GRUPO KES

Marcelo Galas1 y Red WHONET-Argentina2

1

Servicio ANTIMICROBIANOS. Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosos ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn Buenos Aires, Argentina 2 Ver en la figura 1 los participantes de la Red WNONET-Argentina Introduccin

Este grupo esta compuesto por Enterobacter spp. Klebsiella spp y Serratia spp. Se trata de tres gneros de microorganismos frecuentemente asociados a infecciones hospitalarias. Una caracterstica sobresaliente de los miembros de este grupo es la resistencia natural que cada uno tiene y la potencialidad que poseen para adquirir mecanismos de resistencia a varias de las familias de antimicrobianos ms utilizadas en la clnica. Si analizamos globalmente la distribucin de microorganismos aislados, durante el periodo 1997-2000 (n=118.119), en los laboratorios de microbiologa de los hospitales pertenecientes a la red WHONET- Argentina (figura 1), podemos observar que Klebsiella pneumoniae esta tercera en frecuencia (7,5%) despus de E. coli y S. aureus. Enterobacter spp. est noveno con un 3,3% y mucho ms alejada, en el puesto nmero 16, est Serratia spp. con un 0,6% (figura 2). Si tomamos solamente los aislamientos provenientes de las salas de terapia intensiva del mismo periodo (n=8.511), Klebsiella pneumoniae (11%) mantiene su lugar compartido con Staphylococcus coag. neg. Sin embargo tanto Enterobacter spp. como Serratia spp. ascienden a la octava y doceava posicin, 5% y 1%, respectivamente (figura 3). Como se puede ver por las cifras, estos tres patgenos son de aislamiento frecuente en el laboratorio de microbiologa. Analizando las encuestas de control de calidad donde participaron alguno de estos tres grmenes se observa la existencia de problemas en la identificacin bioqumica y tambin en la determinacin, interpretacin e informe de la sensibilidad a los antimicrobianos. Los objetivos de este trabajo son: I) presentar las caractersticas propias de cada especie en cuanto a la resistencia a los antimicrobianos tanto natural como adquirida y como ellas ayudan al microbilogo en la confirmacin de la identificacin bioqumica; II) Proveer los detalles para la correcta determinacin e interpretacin de las pruebas de sensibilidad de estos microorganismos y III) mostrar el estado actual de la resistencia a los antimicrobianos de estos tres patgenos en Argentina. Para cada uno de los objetivos trataremos de explicar de la forma ms sencilla posible los fundamentos de cada fenmeno observado. El conocimiento a nivel molecular de los que sucede en cada placa de petri del antibiograma nos ayudar a entender el porque de muchos de los preceptos que utilizamos a diario en el laboratorio de microbiologa. Al final del trabajo y a modo de resumen se podr encontrar una ficha tcnica de cada uno de los miembros de este grupo con los puntos sobresalientes en cuanto a su resistencia a los antimicrobianos.

FIGURA 1

Red de Laboratorios - WHONET - Argentina 2000

JUJUY Htal. Pablo Soria - M. Royo de Weibel SALTA Htal. Materno Infantil - J. Mulki Htal. San Vicente de Paul - M. Cacace TUCUMAN C. de Microbiologia Medica - H. Musa Htal. Del Nio Jesus - A. Trejo LA RIOJA Htal. Vera Barrios -S. Flores MENDOZA Htal. Ped. Dr. Humbeto Notti - L. Balbi SAN JUAN Htal. Marcial Quiroga - H. Castro CORDOBA Htal. Infantil Municipal - S. Yudowsky Htal. Rawson - A. Littvik Lab. Privados -L. Wolff, M. Bottiglieri LA PAMPA Htal. Gob. Centeno - A. Pereyra,N. Moreno Htal. Lucio Molas - M. Gau de Cornejo NEUQUEN Htal. Provincial - C. Kremer CHUBUT Htal. Zonal Esquel- O. Daher RIO NEGRO Htal. Regional Cipolletti -M. C. Carranza SANTA CRUZ Htal. Reg. R. Gallegos - W. Krause, H. Cano TIERRA DEL FUEGO Htal. Regional de R .Grande - N. Zalazar, M. Laferrara MISIONES Htal. Prov. De Ped. - S. Grenon CHACO Htal. J. Perrando - B. Irigoyen , C. Camargo

SANTA FE Fac. Cs. Bioqumicas - E. Sutich, E. Gregorini Htal. Gutierrez (SF) - C. Mayoral Inst. ABC - R. Notario, N. Borda ENTRE RIOS Htal. San Martn - F. Salamone BUENOS AIRES Capital Federal Htal. Garrahan - H. Lopardo,C. Roldan Htal. Gutierrez - M. Vazquez, A. Procopio Htal. Argerich - N. Gomez Fund. Favaloro - M. Tokumoto, R. Soloaga Htal. Muiz - E. Couto FLENI - L. Guelfand Htal. Piero - L. Rivera , L. Lauro Sanatorio Mitre - A. Di Martino Pcia. de Buenos Aires Htal. Posadas - A. Di Bella, A. Fernandez Lausi Htal. Sor M. Ludovica - M. Altschuler, B. Gatti Htal. Jara - C. F. Pascua Htal. Pena - S. Vaylet

Grupo Coordinador: Marcelo Galas, Marta Tokumoto, Liliana Guelfand, Fernando Pasteran Miryan Vazquez, Laura Rivera, Horacio Lopardo. Inst.. Nac. de Enfermedades Infecciosas ANLIS - Dr. Carlos G. Malbrn

FIGURA 2 PORCENTAJES DE LOS MICROORGANISMOS MAS FRECUENTEMENTE AISLADOS EN Distribucin de microorganismos aislados en hospitales LOS LABORATORIOS DE LA RED WHONET-ARGENTINA PERIODO 1997-2000

% 100
80,7 76,51 84,18 86,9

100 95,31 92,93 93,83 94,63 89,56 91,33

80
59,64

72,11 66,41

60 40 20 0
E. co
33 33

52,5 45

N=118.119 aislamientos

12 7,5 7,14 6,77 5,7 4,4 4,28 3,39 2,72 2,66 1,77 1,6 4,69 0,9 0,8 0,68

. . i . . . s s a e e p. p. p. p. p. ni pp ia eg ia pp pp pp os eu tro sp sp sp sp r sp ga a s in r s la s on O ur rs on g. n s r s a s g e l a e l u l i o lu u t te eum act c e e ru ct um oa m S. hi ra ig oc rote bac on b ae ba M. ne S . c op er pn to Sh oc ro lm o . P t S P. r m e i r .p a S te C in S K te ae H En Ac En li

Porcentaje acumulado

FIGURA 3 PORCENTAJES DE LOS MICROORGANISMOS MAS FRECUENTEMENTE AISLADOS DE SALAS DE TERAPIA INTENSIVA DE HOSPITALES DE LA RED WHONET-ARGENTINA

% 100
83 78

100 91 92

89 86

80
62

72

60
41

52

N=8.511 aislamientos

40
18 18 13

31

20 0

11

11

10

10 6 5 3 3 2 1

. . s e a pp eg ia os eu in rs .n ur on g e g a t a c ru um S. co ba ae ne to S. P. e .p in K Ac

e p. p. p. p. ia sp sp sp sp on s r s a i u m l u t te hi eu te ra ac op ro er pn oc ob . P S r m r S te te ae H En En E. s cu oc

li co

p. sp

s tro

Porcentaje acumulado

RESISTENCIA NATURAL
Los Antibiticos -lactmicos son las drogas ms usadas para el tratamiento de infecciones bacterianas tanto a nivel de la comunidad como hospitalario. El amplio espectro, la baja toxicidad y la actividad fuertemente bactericida sobre la mayora de los microorganismos son algunas de las causas de su amplia utilizacin. Prcticamente todos los miembros de la familia Enterobacteriaceae se caracterizan por poseer mecanismos enzimticos naturales de resistencia a estas drogas. Adems, son capaces de adquirir otros mecanismos enzimticos de resistencia a los antibiticos -lactmicos como resultado de la captacin de elementos de DNA mviles (plsmidos, transposones, etc.) o a travs de mutaciones cromosmicas. Estas ltimas son las responsables, por ejemplo, de los cambios en la acumulacin de estas drogas en el periplasma. Los dos fenmenos observados son: impermeabilidad (mutaciones que afectan el nmero o funcionalidad de las porinas) y eflujo (se ven afectados el nmero o la actividad de bombas capaces de eliminar el antimicrobiano del interior de la bacteria). Por otra parte existen mutaciones que pueden afectar la estructura de las PBPs (protenas ligadoras de penicilina) modificando su afinidad por los antibiticos -lactmicos o incluso afectar el nivel de produccin de las -lactamasas cromosmicas, aumentando la cantidad producida y como consecuencia la resistencia. Salmonella spp. es el nico gnero de la familia Enterobacteriaceae en el cual no se detect la produccin de -lactamasas cromosmicas, el resto de los gneros producen enzimas de este tipo con marcadas diferencias en cuanto a clase, nivel de produccin, sistema de regulacin y perfil de sustratos e inhibidores. Estas diferencias, sumadas a otras resistencias naturales propias de especie a antibiticos no -lactmicos, confieren a las enterobacterias fenotipos particulares que en muchos casos son tiles como ayuda en la identificacin. Como regla general debemos considerar que, debido a la baja permeabilidad de su membrana externa, todas las enterobacterias presentan resistencia natural a penicilina, oxazoil penicilinas (oxacilina, cloxacilina, etc), clindamicina, lincomicinas, glicopptidos

(vancomicina y teicoplanina) y macrlidos. Estos ltimos antimicrobianos muestran una baja a moderada actividad frente a este grupo de microorganismos. En localizaciones como el tracto intestinal donde el pH es bsico y la concentracin de droga es muy alta se produce un efecto potenciador de la actividad de los macrlidos. Esto determina que algunas de las drogas de esta familia se utilicen para decontaminacin o tratamiento de infecciones intestinales causadas por enterobacterias. Por las caractersticas qumicas, el macrlido ms activo sobre bacilos gram negativos es la azitromicina.

