote los Rf calculados AZUCAR Rf

4 .-Comparando los Rf de los carbohidratos patrn con los Rf presentados por las manchas desarrolladas por la solucin problema, indique cules azcares estaban en su muestra?

BIBLIOGRAFIA

1.-Bohinski, R.C. 1978. Bioqumica. Fondo Educativo Interamericano. la. Edicin en espaol, pp:12-15 2.-Clarck, J.M. 1964. Bioqumica Experimental. Editorial Acribia. la. Edicin, pp: 237-247. 3.-Conn, E.E. y P.K. Stunpf. 1978. Bioqumica Fundamental. Editorial Limusa. 3a. Edicin, pp:587-590. 4.-Harper, A.H. 1980. Manual de Qumica Fisiolgica. Editorial El Manual Moderno, S.A. 7a Edicin, pp: 34-35. 5.-Rendira, G. 1974. Tcnicas de Bioqumica Aplicada. Edito rial Interamericana, la. Edicin, pp:77-121 6.-Toporek, M. 1984. Bioqumica. Editorial Interamericana, 3a Edicin, pp:225-227. 7.-Plunmer, D.T. 1981. Introduccin a la Bioqumica Prctica. Editorial McGraw-Hill Latinoamericana^.A. Bogot, Colcrrbia. Traducido de la 2a. Edi cin en ingls, pp:73-77.

POIARIMETRIA Y J^frARPOTACICN DE CARBOHIDRATOS

INTRCDUCCION

La mayora de los carbohidratos con excepcin de la diMdroxiacetona, presentan isonera ptica. Los ismeros pticos enantimeros poseen la mis ma frmula molecular, la misma estructura, pero difieren en su configuracin es decir, en la disposicin espacial de los grupos sustituyentes en cada to mo de carbono asimtrico. Este tipo de estereoiscmera se debe a la presencia de tanos de carbono asimtricos en la molcula de azcar; considerndose cano centro asimtrico aquel tomo de carbono cuyas cuatro valencias estn ocupadas por radicales qumicos diferentes. Asi, un enanti&rvero adopta un determinado arre glo espacial, mientras que su ismero ptico tendr una estructura similar a la de su imagen especular. El par enantianrfico catpartir las mismas propiedades fsicas y qumicas, pero diferirn en la capacidad de rotar el plano de la luz polarizada, ya que uno de ellos girar el plano de luz en el sentido de las manecillas del reloj, mientras que el otro lo har en contra de las mencillas del reloj. El primero se considera dextrgiro dextrorota torio y el ltimo levogiro levorrotarorio. La rotacin del plano de luz polarizada es especifica del azcar, yesto se puede demostrar y medir con el polarmetro . La polarimetra nos per mi te de esta manera la identificacin de un carbohidrato as cono el clculo de la concentracin de un azcar en solucin conociendo su rotacin especfi ca. Cuando se desea identificar un carbohidrato, es conveniente determinar la rotacin especfica al memento de disolver la sustancia y despus de cierto tiempo ya que los glcidos presentan un cambio gradual en la rotacin de la luz, fenmeno conocido cano mutarrotacin.

OBJETIVO Determinar el poder rotatorio de una solucin de carbohidrato, y ccm probar que este valor se modifica despus de un cierto tiempo de reposo.

FUNDAMENTO la rotacin especfica se define cano la rotacin de la luz monocromtica causada por una solucin pticamente activa que contiene un gramo de soluto por mililitro, en un tubo de polarmetro de 1 decmetro de longitud, a una temperatura dada, comunmente 20C.

E1 grado de giro de la luz polarizada, es proporcional a tres factores inportantes que son a) el nmero de molculas asimtricas, es decir, a la concentracin del azcar pticamente activo en la disolucin; b)a la longitud del tubo del polarimetro, que representa el trayecto recorrido por la luz; y tambin por c) la longitud de onda de la luz polarizada, generalmente 589 nm. El poder rotatorio especfico, y el ngulo de giro de la luz polarizada se encuentran relacionados mediante la siguiente ecuacin;

U]
x

observada

donde: felT D = 1 = c =

ngulo de giro determinado experimentalmente temperatura, generalmente 20C longitud de onda de la luz de sodio (589 nm) longitud del tubo del polarimetro (en decmetros) concentracin en gramos/ral

La mutarrotacin presentada por los carbohidratosf es la interconver sin de alfa anmeros y beta ammeros, mediada por la forma no cclica del azcar, el cual se refleja en el cairbio de rotacin especfica que sufre una solucin de azcar al pasar el tiempo. Este fenmeno ocurre debido a la formacin de hemiacetales intramoleculares cclicos, que generan un nuevo cen tro asimtrico (el carbono del grupo carbonilo) el cual puede ahora adoptar un arreglo espacial diferente en el medio acuoso donde se encuentra el azcar. El fenmeno de mutarrotacin es iranifestado solamente por azcarescerno las aldopentosas, aldohexosas, cetohexosas, dado que son las nicas molculas nue pueden adoptar conformaciones cclicas estables. En la figura, se ilustra la intetreonversin de los anmeros de la glucosa, cuando se alean za el equilibrio entre las tres formas del carbohidrato, entonces la solu cin adepta una rotacin especifica definitiva.

H -C = o H -C- OH i HO -C- H i , H - C- OH i H - - OH CH2OH ALFA-D-GLUCOSA CH2OH D-G&XDSA CH2OH BETA-D-GLLCOSA

C

H - c- ce i HO - C- H H - c- ce

MATERIAL POR EQUIPO DE CUATRO PERSONAS 1 matraz de aforacin de 25 mi 1 pipeta de 5 mi 1 probeta graduada 1 piceta con agua destilada 1 espcf-tula acanalada Balanza granataria Papel encerado para pesar 1 frasco Gerber limpio etiquetado Kleenex PARTE EXPERIMENTAL 1.- Encienda el polarmetro durante 10 minutos, siguiendo las instrucciones del profesor. 2.- Calibre a cero su aparato antes de efectuar su experimento, para ello, la ve la celda con agua destilada, y luego llene el tubo con agua destilada7 cuidando de que no se queden burbujas de aire atrapadas. Lleve el tubo al polarmetro y ajuste a cero girando el analizador hasta observar por el ocular que las dos mitades del crculo observado, tengan la misma lumino sidad. 3.- Una vez hecho el ajuste, vacie la celda y squela. Mientras esto ocurre,efecte RAPIDAMENTE las siguientes operaciones. 4.- Pese 2.5 gramos del azcar y transfiralo cuidadosamente a un matraz de -f aforacin de 25 mi procurando que no se le tire. 5.- Adicione 15 mi de agua destilada, y disuelva rpidamente. Enseguida afore hasta la marca y mezcle vigorosamente. 6.- Con esta solucin ee carbohidrato llene el tubo del polarmetro, procuran do que el lquido forme un menisco sobre la superficie del tubo, con el fin de que al cerrar la celda se evite la formacin de burbujas. 7.- Hacer la lectura lo ms rpido posible y antela en su manual. 8.- Al terminar guarde la solucin de azcar en un frasco liitpio y etiquetado debidamente. A las 24 horas determine nuevamente la rotacin especfica, tal y como lo hizo durante este experimento. 9.- Los tubos del polarmetro deben ser lavados con agua destilada despus de cada operacin, y el aparato debe de apagarse.

RESULTADQS I.- Haga un dibujo del polarmetro utilizado en este experimento sealando por su nombre cada una de las partes que lo constituyen.

II.-Registre los grados de rotacin inicial y final determinados experimentalmente para su muestra, as cano los datos obtenidos por sus caipaeros. Angulo de giro INICIAL Angulo de giro FINAL

AZUCAR

III.-Utilizando la frmula dada anteriormente, calcule la Rotacin Especfica Inicial y final de su muestra.

IV. -Despus de haber obtenido matemticamente la rotacin especfica del azcar problema, anote en la siguiente tabla dicho valor, acompaado de los valores respectivos para los azucares trabajados por los diferentes equipos. i Rotacin Especfica final

AZUCAR

Rotacin Especfica inicial

V.-Investiga en la literatura las rotaciones especficas de las formas alfa y beta y de la mezcla en equilibrio para cada uno de los azcares que se utilizaron en este experimento, y regstralos en la tabla siguiente . Variedad alfa Variedad beta Mezcla en equilibrio

AZUCAR .

SECCIQN EE PREGUNTAS

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

102111502

iI

BIBLIOGRAFIA

1.- Baum, S.J. 1981. Introduccin a la Qumica Orgnica y Biolgica. Compaa Editorial Continental, S.A. Mxico, la. Publicacin, pp:301-302. 2.- Bohinski, R.C. 1978. Bioqumica. Fondo Educativo Inter americano, la. Edicin en espaol.pp:237. 3.- Macarulla, J.M. y F.M.Goi. 1978. Bicmolculas. Editorial Revert. la. Edicin, pp: 32-53. 4.- Plummer, D.T. 1981. Introduccin a la Bioqumica Prctica. Traducido de la 2a. Edicin en ingls. Editorial. McGraw-Hill lationamericana,S.A. Bogot Colcrrfoia. pp:155,172.

4.- Ramsey B.J. 1980. Biologa Qumica, una introduccin a la bioqumica, la. edicin en espaol. Ccsnpaa Editorial Continental, S.A. pp:72-74. 5.- Rendina, G. 1974. Tcnicas de Bioqumica Aplicada. Edi to-rial Interamericana, la. Edicin.pp:122-128. 6.- Roherts, J.D.,R. Stewart, M.C. Casero. 1974. Qumica Orgnica, De metano a Macrcinolculas. Fondo Educativo Interamericano, S.A. la. Edicin, pp: 379- 380. 7.- Wingrove, A.S. y R.L.Caret. 1984. Qumica Orgnica. Editorial Hara, Harper & Row latinoamericana. Traducido de la la. Edicin en ingls.pp:1444,1452

DETERMINACION DE AZUCARESTOTALESPOR EL METODO DE LA ANTRONA

INTRODUCCION Uno de los mtodos ms comunmente usados para cuantificar azcares totales es el de la Antrona (Dlmler y col. 1952) . Este procedimiento nos permite determinar cuantitativamente hexosas, aldopentosas, cidos urnicos ya sea en forma libre o formando parte de polisacridos. Para que la medicin sea digna de confianza, deben controlarse cuidadosamente las concentra ciones de antrona y de cido en el reactivo as ccmD el tiempo y la tempera tura de reaccin. Es aconsejable que la muestra se encuentre libre de - protenas ricas en triptofano para evitar interferencias en la reaccin co lorida. OBJETIVO Pretendernos en este experimento estimar cuantitativamente la presencia de azcares en diferentes muestras problemas. FUNDAMENTO En presencia del cido sulfrico del Reactivo de Antrona, los carbo hidratos experimentan deshidratacin convirtindose en furfural hidroxime" tilfurfural. Estos productos pueden condensarse con aminas aromticas, f^ riles, antrona, etc; produciendo compuestos coloreados. La formacin del furfural sus derivados acomplejados con estas sustancias puede utilizarse cano mtodo cualitativo cuantitativo para estimar azcares, ya que la intensidad de color desarrollado durante la condensacin va a estar en funcin de la concentracin de carbohidrato presente en la muestra. Hemos de mencionar, que los polisacridos por accin del cido son primeramente hidrolizados a ironosacaridos los cuales se deshidratan forrando furfural hidroximetilfurfural; stos ulteriormente se condensan con la antrona generando complejos coloreados. La cuantificacin de azcares se hace en base al color desarrollado por la muestra, utilizando espectrofotmetros fotocolormetros para de terminar la intensidad o la energa de la luz que ha pasado a travs de la celda tubo de fotocolormetro conteniendo la solucin coloreada. Para esta determinacin se debe fijar^un valor de longitud de onda que es donde el canplejo colorido muestra su mxima absorcin, y adems disponer de un blan co para calibrar el aparato, esta solucin solamente contiene agua destila11" da y reactivo de antrona sometido al protocolo indicado.

La cantidad de luz que absorbe la muestra se dencmona ABSORBANCIA, y la luz que pas a travs de la solucin se llama TRANSMTEANCIA. Existe una frmala que nos relaciona a ambas:

A = - log T

T= antilog A

Para cuantificar la cantidad de azcar presente en una muestra, primeramente se . prepara una curva de calibracin con los valores de absorban cia mostrados por distintas soluciones de concentracin conocida. Estos valo res se ajustan a una recta usando Regresin Lineal, y con la ecuacin de la recta se determina la concentracin de azcar segn haya sido el valor de absorbancia que mostr. MATERIAL POR EQUIPO DE CUATRO PERSONAS Espectrofotmetro Fotocolormetro equipado con filtro rojo Celdas para espectrofotmetro fotocolormetro 15 tubos de ensaye de 18 x 150 1 mechero, tripie, tela de asbesto 1 vaso de precipitados de 600 mi 1 vaso de precipitados de 1 litro 2 pipetas de 10 mi 2 pipetas de 1 mi 15 canicas 1 gradilla pinzas para tubo de ensaye Hielo Kleenex REACTIVOS 1.- ANTRONA AL 0.2% EN ACIDO SULFURICO CONCENTRADO: En 50 mi de cido sulf rico concentrado y fro disolver poco a poco y con agitacin 0.2 gramos de antrona; y luego aforar a 100 mi con el cido. La solucin se debe guardar en un frasco oscuro y bajo refrigeracin. 2.- SOLUCION PATRON DE GLUCOSA 100 mg/litro: Disolver 0.100 gramos de gluoo sa en 50 mi de agua destilada y luego aforar a 1 litro con agua. Guardar en refrigeracin. 3.-SOLUCION PROBLEMA:Preparar soluciones apropiadas usando agua destilada como diluyente.

PARTE EXPERIMENTAL I.-CURVA DE CALIBRACION ; l.-En una gradilla coloque 8 tubos de ensaye de 18 x 150. A los tubos numerados del i al 6 adicione los volmenes de glucosa y agua indicados en la ta bla siguiente y mezcle. En los tubos 7 y 8 transfiera su muestra apropia damente diluida. LLEVE TODOS LOS TOBOS A UN BAO DE HIELO DURANTE 10 MINlP
1 V^O
o

Tubo No. 1 2 3 4 5 6 7 8

Concentracin ug/ml 0 10 20 30 40 50
_ _ _

mi de Glucosa 100 mg/ml

mi. de agua dest- T f l r t a 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0 1.0

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 2 mi de muestra 1 mi de muestra

2.-Una vez que todos los tubos estn bien fros, adicineles 4 mi de Antrana a cada uno; para agregarla incline el tubo y por las paredes internas del tubo deje fluir lentamente la antrana de manera que el reactivo se estratifique debiendo aparecer una capa inferior amarilla y una superior blan ca lechosa. DESCARTE AQUELLOS TOBOS DONDE NO SE SEPARARON LAS CAPAS O QUE SE HAYAN TORNADO VERDES. 3.-Despues de adicionar la antrona, todos los tubos debern permanecer en el bao de hielo durante 5 minutos. 4.-Enseguida, agite vigorosamente cada tubo en un vortex, de manera que se mezclen perfectamente las dos capas y la solucin adquiera un color amari lio homogneo. DESPUES DE AGITAR EL TOBO REGRESELO AL BAO DE HTFTD. Elimine los tubos, que se tornen verdes. 5.-Cuando haya agitado todos los tubos, transfiralos a un bao de agua queya se encuentre hirviendo, y djelos ah durante 10 minutos. Para evitar la evaporacin, tape la boca de los tubos de ensaye con una canica. 6.-Despus de ese tiempo, saque los tubos del bao de agua, y llvelos al ba o de hielo para que se enfren rpidamente. ~

7.- Cuando ya estn fros los tubos, pase al espectrofotmetro 6 fotocolormetro para leer la .absorbancia de cada uno de ellos. Utilice los tubos especiales de lectura que le sern proporcionados,fliando una lonJ gitud de onda de 640 nm. 8.- Hay que a justar primeramente a cero de absorbancia su aparato, para ello emplee el contenido del tubo No. 1 que es su BLANCO. RESULTADOS I.-UTILICE LA TABLA SIOJIEME PARA REGISTRAR IAS LECTURAS DE SUS TUBOS Tubo Concentracin I ABSORBANCIA ug/ml 1 2 3 4 5 6 7 8 0 10 20 30 40 50
-

UNIDADES KLETT 0

II.-Anote los siguientes datos: Dilucin de la muestra: Modelo del Aparato:

~ ~

III.-Considerando como X a la concentracin de los estndares y Y la absorbancia U.K. respectivas, trabaje estadsticairente esos datos CCMD se pide en la tabla siauiente: Concentracin (ug/i t l L ) t Absorbancia X U.K. (Y) 0 10 20 30 40 50 Y =
N = 6

X2 0

XY 0

Y2

1X2 =

*XY =

*y2 =

III.-Con las ecuaciones dadas enseguida, someta sus resultados experimentales a regresin lineal, para obtener la ecuacin de la linea recta (Y= mx +b) a la cual se ajustan sus datos. Calcule tambin la correlacin existente entre ambas variables. intersecto = b _XX 2 Y - IX Z. XY NlX 2 (ZX ) 2 pendiente = m _N ? XY - IX 2. Y NIX2 - (XX ) 2 ECUACION DE LA RECTA: correlaciona r
\

NZXY - Z X Z Y
fazx2 (2X)2][NZY2-(IY)2]

Y = mx + b m = pendiente b = intersecto

IV.-ESCRIBA LA ECUACION DE LA LINEA RECIA A LA CUAL SE AJUSTARON SUS DATCS

V-_

^ t ^ v ^ raSa0R Y CUANDO x = 50 u g / f r i l

EL VALOR TEORICO DE (Y) CUANDO X=0 ug/bl

Anota aqu tu resultado: Cuando X = 0 ug/faL Cuando X =50 ug/ml

R
'
Y

VII.- En la hoja de papel milimtrico construye una grfica anotando en las abscisas la concentracin de las soluciones patrn, y en las ordenadas los valores de absorbancia unidades klett. Coloca primeramente los puntos correspondientes a tus datos experimentales, y luego traza una linea recta considerando los datos del inciso V., exclusivamente. A es ta lnea se le llama: QJEVA DE CALIBRACION ~ ~ VIII.-Con la ecuacin de la linea recta obtenida, calcula la concentracin de azcar presente en tu muestra. Enseguida te damos ya la ecuacin despejando X solamente sustituye tus datos: X = Y -b m b= inter secto; m=pendiente Y=es la absorbancia U.K, mostrada por la solucin problema.

IX.-Da la concentracin de azcar en ug/ml presente en tu muestra, considerando la dilucin que hiciste:

SECCIN DE PREGUNTAS;

O G R

5gulap.ca, i , ' Ai , ooi 126 . . c r o t i D ard

ft.

'

' '

M:

i XW WIT ICO. . j ,

v i -

442" 23H0iaUJDWCD
& L

. 1 J .
re XKURIIIL

'seriori^

A.BQ

t s & a n v r . . i L < 3 & pfp $ s a ."

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:

~L~

MR.

B I B L I O G R A F I A

1.-Bhagavan, N.M. 1978. Bioqumica. Editorial Interamericana la. Edicin, pp: 126 2.-Bruening, G and R. Criddle, et al. 1970. Biochesnical Expe rlments. Jonh WiUey & Sons, Inc. la. Etition. pp: 1-29. 3.-Conn, E.E. y P.K. Sturrpf. 1980. Bioqumica Fundamental. Editorial Limosa, Mxico. 3aBLCin.pp:56-57. 4.-Dimler, R.J. and W.C.ShasferT.O.S.Wise and C.E.Rist. 1952. Anal. Chem. 124: 1411. 5.-Harper, A.H. 1980. Manual de Qumica Fisiolgica.Editorial El Manual Moderno, S.A. 7a. Edicin.pp:115-122. , 6.-Lynch, M.J. et al. 1972. Mtodos de Laboratorio. Editorial Interamericana. 2a. Edicin, pp: 442-443.

il

7.-Plunmer, D.T. 1981. Introduccin a la Bioqumica Prctica. Traducido de a 2a edicin en ingls. Editorial McGraw-Hill Lationamericana,S.A.Bogot Colombia 8.-Rendina, G. 1974. Tcnicas de Bioqumica Aplicada. Nueva Editorial Interamericana,S.A. la.Edicin. ,pp: 134-135. 9.-Thorpe, W.V. et al. 1967. Bioqumica para estudiantes de Mancina. Ccstpaa Editorial Continental,S.A. 8a. Edicin . pp:67-87.

63-

EXTRACCION DE LIPIDOS INTRODUCCION los lipidos son sustancias no polares, prcticamente insolubles en agua, pero solubles en disolventes grasos no polares cato el cloroforma, ben ceno, etanol, metanol, etc. Este grupo de biotolculas han recibido poco inters por parte de los investigadores, quizs en los problemas en su maneio atribuibles a la in solubilidad en agua; pero desempean una variedad de funciones de oran inpor tancia. los lipidos simples como los triglicseidos, funcionan coto sus tan cas de reserva; y las ceras realizan actividades de proteccin. Ios lipidos carpuestos ccmo las lecitinas, cefalias, tc; se coibinan con protenas para constituir la estructura de todas las membranas biolgicas. Lipidos deri vados ccmo el colesterol es de gran inportancia clnica para el hartare, en cambio otros se desempean cono hermanas, sales biliares, vitaminas, tc. - S J f l S W I S f c t f r K'taa.ciblolbSL S&ei.J&ttLS.DfcnssexW j q t f JU&a. BO.trA -O &L
: T :

Otro papel de Importancia realizado por los lipidos, es el de propor cionar aislamiento fsico y trmico a los diferentes organos del cuerpo. ~ La yema de huevo, el tejido cerebral y ciertas semillas son fuentesricas en fosfolpidos y otros materiales lipideos. OBJETIVO ' m| Utilizar corno fuente de lpidos a la yema de huevo, y preceder a suextraccin y separacin considerando sus propiedades fisicoqumicas. FUNDAMENTO los lpidos generalmente se encuentran enlazados a protenas y polisacridos de los tejidos, formando complejos con diferentes grados de estabi lidad, por lo que para poder rorper estos carplejos se requiere el erapleo de condiciones de extraccin capaces de desnaturalizar separar las protenas carbohidratos asociados con ellos. El etanol,por ejenplo, desnaturaliza protenas y separa los complejos de lipoprotenas. Paca realizar la extraccin total de los lpidos, es coin el empleo de metanol al 95%, etanol al 95% de mezclas metanol: cloroforma (.3:1) etanol: ter (2:1). Es conveniente adaptar las condiciones de extraccin tanto al tipe de tejido empleado, as cano a la cantidad y naturaleza del l pido deseado. La separacin de los lpidos basada en sus diferencias de solubili dad,son desafortunadamente casi siempre, parcialmente satisfactoria, debido"" a que la solubilidad de los constituyentes de las mezclas de lpidos son bas tante diferentes a las de los lpidos puros.

,-M, fi i

Kio.'dbS .CXI ?30CU..

x - v r

so&frferf soi^iiupoxa l s nxooi/fxridTl .18< x b , ' . , .adipal n9 ndracEfe f . T i . ab c f c x o f c f i x ^o?x>R.A.2BfiBoxx^ii6noj[JaI LXH-WM IBX . B X C S f T Di O s .BbeoxXqA wsml ' . ndxc-xb-SJ&X . A.t . ' i f O X ' T . e^asibrrt; neaxj-noO asDXf

/!orm rxa

f:

Para la separacin de las lecitinas de la solucin eterea, se utili zar acetona, ya que las lecitinas, cefalias y esfingolpidos son solubles" en ter, etanol cloroformo, pero insolubles en acetona, y por este motivoprecipitan de la solucin. Otros lpidos simples se separarn por saponificacin con hidrxido de potasio, formando JABONES. En la porcin eterea resultante se va a sepa rar el COIESTEROL, ya que ste no es material saponificable. Para su aisla miento se eliminar el eter por evaporacin. La identificacin del colesterol se hace generalmente realizando las Pruebas de Salkowski v la de Lieberman-Burchard, cuyo fundamentos son los siguientes: PRUEBA DE SALKCWSKI: Cuando a las soluciones clorofrmicas de colesterol seles adiciona un volumen igual de acido sulfrico concentrado, y se mezclan suavemente, se desarrolla un color rolo caracterstico en la capa clarofdrm'i ca. Aunque el mecanismo exacto de la reaccin y la naturaleza del productoC ?? readD n s e ^ P r e c i s a d o / se prepone que el color resulta de la formacin de dobles enlaces adicionales o bien a partir de la aonde-nsacin de 2 molculas de colesterol para formar biesteroides. PRUEBA DE IJEBERMAN-BUECHARD: El anhdrido actico puede condensarse con los grupos hidrxilo de la posicin 3 del colesterol esteroides relacionados,produciendo el ster correspondiente. Si el esterol contiene una insaturacin en la posicin 5, ocurrir una epmerizacin a la forma 3 y una deshidrata cin, con la formacin de un color caracterstico. La reaccin sirve cerao una prueba especfica para los 3-hidroxiesteroides coi una insaturacin en la po sicin 5. S1 MATERIAL POR EQUIPO DE 4 PERSCMAS 4 vasos de precipitados de 400 mi 1 enfeudo de filtracin rpida i agitador de vidrio 1 probeta graduada 1 parrilla elctrica con agitacin y una barra magntica 4 tubos de ensaye de 18 x 150 , 1 gradilla 2 pipetas de 10 mi Papel filtro Bolsas de papel, celofn 2 huevos REACTIVOS; 1.-Acido sulfrico concentrado 2.-Etanol 3.-Acetona 4.-rEter etlico 5.-Anhdrido actico 6.-Cloroformo 7.-Disolucin Alcohlica de Hidrxido de Potasio al 5.6%: Disuelva 56 gramos de hidrxido de potasio en etanol fro, agite continuamente enpleando unagitador magntico, y luego afore a un litro con etanol. procurando obtener una solucin cristalina.