Klebsiella spp
Las cepas salvajes de este gnero presentan, como nica resistencia natural, la produccin de una -lactamasa de espectro ampliado (BLEA) (figura 4). Prcticamente todas las Klebsiella pneumoniae producen cromosmica y constitutivamente bajos niveles de esta enzima, se trata de SHV-1 (clase A de Ambler, grupo 2b de Karen Bush)1,2 . El espectro de actividad de esta -lactamasa incluye amino y carboxipenicilinas, es por ello que a pesar de los bajos niveles de enzima producidos, K. pneumoniae, es naturalmente resistentes a ampicilina (AMP), amoxicilina (AMX), carbenicilina (CAR) y ticarcilina (TIC)3. Como se observa en la figura 5, pueden encontrarse unos pocos aislamientos de Klebsiella spp con sensibilidad intermedia (6%) o incluso en forma excepcional algunos sensibles a ampicilina (3%). Esto puede deberse a que el bajo nivel de enzima producido no es suficiente para inactivar completamente la droga. A pesar de esto, un aislamiento de Klebsiella spp sensible a ampicilina debe ser confirmado en cuanto a su identificacin bioqumica y su sensibilidad porque puede tratarse de un error. La actividad de esta enzima sobre aciluredopenicilinas (piperacilina <PIP> y mezlocilina <MEZ>), y cefalosporinas de primera generacin es mucho ms baja, por ello en la gram mayora de los casos se presentan como sensibles a estas drogas en el antibiograma. Klebsiella oxytoca tambin produce constitutivamente una -lactamasa cromosmica clase A, que confiere un perfil similar al de SHV-1 de K. pneumoniae, la enzima se denomina K1 4,1

Figura 4

Resistencia natural

GEN

Klebsiella pneumoniae Cepa salvaje (fenotipo normal)

El fenotipo salvaje de Klebsiella spp. se caracteriza por su resistencia a aminopenicilinas (ampicilina y amoxicilina) y carboxipenicilinas (ticarcilina y carbenicilina) provocada por la presencia de una -lactamasa cromosmica de amplio espectro (SHV-1). Esta encima es inhibible por inhibidores de lactamasas plasmdicas del grupo 2 de Karen Bush por lo que se observa sensibilidad a ampicilina/sulbactam. Amoxicilina/ac. clavulnico tambin presentar actividad sobre Klebsiella spp. salvaje.

AMK CPD

AMP

AMS CTX

COL

CTN FOX

NIT

60 50 40 30 20 10 0

Figura 5: Klebsiella spp (n=2297) frente a Ampicilina Aislamientos sensibles a cefalosporinas de tercera generacin y ampicilina sulbactam. Perodo1998-2000
91% 6% 3%

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

34

Dimetro de inhibicin

Las -lactamasas cromosmicas de K. oxytoca presenta una gran variabilidad. Se pueden dividir en dos grandes grupos, OXY-1 y OXY-2 5,6 . Cada uno de los grupos, a su vez, est compuesto por varias enzimas con distintas caractersticas bioqumicas y diferencias en cuanto a la capacidad hidroltica sobre los antibiticos -lactmicos y la sensibilidad a los inhibidores de -lactamasas plasmdicas7. Como veremos ms adelante, los genes codificantes de esta -lactamasa pueden sufrir mutaciones que dan como resultado la hiperproduccin de la misma.

Enterobacter spp. y Serratia spp

Estos dos gneros junto con, Citrobacter freundii, Morganella morganii y Providencia spp producen una -lactamasa cromosmica que le confiere a los aislamientos una resistencia natural caracterstica. Se trata de una enzima del tipo AMP-C perteneciente al grupo 1 de Karen Bush (Clase C de Ambler). En las cepas salvajes esta se expresa en forma inducible. En condiciones basales (sin induccin), la cantidad de enzima sintetizada es mnima, pero en presencia de un -lactmico inductor se comienzan a sintetizar copiosas cantidades de enzima (ver figura 6). Este mecanismo es reversible, por lo tanto cuando el inductor desaparece nuevamente se retorna al estado de sntesis basal. La expresin fenotpica de este mecanismo de resistencia ser diferente de acuerdo al lactmico analizado. A) Si se trata de un buen inductor, sensible a la hidrlisis mediada por la -lactamasa, su presencia provocar la sntesis de grandes cantidades de enzima que terminarn destruyndolo. Por este motivo los aislamientos se comportarn como resistentes a dichos antimicrobianos, este es el caso de las aminopenicilinas (ampicilina y amoxicilina), cefalosporinas de primera y segunda generacin (cefalotina <CTN>, cefaclor <CEC>, etc) y cefamicinas (cefoxitina <CXT>). B) Si la droga es buen inductor, pero resistente a la accin de la enzima, su presencia determinar la produccin de elevados niveles de la misma, pero por ms altos que estos sean, no lograrn hidrolizar al antibitico ya que este es estable a su accin, por lo que se vern como sensibles en el antibiograma. Los carbapenemes (imipenem <IMP> y meropenem <MER>) son ejemplos de este tipo de drogas. C) El grupo de drogas restantes es el que presenta escasa capacidad inductora, pero son sensibles a la hidrlisis mediada por esta enzima, su presencia no activar el mecanismo de induccin y por lo tanto la produccin enzimtica se mantendr en niveles basales. Estos niveles son tan bajos que no logran destruir a la droga a pesar de que esta sea sensible a la hidrlisis. Como consecuencia del bajo poder inductor de estos antimicrobianos los aislamientos sern sensibles a los mismos. Este comportamiento se observa frente drogas como las carboxipenicilinas (TIC y CAR), aciluredopenicilinas (MEZ y PIP), cefalosporinas de tercera generacin (Ceftazidima <CAZ>, cefotaxima <CTX> y ceftriaxona <CRO>) y monobactames (aztreonam <AZT>) (ver figuras 7 y 8). Las cefalosporinas de cuarta generacin (cefepime <FEP> y cefpirome <PIR>) representan un caso particular, tienen bajo poder inductor y adems son bastante resistentes a la hidrlisis mediada por la enzima. Una caracterstica de la -lactamasa tipo AMP-C, es la resistencia a la inhibicin por los inhibidores de -lactamasas plasmdicas del grupo 2 de Karen Bush (ac. Clavulnico, sulbactam y tazobactam). Cabe aclarar en este punto que existen excepciones, principalmente con las sulfonas: sulbactam y tazobactam

Si se analiza el mecanismo de induccin presentado en la figura 6 surge una pregunta: -si todos los antibiticos -lactmicos inhiben la sntesis de pared celular (aumentando, como consecuencia, la concentracin de metabolitos en el citoplasma), por que algunos se comportan como inductores (grupos A y B) y otros no (grupo C y cefalosporinas de cuarta generacin)? Segn Dietz y col.,que estudiaron la induccin de la -lactamasa cromosmica de Enterobacter cloacae, la respuesta est en la afinidad de cada antibitico -lactmico por las distintas PBP bacterianas y por lo tanto la inhibicin selectiva de las mismas8. En el periplasma bacteriano hay distintas PBPs que tienen diferentes funciones (trans o carboxipeptidasas), algunas de ellas son esenciales para la bacteria (PBPs 1-3) y otras no (PBPs 4-6). Estas ltimas tienen fuerte actividad carboxipeptidasa (eliminan la D-alanina terminal de los metabolitos pentapeptdicos). Todos los antibiticos -lactmicos se unen al menos a una de las PBPs esenciales provocando el debilitamiento de la pared y la muerte celular. Como se puede ver en la figura 6 slo uno de los metabolitos de pared (anhdrido muramilpentapptido) logra inducir la produccin de la -lactamasa de Enterobacter. Teniendo en cuenta este ltimo concepto, sumado a la presencia de las PBPs 4 a 6 en el periplasma, la nica forma de encontrar pentapptido en la bacteria es que estn inhibidas las carboxipeptidasas (PBPs 4-6), caso contrario todo el pentapptido ser transformado en tetraptido impidiendo la induccin de la -lactamasa. Los autores concluyen que los buenos inductores del mecanismo de produccin de la enzima son aquellos que inhiben tanto a las PBPs esenciales (PBPs 1-3) como a las no esenciales (PBP 4-6), ejemplo de este tipo de drogas son la CXT y el IMP.

Figura 6

REGULACION DE LA PRODUCCION DE LACTAMASAS TIPO AMP-C

MI

ME

Referencias: Reciclaje de pared celular y su interaccin con la regulacin de la sntesis de la -lactamasa tipo AMP-C. ME, membrana externa; MI, membrana interna; PG, pptido glicano; , disacrido; , N acetil glucosamina; , anhidrido N acetil murmico; , Ac. N acetil murmico; , alanina; , Glutmico; , Ac. Diaminopimlico. Adaptado de (Dietz H., Pfeifle D. and Wiedemann B. 1997. The Signal Molecule for lactamase Induction in Enterobacter cloacae is the Anhydromuramyl-Pentapentide. Antimicrob Agents Chemother. 41:2113-2120).
La pared celular bacteriana es una estructura muy rgida que cumple la funcin de proteger al microorganismo de los cambios osmticos del medio que lo rodea. Esta estructura esta formada por un polmero de azcares y aminocidos con entrecruzamientos que le confieren su fortaleza caracterstica. La unidad precursora de la pared es un monmero compuesto por dos restos azcares (N-acetilglucosamina y N-acetilmurmico) y una cadena de cinco aminocidos (D alanina-glutmico-ac. diaminopimlico-D alanina-D alanina). Estos monmeros son sintetizados en el citoplasma y exportados al periplasma celular dnde son incorporados a la pared. En la incorporacin de dichos monmeros intervienen principalmente dos tipos de enzimas: transglicosilasas, encargadas de unir los restos azcares y carboxi y transpeptidasas involucradas en la produccin de los entrecruzamientos que fortalecen la pared. Este ltimo tipo de enzimas son tambin conocidas como PBPs o protenas ligadoras de penicilinas. En su ciclo de vida la bacteria necesita desarrollarse y duplicarse, estos procesos no seran posibles si no pudiera enlongar su pared ya que esta se comportara como una carcaza que se lo impedira. Para que se puedan llevar a cabo dichos procesos la bacteria mantiene su pared celular en continua remodelacin. Para esto cuenta con distintos tipos de enzimas: las conocidas como autolisinas, que degradan pared produciendo agujeros en la misma y las transglicosilasas y PBPs que se encargan de agregar nuevos monmeros en los espacios producidos por las enzimas lticas. Este es un proceso muy controlado que permite el continuo enlongamiento de la pared. Como resultado de la actividad de las autolisinas se desprenden de la pared un buen nmero de metabolitos (precursores de pared modificados) que tal como se liberan no pueden ser reincorporados a la misma. Estos metabolitos estn formados por los dos restos azcares (N acetil glucosamina y anhdrido N acetilmurmico) y una cadena peptdica que puede ser de distinta longitud (tripptido, tetrapptido o pentapptido). Para poder reutilizarlos la bacteria los ingresa al citoplasma a travs de una protena transportadora (AMP-G). Una vez en el citoplasma estos compuestos sufren diferentes modificaciones que dan como resultado un nuevo monmero precursor listo para ser transportado al periplasma e incorporado a la pared en crecimiento. Una de las primeras modificaciones que ocurren en el citoplasma es la eliminacin de los restos azcares, N-acetilglucosamina y anhdrido N acetilmurmico, en estos procesos interviene la protena AMP-D. Una caracterstica que nos interesa de esta protena es su saturabilidad por sustrato. En condiciones fisiolgicas, AMP-D es capaz de procesar todos los metabolitos que ingresan al citoplasma como resultados del reciclaje de la pared. Sin embargo, cuando la bacteria est expuesta a un antibitico -lactmico, cuyo mecanismo de accin se basa en la inhibicin de la sntesis de pared (inhibe las PBPs), el equilibrio se ve desplazado hacia la degradacin de la pared celular mediada por las autolisinas (no inhibibles por el antibitico). Este fenmeno determina que se incremente mucho la cantidad de metabolitos en el periplasma, estos ingresan al citoplasma (AMP-G no es saturable) y saturan a la enzima AMP-D, que no puede procesar todo el sustrato que se le ofrece, dando como resultado el aumento de los metabolitos de pared en el citoplasma. Este es el punto de conexin con la induccin de la -lactamasa tipo AMP-C cromosmica inducible propia de especie. En general, todas las cepas salvajes de Enterobacter spp., Citrobacter freundii, M. morganii, Providencia spp y Serratia spp. poseen el gen de la -lactamasa tipo AMP-C y su batera de genes reguladores. El gen codificante para la enzima se encuentra normalmente reprimido por una protena citoplasmtica denominada AMP-R. Esta protena tiene la capacidad de unirse a uno de los metabolitos de la pared celular, el anhdrido N acetilmurmico pentapptido (AMPEN), transformndose en activadora de la sntesis de la -lactamasa. En condiciones normales (sin -lactmico en el medio) todo el AMPEN que aparece en el citoplasma, derivado del reciclaje de pared, es procesado por el AMP-D por lo que no est disponible para unirse al AMP-R, que estar siempre reprimiendo la sntesis de la -lactamasa. En caso que la bacteria este expuesta a la accin de un antibitico lactmico, comenzar una cascada de eventos: I) se producirn grandes cantidades de metabolitos de pared, II) estos ingresarn al citoplasma, III) se saturar el AMP-D, IV) quedar AMPEN libre, V) este se unir al AMP-R que se transformar en activador de la sntesis de -lactamasa y VI) como resultado final se producirn copiosas cantidades de enzima que se exportaran al periplasma. No todos los antibiticos -lactmicos disparan el mecanismo de induccin y por otra parte algunos son resistentes a la hidrlisis mediada por la enzima. Esto determina que dependiendo del antibiticos -lactmico ensayado se observar sensibilidad o resistencia a la droga.