mo

3O8BTP

aobxql hTSfvloalb aeldul XliuSUI .OS

. C . . . . " . ' 1 . . . . . . bidioai . x B f a a I l i / t . L Q ( J K d dlss oteet&B xe t a f i f i s t l c b i q aol os aBsxx \V J ' . " . ' . . '. : ' "' . " ' " i 3C 9 f l i ofii eb bf

,n&tooeoiq sb j I asoxpioxd a i i Is B ' X S C J SOiXil" i '

1 0 & H
'.& SQ

: Xpxi aol c TLJO& f f S S * ^aiaails^ asi as; O: 1 f i B X , . sfficwnod s&s&xlsem . D 3 C l f . 6 COX

r j i r osJ-ee

p . s d ' n s i r

o qy

. f atfOKJ 6 . i ' a f e a s e n ; . ' ' vas T B C B ^ l X' J O ' X C '

bxcll 5 (X) G U f t c . * a t t O c

c t e b .J

PARTE EXPERIMENTAL;
1

'~l^io^y"^eTO 1 ^^

granataria m

^ ^

precipitado de 400 mi ccnpletamente

2.-Rcrnpa cuidadosamente dos huevos, y transfiera las yanas al vaso de precipita dos. Pese nuevamente y determine el peso de las yemas de huevo. 3.-Adicione 70 mi de etanol y 35 mi de ter y agite continuamente durante 10 minutos para extraer todos los lpidos. 4.-Filtre la suspensin a travs de una gasa adaptada a un enfeudo de filtracin rpida, recogiendo el filtrado en un vaso de precipitados de 400 mi bien seco, LEJOS DE TODA FIAMA.. 5.-El filtrado, se filtra nuevamente en un enfeudo de filtracin rpida cubierto con papel filtro humedecido previamente con etanol. 6.-Este filtrado se evapora hasta casi sequedad utilizando una base magntica con agitacin. Obtendr una suspensin pastosa amarillenta. 7.-Enfriar el vaso al chorro de agua, procurando que no caigan gotas de agua scbre el residuo. 8.-Una vez enfriado el vaso, resuspenda el residuo en 10 j n l de ter. 9.-Adicione 30 mi de acetona, agitando continuamente la solucin. El precipitado que se forma son las LECITINAS.
*

10.-Filtre recogiendo el filtrado en un vaso liirpio y seco. El precipitado cfetenido se oesa v se cruarda en una bolsa de celofn. Entregelo con su informe. 11.-Evapore el filtrado hasta obtener una pasta viscosa de color caf amarillento, utilice para ello la parrilla elctrica con agitacin constante. 12.-Enfrie el vaso de precipitados al chorro de agua. 13.-Aada al residuo 30 mi de disolucin alcohlica de hidrxido de potasio, y agite para resuspenderlo harogendafrvante. 14.-Caliente la solucin durante 5 minutos, con agitacin constante. 15.-Enfrie, y aada 50 mi de ter agitando continuamente. Todo el material saponificado, sedimenta. Es un JABON. 16.-Filtre a travs de un embudo de filtracin rpida acondicionado con papel filtro humedecido con alcohol. Pese el jabn. El filtrado contiene el material no saponificable, principalmente colesterol. 17.-Evapore a sequedad el filtrado. Con una varilla de vidrio raspe el residuo formado de manera que obtenga un polvo fino, recuprelo y p^elo. Teme una pequea cantidad para realizar las siguientes pruebas cualitativas, y el restante gurdelo en una bolsa de celofn y adjintelo a su reporte.

PRUEBA DE SALKOWSKI PARA COLESTEROL: En un tubo de 18 x 150 disuelva una pequea porcin del colesterol obtenido en 3 mi de cloroformo. En otro tubo colooue 3 mi de cloroformo. ^ A ambos^tuhos adales 3 mi de cido sulfrico concentrado, agtelos cuidadosamente, dejelos reposar 15 minutos. Observar la separacin de dos capas, la cloroformica adquiere una coloracin roja cereza e n caso de existir coleste rol. la capa sulfrica tema una coloracin amarilla con fluorescencia verde La presencia de humedad dificulta la reaccin. PRUEBA DE LIEBERMAN BURCHARD: En un tubo de ensaye de 18 x 150 disuelva una pequea porcin de colesterol en 1 mi de cloroformo. En otro tubo transfiera 1 mi de cloroformo. Agregue a los dos tubos 2 mi de anhdrido actico y 4 gotas de acido sulfrico concentrado. Mezclar bien y dejar reposar 15 minutos. Si existe colesterol aparecera una coloracin azul verdosa que pasa a verde.

RESULTADOS 1.- Determine el peso de las 2 yemas de huevo: Peso del vaso de precipitados + 2 yemas de huevo: Peso del vaso de precipitados : PESO DE LAS YEMAS DE HUEVO : En la siguiente tabla registre los pesos determinados para los materiales se citan:

MATERIAL YEMAS DE HUEVO LECITINAS JABON COLESTEROL,

Peso en gramos

3.-Calcule los porcentajes de lecitina, jabn y colesterol en % g/q

4.-REGISTRE LOS PORCENTAJES DE LOS COMPONENTES MENCECNADOB AOTERIORMENTE MATERIAL LECITINA JABON COLESTEROL 5.-Reporte los resultados de las prunas cualitativas para colesterol PRUEBA DE SALKOWSKI PRUEBA LIIBERMAN-KJRQIARD % granos/gramos

TESTIGO Reaccin:

COLESTEROL Reaccin:

TESTIGO Reaccin:

COLESTEROL Reaccin:

6.-En los siguientes cuadros engrape cada una de las muestras de lipidos que 4 aisl durante su experimento. -y . ^

LECITINA

J A B O N

COLESTEROL

DISCUSION

1 "M p a i . 4 '

JL

COfCLSICNES

SECCION DE PREGUNTAS:

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

BIBLIOGRAFIA

1.-Clarck,J.M. 1964. Experimental Biochanistry. W.H.Freeman and Carpany. la. Edition. pp:43-66. 2.-Harper, A.H. 1980. Manual de Qumica Fisiolgica. Editorial El Manual Moderno,S.A. 7a. Edicin pp:132. 3.-Mazur, A. y B. Harrow. 1973.Bioqumica Bsica. Editorial Interamericana.3a. Edicin. pp:322. 4.-Macarulla, J.M. y F.M. GDi. 1978. Bicmolculas. Lecciones de Bioqumica estructural. Editorial Re vert, la. Edicin. 5.-Parker,G.E. y T.R.Mertens. 1975. Bionolculas, Base de la Vida. Editorial Limusa. la.EDicin. 6.-Rendina, G. 1974. Tcnicas de Bioqumica Aplicada. Editorial Interamericana, la. Edicin .

INDICE DE IODO E INDICE DE SAPONIFICACION DE UNA GRASA INTRODUCCION Adoras de los mtodos fsicos (puntos de fusin, ndice de refraccin, etc) , el nalisis de grasas consiste en la determinacin de ciertas constantesqumicas, entre ellas las siguientes: ndice de saponificacin, ndice de iodo, los qumicos utilizan otras constantes para investigar los caracteres de los l pidos, por ejanplo, el ndice de Reichert-Meisel que mide los cidos grasos vo^ ltiles y el ndice de acetilo que estima los hidroxicidos. Hay otros ndices o nmeros que solo tienen Importancia para los especialistas en este carrpo. OBJETIVO Obtener la informacin en cuanto a los valoresde ndice de iodo indi ce de saponifiacin para distintos tipos de grasas incluidas canunmente en la dieta, y compararlas con valores establecidos en la literatura. FUNDAMENTO INDICE DE YODO: El Indice de yodo se considera al nmero de granos de yodo fijados porlOOgramos de grasa y nos indica el grado de insaturacin de la arasa. ^ Cuando en condiciones de oscuridad se mantienen lpidos insaturados en contacto con monobromuro de yodo (mtodo de Hanus) rronocloruro de yodo (Meto do de Wijs), ocurre la adicin de los halgenos a los dcbles enlaces fonpand se compuestos de adicin, coro se ilustra enseguida: ~ I Br 0 I I CH3- (CH2)n -CH = CH -(CH2)n-8- Q-CH2 CH.- (CH_) -CH -CH-(CH2)n-C-0-CH2
J Ti

O I I CH3- (CH2)n -CH = CH -(CH2)n-C-0- CH O I I CH3- (CH2)n -CH = CH -(CH2)n-C-0- CH2

I > CH3- (CH2)

Br CH- (CH2) ^-C-O-CH

Br CH3- (CH2 )n-CH- CH- (CH2 )n-C-0-CH2

COMPUESTO CE ADICION LIPIDO INSATURADA Si a la mezcla anterior se le aade KI, ste reacciona con el Bromuro de yodolibre que no se adicion a la grasa, liberndose coro producto yodo, de acuerdo a la siguiente reaccin: IBr -libre + KI -> KBr + I 2

El yodo liberado se titula con una solucin estandar de tiosulfato de sodio atpleando cono indicador almidn. La reaccin de titulacin es la que se muestra enseguida:
+

2 Na2S203 -

2 Nal + Na2S406

Se cardaran luego los resultados con los obtenidos de un blanco tra tado en la misma forma, pero del que se ha omitido la grasa. La diferencia" entre la lectura del blanco y de la muestra (A - B) corresponde al nfcnero de mililitros de tiosulfato 0.1M necesario para reaccionar con un volSmen equi valente de yodo. Con este dato podresos calcular el nnero de granos de yodo rifados a 100 gramos de grasa si seguimos efectanos correctamente los si guientes clculos: # meq S # meq I, # meq S0 = V ^ ' X Entonces: A -B ) ( N INDICE DE YCOO = Sustituyendo valores: INDICE DE YCOO ( A -B) (Q.l N) (127/1000) 0.5
T

Vi
P.M. J 2 ) iOQQ

= (A -B) ( N

_) 2 3

*) 2 3

( 100 )

GRAMOS DE MUESTRA

(1QQ)

( A -B) (Q.l) (Q.127) ( 100) "075 ( A -B) (1.27) O INDICE DE YODO = ( A - B ) (2.54)

Sobre el valor del ndice de yodo influyen varios factores, entre ellos el porcentaje de acido insaturado en la molcula de triglicrido, v rZJ**^ ^saturacin de cada cido graso. En general, un valor alto de ndice de yodo indica un alto grado de insaturacin en la molcula de lpiLas grasas- naturales cuyo contenido de cidos grasos saturados es alto poseen ndices^de yodo bajos, aproximadamente de entre 10 y 50, y aquellasque contienen cidos grasos poliinsaturados presentan altos ndiceTde yodo yoao generalmente entre 120 y 150.

INDICE DE SAJCTIF^ACIC^I: Cuando un t^gflicrido se snete a reflujo en presencia de hicFX&fc d potasio alcohl&c, se hidroliza generando glicerol y tres molculas de.cido graso en frmamete? sales de potasio (JABONES), Esta reaccin de hidrlisis conocida caro ^K&JIFICACICN, se muestra enseguida: 0 CH3-(CH2)n^- 0 -<p2
H

0 W CH^-(CH_) -O- 0 i 2n CH. - (CH0) -C* j n

+ KOH

O ' - + CH_-(CH0) -C- 0 K 3 2n

CH9 - CH - CH9 i^ i t^ OH OH OH

Al n&ntto de miligramos de KOH requeridos para saponificar los cidosgrasos resultantes de la hidrlisis ccwpleta de un gramo de grasa aceite (triglicrlto) se le denomina INDICE; t SAPONIFICACION. Este valor se determina titulando el 'KOH libre, no utiliaecb en la saponificacin, con una solu cin patrn de f*TX 0.9-1 empleando casfr indicador a la fenolftalena. La reac cin de titulacift es la siguiente: KOH libre + HC1 KC1 H20

los nvUaJLityos de HC1 gastados n esta titulacin se ocupara ocn el cb tenido tratado-en la mij^ft forma pero al que se la ha emitido la grasa, ta difespencia ctotenida entrlas lecturas obtenidas oara el blanco y para la muestra, proporciona el ndmearo de mililitros de KOH 0.5M gastados en la saponificacin de la grasa. Con este valor poderos calcular el INDICEDE SAPCfrHTICACION Si seguimos cuidadosamente el siguiente procedimiento: f.meq KDH = V gastados en la hidrlisis X r ^ = (A-B) (N , )
1301

#ttieqKOH = ( A -B h CR-J = gramos KOH gastados en la > Pmeq hidrlisis I , qranos de |3DH gastados = en la hids*lisis , ' > G W
nc

_ g KOH 6 1 xlOOO

g KDH 056"

(A

(0

' 056)

miligrarros de KOH gastados en la hidrlisis = de 2 gramos de grasa

(A

., v 4 _ v " B > (0 " 5N) <0-056' 1'000'

miligramos de KOH gastados por gramo = INDICE DE SAPONIFICACION _ de grasa

( A - B ) (28) 2

INDICE DE SAPONIFICACION =

( A - B ) ( 14 )

MATERIAL POR EQUIPO DE CUATRO PERSONAS 2 matraces Erlenmeyer de 250 mi 2 buretas de 50 mi 1 soporte y 2 pinzas para soporte 1 pinzas D a r a bureta 1 matraz bola de 250 mi (Equipo Corning) 1 refrigerante de reflujo (ECIUDO Corning) 2 mangueras 1 balanza granataria 1 vaso de precioitados de 250 mi 1 probeta graduada 3 pipetas de 10 mi 2 pipetas de 5 mi 1 agitador de vidrio 1 mechero papel aluminio lpiz mantequilla aceite de oliva aceite de almendras aceite de higado de bacalao aceite de ajonjol aceite de coco aceite de maiz leche de vaca

> X f l

REACTTVOS: 1.-YODURO DE POTASIO AL 15%: Disolver 15 granos de KI en 100 mi de agua destilada, guardarlo en frasco oscuro. 2. -CLOROFORMO 3.-REACTIVO DE HANUS: Disolver 13.2 gramos de yodo puro en un libro de cido actico glacial. Aada le aproximadamente 3 mi de broto cuidadosamente, para duplicar la cantidad de halaeno. Guarde el reactivo en frasco oscuro. 4.-TIOSULFATD SODICO 0.1N: Disolver 12.4 gratos de Na S O 5 H O en agua recientemente hervida y fra, afore a un litro. Estandarizar la solucin. ESTANDARIZACION DEL TIOSULFATO: Titule la solucin anterior con una solucin patrn de Yodo, utilizando almidn coro indicador. YCDO 0.1N: Disolver 12 gramos de KI en 10 mi de agua destilada, aadir 6.5 gramos de yodo, disolver el yodo y luego aforar a 500 mi. 5.-SOILJCION ALCOHOLICA DE KOi AL 5.6%: Disuelva 56 granos de KOH en etanol conagitacin constante. Afore a un litro con etanol, procurando obtener una solucin cristalina. 6.- ACIDO CLORHIDRICO 0.5N: transferir 41.66 mi de HCl concentrado en un matraz de aforacin de un litro coteniendo 200 mi de agua destilada, mezcle heno geneamente y luego afore hasta un litro con agua destilada. 7.-ALMIDON AL 1%: a 100 mi de agua caliente aada 2 granos de almidn soluble,agite hasta disolver conpletamente. Luego aada 100 mi de agua fra y mezcle bien. 8. -SOLUCION INDICADORA DE FENOLFTALEINA: Disolver un grano de fenolftalena en 100 mi de etanol. PARTE EXPERIMENTAL INDICE DE YDDQ * 1.-Pesar 0.5 gramos de grasa en un matraz Erlenmeyer de 250 mi envuelto en papel aluminio. 2.-Adicionar 10 mi de cloroformo y agitar para disolver la grasa. 3.-Agregar 10 mi del reactivo de Hanus, agitar vigorosamente y dejar reposar en la oscuridad durante 30 minutos, agitando ocasionalmente. 4.-Enseguida, agregar 10 mi de KE al 15%, agitando fuertrente. 5.-Luego adicione 100 mi de agua recientemente hervida y fra, lavando la pequea cantidad de yodo que hubiera quedado en las paredes del matraz. 6.-Titular el yodo libre, no utilizado en la halogenacin, con NfcuS00, 0.1N hasta que la solucin adquiera un color amarillo plido. Cuando esto oura, agregue 2 mi de almidn al 1% coro indicador, la solucin se tie de color azul.

7.- Proseguir la valoracin, AGITANDO VIGOROSAMENTE EL MATRAZ, hasta que desa paricin del color azul. " 8.- Registre el vomen de Na2S203 0.1N utilizado en la titulacin. . *CORRA UN BLANCO UTILIZANDO 10 mi BE CLOROFORMO TRATADO DE IA MISMA* FORMA QUE IA MUESTRA. ANOTE EL VOLUMEN DE Na~S00., 0.1M NECESARIOS PARA VAIORAR EL YODO EN EL BLANCO.

INDICE DE SAPONIFICACION *BEBEBA PREPARAR IF BLANCO REFLUJA*0 50 MI DE DISOLUCION ALCOHOLICA EE ROH EN LA FORMA C E S O T M A (XOTINUACICN Y TITULANDO EL ALCALI CON HC1 0.5N. Anote el VOLUMEN DE HDT GASTADO.

1.- En un matraz bola de 250 mi, coloque 2 granos de grasa, y agregue 50 mi de disolucin alcohlica de KOH. Disuelva bien la grasa. 2.- Adapte al matraz bola un refrigerante de reflujo, y refluje la iwszcla porun mnimo de 30 minutos. Una saponificacin ccrapleta ocurre cuando la mez
ca est bie clara. ~ -

3.- Al terminar la saponificacin, retire el mechero, y deje circular el agua hasta que se enfrie la mezcla. 4.- Cuando la solucin est fra, adicione 5 gotas de fenolftalena cano indicador, se desarrollar un color rosa. 5.- Titule el KQH libre con HC1 0.5N, hasta que el color rosa desaparezca. Anote el volmen de cido clorhdrico gastado en la titulacin.

RESULTADOS I.-En las tablas siguientes anote los resultados obtenidos durante las titulaciones efectuadas.

A) NUMERO DE MILILITROS DE N a ^ ^

0.1 N
=

GASTADOS EN LA TITULACION DEL BLANCO B) NUMERO DE MILILITROS DE Na2S23

0,lN

GASTADOS EN IA TITUIACION DE LA MUESTRA DIFERENCIA (A - B )

INDICE DE SAPONIFICACION A) NUMERO DE MILILITROS DE HC1 0.5 N GASTADOS EN LA TITUIACION DEL BLANCO B) NUMERO DE MILILITROS DE T I 0.5 M GASTADOS EN LA TITULACION DE LA MUESTRA DIFERENCIA ( A -B)

II.-Con las diferencias ( A- B ), determine el INDICE DE YODO e INDICE DE SAPONIFICACION, en el siguiente espacio:

III.-En la siguiente tabla reporte los valores de INDICE DE YODO e INDICE DE SAPONIFICACION para su muestra y para las de sus ccrrpaeros

MUESTRA

INDICE DE YODO

INDICE DE SAPONIFICACION!

IV. -INVESTIGE m LA LITERATURA IOS INDICES DE SAPONIFICACICXJ Y DE YCDO PARA las muestras trabajadas, y anotelos en la siguiente tabla:

MJESTRA

INDICE DE XOX>

, INDICE DE' S A P A ^ I P ^ C N ' .

BIBLIOGRAFIA

1.-Baum, S.J. 1981. Introduccin a la Qumica Orgnica y Biolgica. Compaa Editorial Continental, S.A. Mxico, la. Publicacin en espaol.pp: 326-328. ~ 2.-Cantarrow, A y B. Schepartz. 1969. Bioqumica. Editorial Interamericana, 4a. Edicin, pp:44-47. 3.-Clark, J.M. 19 . Bioqumica Experimental. Editorial Acribia. la. Edicin. pp: 76. 4.-Harper, H.A. 1980. Manual de Qumica Fisiolgica. Editorial El Manual M e m o , S.A. 7a.Edicin,pp: 134. 5.- Lynch, M.J. et al. 1972. Mtodos de Laboratorio. Editorial Interamericana. 2a. Edicin, pp:56,382-39*6. 7.-Plummer, D.T. 1981. Introduccin a la Bioqumica: -^actica Editorial McGraw-Hill Latinoamericana,S.A. Bogot, Colorfoia. Traducido de la 2a. Edicin en ingls. pp: 197-199. 6.-Macarulla, J.M. y F.M. Goi. 978. Bicmolculas. Editorial Revert. la. Edicin. pp:76. 7.-Ramsey,B.J. 1980. Bioloqa Qumica. Una introduccin a la Bioqumica. Editorial Continental, S.A. la. Edicin en espaol. pp: 172-173. 8.-Rendira, G. 1974, Tcnicas de Bioqumica Aplicada. Editorial Intermericana, la. Edicin, pro:142-143. 9.-Toporek, M. 1984. Bioqumica. Editorial Interamericana 3a. Edicin, pp:210.214.

SEPARACION DE LIPIDOS MEDIANTE CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA INTRODUCCION La cromatografa en capa fina (TLC), es un mtodo simple, rpido y no costoso; utilizado nara separar cualitativamente una muestra en sus componentes. La capa delgada se prepara dispersando una suspensin de material adsorbente sobre una placa de vidrio y dejando secar para formar una capa con un grosor aproximado de 250 mieras. Esta tcnica puede adaptarse a la separacin y caracterizacin de lpidos, utilizando microcantidades de'material; es posible tambin efectuar es timaciones cuantitativas de las distintas clases de lpidos. Por ello, este mtodo ha desplazado a otras tcnicas y es ampliamente utilizada tanto en la industria cano en los laboratorios clnicos para la separacin de lpidos delpidos sricos, corticosteroides de la orina, hormonas sricas, vitaminas li posolubles, etc.

OBJETIVO Intentaremos la extraccin de lpidos de muestras biolgicas con un alto contenido de lipidos y posteriormente los separaremos e identificaremos utilizando la tcnicas de cromatografa en capa fina. FUNDAMENTO Bsicamente a la cromatografa en capa fina se aplica el mismo fundamento de la cromatografa en papel, Agui la muestra se coloca sobre una cu bierta de slica gel adsorbida a una placa de vidrio; esta placa se introduce en un eluente contenido en una camara crcmatografica dejndolo migrar a travs del material adsorbente (fas estacionaria). El eluente (fase irvil) al ir desplazndose sobre la slica, arrastra la muestra. La adsorcin y la particin retardan el avance de la muestra; y la resolucin de los diferentes canponentes se debe a que las sustancias presentes tienen diferente velocidades en direccin del flujo. Generalmente se permite gue la fase mvil avance de 10 a 15 an, la deteccin de los canponentes separados se hace con vapores de yodo, rociando con cido sulfrico al 50%, rociando con reactivos especiales como el cido fosfcmolbdico entre otros. La identificacin se hace calculando el Rf de cada uno de los componentes de la mezcla y comparndolo con los Rf de soluciones lipdicas conociT e ? S t !V a l r S e btieale a l la distancia recorrida ra por la mancha entre la distancia total recorrida por el solvente.

MATERIAL POR EQUIPO DE CUATRO PERSONAS PROTOCOLO A: 1 1 1 1 1 1 i - .- o . - b '. : x ' LUu ;oaojs
g;b t t o s c

- . r i

v w

-yj

tubo de 18 x 150 gradilla matraz erlenmeyer de 50 mi pipeta de 5 mi parrilla elctrica con agitacin embudo de filtracin rpida vaso de precipitados de 250 mi probeta graduada tubos de ensaye de 18 x 150 gradilla pipetas de 10 mi embudo de filtracin rpida

B'IOX f i l 0 5 I > ' .

; X : L 3 C ? O I . ' a b oy f ' x : . ' . * i cu

' ' . . - ebeoq

" . V : r c . ' ^ sts3

PROTOCOLO B si 1 3 1 2 1 REACTIVOS

5 & E S X X T L J j f S 9 K S X S f J . v ; 2 S i ? ; . . 'X t O s f e f r StO G ODB86lCf8JD B f ODCX r l f BtSC 3 C W ) . v " X . , . Q 80J E1C

PROTOCOLO A: 1.- ELUENTE I: Eter de petrleo 2.- ELUENTE II: Hexano: Cloroformo (25:75) 3.- ELUENTE III: Cloroformo-Metanol (95:5) 4.-Eter de petrleo 5.- Mezcla cloroformo metano (50:50) 6.- Soluciones patrn de aceite de oliva, acido olico, lecitina, colesterol, etc: Disolver 100 mg de cada uno de ellos en lOQml de una mezcla cloroformo: metanol (50:50). 7.- Revelador: ^Acido fosfcroolbdico al 20% en etanol: Disolver 20gramos de cido fosfomolbdico en 100 mi de etanol y guardarlo en frasco oscuro hasta el memento de su uso. -jsot/ omsxm le saxla PROTOCOLO B: 1.- ELUENTE: Cloroformo- Solvente Polar (100:7) 2.- SOLVENTE POLAR: 90 mi de metanol se mezclan con 5 mi de agua destilada y 5 mi de hidrxido de amonio. si i "fi" i B ' i p x i r olov , a & nx : -r . > - . as - Enanco g-j-eols n x j h 3.- Soluciones patron al 1 mgA d : prepararlas coro el protocolo A. - I B (IXV&JT eas) nsule IE & i r i f i r : v-) i BIFFINI Is& es' 4.- REVELADOR: Acido fosfomolbdico al 20% en etanol bien vapores -leer I y :;iaebs &I , s i i ^ ; ras . xc : : > . s i i e r < eao&ruvsBqssb " 3 . de yodo. saina:CSJ.;5 201 ab i f. : . 0 t X 0 8 & " . '! .sx; . ; < . . E i 'xi~.vt> X . : " ' - rasbriBsri nroi" 5.- Cloroformo- metanol (50; 50) .i-ooxev a . X - > ' : x f 5 i-E c J i X f ; ." a . . ' . . . V . V q1 . . a e^n^noqm .-, j j . I [- noxoosrx: as a s i PREACTTVOS PARA AMBOS PROTOCOLOS: Slica Gel, y Agua destilada -> J ,no ? s Ci eb ooibvb X J r v S c ? - ODfifixooT ,obov ob 2 icqBV neo o r ; : > . ' t i . r : . . s .3 3 inori'BssnsO f so > ' & ;tdo sol a:ooe PREPARACION DE LAS PLACAS CRCMATOGRAFICAS 1.- Pese 30 gramos de Silica Gel H HF254 y suspndalos en 50 mi de agua destilada, esto es suficiente para preparar 5 placas de 250 mieras de espesor, oqpK soX s ' : 'w sfogo s . b' ' Xs o t o s , " . ; ' i .so . o a -r s ax i * } , i j-nsx ed S S * N BX EB S -ioorrco 8DIBI - cX ESNO,.ODOS E I . IH eoi X XoxsiB<YsDo BX 3 - sbxTioo^ si xxblvxb X sraatoo es IBV eup soma&xx&fit 2.- Agite el matraz bola que contiene la mezcla durante un minuto vigorosamente. 3.-Vierta la suspensin en el distribuidor para placas, y rpidamente pselo sobre los cristales limpios y desengrasados con acetona. s q r . o si & ^ f t e i i J B o x s B J