Figura 7

Resistencia natural

Enterobacter aerogenes cepa salvaje (fenotipo normal)

AMK GEN

Lectura incorrecta
CTX

AMS CPD

Lectura correcta

COL AMP

N C C IO IN D U
FOX

CTN

NIT

TET

El fenotipo salvaje de Enterobacter spp. se caracteriza por su resistencia a ampicilina, cefalotina y cefoxitina provocada por la induccin de su -lactamasa cromosmica inducible. El achatamiento del halo de inhibicin de cefotaxima observado en las proximidades del disco de cefoxitina es caracterstico de todos los microorganismos productores de -lactamasa cromosmica inducible tipo AMP-C y se debera observar siempre que se coloquen prximos discos de un buen inductor (Cefoxitina, cefalotina, ampicilina, ac. clavulnico, imipenem, etc) y un mal inductor lbil a la enzima (piperacilina, ticarcilina, cefalosp. de 3a gen., aztreonam, etc)

Figura 8

Resistencia natural

Serratia marcescens Cepa salvaje (fenotipo normal)

AMK

CPD

AMS

COL

AMP

CTN TET

El fenotipo salvaje de Serratia spp. se Lectura caracteriza por su incorrecta resistencia a ampicilina, cefalotina y cefoxitina CTX (no siempre) provocada por la induccin de su Lectura lactamasa cromosmica correcta inducible. La causa del achatamiento observado FOX entre los dicos de ION cefotaxima y cefoxitina C C U I ND es la misma que para Enterobacter spp y se puede ver en la figura 7. NIT Por otra parte este gnero muestra adems resistencia a nitrofurantona, tetraciclina y polipptidos (polimixina y colistin)
GEN

En la figuras 9 y 10 se muestra la distribucin de los dimetros de inhibicin para AMP, ampicilina/sulbactam (AMS), cefuroxima (CXM) y CXT frente a las enterobacterias productoras de -lactamasa tipo AMP-C inducible. Se excluyeron del anlisis las cepas que presentaron resistencia a las cefalosporinas de tercera generacin. En general , todas las bacterias productoras de AMP-C son consideradas naturalmente resistentes a AMP, CXM y CXT porque todas estas drogas se comportan como buenos inductores y son eficientemente hidrolizados por la enzima. Por otra parte como el sulbactam no es buen inhibidor de la -lactamasa tipo AMP-C, este no debera potenciar la actividad de AMP, debiendo observarse resistencia a la combinacin de estas dos drogas. Como se puede ver en las figuras 9 y 10, existen varias excepciones que se deben tener en cuenta en el momento de analizar los perfiles de resistencia. Si bien casi todos los microorganismos analizados presentan resistencia a ampicilina (fuerte inductor, lbil a la enzima), C. freundii y Providencia spp. muestran un 12 y 27 % de aislamientos sensibles, respectivamente, esta excepcin fue descrita anteriormente y parece estar relacionada a que en algunas cepas de estas especies, AMP se comporta como pobre inductor de la produccin de la enzima3. Otra excepcin la constituye la actividad inhibitoria de sulbactam que potencia la actividad in vitro de ampicilina frente a un nmero importante de aislamientos de Enterobacter spp , C. freundii, M. morganii y Providencia spp. Cabe aclarar en este punto que si bien sulbactam no es un inhibidor clnicamente til para asociar a ampicilina para el tratamiento de aislamientos productores de enzimas tipo AMP-C, las sulfonas (sulbactam y tazobactam) muestran una cierta actividad inhibitoria que podra justificar este fenmeno in vitro. La distribucin de los dimetros de inhibicin de AMP y AMS frente a aislamientos de Serratia spp es muy similar, indicando la ausencia de inhibicin por sulbactam de la enzima cromosmica de este gnero. Las cefalosporinas de segunda generacin suelen ser buenos inductores y adems sensibles a la hidrlisis por la enzima cromosmica de estos microorganismos. Sin embargo, analizando las distribuciones de halos de inhibicin para cefuroxima, podemos concluir que slo Serratia spp. muestra niveles de resistencia elevados (94%) a esta droga. En los otros cuatro grmenes, si bien las distribuciones de dimetros de inhibicin solapan las categoras intermedia y resistente, se observa un elevado nmero de aislamientos sensibles, 70%, 90%, 36% y 81% para cefuroxima frente a Enterobacter spp., C. freundii, M. morganii y Providencia spp., respectivamente. La resistencia a cefoxitina est catalogada como el mejor marcador de la presencia de -lactamasa tipo AMP-C en enterobacterias, esto es cierto casi exclusivamente para Enterobacter spp. y C. freundii, la misma enzima en Serratia spp., M. morganii y Providencia spp., en general confiere al microorganismo slo bajos niveles de resistencia e incluso pueden aparecer sensibles a esta droga en el antibiograma. Como podemos ver, a pesar de que Enterobacter spp, C. freundii, Serratia spp, M. morganii y Providencia spp producen -lactamasa cromosmica tipo AMP-C, no todas estas bacterias se comportan de la misma manera frente a los distintos antibiticos -lactmicos. Esto se debe a que las enzimas tipo AMP-C de los distintos microorganimos tienen caractersticas distintas.

Figura 9

ENTEROBACTERIAS PRODUCTORAS DE -LACTAMASA TIPO AMP-C INDUCIBLE Resistencia Natural (Periodo 1998-00)
%
93%

AMPICILINA
4% 3%

100

100

AMPICILINA/SULBACTAM %
46% 15% 39%

80 60 40 20 0 6
100

80 60 40 20

Enterobacter spp n=1333

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

0 6 100 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

%
77% 11% 12%

80

80 60 40 20

C. freundii n=396

60 40 20 0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

17%

12%

71%

0 6 100 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

% 100

%
77% 11% 12%

Serratia spp n=443

80

80

94%
60 40 20 0 6

3%

3%
60 40 20

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

% 100

% 100
80

M. morganii n=688

80

90%
60 40 20 0 6 100

3%

7%
60 40 20

33%

19%

48%

8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

0 6 100 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

%
70% 3% 27%

%
31% 13% 56%

Providencia spp n=134

80 60 40 20 0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

80 60 40 20

0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Figura 10

ENTEROBACTERIAS PRODUCTORAS DE -LACTAMASA TIPO AMP-C INDUCIBLE Resistencia Natural (Periodo 1998-00)
%
100 80
21% 9% 70%

CEFUROXIMA

%
100 80
89%

CEFOXITINA

3%

8%

60

60 40 20
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Enterobacter spp n=1333

40 20 0

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

%
100 80
9% 1% 90%

%
100 80
81% 3% 16%

60

60 40 20
6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

C. freundii n=396

40 20 0

6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
22% 49%

%
100 80
83% 11% 6%

100 80

29%

Serratia spp n=443

60 40 20 0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

60 40 20 0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

%
100 80
56% 8% 36%

%
100 80
22% 16% 62%

M. morganii n=688

60 40 20 0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

60 40 20

0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

%
100 80
17% 2% 81%

%
100 80
6% 3% 91%

Providencia spp n=134

60 40 20 0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

60 40 20 0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

Recordar que est descrito que excepcionalmente aislamientos de Enterobacter spp y C. freundii pueden tener afectado el mecanismo de induccin de la enzima (generalmente mutaciones en la permeasa AMP-G, ver figura 6) produciendo siempre niveles basales. Estos aislamientos se comportan, en cuanto a su sensibilidad, como E. coli y por lo tanto son sensibles a casi todos los antibiticos -lactmicos (figura 11) con excepcin de los que, por sus caractersticas qumicas, no pueden ingresar a travs de la membrana externa de los bacilos gram negativos (penicilina y oxacilinas). Como hemos visto casi todas las especies de Enterobacter producen la -lactamasa cromosmica inducible tipo AMP-C pero existen excepciones como E. gergoviae, E. agglomerans y una buena parte de los E. sakazakii. En estos microorganismos la enzima se produce constitutivamente y de bajo nivel, expresando el fenotipo basal (sensibilidad similar a E. coli)9 . Figura 11

E. cloacae ATCC Fenotipo basal

GEN AMK

AMP CPD CTX

AMP

COL

INDUCCION
FOX

CTN

NIT

Un E. cloacae con expresin basal de su lactamasa cromosomica presenta un antibiograma similar al de E. coli. Se diferencia de la cepa salvaje por su sensibilidad a ampicilina, cefalotina y cefoxitina. Este fenmeno es consecuencia de mutaciones que anulan o disminuyen la capacidad de induccin del mecanismo enzimtico. En este caso el aislamiento aun conserva una pequea capacidad de induccin que se evidencia con el achatamiento del halo de cefotaxima por el disco de cefoxitina. Este fenotipo es poco comn y tiene una prevalencia menor al 1%.