4.- Deje que las placas se seouen al aire, Dermaneciendo siempre sobre el nivelador. 5.- Activar las placas llevndolas a secar en una er-tuta a 110C durante unahora oara eliminar la mayor parte del acrua. 6.- Guarde el estante con las placas dentro de un desecador hasta el nonentode su uso PARTE EXPERIMENTAL Segn sea el material biolgico con el que se cuente, el intructor in dicar el protocolo adecuado. ~ ~ PROTOCOLO A 1. -PREPARACION DE LA MUESTRA a)Si su muestra es una grasa aceite, disuelva 1 gramo de ella en 4 mi deter de petrleo. b)Si trabaja con suero, entonces adicin 1 mi de suero a 25 mi de una mezcla de clorformo-metano1 (50:50) en un matraz erlenmeyer de 50 mi. Caliente brevemente para precipitar protenas, y filtre a travs de papel filtro No.l 2.-APLICACION DE LA MUESTRA La muestra y las soluciones patrn se aplicaran en forma de gota pegueasobre la slica, utilizando la plantilla especial para ello, procurando gue las muestras queden bien separadas entre s. Coloque 3 gotas de cada solucin permitiendo que la gota se seque antes de anlicar la siguiente, 3.-DESARROLLO DEL CROMATOGRAMA a)Introduzca la pica en la cmara, craratogrfica colocndola previamente en el dispositivo especial para ello, y eluya hasta una altura de 16 cm con el eluent e I. Saque la placa, y deje secar al aire. b)Introduzca la placa en otra cmara c r u e contenga el eluente II v eluya hasta una altura de 12 cm, deje secarla al aire, y posteriormente eluya con el eluen te III hasta una altura de 5 cm. y seque al aire. 4. -DETECCION DE IAS MUESTRAS Roci la placa con cido fosfcmolbdico al 20% en etanol, y calintela una vez seca, en el horno a una temperatura de 105C - 110C durante 5 minu tos. 5. -IDEOTIFICACION Delimite los contornos de las manchas con un alfiler un lpiz de punta fina, coloque un punto en el centro de cada mancha, y determine el Rf.

PROTOCOLO B 1.- PREPARACION DE IA MUESTRA En vaso de precipitados de 250 mi, coloque la yena de un -huevo, y aada 100 mi de una mezcla cloformo^etanol (50:50). Agite vigorosamente y luego filtre usando un embudo de filtracin rpida, bien deje reposar hasta que se separe bien el sobrenadante. Del sobrenadante o" del filtrado, prepare diluciones 10~\ lo"2 f mezcla cloformo-metanol (50:50); la solucin ms diluida permite la determinacin de fosfatidiletanolamina (cefalias) y lecitina. La solucin ms concentrada demuestra la presencia de fosfatidil-serina y fosfa2 tidilinositol.
1

2.- APLICACION DE 1A MUESTRA las muestras y las soluciones patrn utilizadas se aplicarn en forma de gota sobre la slica, utilizando para ello la plantilla de ols tico Deje secar la gota antes de colocar la siguiente; ya que deber apli car 5 gotas de cada solucin. 3.- DESARROLLO DEL CROMATOGRAMA Introduzca la placa de cromatografa en la cuba, acorodandola pre viamente en el dispositivo especial para ello; la cuba deber contener el~ eluyente. Permita que el eluentemigre una distancia de 10 cm a 15 cm. En seguida saque las placas de la cmara cromatogrfica y djelas secar al -

4.-DETECCION DE IAS MUESTRAS Roci las placas con acido fosfcmolbdico al 20% en etanol, y calintelas,yna vez secas, a 110C durante 5 minutose 5. - IDEISKTFICACION Delimite los contornos de cada una. de las manchas utilizando pa ra ello un alfiler un lpiz con punta fina, y luego coloque un punto en el centro de la mancha. Mida la distancia desde el centro de la mancha has ta el origen, y la distancia desde el origen hasta el frente del solvlenti. Determine el Rf de las manchas, e identifique los componentes de su muestra comparando los Rf de estos con los Rf de soluciones conocidas.

RESULTADOS I.-Dibuje un esquena del cromatograma cbtenido, indicando los ncmbres de las soluciones utilizadas oomo patrn. Asi mismo el -tiorpo de desarrollo.

TI.-En la siguiente tabla anote la distancia recorrida por el eluente, la distancia recorrida por cada una de las soluciones patrn utilizadasy la distancia migrada por los ocnponentes presentes en su problema. DISTANCIA MIGRADA (centmetros)

SOLUCION

III.-Calcule los Rf's de todas las soluciones patrn y de los componentes presentes en su muestra problema.

los datos obtenidos en el ndnero anterior, y antelos en la tabla.

SOLUCION

Rf

V.-Cules fueron los lpidos presentes en la muestra?

DISCUSION

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFIA 1.- Conn, E.E. and P.K. Stumpf. 1972, Outlines of Blochonlstry. International Edition. 3a. Edition. pp:58. 2.- Devel, H.J. The Lipids; their biochemistry and chemistry. Intersciencie Pub. 3.- Harper, H.A. 1980. Manual de Qumica Fisiolgica. Editorial El Manual Moderno, S.A. 7a. Edicin. pp:136-137. 4.- Lynch, M.J. et al. 1979. Metodos de Laboratorio. Editorial Interamericana, 2a. Edicin pp:1333-13335. 5.- Stahl, E. 1966. Thin layer Chromatography. Academic. Press New. York. 6.- Gelman Chromatography System. 1974., GeOiran Instrument Corrpany. Technical Bulletin . 30. 7.- Instant Thin Layer Chromatography. 1971. Gelman Instrument Company, Technical Bulletin 17. 8.- Separacin de lpidos por cromatografa en capa, fina, 1974 Asesora Tcnica. Merck, MEXICO, S.A.

REACCICNES DE IDENTTFIGACICXSI DE AMINOACIDOS Y PROTEINAS INTRODUCCION Un gran nmero de reacciones son utilizadas para la deteccin de protenas. Debido a la conpejidad de las molculas proteicas y a la dificultad de obtenerlas en forma pura y aislada, estas pruebas son usadas sabiendo que identifican grupos qumicos especficos de la molcula de prote na, ms general todava, para las cadenas laterales de los aminocidos encontrados en todas las protenas. As, el reactivo de Milln da una reaccin positiva cuando reacciona con los grupos fen lieos de los aminocidos presentes en las protenas. las reacciones de aminocidos libres, son en general, las que podr an esperarse para los compuestos que contienen grupos aminos y grupos car boxilo, adems cualquier otro grupo que pueda estar presente, sufre sus pro pias reacciones caractersticas. ~
OBJETIVO

Estimar qumicamente la presencia de algunos aminocidos, y tratarde determinar si estos mismos estn presentes en las protenas utilizadas. FUNDAMENTO PRUEBA DE MILLON; Esta prueba nos permite detectar compuestos con radical hidroxibenceno cano el aminocido tirosina sus derivados; as cono protenas que lo contengan (albmina). El reactivo de Milln es una mezcla de ni tritos y nitratos mercricos los cuales ocasionan la mercuracin y nitraciSn nitrosacin del grupo fenlico de los aminocidos libres presentes en protenas, generando un precipitado blanco que por la accin del calor, tema un color rosado rojo ladrillo. PRUEBA XANTOPROTEICA: Mediante esta prueba cualitativa podaros identificar aminocidos que contienen anillos aromticos heterociclicos en su nolcula protenas que los contengan; aunque el anillo bencnico de la fenilalanina no tiene suficiente capacidad para tornar positiva la prueba. Cuando los aminocidos con la caracterstica estructuralya mencionada, se calientan en presencia de cido ntrico concentrado, produ cen compuestos nitrados de color amarillo, a los cuales el lcali caro el r NaOH NH4OH, convierten en sus sales respectivas de color naranja. PRUEBA DE BIURET: Este ensayo nos permite detectar compuestos que poseen dos mas enlaces peptdicos.- Cuando estas sustancias se tratan con solucionesde sulfato de cobre disuelto en solucin alcalina (Reactivo de Biuret), dan un color violeta caracterstico.

E1 color desarrollado es debido aparentemente al corplejo de coordinacin formado entre el teme de cobre del Reactivo de Biuret, y cuatro tanos de nitrogeno peptdicos presentes en las cadenas polipept dicas cono se ejemplifica enseguida: -

0 = C

la intensidad del color generado es una medida cuantitativa del numero de enlaces peptdicos presentes en la molcula. Esta prueba no es especifica exclusivamente para detectar enlaces peptdicos, ya que cualquier conpuesto que contenga dos grupos carbonilos unidos por un tono de nitrogeno o de carbono, da tambin un resultado positivo, Asi. el compuesto conocido ccmo biuret (H2NeO- NH-OQNH2) da una reaccin positiva RE^CION DE HOPMNS-COLE: Esta prueba es especfica para la identificacin de triptofno libre presente en protenas. El reactivo de Hopkins Col es una disolucin de cido glixilico en agua, aunoue el cido actico glacial expuesto a la luz contiene tambin cido glioxlico y se puede emplear en la prueba. _ Cuando una solucin de triptofano de protena se trata con el Reactivo anterior, y luego se permite la estratificacin de cido sul furico? en la zona de nter fase se genera un anillo ptrpura rojo violi ta resultante de la condensacin del grupo carbonilo del cido glioxlico y al anillo indol del triptofno: HC = O COOH Acido Glioxlico

Cfcr
Triptofano

NMj

2 S0 4

Ccuplejo de Color prpura rojo violeta

REACCION DE XA NIMDRim: Esta prueba permte identificar ccnpuestos que

Al aadir nlnhidrina a una solucion que contema aminocidos S T ^ f ^ r / f C C 6 n d S O X d a c i 6 n V reduccin con l ^ q r ^ S i S a ^ g W 5 S b c n o y amoniaco por destinacin oxi^ dativa. Esta reaccin, ocurre a pH entre 4 y 8, es mostrada enseguida:

Ninhidrna

azul a v l i r d S L ^ S f S E J n a l producido por los aminocidos vara de color Pitidos 6 proteinas dan una reaccin positiva dbil rtSS^ I o l e t a ' debido a que presentan menos grupos amino libres que los aminocidos Las primarias y el amonaco dan ^sitiva la pru^a, p e ^ S d S r e ^ S = ^ S * 1^s.acldos la prolina y la Mdroxiprolina tanfai reaccionan con la mnhidrma, pero el color desarrollado es Carillo y -

PgECPmCION PON SAUS DE METALES PESADOS (PRECIPITOTUS OmCHimBl , LasP a ste se encuentran en torm aninica es d cir cargados negativamente, por lo que al adicionar iones de metales pesados cargados Dositivamente se neutraliza la carqa de la protena y S T precipita de la solucin dbilmente alcalina. Un eceso de lcSiocTstona Sfff t a C 5 n f M d r 6 x i c t o s itlicos. Y cuando t S ^ n LceSnte^e S L s Pf" 0 1 1 1 3 3 ^ g a s positivas estables, por estos irotivos, el ensayo se debe eectuar cuidadosamente. ' Proteina' ' + Aq+ < 5 Hg"^ > Proteinato de Ag Hg