A diferencia de lo que ocurre en Enterobacter spp., que tiene como nico mecanismo de resistencia natural, la produccin de la -lactamasa cromosmica tipo AMP-C, Serratia spp. presenta, adems, resistencia intrnseca propia de especie a nitrofuranos (nitrofurantoina <NTI>), tetraciclina (TET) y polipptidos (polimixina <POL> y colistin <COL>) (figuras 7 y 8). Uno de los primeros pasos de la accin de los polipptidos sobre los bacilos gram negativos, es su interaccin con las cargas negativas de los lipopolisacridos que componen la cara exterior de la membrana externa. En el caso de Serratia spp. estos lipopolisacridos se encuentran esterificados impidiendo la unin de los polipptidos y determinando la resistencia a estas drogas. En lo que respecta a la resistencia a nitrofuranos, si bien la mayora de los aislamientos se presentan sin halo de inhibicin para esta droga, hay un nmero importante que pueden dar dimetros de inhibicin pequeos y unos pocos pueden ser sensibles (ver figura 12).

Figura 12: Serratia spp (n=792) frente a Nitrofurantoina. Perodo1997-2000

% 60
50 40 30 20 10 0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Dimetro de inhibicin

La resistencia natural de las cepas salvajes de Klebsiella spp. Enterobacter spp y Serratia spp es lo suficientemente caracterstica de cada gnero como para diferenciarlos claramente entre si. Como podemos ver en la tabla 1, con muy pocos discos podemos diferenciar estos tres microorganismos. CXT es una droga muy til para este propsito, Klebsiella spp es sensible a este antibitico mientras que Enterobacter no. Serratia spp. puede presentarse como resistente o sensible a cefoxitina en el antibiograma, pero es fcilmente diferenciable de los otros dos gneros por su resistencia natural a los polipptidos (POL y COL). Cabe aclarar que muy excepcionalmente Klebsiella o Enterobacter spp presentan resistencia a estas drogas. Con respecto a la CXT, pueden existir aislamientos de Klebsiella spp que muestren resistencia a esta droga (en general por mecanismos de impermeabilidad o por adquisicin de enzimas tipo AMP-C plasmdicas). Este fenotipo particular de Klebsiella spp se diferencia de Enterobacter spp o Serratia spp. por la induccin que cefoxitina ejerce sobre la enzima cromosmica de estos timos dos gneros que no se observa para Klebsiella. Este fenmeno se manifiesta en el antibiograma por el achatamiento que aparece en el halo de inhibicin de las cefalosporinas de tercera generacin cuando se colocan prximos los discos de algn buen inductor (AMP, CTN, CXT, imipenem, etc) (ver figuras 7,8 y 11). Contrariamente Klebsiella spp. no tiene ningn mecanismo de resistencia inducible, natural o adquirido, que afecte a los antibiticos -lactmicos.

TABLA 1: Diferenciacin por antibiograma de aislamientos del grupo KES Antibiograma de aislamientos salvajes Klebsiella spp. Enterobacter spp. Serratia spp. S R R-S S S R

Cefoxitina Colistin Induccin (achatamiento del halo de inhibicin de CTX o CAZ en las proximidades de los discos de AMP, CTN, CXT, IMP, etc)*

*Recordar que cuando se realiza la lectura del halo producido por la cefalosporina de tercera generacin no se debe tener en cuenta el achatamiento producido por el inductor (ver figura 7 y 8).

En la prctica clnica un antibiograma confiable nos ayuda, en muchos casos, a confirmar la identificacin bioqumica del grmen en estudio. Hacer la validacin cruzada de ambos procesos es un ejercicio muy til, que complementa al control de calidad interno del laboratorio de microbiologa para la deteccin de errores en el trabajo cotidiano. Las resistencias naturales de las bacterias son una herramienta indispensable para esta validacin y en muchos casos nos ayuda a diferenciar entre distintos microorganismos.

Si tenemos en cuenta todo lo expuesto anteriormente con respecto a la resistencia natural de los microorganismos pertenecientes al grupo KES, no podemos dejar de confirmar las siguientes duplas inusuales de resultados de identificacin y sensibilidad: 1. Klebsiella spp sensible a carboxipenicilinas (carbenicilina o ticarcilina)Klebsiella spp Enterobacter spp o Serratia spp sensibles a ampicilina 2. Enterobacter spp o Serratia spp sensibles a cefalosporinas de 1 generacin 3. Enterobacter spp o citrobacter freundii sensible a cefoxitina 4. Serratia spp. sensible a cefuroxima, polipptidos (polimixina o colistin), nitrofuranos o tetraciclinas. En cualquiera de estos casos se deben repetir tanto la identificacin bioqumica como las pruebas de sensibilidad.

RESISTENCIA ADQUIRIDA Antibiticos -lactmicos

Cambios en el nivel de produccin de -lactamasas cromosmicas
Las cepas salvajes de los tres microorganismos de este grupo producen -lactamasas cromosmicas que le confieren un fenotipo particular. A su vez cada uno de ellos, mediante distintos mecanismos, pueden elevar marcadamente el nivel de produccin de estas enzimas. Este aumento extiende la resistencia a antibiticos -lactmicos de mayor espectro y en muchos casos a la combinacin con inhibidores de -lactamasas. Estas modificaciones incluyen la derrepresin de la -lactamasa tipo AMP-C en Enterobacter spp y Serratia spp, hiperproduccin de SHV-1 de K. pneumoniae y de K1 en K. Oxytoca.

Derrepresin de la -lactamasa tipo AMP-C.

Contrariamente a la resistencia natural, la resistencia adquirida en aislamientos del grupo KES es bastante parecida para cada uno de sus componentes. La mayor diferencia que podemos encontrar es en cuanto a la resistencia adquirida a los antibiticos -lactmicos. Todos los miembros del grupo son capaces de adquirir plsmidos con distintas lactamasas, ya sea de amplio espectro o de espectro extendido pero slo Enterobacter spp y Serratia spp pueden hiperproducir la -lactamasa cromosmica tipo AMP-C por derrepresin. Este fenmeno se produce, en la mayora de los casos, por mutaciones en los genes que codifican a la protena AMP-D que como vimos en la figura 6 es la responsable de procesar todos los metabolitos de pared celular que ingresan al citoplasma (elimina el resto anhdrido N acetilmurmico), producto del reciclaje de la misma. Algunas mutaciones en este gen pueden determinar la sntesis de una protena AMP-D inactiva o ms an pueden hacer que esta protena no se produzca. En esos casos se acumularn en el citoplasma los metabolitos de pared (anhdrido Nacetilmurmico, tri, tetra y pentapptido), el anhdrio N-acetilmurmico pentapptido libre, se unir al AMP-R y activar de esa manera la sntesis de la -lactamasa. Dado que la bacteria continuamente est reciclando su pared, en el citoplasma siempre estarn presentes los metabolitos, estos anularn la represin que AMP-R produce sobre la sntesis de la -lactamasa y siempre se estarn sintetizando grandes cantidades de enzima. A este fenmeno se lo conoce con el nombre de derrepresin y a diferencia de la induccin, donde la sntesis de la enzima vuelve a su estado basal cuando desaparece el inductor, la derrepresin es estable e irreversible est o no presente un antibitico inductor. Las mutaciones que afectan la actividad de AMP-D ocurren con una frecuencia aproximada de 1/105 a 1/107. Esto quiere decir que en toda poblacin bacteriana de cualquiera de estos microorganismos, aproximadamente una de cada 1.000.000 de clulas inducibles contiene esta mutacin en su gen amp-D y se comporta como derreprimida. Analizando el comportamiento de los grupos de drogas A), B) y C) (ver resistencia natural de Enterobacter spp y Serratia spp) sobre la poblacin total, podremos entender el significado del fenmeno denominado seleccin. Este describe la aparicin de resistencia a casi todos los antibiticos -lactmicos en Enterobacter spp, C. freundii, Serratia spp, M. morganii y Providencia spp. Los antibiticos -lactmicos del grupo A son buenos inductores lbiles a la enzima por lo que no tendrn actividad sobre la poblacin inducible ni sobre la derreprimida. La aplicacin de drogas de este grupo a la poblacin total no ejercer ningn cambio (todas sobrevivirn). En cuanto a los del grupo B (buenos inductores estables a la enzima), la enzima producida por las dos subpoblaciones (inducible y derreprimida) no logra proteger al microorganismo ya que estas drogas son resistentes a la hidrlisis producida por este tipo de -lactamasas independientemente de la cantidad sintetizada, resultando en la muerte de la poblacin inducible (mayoritaria) como de la derreprimida (minoritaria). Cuando se somete a la poblacin total a drogas del grupo C (pobres inductores, lbiles a la enzima) observamos un efecto disociado. Este tipo de antibiticos -lactmicos no logran inducir la produccin de la enzima de la poblacin mayoritaria (inducible), que por lo tanto, se mantiene en niveles basales. Esta cantidad de enzima no es suficiente para hidrolizar al antibitico que, de esta manera, provocar la muerte bacteriana. Por otro lado sabemos que estas drogas son sensibles a la hidrlisis mediada por la enzima, por lo tanto la pequea fraccin preexistente de mutantes derreprimidas, que sintetizan constitutivamente altos niveles de AMP-C (capaz de destruir al antibitico), escapa a la accin de estas drogas y se comporta como resistente. La utilizacin de drogas del grupo C sobre una poblacin bacteriana de Enterobacter spp, C. freundii, Serratia spp, M. morganii o Providencia spp. da como resultado la eliminacin de la poblacin salvaje pero no de la subpoblacin preexistente