MATERIAL POR EQUIPO DE CUATRO PERSOGAS

20 tubos de ensaye de 18 x 150 6 pipetas de 5 mi 2 pipetas de 10 mi 1 mechero 2 gradillas 1 pinzas para tubos de ensaye masking-tape etiquetas REACTIVOS 1.- SOLUCIONES DE AMINOACIDOS AL 0.1 %: Disolver 0.1 gramo de amiroacido en 100 mi de agua destilada. Aadir unas gotas de HC1 concentrado en casode que no ocurra la disolucin total del aminocido. 2.- ACIDO NITRICO CONCENTRADO 3.-fflDROXIDODE SODIO 10M : En 80 mi de agua destilada fra disolver lentamente 40 gramos de hidrxido de sodio, manteniendo el vaso de precipitados en un bao de hielo. Cuando la solucin est fra, afore con agua destilada hasta un voldmen final de 100 mi. 4.- CLORURO MERCURICO 0.2M : Disolver 54.428 granos de HgCl2 en agua destila da y luego aforar hasta un litro con agua destilada. ^ 5.- ACIDO SULFURICO (XNCENTRADO 6.- ACETATO DE PLOMO 0.2M: Disolver 75.842 granos de PbOAc.3 H20 en agua des tilada, y luego aforar a un litro. < 7.- NINHIDRINA AL 0.1%: Disolver 0.100 gramos de ninhidrina en n-butanol, y luego completar a un litro con n-butanol. 8.- REACTIVO DE BIURET: Disolver 1.50 granos de CuS045 H 2 0 y 6 gramos de Tartrato de sodio y potasio ( NaKC^Og 4H2O) en 500 mi de agua destilada, enseguida, adicionar 300 mi de NaOH al 10%, y aforar a un litro con agua destilada. 9.- REACTIVO DE HOPKENS-COI: Colocar 10 granos de polvo de magnesio en un matraz Erlermeyer de 1 litro, y aadir agua destilada hasta que cubra completamente al magnesio. Enseguida, agregar lentamente 250 mi de una solucin saturada en fro de cido oxlico y agitar bien el conjunto, enfriando si es necesario. Luego filtre y acidifique el filtrado con ci do actico glacial y diluyendo a un litro con agua destilada. 10.-REACTIVO DE MILLON: Disolver 10 granos de mercurio en 20 mi de Acido Ntrico fro. Cuando la disolucin sea completa y haya cesado de despren derse humos pardos, adicione 60 mi de agua. Despus de varias horas, decante el sobrenadante y gurdelo en frasco oscuro. PREPARACION ALTERNATIVA: Prepare una solucin de sulfato mercrico al 15% en H2SO4 al 15% v/v.

PARTE EXPERIMENTAL 1.- PRUEBA PE MILES En una serie de tubos de ensaye, transfiera 2 mi decaoa una de las sofiones proporcionadas. Aad 5 g o S d 5 PeaSi^ Y Caliente ^ ^ d o s a m e n t e la mezcla duranSIS minutos en un bao de agua hirviendo. Observe y anote sus cbservSiones 2.- ^ C I O N XA^PROIEICA: E^site 1 mi de cada una de las soluciones a dG de d r X ^ e d S ^ ^ y cuidadosamenteTnS de cido ntrico concentrado, mezcle bien, y caliente ligeramente a la Uama del mechero Deje enfriar y observe'el color s S S ios^u bos pueden ser enfriados al chorro del agua. -

centra^fL^010116 b ^ e t i ^ ^ 61

M 0 t a Y 0011 lquido sea

^tacin NaOH 10 M (6 NH4OH con G n e n t e alcalino. Observe4el cam .

1 SOluci nes g " ^ * ^ d? cayadas, adicione 2 mi del Reactivo de Biuret y mezcle bien. Observe el color desarrollado y ante

4.- RACION DE HOPKINS-COLF): Adicione 2 mi del Reactivo de Hopkins-Cole a 2 mi ae las soluciones en estudio, mezcle bien. L U b y v i e r t a c e m e n t e por las paredes del tubo f^ l f r i C O encentrado, de modo que llegue al fondo yy Sse e estratifique, NO MEZCLE. Deje reposar. ^ 1
60 e

i* ^serve el color producido en la zona de contacto entre los doslquidos, y solo en caso necesario AGITE MUY S t W ^ E T ^ ^ f l conseguir que se produzca la reaccin generadora de color. 5.- PRECIPITACION CON SALES METALICAS;

A)

^aye'df I s V S o ^

* ^

- tubos

B) Alcalinice con NaOH diluido hasta un pH de 7 - 8.

C) adic ne 5 gotas de Acetato- de Plano 0.2M . Describa los resuitaaos obtenidos

D) En otra serie de tubos de ensaye de 18 x 150 coloque 3 mi de las soluciones proteicas, alcalinice ligeramente cono en el ensayo anterior dlUld0 adCOne 5 de - ^ cloru^meSS y anote sus observaciones. 6.- PWJEffi DE IA NIMHIDRINR: En ura serie de tubos de ensaye transfiera 3 mi ^OXUC1fS ensa^das' y 0.5 nd de NiiJdrim alTl%, ^ y diente a ebullicin directamente a la llama de me chero. Anote el color desarrollado por la solucin -

RESULTADQS: 1.-PRUEBA DE MILLON: Anote av. SOLUCION REACCION (+) 6 (-) OBSERVACIONES

neo

OV^OB'

3UD

2.-REACCION XANTOPROTEICA. :Anote sus resultados enseguida:

SOLUCION

,<< . (

REACCION (+) 6 n

OBSERVACIONES

/ I C S J .

3.- PRUEBA DE BIUgCT: Registre sus observaciones

4.- PRUEBA DE HOPKINS-CO^: Descri sus observaciones enseguida:

-98-

5.- PRECIPITACION CON SALES METALICAS a)Anote sus observaciones cuando utiliz el Acetato de Plano REACCION (+) 6 (-)

SOLUCION

OBSERVACIONES

b)Anote lo observado cuando adicion Cloruro Mercrico

SOLUTION

REACCION (+) 6 (-)

OBSERVACIONES r

fi'-PftTTFraA PiF. TA NJTNHIDRINA Describa sus observaciones

DISCUSION

11

CONCLUSIONES

SECCION DE PREGUNTAS:

vu.

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

B I B L I O G R A F I A

1.- Baum, S. J. 1981. Introduccin a la Qumica Orgnica y Biolgica. Editorial Continental,S.A la Edicin. Pag: 381- 386. 2.- Bhagavan, V.N. 1978. Bioqumica. Nupva Editorial Inter americana, S.A. la. Edicin. pp: 52-54. ~ 3.- Bohinski, R.c. 1982. Bioqumica. Fondo Educativo Inter americano, S.A. la. Edicin. pp:93-96 4.- Bronk, R.J. 1980. Biologa Qumica . Una introduccin a la Bioqumica. Editorial Continental, S. A. la. Edicin. Pg:102, 142-143. 5.- Harper, H .A. 1980. Manual de Qumica Fisiolgica. El Manual Moderno, S.A. 7a. Edicin Pag;26-32. 6.- Macarulla, M.J. y Goi, F.M. 1978. Bicroolculas, lecciones de Bioqumica Estructural. Editorial = Revert, S.A. la. Edicin. Pp:88-92, 107-108. 7.- Plurrmer, T.D. 1981. Introduccin .a la Biooumica Prctica Editorial McGrawrr-Hill Latinoamericana, S.A la. Edicin, pp 128-137. 8.- Toporek, M. 1984. Bioqumica. Editorial interamericana. 3a. Edicin. pp: 229-232.

PROPIEDADES DE LAS PROTEINAS (DESNATURALIZACION, DIALISIS Y EQUILIBRIO DE DONNAN) INTRODUCCION ,, . ^ caracterizacin de una proteina en cuanto a su estructura y funcin Y raf^ara'eST ^ P - i f i c ^ i n a partir de la f u i t f S rai Para ello es aplicable tcnicas que permiten la eliminacin de material SOn lrt os suaves S ^ r ^ l ^ ^ ^ que precisan de un t r a S " ^ o 1 so siendo tiles para el aislamiento de protenas globulares nativas pero no^ anpleadas para otros corrpuestos de carbono biologiLnente i ^ S S . ^ Sin embarrro nara trabajar con estas biorolculas - es necesario una atencxn estricta a los detalles, puesto ^ e son e x t r e r a d a m S t e ^ S S ^ n i S a ^ destila^ aC1 neS/
S

lventes

orCTnicos

'

tc

' X en alarnos casos hasta

OBJETIVO - ! T r a t a r a T I s d e demostrar experimentatoente el efecto de los factores am bientales coro el calor y el pH sobre la integridad de las protems, observaras la propiedad que tienen estas moloilas de no L * v e z a r m S S S S sanipermeables, as cono la capacidad de un in no difusible ( p r o t e i n ^ ^ a s^nar una distribucin desleal de iones a ambos lados de L S T s ^ i p S

FUNDAMENTO DESNMTOALIZACICM: Este fenmeno, es el cambio que experimentan las molculas S r a t o f ^ a diferente corriiSon^ccno s S ^ S s ^ S i . peratura, pH somcacin, exposicin a la radiacin ultravioleta, agitacin 1COS ' de compuestos p o l a S S i S i n .
^Sre ? ^OCaS1nada! * *
e3tOS factores

fisicoqumicos sn directamente

tercar dfa? * Y cuaternaria de las nroteras deb do alrarpimientode los enlaces no covalentes irantienai dichas estructurad la de la desnaturalizacin se manifiestan cato prdida de-

U t i Z s ^ T ^ * 1 3 hidrlisis efectuda pOT^ziraas^rote? uticas. los agentes que ocasionan la desnaturalizacin de lks nrotena* e nocen como AGENTES DESNATURALIZANTES. "-ion ae xas protenas se co sufren e!

fe S ,

c r i m S ^ 1 ^ ' S 1 U b l l d a d . d S n m d a 611 e l P ^ iselctr^, prdida oristabilidad, as cono aumento en la levorrotacin, asimetra de

Se c locan a teroeraturas superiores a los 35C S 6 / 8 f f naturalizacin y la alteracin- es total al llegar a ios 80 C. Entre estos lmites la solubilidad disminuye observndose la formacin

felf^tfisoS^'

****

13 Pr tera Se

DESNATORALIZACICN TOR SOLVENTES ORGANICOS: Sustancias orgnicas coto el alcohol, la acetona, ter con una baja constante dielctrica, al ser adicionadas a soluciones acuosas de protena, reducen la constante dielctrica de esas soluciones, abatiendo la afinidad de la protena por el solvente, por lo que estas bionoleculas se disuelven menos y precipitan de la solucin. PRECIPITACION POR ANIONES: los iones negativos se combinan con las protenascargadas positivamente (a pH cido con respecto al punto isoelctrico), preci pitando en fo-ma de sales de protena; algunas de estas sales son insolubleS". Entre estos agentes precipitantes figuran el acido- tricloractico, acido pcnco, acido tnico, acido fosfcmolbdico, tngstico, y aniones cano el metafosfato. EQUILIBRIO DE DQNNAN: Dormn en 1911, demostr oue cuando una solucin de protena cargada se separa de una solucin salina mediante una mentorana semipermeable, la macromolcula no atravieza la merrbrana, pero su contrain s, obtenindose una distribucin desigual de iones a ambos lados de la membranaen el equilibrio, lo cual genera una diferencia de potencial elctrico a travs de ella. Este tipo de distribucin de iones en el equilibrio, debido a la presencia de un in no-difusible en un compartimiento, se ha llamado EOUILIBRIO DE DCNNAN; el cual se rige por las siguientes reglas: TOiq J d la. Ley: La suma de cationes es igual a la suma de aniones en cada uno de los ccmpartimientos. 2a. Ley: El producto de los dos iones (anin y catin) de cualquier sal difusible es igual en los dos ccmpartimientos. 3a. Ley: la suma de cationes difusibles es mayor en el compartimiento que con tiene el anin coloidal no difusible. ~ 4a. Ley: La suma total de iones es mayor en el corpartimiento del coloide ionico. COMPARTIMIENTO I a Na+ | COMPARTIMIENTO II ! Na+ b I a+ x Na Pr ncri cJ
V
+

mm

I I Na+ b - x

\ P3fO: c l \ b c o i \ c r \ t v a , c i o \ contrae,n SITUACION -INICIAL

X Cl" ! Cl~ b - x c o * c n t r o x W 5 n | concntracWn EQUILIBRIO DE DONNAN

Este equilibrio de Donnan se puede poner de manifiesto dializando una solucin de protena cargada negativamente contra un mismo voldmen de agua des tilada. Como sabemos, |a protena no puede atravezar la bolsa de dilisis pero si contrain s (el Na ); esto ocasiona un excso de cationes en el lquido ex terior, por lo que para mantener la neutralidad elctrica ah, el agua de diso ca generando iones H+ y OH"; los iones H+ migran al interior de la bolsa de dilisis ocasionando una disminucin del pH, mientras que el lquido exterior al conservar los OH" incrementa su pH.