de mutantes derreprimidas, produciendo la seleccin de estas ltimas. Si tenemos en cuenta la frecuencia de mutacin para la derrepresin (1/105 a 1/107), slo unas pocas clulas sobreviviran a la accin del antimicrobiano. Por lo tanto la seleccin de las mutantes derreprimidas no es necesariamente sinnimo de falla de tratamiento ya que este pequeo nmero de bacterias pueden ser eliminadas, en general, por el sistema inmune del paciente10. A las drogas del grupo C se las denomina buenos selectores. La seleccin de este tipo de mutantes ha sido ampliamente descripta tanto in vitro como en modelo animal e in vivo como resultado de tratamientos con C3G, AZT y en menor medida con carboxi y aciluredo penicilinas10, 11, 12, 13. El riesgo de seleccin vara considerablemente entre hospitales y depende fundamentalmente de distintos factores como el estado inmunitario del paciente, la enfermedad de base, el sitio de la infeccin, etc.. Por todo esto, cuando se esta frente a infecciones producidas por este tipo de microorganismos, y se va a aplicar un tratamiento basado en la utilizacin de drogas pertenecientes al grupo C, es conveniente hacer un seguimiento muy cercano de la evolucin del paciente, y ante el menor indicio de falla en el tratamiento, recuperar nuevamente el microorganismo y repetir las pruebas de sensibilidad para descartar la seleccin de la mutante resistente. Cabe destacar que los carbapenemes conservan su actividad tanto sobre las cepas salvajes, con expresin inducible de la -lactamasa AMPC, como sobre las mutantes derreprimidas. Este fenmeno se debe a que estas drogas son zuiteriones, por lo que tienen una muy alta penetracin a travs de la membrana externa de los bacilos gram negativos y adems son estables a la hidrlisis mediada por la enzima AMP-C14. Varios autores recomiendan evitar, si es posible, la utilizacin de drogas del grupo C, (por ej. cefalosporinas de 3era generacin) en el tratamiento de infecciones severas ocasionadas por microorganismos productores de CCI, y reemplazarlas por carbapenemes o quinolonas, excepto en infecciones urinarias no complicadas donde el riesgo de seleccin es mnimo3. Las cefalosporinas de cuarta generacin son bastante estables a la hidrlisis mediada por la -lactamasa tipo AMP-C y constituyen una opcin intermedia entre las cefalosporinas de tercera generacin y los carbapenemes para el tratamiento de cepas productoras de este tipo de enzimas. Existen varios trabajos que sugieren la utilidad de cefalosporinas de cuarta generacin en el tratamiento de infecciones serveras causadas por cepas salvajes que expresan su AMP-C en forma inducible. En estos trabajos se muestra como la seleccin de mutantes derreprimidas es mucho menos frecuente que cuando se utilizan cefalosporinas de tercera generacin10, 15. Ms an cefepime y cefpirome se muestran activos in vitro frente a aislamientos de enterobacterias productoras de AMP-C, resistentes a cefalosporinas de tercera generacin (mutantes derreprimidas) (Figura 13)16,17. Hay trabajos que prueban el xito teraputico de las cefalosporinas de cuarta generacin en estos casos18. Este punto est bastante discutido ya que la utilizacin de cefepime en cepas sensibles pero resistentes a cefalosporinas de tercera generacin selecciona con relativa facilidad mutantes de permeabilidad que elevan las CIMs de las cefalosporinas de cuarta generacin a niveles superiores a los puntos de corte de resistencia19, 20, 21.

Figura 13

E. cloacae derreprimido
ANTIBIOGRAMA
FEP

CAC

AMC

FOX

FOX: 6mm CTX: 6mm CTC: 8mm CAZ: 9mm CAC: 9mm FEP: 23mm AMC: 6mm AMS: 6mm

MINIMA INHIBICION (HUEVO)

CTX CTC AMS CAZ CTX

INHIBICION:
(HUEVO)

AMC

MINIMA INHIBICION (HUEVO)

AMS-CTX AMS-CAZ AMC-CAZ (mnimo)

CAZ

En conclusin debera evitarse el uso de cefalosporinas de tercera generacin en infecciones severas causadas por Enterobacter spp y Serratia spp (y los otros productores de la enzima tipo AMP-C cromosmica inducible). Por otra parte parece seguro utilizar cefalosporinas de cuarta generacin en cepas inducibles (sensibles a cefalosporinas de tercera generacin) pero no en cepas con AMP-C derreprimida. Para stas ltimas, la nica opcin dentro de los antibiticos -lactmicos son los carbapenemes. La resistencia a carbapenemes en toda la familia Enterobacteriaceae continua siendo sumamente inusual. A pesar de esto, como sucedi en otras partes del mundo, se han comenzado a recuperar en Argentina aislamientos con resistencia a estas drogas. A nivel mundial, los fenmenos de disminucin de la acumulacin de drogas en el periplasma (impermeabilidad y eflujo) y la presencia de -lactamasas fueron los mecanismos de resistencia ms frecuentemente involucrados. En nuestro pas an no se han detectado carbapenemasas en enterobacterias aunque se han descripto este tipo de enzimas en Acinetobacter 22, 23. Si bien la derrepresin de la -lactamasa tipo AMP-C no confiere per se resistencia a los carbapenemes, la combinacin de este mecanismo con el de impermeabilidad de la membrana externa puede determinar resistencia a este tipo de drogas 24, 25. Tambin se han descrito aislamientos de Enterobacter aerogenes con resistencia a imipenem por alteracin de la permeabilidad de la membrana externa solamente26, 27. La resistencia enzimtica a los carbapenemes en Serratia marcescens se encontr mediada por distintas carbapenemasas. IMP-1, una metaloenzima plasmdica aislada en Japn inicialmente de P. aeruginosa, se encontr posteriormente en aislamientos clnicos de Serratia marcescens y Klebsiella pneumoniae28. Otras no metaloenzimas cromosmicas fueron recuperadas en casos aislados de enterobacterias resistentes a carbapenemes. Sme-1 se encontr en dos Serratia marcescens en Londres en el ao 198229. Recientemente se ha detectado una enzima del mismo tipo en un

aislamiento de Klebsiella pneumoniae de EEUU30. IMI-1 fue recuperada de un brote de Enterobacter cloacae en un hospital de California, EEUU, en el ao 198431 y NMC-A provino de un nico aislamiento de Enterobacter cloacae aislado en Paris en199032. En general las diferencias fenotpicas entre las metaloenzimas (IMP-1) y las serin protenas (Sme-1, IMI-1 y NMC-A) son varias: I) Las metaloenzimas confieren similares niveles de resistencia para imipenem y meropenem mientras que las serin proteinas afectan ms a imipenem que a meropenem; II) Las primeras no se inhiben con cido clavulnico y las segundas si; III) Las metaloenzimas no tienen actividad sobre aztreonam y las serin protenas hidrolizan eficientemente este antibitico33. Es sumamente importante tener en cuenta que la resistencia a carbapenemes en enterobacterias se presenta slo excepcionalmente y que de ninguna manera se debe informar sin antes haber realizado la correspondiente confirmacin. Dada la diseminacin de resistencia a cefalosporinas de tercera generacin en enterobacterias de Argentina, los carbapenemes son frecuentemente la nica alternativa teraputica disponible. Por lo tanto se hace crtico que cualquier aislamiento clnico de enterobacterias con estas caractersticas sea enviado a un laboratorio de referencia para su caracterizacin y de esa manera se puedan establecer medidas rpidas para evitar su diseminacin. Dentro de este grupo de microorganismos hay variaciones interespecie en cuanto a las caractersticas conferidas por la presencia de la -lactamasa cromosmica inducible (CCI). Por ejemplo los niveles de resistencia de las mutantes derreprimidas de Enterobacter spp. y Citrobacter freundii son 10 veces superiores a los observados en Serratia, Providencia y Morganella spp.

hiperproduccin de SHV-1 de K. pneumoniae y de K1 en K. oxytoca.

Las -lactamasas SHV-1 y K1 se expresan en forma constitutiva de bajo nivel en K. pneumoniae y K. oxytoca, respectivamente. Estas dos enzimas, en cepas salvajes, confieren una resistencia muy similar, afectando slamente a las aminopenicilinas (AMX y AMP) y a las carboxipenicilinas (CAR y TIC). A diferencia de lo que ocurre con la lactamasa cromosmica tipo AMP-C de Enterobacter spp o Serratia spp, SHV-1 y K1 no son inducibles, por lo tanto no se puede derreprimir. El aumento en los niveles de enzima producido se alcanza por un mecanismo distinto a la derrepresin y se denomina hiperproduccin. La hiperproduccin de SHV-1 en K. pneumoniae es muy poco frecuente. Cuando se produce, en general, es debida a la existencia de varias copias del gen dentro del cromosoma o cambios en el promotor del gen que codifica para la enzima1, 34. Este ltimo fenmeno asociado a disminucin de la permeabilidad de la membrana externa puede ocasionar un aumento considerable de la CIM para ceftazidima (CAZ) y piperacilinatazobactam pero no del resto de las cefalosporinas de tercera generacin o del aztreonam, pero es poco frecuente35. La diferencia principal entre SHV-1 de K. pneumoniae y K1 (OXY-1 y OXY-2) de K. oxytoca es la actividad de -lactamasa de espectro extendido (BLEE) que ubica a esta ltima dentro del grupo 2be de Karen Bush36. Cuando OXY-1 u OXY-2 se hiperproducen confieren al aislamiento un fenotipo de resistencia a C3G y monobactames muy particular, son resistentes a todas la penicilinas con CIMs > 64 g/ml, a CXM y AZT (CIMs> de 32 g/ml) y resistentes o moderadamente resistentes a CTX y CRO (CIMs de 4 a 32 g/ml) pero totalmente sensibles a CAZ37,38. Adems tampoco confieren resistencia a CXT y a los carbapenemes. La hiperproduccin de esta enzima est provocada por mutaciones en el promotor del gen que codifica para la -lactamasa37,39,40. Como consecuencia de estas mutaciones la cantidad de enzima producida aumenta en general ms de 100 veces. Este tipo de mutantes aparecen con una frecuencia de 10 al 20% en Europa1,3,6 y se han

comunicado selecciones intratratamiento con C3G (CTX y CRO) pero con una frecuencia mucho menor que para Enterobacter spp. Tanto SHV-1 como K1 son sensibles a los inhibidores c. clavulnico, sulbactam y tazobactam, pero en los aislamientos de K. oxytoca que presentan hiperproduccin de K1 la combinacin -lactmico/inhibidor de -lactamasa tiene muy baja actividad3.

Adquisicin de -lactamasas plamdicas

Este tipo de enzimas se encuentran generalmente codificadas por elementos mviles tales como plsmidos, transposones o integrones. -lactamasas de los cuatro tipos moleculares que componen la clasificacin de Ambler (A, B, C y D) han sido descriptas en plsmidos. Sin embargo, las ms ampliamente distribudas son las enzimas de espectro ampliado (grupo 2b de Karen Bush) TEM-1, TEM-2, SHV-1 y sus derivadas de espectro extendido (grupo 2be de Karen Bush) TEM-3, SHV-2, etc, todas ellas pertenecen a la clase A de Ambler. Existen diferentes estructuras de DNA (plsmidos, transposones e integrones) que intervienen en la diseminacin de mecanismos de resistencia a los antimicrobianos. Los plsmidos tienen la capacidad de transferirse entre bacterias de la misma especie o entre distintas especies y gneros41. Esto los convierte en excelentes herramientas para la diseminacin de resistencias. En general los plsmidos, sobre todo en aislamientos de Argentina, codifican para ms de un mecanismo de resistencia. Este hecho determina que en un evento de transferencia, la bacteria receptora adquiera en bloque todos los mecanismos de resistencia que porta dicho plsmido. Los transposones son fragmentos de DNA que pueden escindirse de su ubicacin en la estructura de DNA que los contiene (plsmidos o cromosomas) y se puede integrar en otra estructura de DNA42. Por ejemplo un transposon puede desprenderse de un plsmido e integrarse al cromosoma bacteriano o viseversa. Este mecanismo da la posibilidad, por ejemplo, que mecanismos de resistencia cromosmicos que no son transferibles pasen a un plsmido y a travs de este a otra bacteria. Un ejemplo de este fenmeno lo constituyen las -lactamasas tipo AMP-C que tienen codificacin cromosmica en Enterobacter spp, C. freundii, Serratia spp, M. morganii y Providencia spp, pero que con la ayuda de transposones pudieron pasar a plsmidos y a travs de estos alcanzar gneros bacterianos como Klebsiella spp. donde no se las encuentra naturalmente. Adems los transposones pueden ser conjugativos por si mismos43. Los integrones son elementos de DNA que pueden estar en el cromosoma bacteriano, dentro de plsmidos o incluso formar parte de transposones44,45,46. Estas estructuras se comportan como sitios calientes de insercin de cassettes de DNA47. Estos cassettes de DNA pueden codificar para mecanismos de resistencia a antibiticos48,49. Cualquiera de las estructuras de DNA vistas anteriormente que posea un integrn, tendr potencialmente la capacidad de incorporar secuencialmente genes de resistencia a distintos antimicrobianos. Todos estos mecanismos de transferencia de genes son particularmente comunes en las enterobacterias y constituyen una de las formas ms frecuentes de adquisicin de resistencia a los antimicrobianos dentro de los miembros de esta familia.

-Lactamasas de espectro ampliado (BLEA)

TEM-1, TEM-2 y SHV-1 son las BLEA plasmdicas ms comnmente distribudas en bacilos gram negativos y pertenecen al grupo 2b del esquema de Bush. Las BLEAs hidrolizan eficientemente aminopenicilinas (AMP y AMX) y carboxipenicilinas (CAR y TIC), esta hidrlisis se traduce en resistencia fenotpica a esas drogas en la

mayora de los casos. La resistencia a otros substratos como las cefalosporinas de primera generacin (CTN, cefaloridina, etc), las acilureidopenicilinas (PIP y MEZ) y la combinacin de antibiticos -lactmicos con inhibidores de -lactamasas (AMS, amoxicilina-clavulnico <AMC>, ticarcilina-clavulnico <TIM> y piperacilina-tazobactam <PIT>), slo se observa cuando este tipo de enzimas se hiperproducen. Autores como Livermore3 recomiendan evitar el uso de cefalosporinas de 1 generacin o acilureidopenicilinas en microorganismos productores de este tipo de BLEA, sensibles a estas drogas, a no ser que se trate de infecciones bajas, no complicadas, del tracto urinario donde la enzima no alcanza a protegerlos de la elevada concentracin de antimicrobiano. Prcticamente todos los aislamientos de Klebsiella pneumoniae producen cromosmica y constitutivamente bajos niveles de una BLEA (SHV-1) y los de K. oxytoca una BLEE (K1). Esto hace muy difcil establecer la prevalencia de BLEAs plasmdicas en este gnero ya que la resistencia conferida por este tipo de enzimas es muy similar a su resistencia natural. Varios autores demuestran que la presencia de BLEAs plasmdicas en estas dos especies es muy rara. Segn Leung y col, ninguna de 22 K. oxytoca y slo 5 de 80 K. pneumoniae presentan una -lactamasa plasmdica1. Vale aclarar que de las 5 K. pneumoniae dos eran productoras de BLEE. Cuando K. pneumoniae adquiere un plsmido con una BLEA, en general se eleva mucho el nivel de resistencia a amino y carboxipenicilinas. El c. clavulnico, sulbactam y tazobactam son buenos inhibidores de este tipo de enzimas, pero el xito de la inhibicin vara ampliamente con el nivel de BLEA producido y el -lactmico a ser protegido. Las combinaciones ms efectivas son piperacilina/tazobactam y cefoperazona sulbactam, esto se debe a que combinan dbiles substratos, fciles de proteger como piperacilina y cefoperazona, con potentes inhibidores. El c. clavulnico tambin es un potente inhibidor, pero tiene la desventaja que esta asociado con penicilinas muy lbiles a este tipo de enzimas, por lo tanto difciles de proteger, como la amoxicilina y la ticarcilina. Las cefalosporinas de tercera y cuarta generacin as como tambin los monobactames, cefamicinas y carbapenemes, que son resistentes a estas -lactamasas conservan la actividad frente a bacterias productoras de BLEAs. La importancia de la presencia de BLEAs plasmdicas en Enterobacter spp y Serratia spp es muy discutible. Estos gneros son naturalmente resistentes a ampicilina por su lactamasa cromosmica tipo AMP-C, tengan o no una BLEA no cambia mucho la situacin en cuanto a esta droga. Estas enzimas toman importancia cuando se analiza la resistencia a carboxipenicilinas o a acilureidopenicilinas que son activas sobre las cepas salvajes de estos dos gneros. La presencia de BLEA puede afectar la actividad de estas drogas, siendo las carboxipenicilinas las ms comprometidas. En la figura 14 se muestra la distribucin de los dimetros de inhibicin de piperacilina frente a aislamientos de Enterobacter spp y Serratia spp recuperados por la red WHONET-Argentina en los ltimos cuatro aos. Analizando los grficos podemos concluir que la resistencia a piperacilina por la presencia de BLEAs plasmdicas como nico mecanismo en los gneros Enterobacter y Serratia es muy baja. La prueba de esto es que, eliminando del anlisis las cepas que tienen resistencia a cefalosporinas de tercera generacin, desaparece casi toda la resistencia a piperacilina. Esto indica que dicha resistencia est producida probablemente por la derrepresin de AMP-C o la produccin de -lactamasas de espectro extendido en combinacin o no con una BLEA. Existen otras -lactamasas plasmdicas de espectro ampliado no relacionadas a TEM y SHV, pero su prevalencia es mucho menor, se trata de enzimas de las familias PSE, OXA y otras ms raras como la HMS-1, ROB-1, SAR-1, etc. Todas esta enzimas tienen perfil de substratos muy similar al de TEM-1.

Figura 14

Serratia spp. (n=792) y Enterobacter spp. (n=2138) frente a Piperacilina 1997-2000

25

Distribucin de los dimetros de inhibicin de piperacilina frente a Serratia spp %

35 30

Distribucin de los dimetros de inhibicin de piperacilina frente a Enterobacter spp

20
25

15

20 15 10

10

5
5

0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34

10

12

14

16

18

20 22

24

26

28

30

32

34

25

Distribucin de los dimetros de inhibicin de piperacilina frente a Serratia spp sensibles a cefalosporinas de 3a generacin

35 30

Distribucin de los dimetros de inhibicin de piperacilina frente a Enterobacter spp sensibles a cefalosporinas de 3a generacin %

20 25 15 20 15 10 5 5 0 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 0

10

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

30

32

34

-lactamasas de espectro extendido (BLEE)

Las BLEE son enzimas que confieren resistencia a penicilinas, cefalosporinas de primera, segunda, tercera y cuarta generacin, y monobactames. Escapan a su accin, las cefamicinas (cefoxitina, cefotetan, etc) y los carbapenemes (imipenem y meropenem). En EEUU y Europa, estas enzimas suelen ser derivadas de las -lactamasas de amplio espectro ms comunes como las tipo TEM-1 y TEM-2 o SHV-13,50,51,52,53,54,55,56 .Slo unas pocas mutaciones en el gen que codifica a la enzima, convierten una BLEA en una BLEE. Estas mutaciones amplan el espectro de las enzimas extendindolo a las nuevas cefalosporinas y los monobactames, pero generalmente se acompaan de una prdida importante de su eficiencia hidroltica. Este hecho da como resultado en la mayora de los casos niveles de resistencia muy bajos que no siempre elevan la CIM de estas drogas por encima del punto de corte de resistencia recomendado por el NCCLS, complicando su deteccin en el laboratorio clnico. En los ltimos aos se estn realizando enormes esfuerzos para encontrar una metodologa capaz de detectar desde el laboratorio este tipo de resistencia. Esto se debe a que frecuentemente, se han observado fallas de tratamiento con cefalosporinas de tercera generacin (C3G) de microorganismo productores de BLEE ha pesar de la sensibilidad in vitro mostrada por estas drogas. Debido a esto se acepta internacionalmente que la presencia de una BLEE en cualquier microorganismo determina que el mismo se informe como resistente a las penicilinas, monobactames y todas las cefalosporinas inclusive las de tercera y cuarta generacin independientemente de su sensibilidad in vitro3. Todo esto llevo al NCCLS a modificar los puntos de corte para C3G en el ao 1997, hacindolos mucho ms exigentes, pero esta modificacin slo alcanz a Escherichia coli y Klebsiella spp. quedando pendiente el resto de las enterobacterias que deben ser interpretadas con los puntos de corte incluidos en la tabla general de las normas NCCLS para la interpretacin de las pruebas de sensibilidad por difusin y dilucin (ver tabla 2)60

TABLA 2: Puntos de corte para deteccin de BLEE en E. coli y Klebsiella spp. y deteccin de resistencia a cefalosporinas de 3 generacin en microorganismos productores de -lactamasa tipo AMP-C inducible Microorganismos productores de AMP-C E. coli y Klebsiella spp inducible: Enterobacter spp, C. freundii, Antibiticos Serratia spp, M. morganii y Providencia spp. Sospechoso de BLEE Sensible Cefpodoxima < 22 mm > 21 mm
Ceftazidima Aztreonam Cefotaxima Ceftriaxona < 22 mm < 27 mm < 27 mm < 25 mm > 18 mm > 22 mm > 23 mm > 21 mm