-105-

dial ticas son i r S toi^r33 5)330 ? 1t o s Permeables al agua y solutos verdadea los solu iZr'J^ ^ ^ } coloidales debido a su gran tamao l u t o f ^ o S f ? 1* DIALISIS, txxteros separar solutos toistaSiL^^ lutos coloidales (protenas), en virtud a oue los coloides por sus orandes dimensiones quedan retenidos dentro de la membrana ^ ^

" T ^ d u r a n t e la purificacin de protenas para ^ Precipitantes de protenas utilizados en" el primer paso de su aislamiento como son las sales neutras (NH4S04) etanol. seoarar 1
age

1SS 3 6 tes

MATERIAL POR EQUIPO DE CUATRO PERSONAS 3 vasos de precipitados de 250 mi ( frascos Gerber) 2 pipetas de 10 mi ' 2 pipetas de 1 mi 10 tubos de ensaye de 18 x 150 5 tubos de ensaye de 13 x 100 1 gradilla 1 pinzas para tubos de ensaye Mechero Tripi y tela de asbesto

REACTIVOS 1 . f ' W N U i i t ' i ' A L E I N A AL 0.5%:Disolver 0.5 gramos de fenolftaleina en 100 mi etanol. ^ G ^ ^ 2%: Disolver 2 gramos de gelatina en 80 mi de agua destilada3 1 ' ' , * suavemente para disolver y enseguida aforar a 100 mi y conservar en el refrigerador.

3.- ALBUMINA DE HUEVO: Tener la clara de 2 huevos y disolverla suavenente en 500 mi de agua destilada a 37C. guardar en refrigeracin. 4- SOUTION AL 1% DE GELATINA: Disolver 1 gtJamo de gelatina en 80 mi de agua destilada a 37C, luego afore a 100 mi con agua desti lada a 37C.

aeb Birg& eb 0130 3 J E3 . I xs c&ixrpT I

5.-SOLUCION DE CASEINA AL 0.1% Disolver 0.1 grano de casena en 80 mi de agua. destilada a 37C y luego afore a 100 mi con agua a 37C 6 -SOLUCION DE PEPTONA AL 1%: Disuelva suavemente 1 gran*) de peptona en 100 mi de agua destilada tibia a 37 C. PH M e Z C l a r 15 5 soluci(5n A - ** d e y 24.5 mi de solucin B y aforar a 100 mi con agua destilada SOLUCION A: HQAc 0.2M: Diluir 11.5 mi"de acido actico concentrado a 1 litro con agua destilada SOLUCION B: NaQAc 0.2M: Disolver 16.31 gramos de acetato de sodio anhidro 27.22 gramos de acetato de sodio trihidratado en 800 mi de agua destilada y luego aforar a un litro 8.-REACTIVO DE BIURET.

-106-

PARTE EXPERIMENTAL 3I2UIQ ossq iUAIQ

. r q m r .

jttiDom

I.-DESNATURALIZACION POR CALOR (COAGULACION) . Prepare tres tubos de ensaye de 18 x 150 como se indica enseguida: TUBO 1 2 3 Albmina 1% 9 mi 9 mi 9 mi Reg .Acetatos pH 4.6 1 mi K21 0.1M i ' mi NaOH 0.1M 1 mi

X C . T 1 .

bJxai n? r

3D P . & 9 C L SBC sb ^sc

BSiUC

Coloque los tres tubos en un bao de agua hirviendo durante 10 minutos, y enfrelos al chorro de agua corriente. Anote en cuales tubos ocurri coagulacin. En los tubos donde no se haya presentado este fenmeno, adicineles 2 mi de Regulador de acetatos pH 4.6, y anote sus observaciones. II.-DESNATURALIZACION POR SOLVENTES ORGANICOS a) En 4 tubos de 18 x 150, coloque 2 mi de las soluciones de protena proporcionadas . Enseguida, agregeles 2 mi de acetona y anote sus observaciones. En un 5o. tubo adicione 2 mi de agua destilada y 2 mi de acetona. b)En 4 tubos de ensaye de 18 x 150, coloque 2 mi de las soluciones proteicas bajo estudio, y en un 5o. tubo adicione 2 mi de agua destilada. A todos los tubos adales 2 mi de etanol, y observe. Anote los cairbios ocurridos.

rrr^ri-

J.OS.

III. -PRECIPITACION POR ANIONES a) En una serie de 4 tubos de ensaye deposite 2 mi de las soluciones bajo estudio, en tanto que en el tubo 5 agregue 2 mi de agua . Agregue luego a to dos los tubos 1 mi de Acido Trieloroactico saturado, mezcle y anote sus observaciones. b)En una serie de 4 tubos de ensaye de 18 x 150 transfiera 2 mi de las soluciones proteicas y en un tubo numero 5 coloque 2 mi de agua, A todos los tubos adicineles 1 mi de Acido Sulfosaliclico saturado, mezcle, y anotelo ocurrido. '131. DT IV.- DIALISIS a)Corte un tubo de celofn de 25 cm de longitud b)Humedzcalo con agua destilada y telo cuidadosamente por un extremo, c) Transfiera dentro de la bolsa de celofn 20 mi de Albmina al 1% y cierre la bolsa atando el otro extrao. d)Introduzca la bolsa de dilisis en un vaso de precipitados de 400 mi conteniendo 300 mi de agua destilada, y djela ah por'90 minutos. e)Corra un blanco colocando 20 mi de NaCl 0.85% dentro de la bolsa de dilisis f)Una vez transcurrido el tiempo indicado, efecte la Prueba de Biuret tantoai lquido exterior cano a la solucin del interior de la bolsa de dilisis. g)Registre sus resultados.

JI8 30

V.-EQUILIBRIO DE DQNNAN a)Htmedezca un tubo de celofn de 25 an de longitud con agua destilada, Jy telo por un extremo. pipeta deposite en el interior 20 mi de gelatina al 2% de pB= 9, y 4 gotas de fenolftalena. Anote el color gue tana la solucin, c Ate el otro extremo de la bolsa y cercirese de que est bien cerrada. m a 0 d / f 1 f Palpitados de 250 mi en un frasco Gerber, coloque 20 mi de agua destilada pH= 7 y adicinele 4 gotas de fenolftalena. Registre el color que tona la solucin. e)Introduzca la bolsa de dilisis conteniendo la protena dentro del frasco Gerber con el agua destilada pH=&. f ^ 9 0 minutos. Transcurrido ese tiempo registre los colo dei c r ) Con P T ^ - fxterior interior de la bolsa de dilisis y~ g)Con el potencimetro determine el pH de ambas soluciones. Regstrelo. RESULTADOS I.-DESNATURALIZACION POR CALOR (COAGULACION) un la siguiente tabla anote las observaciones tenidas en este experimento

TUBO

Despus de Calentar

Despues de adicionar regulador de acetatos pn - 4.6

m II. -DESNATURALIZACION POR SOLVENTES ORGANICOS Intorme en la siguiente tabla los resultados que obtuvo con los dos solventes utilizados,

SOLUCION PROTEICA

ACETONA

ETANOL

-108-

111

.-PRECIPITACION POR ANIONES

Anote en la tabla sus observaciones. Da 3

SOLUCION PROTEICA ACIDO TRICLORQACETICO ACIDO SULFOSALICILICO

IV.- D I A L I S I S utilice los dibujos para presentar lo ocurrido en este experimento.

SOLUCION PROTEICA PRUEBA DE BIURET

i i ;

BLAKOD(NaCl)

PRUEBA DE CLORUROS

V.- EQUILIBRIO DE D O N

NA N

En los siguientes esquemas, represente las observaciones que usted tuvo tanto al inicio cono al final del experimento.

SITUACION INICIAL

Color pH Color pH

de la solucin interna de la solucin interna del lquido exterior del lquido exterior

SITUACION AL EQUILIBRIO

Color pH Color pH

de la solucin interna de la solucin interna de la solucin externa del liquido exterior

SECCION DE PREGUNTAS su

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

-112-

BIBLIOGRAFIA 1.-Bhagavan, N.V. 1978. Bioqumica. Editorial Interamericana,S.A. 3a. Edicin, pp 227- 231. 2.-Bohinski, R.C. 1982. Bioqumica. Fondo Educativo Inter cano. 2a. Edicin, pp: 227-231. 3.-Macarulla, J.N. y Goi, F.M. 1978. Bionolculas. Edito rial Rever t, S.A. la. Edicin pp: 113-114. 4.-Mazur, A y B. Harrow. 1973. Bioqumica Bsica. Editorial Interamericana, 10a.edicin. pp:87. 5.-Plunmer, D.T. 1981. Introduccin a la Bioqumica Prctica. Editorial McGraw-Hill Latinoamericanaf S.A. la. edicin, pp: 47-49 , 134-136. 6.-Ramsey, J.B. 1980. Biologa Qumica, una introduccin a la Bioqumica. Editorial Continental, S.A . la. edicin, pp: 559-564. 7.-Rendina,G. 1974. Tcnicas de Bioqumicq Aplicada. Editorial Interamericana, la edicin, pp:55-60. 8.-Stryer, L. 1979. Bioqumica. Editorial Revert,S.A. la. edi cin. pp 19-20, 36. ~ 9.-Tbporek, M. 1984, Bioqumica. Editorial Interamericana, S.A. 3a. edicin, pp:227-231.

-113-

OBTECION DE LA CASEINA A PARTIR CE LA LECHE INTRODUCCION recurso cidos?

L

^ ^ **
d

n d e Sl

^ dieta huraa. Es el tnico Y crecimiento de los nios recirTra fuente fundamental de protenas carbohi

f< le S he

d e v a c a e s 11113

S n ^ U tS U1T ^ m ^ srica v^ cSve fl, *

13 n^* Y un 0.5% respectivamente.

las cuales se cus-

If^S?3
61

68 r Una
d e las

^ ^

soluble, parecida a la albmina Protena conjugada c^e se infosfcproteinas, ya que algn de los resi-~

Pr?tena aSena 63

un aciao tostoneo caro se ilustra enseguida:

+

ch2 -CH

H3N - C -H coo

H,N

CH 9 - OI

-CH

ce

I _

- C- H COO FOSFOSERINA

SERINA

S ^ V L & r f dS ^ leChe
CBJETIVO

Aunque el contenido de protenas de la leche de vaca es relat-va-

protenas de origen animal ccmo la miosina y la albdmina de huevo mnt-^n - todos los aminocidos escenciales para el c r e S S feTE

Intentronos en este experimento separar la casna de la leche protera v t S t S J S ^ T

4 63 61 PUnt '8' * * ~ * * e s t ^ i 6 n cuantitativa presente en es

FUNDAMENTO protenas muestran machas de las propiedades anfotricas de 133 Pr0tGnaS ^ cc^ortan^ s i ^ L aminocidos, y se ionizan de la misma manera, ya que los grupos R de los i ^

-114-

residuos pueden cargarse positivamente negativamente. La carqa neta de una molcula de protna depende del pH de la solucin y de la cantidad y tipo de grupos "R" presentes. Cuando la carga neta de la protena es cero, es decir, el nmero de cargas positivas es igual al numero de carqas negativas, entonces la proteina no emigrar hacia ninquno de los polos en un campo electri co, y el pH en el que ocurre esta situacin se dencmina PUNTO ISOELECTRICO. Cuando una protena, se encuentra en una solucin alcalina conrespecto a su ounto isoelctrico, tendr una carga neta negativa, mientras que en una solucin cida, con respecto a su punto isoelctrico, poseer una caraa positiva. " Si a una solucin de nrotena se le a-justa el pH al DH isoelc trico, la orotena orecioita ce la solucin, y cuede ser separada fcilmeH te. Este proceso se conoce como PRECIPITACION ISOELECTRICA, y permite la separacin de protenas y su posterior purificacin. La forna zwitterinica, aninica y protonada de una orotena se ilustran enseouida:

p
-

- HECOGE

H*

-HH3

CE~

-cocr

eoo" FORMA ANIONICA

FORMA CATIONICA

FORMA .ZWITTERIONICA

MATERIAL POR EQUIPO DE CUATRO PERSONAS 2 vasos de precipitados de 400 mi 2 pipetas qraduadas de 10 mi 1 termmetro 1 parrilla elctrica con agitacin 1 barra magntica 1 apitador de vidrio 1 embudo de filtracin rpida 1 mortero 2 tubos de 18 x 150 i oradilla Gasa, y dos bolsas de papel celofn

REACTTVOS 1.-Acido Actico 2M: Tomar 117.6 mi de HOAc concentrado y aforar a un volmen de un litro con agua destilada. 2.-HC1 2%: Transferir 54 mi de acido clorhdrico concentrado a un matraz volu mtrico de 1 litro conteniendo 300 mi de acrua destilada, mezclar, y aforar. 3.-ETANOL 4.-ETER ETILICO 5.-NaOH 0.1%: Disolver 0.1 gramo de hidrxido de sodio en 50 mi de aqua desti lada y afore a 100 mi con agua destilada. ~ PARTE EXPERIMENTAL 1.-En un vaso de precipitados de 400 mi, coloque 50 mi de agua destilada.y calintela hasta una temperatura de 38C. 2.-Adicione 100 mi de leche y deposite cuidadosamente una barra magntica. 3.-Coloque el vaso de precipitados sobre una base magntica cercana al potencio metro e introduzca los electrodos en la solucin. ~ Encienda la agitacin cuir dadosamente .Determine el pH inicial y deje el botn en la posicin de pH. 4.-Con una pipeta, comience a adicionar gota a gota Acido Actico 2M HC1 2%, 1 hasta que el pH de la solucin sea de 4.8 , donde ocurrir la mxima precipi tacin de casena. 5.-Una vez obtenido el precipitado, detenga la agitacin, remueva los electro dos, lvelos y dejelos dentro de agua destilada limpia. La solucin mantngala en reposo durante 10 minutos 6.-Elimine por decantacin una buena parte del sobrenadante. La porcin restante fltrela a travs de un embudo de vidrio cubierto con papel filtro, recogiendo el filtrado en un vaso de precipitados, el cual se elimina. 7.-El residuo que qued en el embudo, lvelo con 20 ,ml de etanol agitando con una varilla de vidrio cuidadosamente sin romper el papel. 8.-Entre varias hojas de papel secante, coloque el cono de papel que contiene el residuo y desquelo presionando con las hojas de papel secante. 9.-El precipitado seco, colquelo en un vaso de precipitados y adicione 20 mi de eter etlico, agite bien la suspensin para deslipidizar la protena, 10.-Filtre nuevamente esta suspensin a travs de un eirbudo de filtracin rpida cubierto con papel filtro. Descarte el filtrado. El residuo de color blanco esla CASEINA. 11.-Transferir la.casena a un mortero y pulverizarla. PESELA, y guardela en una bolsa de papel celofn. 12.-En un tubo de ensaye de 18 x 150 coloque una pequea porcin de la casena obtenida y disulvala en 5 mi de NaOH al 0.1% y realice la PRUEBA DE BIURE7T. PRUEBA DE BIURET:- A la solucin proteica, adicinele 1 mi del Reactivo de Biuret, agite y observe el color desarrollado. Corra un control positivo utilizando albmina de huevo.