En nuestro pas la realidad es muy particular, aproximadamente las dos terceras partes de la resistencia mediada por BLEE en Klebsiella spp. se debe a la produccin de CTX-M257. Esta enzima es una fuerte cefotaximasa perteneciente al grupo 2be de la clasificacin de Karen Bush con muy poca actividad sobre CAZ y AZT, inhibible por c. clavulnico, sulbactam y tazobactam . Esta enzima slo fue descripta en Argentina y algunas cepas de Paraguay y Uruguay. Se encuentra generalmente codificada en megaplsmidos transferibles de alto peso molecular (>120 kb)58. En casi la totalidad de los casos, estos plsmidos codifican, adems para la sntesis de dos enzimas inactivantes de aminoglucsidos (AAC(6)I y AAC(3)II) y otros mecanismos de resistencia. La presencia de estas dos enzimas confieren a los aislamientos un perfil de resistencia caracterstico: resistencia neta a gentamicina (casi siempre sin halo de inhibicin) y sensibilidad variable a amicacina con halos de inhibicin alrededor de los 14 mm. Fenotpicamente la resistencia mediada por CTX-M-2 vara ampliamente segn la especie bacteriana en que se encuentre y segn el aislamiento en particular. La presencia de esta -lactamasa en distintos aislamientos de Klebsiella pneumoniae confiere niveles de resistencia heterogneos que van desde la franca resistencia a CTX y CAZ, hasta cepas sensibles a CAZ y con resistencia intermedia a CTX. PER-2 es otra BLEE propia de nuestro pas, a diferencia de CTX-M-2 tiene fuerte actividad ceftacidimasa y es el segundo miembro de una nueva familia de enzimas. El otro miembro de la familia, PER-1, fue descripto en Turka y muestra similar perfil de substratos, hidroliza muy eficientemente CAZ y AZT y en menor medida CTX, cefepime (FEP) y ceftibutem (CTB). La actividad sobre ceftibutem diferencia PER-2 de la mayora de las BLEE. La resistencia a las cefalosporinas de tercera generacin en aislamientos productores de esta enzima, es inequvoca, superando los puntos de corte tanto para CAZ (CIMs >128 g/ml) como para CTX (CIM >32 g/ml), su prevalencia en Klebsiella spp. es de aproximadamente el 12%. Hasta la actualidad se encontr codificada siempre en plsmidos de alto peso molecular (> 120 kb) transferibles por conjugacin. PER-2 presenta un perfil de inhibicin muy particular, adems de ser inhibida por c. clavulnico, sulbactam y tazobactam, sufre una fuerte inhibicin por CXT e IMP que se refleja en el antibiograma al colocar prximos un disco de C3G y uno de CXT o IMP. La inhibicin enzimtica producida por estas drogas agranda el halo de la C3G, observndose un efecto similar al producido por el disco de amoxicilina-c. clavulnico o el de ampicilinasulbactam sobre la CTX con la mayora de las BLEE (efecto huevo). En nuestro pas las BLEE tipo SHV representan aproximadamente el 21% de las enzimas hidrolizantes de C3G encontradas en Klebsiella spp. Los miembros de esta

familia que se describieron en nuestro medio fueron SHV-2 (11%) y SHV-5 (10%). Hasta el momento no se han detectado en Argentina BLEE pertenecientes a la familia TEM, hecho que resulta muy extrao, teniendo en cuenta la amplia difusin que tiene TEM-1 en la familia Enterobacteriaceae 57. Todas las BLEE plasmdicas detectadas en Klebsiella spp. son sensibles a la inhibicin por c. clavulnico, sulbactam y tazobactam. Pero el fenotipo observado en productores de BLEE cuando se ensayan combinaciones de antibiticos -lactmicos con inhibidores de -lactamasas, vara considerablemente entre individuos de la misma especie y sobre todo depende de la cantidad de enzima sintetizada. La actividad de las combinaciones de antibiticos -lactmicos con inhibidores de -lactamasas en los aislamientos clnicos de K. pneumoniae productores de BLEE de Argentina, es muy pobre. Menos del 5% de los mismos presenta sensibilidad a ampicilina-sulbactam, amoxicilinaclavulnico o ticarcilina-clavulnico. La actividad de las combinaciones ms potentes, piperacilina tazobactam y cefoperazona-sulbactam es un poco ms alta, con porcentajes de actividad que rondan el 25% de las cepas con resistencia a cefalosporinas de tercera generacin. Como ya hemos visto, la presencia de una BLEE en enterobacterias puede determinar falla de tratamiento de infecciones severas con cefalosporinas de tercera y cuarta generacin y monobactames a pesar de parecer sensibles por el antibiograma. La correcta deteccin de este mecanismo de resistencia en los aislamientos clnicos es, por lo tanto, una gran responsabilidad del laboratorio de microbiologa. El nivel de dificultad para detectar este mecanismo de resistencia depende especialmente del tipo de -lactamasa que se trate. Es particularmente difcil en EEUU o Europa donde predominan las BLEE tipo TEM o SHV. Esto se debe a la baja actividad hidroltica que este tipo de enzimas tienen sobre las cefalosporinas de tercera y cuarta generacin. Este hecho determina que los aislamientos productores puedan mostrar sensibilidad a estas drogas en el antibiogramas a pesar de poseer el mecanismos de resistencia. En la actualidad existen una gran variedad de mtodos para la deteccin de -lactamasas de espectro extendido en enterobacterias. Hay mtodos basados en la actividad hidroltica de estas enzimas. Dentro de estos el ms sencillo es el que se basa en el antibiograma. La actividad hidroltica de estas enzimas sobre las cefalosporinas de espectro extendido y los monobactames determinan, en general, la resistencia a estas drogas en el antibiograma (ver figura 15). Como vimos antes, esto no siempre es as ya que existen BLEE con pobre actividad hidroltica que dan CIMs bajas o dimetros de inhibicin grandes para una o varias de las C3G o monobactames que no siempre presentan resistencia neta en el antibiograma (por ej. ceftazidima en la figura 15). Teniendo en cuenta este hecho y despus de muchos estudios, el NCCLS proporcion nuevas recomendaciones con respecto a los puntos de corte a utilizar en la deteccin de BLEE en E. coli, K. pneumoniae y K. oxytoca (ver tabla 2). Estos nuevos puntos de corte son mucho ms exigentes y aumentan considerablemente el nivel de deteccin de aislamientos clnicos con este tipo de enzimas. Las drogas recomendadas son: cefotaxima, ceftriaxona, ceftazidima, cefpodoxima y aztreonam. Cuanto ms de estas drogas se utilicen en el antibiograma mayor ser la probabilidad de detectar cepas productoras de bajos niveles de BLEE. Estudios realizados en nuestro pas indican que los mejores detectores de estas enzimas son los discos de cefotaxima, ceftriaxona o cefpodoxima. Contrariamente a lo observado en EEUU, Ceftazidima y aztreonam presentan muy pobre sensibilidad en la deteccin de BLEE en Argentina77

Figura 15

Klebsiella pneumoniae CTX-M-2

CAC

Referencias: POD, cefpodoxima; CAZ, ceftazidima; CTX, cefotaxima; CRO, ceftriaxona; AZT, aztreonam; CAC, ceftazidima/ac. clavulnico; CTC, cefotaxima/ac. clavulnico

CTC

CAZ

POD= 06 mm CTX= 09 mm AZT= 14 mm

CRO= 08 mm CAZ= 19 mm CAC= 25mm

P0D

CTX

AZT

CTC= 25 mm Delta CAC-CAZ= 6 mm Delta CTC-CTX= 17 mm

CRO

DETECCION de BLEE Antibiograma

Otro mtodo basado en la actividad hidroltica de estas enzimas es el microbiolgico tridimensional. La metodologa es la siguiente: se colocan los discos de las cefaloporinas de tercera generacin en una placa de agar previamente isopada con la cepa en estudio (mtodo directo) con una cepa patrn como el E. coli ATCC 25922 sensible a las cefalosporinas de tercera generacin (mtodo indirecto). Se coloca el disco de la C3G a ensayar e inmediatamente se realiza un corte en el agar con bistur estril a una distancia de aproximadamente 5 mm por encima del disco. Posteriormente se toma con el bistur una porcin del cultivo bacteriano en estudio y se procede a realizar otro corte en el agar aproximadamente 5 mm por debajo del disco de la C3G. Se debe tener especial cuidado de no separar el agar con el corte. La prueba se incuba 24 hs. El antibitico del disco difunde en forma radial. Por un lado se encuentra con el corte realizado con bistur estril y contina difundiendo produciendo un radio de inhibicin determinado. Por otro lado se encuentra con el corte hecho con bistur inoculado con la cepa en estudio. Si el aislamiento no produce BLEE el antibitico seguir su camino de la misma manera que lo hizo cuando atraves el otro corte (con bistur estril), dando el mismo radio de inhibicin. Si la cepa en estudio produce una BLEE, el antibitico que atraviesa el corte se encuentra con una pared de enzima que lo hidroliza, por lo que sigue su camino hidrolizado (sin actividad antibitica), disminuyendo el tamao del radio de inhibicin (Ver figura 16). Dicha disminucin es indicativa de produccin de -lactamasa de espectro extendido. Este mtodo es til sobre todo en aislamientos productores de grandes cantidades de BLEE o con enzimas de alta actividad hidroltica. En estos casos probablemente no haya dificultades en la deteccin ya que conferirn al aislamiento resistencia neta en el

antibiograma a alguna de las cefalosporinas de espectro extendido o monobactames. Como conclusin este mtodo es de dudosa utilidad clnica, debido a su escasa sensibilidad para detectar -lactamasas de espectro extendido que confieren moderados o bajos niveles de resistencia a las cefalosporinas de tercera generacin.

Figura 16

Klebsiella pneumoniae CTX-M-2

METODO DIRECTO METODO INDIRECTO

K. pneumoniae CTX-M-2

E. coli ATCC 25922

Corte en el agar

Corte en el agar con K. pneumoniae CTX-M-2

Referencias: CRO, ceftriaxona; CAZ, ceftazidima. Con flechas blancas cortadas se observa el radio de inhibicin hacia el corte sin cepa problema y con flechas blancas continuas se observa el radio de inhibicin afectado por el corte con cepa problema productora de BLEE. Como este aislamiento es productor de CTX-M-2 (con fuerte actividad hidroltica sobre cefotaxima y ceftriaxona), el mtodo da resultado positivo para ceftriaxona y no para ceftazidima que es dbilmente hidrolizada por esta -lactamasa.

DETECCION de BLEE Mtodo tridimensional

Por otro lado contamos con los mtodos que se basan en la sensibilidad de Las BLEE a la inhibicin con ac. clavulnico, sulbactam y tazobactam. Los mtodos que se basan en esta caracterstica son:

Doble disco: se colocan en el antibiograma los discos de cefalosporinas de tercera generacin prximos a un disco de amoxicilina-clavulnico o ampicilina-sulbactam. Si la cepa en estudio produce una BLEE, se observar una deformacin del halo producido por la cefalosporina de tercera generacin (ver figura 17). Este fenmeno es conocido como efecto huevo y toma distintas formas dependiendo del dimetro de inhibicin de las drogas ensayadas, la capacidad inhibitoria del inhibidor sobre la BLEE en cuestin y sobre todo de la distancia a la que son colocados los discos. La distancia recomendada para la colocacin de los discos es variable entre distintos autores, en general se acepta que esta puede ser de 20 a 30 mm entre los centros de cada disco. Una distancia menor a 20 mm mejora la visualizacin del efecto huevo en cepas que tienen dimetros muy pequeos para las cefalosporinas de tercera generacin y para el AMS o AMC (ver figura 18). En realidad en estos aislamientos no sera necesario detectar la BLEE porque las cepas ya son claramente resistentes a las C3G. Por otra parte distancias entre los discos menores de 20 mm pueden dificultar la visualizacin del efecto huevo en cepas con bajos niveles de resistencia, debido a la superposicin de halos (ver fila 1 columna 3 de la figura 18). En este tipo de cepas es donde se hace indispensable la

deteccin de la BLEE. A una distancia mayor que 30 mm puede no producirse el efecto huevo debido a las bajas concentraciones del inhibidor y la cefalosporina de tercera generacin en la interseccin de los gradientes de difusin, aunque la cepa sea productora de BLEE (ver fila 5 figura 18). Como se puede ver en la figura 18 entre 20 y 25 mm se detectaron correctamente la BLEE en las 3 cepas evaluadas (alto, medio y bajo nivel de resistencia a las C3G). El efecto observado se debe a que el inhibidor de -lactamasa contenido en los discos difunde radialmente generando un gradiente continuo de concentraciones decrecientes alrededor del disco de AMC o AMS. Las bacterias que se encuentren en la zona circundante a esos discos tendrn la BLEE inhibida hasta la distancia en la que la concentracin de ac. clavulnico haya disminuido lo suficiente como para no seguir produciendo inhibicin de la enzima. Por otra parte la cefalosporina de tercera generacin tambin difundir generando un gradiente de concentraciones. La interaccin de estos dos gradientes es la que determina la deformacin del halo de inhibicin (Ver figura 17). Cualquier aislamiento que presente este efecto en el antibiograma debe ser considerado productor de BLEE e informado resistente a todas las penicilinas, cefalosporinas y monobactames aunque parezcan sensibles por el antibiograma.