RESULTADOS 1. -PESO DE IA CASEINA OBTENIDA: n j j 2.-REPORTE EL % DE CASINA EN GRAMDS/100 mi DE LECHE: 3.-ENTREGUE LA CASEINA OBTENIDA, GRAPANDOLA EN EL SIGUIENTE ESPACIO:

nu no J

sil

4.-Muestre sus resultados de la prueba de Biuret CASEINA OBTENIDA ALBUMINA DE HUEVO

Color: Reaccin:

Color: Reaccin:

-119-

BIBLIOGRAFIA

1.-Baum, S.J. 1981. Introduccin a la Qumica Orgnica y Biolgica. Ccmpaa Editorial Continental,S.A. Mxico, la. Publicacin. pp:380. 2.-laboratory Manual.Chemistry 3403. Pan-American University, Edinburg Texas. 3.-Macarulla, J.M. y F.M. Goi. 1978. Biolculas. Leccio= nes de Bioqumica Estructural. Editorial Re vert la. Edicin. pp:115. 4.-Mazur, A. y B. Harrow. 1973. Bioqumica Bsica. Edtorial Interamericana. 10a edicin, pp:46-47. 5.-Rendira, G. 1974. Tcnicas de Bioqumica Aplicada. Edito rial Interamericana, la. Edicin, pp: 52-53.

-120-

OBTEtCION DE ACIDOS NUCLEICOS A PARTIR DE LEVADURAS

INTRODUCCION f l 2 C d O S n u c l e i c o s son polmeros de elevado peso molecular cuya S t t T T ^ ' C P n e n t e fundamental es el MSKMJOJCTIDO, el c l fosfrico^ nitrogenada prica o pirimdica, una pentos, y cidol l n M

Existen dos tipos de cidos nucleicos que son: el Acido Desoxiribonucleico (DNA) y el Acido Ribonucleico (RNA). Desoxiribc^
loc izacl6n cleo de S s ^ n ? / ^ ' el ENA se encuentra sierre en el nflnt^of r, eucariticas, y en la regin del nucleoide en los orgaS ^ e K 1 ^ ' , ** 1 0 3 " O T 1 ? 3 ^ mitocondrias y el clorosas ?' jostrado la presencia de cido desoxiribonucleico llanado ? n r faATELITE En las clulas procariticas, adems de su genforo existen ne CrCulares ^ S f ^ 3 3 ^ ' cadena y lutorepuSS? S

enoontrar Dero n r i n ^ L ' el de las clulas eucariticas pero principalmente se encuentra en el citoplasma celular.

^ l 0 S ^J 3 " 3 1 0 3 ecariotes, los cidos nucleicos suelen asociarse con protemas bsicas especficas llamadas HISTONAS o PROIAMINAS las cua les neutralizan el caracter polianiSnico de las rrolculas, formando carpid
N U C ^RA ^ ^ D E ^ R 3 5 a^20% de cidonucleico?' ^ L W R 0 1

^ ** ^ ^

^ ^

OBJETIVO

S% f S

n U C

Considerando que las levaduras contienen una elevada prooorcin deeC S ? ' -nS pr P naTOS Oslarlos parcialmente, fraccionarlos e S1 ^ ^ S r ^ 6 ^ * Sl constituyen

FUNDAMENTO Existen mtodos especiales para el aislamiento, purificacin y medi cin cuantitativa de los cidos nucleicos. Entre esto^ se incluyen la c r ^ r ^ t E ^ S ' Preciuitacin, centrifugacin ( filtracin), hidrlisis, cromatografa y tcnicas pticas para establecer la cantidad de cido nucle co que existe en una muestra. -

-121-

MATERIAL POR EQUIPO DE CUATRO PERSONAS levadura de papadera (un paquete por qrupo) Balanza granataria 2 Dipetas de 10 mi 1 pipeta de 1 mi 1 agitador de vidrio 1 Dinzas para tubo de ensaye 1 embudo de filtracin rpida 1 vaso de orecipitados de 250 mi 1 probet a graduada 5 tubos de ensaye de 18 x 150 1 mechero gasa manta de cielo Papel Hydrion Papel Filtro

REACTIVOS 1.- NaOH 30%: Disolver 30 gramos de hidrxido de sodio en 80 mi de agua destilada fra, afore despus con agua hasta 100 mi 2.- NaOH 1 N: Disolver 40 gramos de hidrxido de sodio en 800ralde agua des tilada fra y luego afore hasta un litro con ese solvente. 3.- FeCl310%: Disuelva 10 gramos de FeCl3-6H20 en 50 mi de agua destilada,y adicione 1 mi de HC1 conc. Afore a 100 mi con agua destilada. 4.- Etanol al 95% 5.- Acido Clorhdrico concentrado 6.- Reactivo de Bial 7.- Acido Sulfrico 3 N: Aadir 8.3 mi de H2S04 concentrado por los paredesdel recipiente a un volumen de 50 mi de agua destilada, mezcle cuidadosamente a medida que se aada el cido. Completar con agua hasta un volumen de 100 mi. 8.- H2S04 10 N: Repita el procedimiento anterior, pero utilice 27.7 mi de cido sulfrico concentrado. PARTE EXPERIMENTAL I.-SEPARACION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS 1.-En un vaso de Drecipitados de 250 mi, coloque 20 gramos de levadura de pa nadera, y agregue 15 mi de NaOH al 30%. Agite con una varilla de vidriodurante 20 minutos hasta formar una suspensin. 2.-Luego adicione 20 mi de agua destilada y homogenice. Despus aada 10 mi de FeCl. al 10% y mezcle bien.

L suspensin a travs de un embudo de filtracin rpida iirplonentado 6 d e Ciel ^ n ^ t T^t f ^ - ^ P la pasta usando para ello guantes de hule. Recoga el filtrado en un vaso de precipitados dT 2 50 mi S"8* a d C n f n d o l e 1 5 m d e agua destilada recuperando el lavado en el vaso de precipita dos donde recuper el filtrado anterior. ^trados entonces filtre de nuevo utili zando papel filtro adaptado a un embudo de filtracin r pida. 6.-El residuo que qued en la gasa elimnelo.
7

' t - n w e :Lt^ado? ac^icionele 50 mi de etanol al 95% agitando continuamente durante la adicin.

8.-Eespus aadir con agitacin suficiente BCl concentrado hasta acidificar lasolucin, utilice papel hydrion para verificar- el pH. Con esto se consigue la precipitacin del cido nucleico. ydeschelos^
1

^ t e n i d a a ^avs d e Papel filtro y lave el residuo recuperando ambos filtrados en un vaso de precipitados,

aS

10.-El residuo que se retuvo en el papel filtro son los ACIDOS NUCLEICOS , utili celo oara realizar los siguientes ensayos: ~ II.-HIDROLISIS DE LOS ACIDOS NUCLEICOS 1.-Disuelva una pequea porcin del cido nucleico obtenido, en 5 mi de NaOH 1N y caliente en bao de agua hirviente durante 15 minutos. Enfrie. 2.-Acidifique la solucin hasta un pH=3.5 con HC1 0.1N, manteniendo de tubo de ensayo en un bao de hielo. Con este hidrolizado efecte la:
PRUEBA DE BIAL

a) En un tubo de ensaye de 18 x 150, coloque 3 mi del Reactivo de Bial, y aada1 mi del hidrolizado anterior. Caliente al mechero con agitacin, hasta que las primeras burbujas alcancen la superficie. Cbserve el color desarrollado por la solucin. Antelo. III.-IDENTIFICACION DE FOSFATOS Prepare al memento las siguientes soluciones: i)M0LIBDAT0 DE AMDNIO AL 2.5%:Disuelva 2.5 granos de nolibdato de amonio en 20 mi de agua destiladas. Coloque 30 mi de H2SO ION en un matraz de aforacin de 10(tal agregele la solucin de molibdato y diluya a 100 mi con agua destilada .Mezcle bien, y guarde la solucin en un frasco de ambar bajo refrigeracin. ii)CIORURO ESTANNOSO: Disuelva SnCl2.2H20 en HC1 6M. Decante y al decantado aade granallas de estao. l.-En un tubo de ensaye de 18 x 150 coloque una porcin del acido nucleico ctote nido.Aada 2 mi de H2So4 3N. Hierva lentamente durante 5 min para hidrlizar~ el acido nucleico. Enfrie.

2.-Transfiera 1 mi de este solucin a un tubo de ensaye de 18 x 150 y aada 0.5 mi de H2S04 ION, 1 mi de solucin de molibdato de anonio al 2.5%, y 5 gotas del reactivo reductor de cloruro estannoso. Deje reposar durante 10 minutos. Cbserve el color desarrollado. Antelo. i xa-, Corra un control utilizando una solucin de KHJPO. 0.1M y otro control negativo utilizando agua destilada cerno muestra.

si:

RESULTADOS 1.-Anota enseguida las caractersicas fisicas del cido nucleico obtenido:

ri 13090

S i id U f i W 3 i
X13

I 2-En la siguiente tabla anota los colores desarrollados por las diferentes muestras al efectuar las pruebas sealadas.

flLf Chi DXDB

ILIK?

. . .

PRUEBA BIOQUIMICA

nxoul'

HIDROLIZADO (AC.NUCLEICO)

rnNFTOnT. POSITIVO

Anm

PRJEBA DE BIAL

PRUEBA DE FOSFATOS
9Di

9b
OS

i' -124: 3 b "39XJBftBTi sfoen6 v 051 x 81 sb 'Vaans 9b x r7 s aoxau.os n res wn r L m r m d.i i d t i ec un le oirran 9b atfibdian ' . a ot v jvio'oesi Isb 86dt3g c x s i i j b isaoqsi 9 9 ( 3 .oaofius^BQ exn&fco s J sadD .attufm Q J .oJktriA ..obsliansBeb ic \ r _ u Xoxnoo nt/.sxto' Xc t f i c o occto Y M1.0 C-L.HN et f d i o i ' X o f , n x ' o c v x f i p . ' ; .BUzaum atDDfibktitsabS . . dbn&sxlxx; c

DISCSION

axLgrju:^; sobxnsJdo colsXojn obras leo B f . J . B X J p 9 S f I 9S i ' O f l A - .1

39~n919ixb SJ HOQ 3GB

J STMI) OG LJn I oviTiaoq ' 1 mmrxm. A.

, J

, : ; ! r mjfri j

j 'ja " j e ' AsaiH ^

CONCLUSIONES

-125' t e

SECCION DE PREGUNTAS

fmxmt

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA 33MOI.

BIBLIOGRAFIA 1.-Bohinskl, R.C. 1978. Bioqumica. Fordo Educativo Interamericano. la. edicin, pp:201-233. 2.-Conn, E.y P.K. Stumpf. 1978. Bioqumica Fundamental. Editorial Lmusa. 3a. edicin, pp:127-150. 3.-Mertz, E.T. 1977. Bioqumica. Publicaciones Culturales .A. 3a. reimpresin en espaol, pp: 111-122. 4.Macarulla, J.M. y F.M. Goi. 1978. Bionolculas, lecciones de Bioqumica estructural. Editorial Re vert, S.A. la. Edicin, pp: 118-122. 5.-Ouiroga, V.L. 1971. Anlisis de Alimentos utilizados en Nutricin Animal. Facultad de Agronoma, U.A.N.L. Monterrey, N.L. pp 35.