Figura 17

DETECCIN D E -LACTAM ASAS DE ESPECTRO EXTEN DID O M ETODO DE DOBLE D ISCO

Bacterias con BLEE no inhibida por el clavul nico del AM C D im etros esperados para una K. pneum oniae sin BLEE

Bacterias con BLEE inhibida por el clavul nico del AM C sensibles a CTX

Bacterias con BLEE inhibida por el clavul nico del AM C sensibles a CAZ

Bacterias con BLEE inhibida por el ac. clavul nico del A MC, pe ro enfrentadas a bajas conce ntra ciones de CTX y CAZ Referencias: CTX, c efotaxim a; A MC, amoxicilina-ac. c lavulnic o; CAZ, ceftaz idima. En crculos negros cortados se pue de observa r los dimetros de inhibicin reales producidos por los a ntibiticos, e n crculos blancos c orta dos los dim etros de inhibicin tericos para una K. pneum oniae sin BLEE. La interseccin de los crculos blancos cortados determ ina las zonas de la placa de agar donde las c oncentraciones de ac. clavul nico y ce fota xim a (o ceftaz idima) son lo suficientemente altas como para: e n el ca so del a c. cla vulnico inhibir la BLEE que produce esta cepa y en el c aso de la cefotaxima o ce fta zidima inhibir el desarrollo de la mism a. En lneas generale s, la form a de las interaccione s depender del tamao real de la z ona de inhibic in de los antibiticos probados, de la c apacidad inhibitoria del inhibidor utiliz ado y fundam enta lm ente de la distanc ia entre los discos

Figura 18

Sensibilidad en funcin de la distancia entre los discos frente a aislamientos con distinto nivel de resistencia
K. pneumoniae CTX-M-2
Resistencia de Alto nivel Resistencia de nivel medio

Deteccin de BLEE por el mtodo de doble disco

K. pneumoniae SHV-2

K. pneumoniae SHV-2
Resistencia de bajo nivel

Distancia entre los discos de cefalosporinas de tercera generacin y el disco de amoxicilina-ac. clavulnico

15 mm

CTX 30

CTX 30

CTX 30

AMC 30

AMC 30

AMC 30

CAZ 30

CAZ 30

CAZ 30

20 mm

CTX 30

CTX 30

CTX 30

AMC 30

AMC 30

AMC 30

CAZ 30

CAZ 30

CAZ 30

25 mm

CTX 30

CTX 30

CTX 30

AMC 30

AMC 30

AMC 30

CAZ 30

CAZ 30

CAZ 30

CTX 30

CTX 30

CTX 30

30 mm

AMC 30

AMC 30

AMC 30

CAZ 30

CAZ 30

CAZ 30

CTX 30

CTX 30

CTX 30

35 mm

AMC 30

AMC 30

AMC 30

CAZ 30

CAZ 30

CAZ 30

 Mtodo epsilomtrico (E-test): Este mtodo se basa en una tira de material plstico que contiene distintas cantidades de un determinado antibitico a lo largo de la tira. Cuando son colocadas en una placa de agar, producen un gradiente elptico de concentraciones que determina una elipse de inhibicin en vez de un halo circular como en el antibiograma por discos. La tira esta graduada en valores de CIM y el valor de la misma se lee en el punto donde la elipse corta la tira. Existen tiras especiales para la deteccin de BLEE en enterobacterias59. Estas tiras estn divididas en dos partes, de uno de sus extremos hacia el medio, contienen concentraciones decrecientes de ceftazidima o cefotaxima y desde el otro extremo hacia el centro, concentraciones decrecientes de la correspondiente cefalosporina de tercera generacin ms una cantidad constante de ac. clavulnico. Si la cepa en estudio posee una BLEE, la CIM de la cefalosporina de tercera generacin sola ser mucho mayor que la CIM de la cefalosporina de tercera generacin en presencia de ac. clavulnico (ver figura 19). Una relacin igual o mayor a 8 entre ambas es indicativo de presencia de BLEE. Segn estudios preliminares la nica tira que dio resultados aceptables en la deteccin de BLEE en nuestro pas fue la que contiene cefotaxima y cefotaxima clavulnico. Esto se debe a la prevalencia de CTX-M-2 que hidroliza muy eficientemente cefotaxima y no ceftazidima (ver figura 20).

Figura 19

Deteccin de -lactamasas de espectro extendido por mtodo de E-test Klebsiella pneumoniae productora de BLEE CTX-M-2 de alto nivel

Referencias: ceftacidima, TZ; ceftacidima/ac. clavulnico, TZL. En este caso la relacin de CIMs entre TZ (2 g/ml) y TZL (0,25 g/ml) es de 8 por lo tanto podemos confirmar la produccin de BLEE.

Figura 20

Falla en la deteccin de -lactamasas de espectro extendido por el mtodo de E-test utilizando la tira de ceftacidima y ceftacidima/ac. clavulnico Klebsiella pneumoniae productora de BLEE CTX-M-2 de bajo nivel

Referencias: ceftacidima, TZ; ceftacidima/ac. clavulnico, TZL. En este caso la relacin de CIMs entre TZ y TZL no se puede calcular. Esto se debe a que el nivel de enzima producida y su actividad sobre ceftacidima son muy bajos y dan valores de CIM muy pequeos que escapan a la sensibilidad de la tira. Este aislamiento seria un falso negativo para la produccin de BLEE.

Mtodo confirmatorio por discos: A partir del ao 1999 la NCCLS recomienda para la confirmacin de BLEE un mtodo sumamente sencillo y barato. Se trata de la colocacin en el antibiograma de dos pares de discos: ceftazidima (30 g), ceftazidima-ac. clavulnico (30-10 g) y cefotaxima (30 g), cefotaxima-ac. clavulnico (30-10 g). Si la bacteria ensayada produce una BLEE el dimetro de inhibicin del disco de la cefalosporina de tercera generacin ms ac. clavulnico (inhibidor de la enzima) ser mayor que el de la correspondiente cefalosporina sola. Se consideran productores de BLEE aquellos aislamientos que muestren una diferencia mayor o igual a 5mm entre el halo de inhibicin de cefotaxima-ac. clavulnico y cefotaxima sola o entre ceftazidima-ac. clavulnico y ceftazidima sola (ver figuras 15 y 21). Recordar que el ac. clavulnico es sumamente inestable y se degrada rpidamente. Por lo que se recomienda extremar los cuidados en la conservacin de los discos y controlar su calidad quincenalmente o mejor semanalmente con la cepa patrn correspondiente (K. pneumoniae ATCC 700613). Los discos de cefotaxima-ac. clavulnico y ceftazidima-ac. clavulnico se encuentra disponibles comercialmente. Tambin pueden ser preparados en el laboratorio segn el procedimiento que recomiendan las normas NCCLS60.

Conclusiones: en Argentina la deteccin de -lactamasas de espectro extendido no es un problema grave. La mayora de los aislamientos de Klebsiella spp (y del resto de las enterobacterias) producen CTX-M-2. Esta enzima confiere alto nivel de resistencia a cefotaxima o ceftriaxona por lo que los dimetros de inhibicin de estas drogas siempre sern pequeos. Por otro lado en mucho menor proporcin tenemos las BLEE PER-2, SHV-5 y SHV2. Las dos primeras confieren elevados niveles de resistencia a ceftazidima y aztreonam por lo que en el antibiograma se detectan fcilmente con estas drogas. Las cepas productores de SHV-2 son las ms difciles de detectar porque dan bajos niveles de resistencia a casi todas las cefalosporinas de tercera generacin y monobactames, dando dimetros de inhibicin grandes para todas ellas. Afortunadamente esta enzima no es muy frecuente en enterobacterias de nuestro pas. De todo esto se puede concluir que en enterobacterias de Argentina, un antibiograma bien estandarizado, ensayando al menos cefotaxima (o ceftriaxona) y ceftazidima es capaz de detectar casi la totalidad de las cepas productoras de BLEE. Para aumentar la seguridad se recomienda colocar entre los discos de CAZ y CTX el disco de AMC o AMS (este mtodo detecta muy bien cepas productoras de enzimas con pobre actividad hidroltica como SHV-2). Cefpodoxima es otra droga muy til para la deteccin de BLEE en el antibiograma, pero tiene el inconveniente de dar falsos positivos en algunas enterobacterias productoras de -lactamasa tipo AMP-C. Cabe aclarar que, el disco de cefpodoxima es el ms sensible para la deteccin de BLEE en aislamientos de E. coli, Klebsiella spp, Proteus spp, Salmonella spp y Shigella spp. Si se est frente a una cepa dudosa en cuanto a su produccin de BLEE, se puede utilizar cualquiera de los mtodos confirmatorios como por ejemplo los discos de las dos cefalosporinas de tercera generacin ms ac. clavulnico que demostr tener, en Argentina, un 100% de sensibilidad y especificidad. -lactamasas de espectro extendido en Enterobacter spp y Serratia spp: El mecanismo de resistencia a cefalosporinas de tercera generacin ms comn en estos gneros y en los otros productores de -lactamasa cromosmica tipo AMP-C indicible, es la derrepresin de esta enzima. Sin embargo en los ltimos aos ha aumentado considerablemente la descripcin de distintas BLEEs plasmdicas en estos microorganismos61,62,63. En Argentina la situacin es muy particular observndose una inusualmente alta prevalencia de BLEE en aislamientos de Enterobacter spp, C. freundii, Serratia spp, M. morganii y Providencia spp. que casi iguala a la resistencia mediada por derrepresin de AMP-C64. Este hecho nos obliga a estar muy atentos y a extremar los cuidados para la deteccin de microorganismos con estas enzimas en el laboratorio. La pregunta que surge espontneamente es: Tiene importancia la deteccin de BLEE en estos gneros? La respuesta es si . La presencia de una BLEE tiene un impacto directo sobre el tratamiento de los pacientes. Por un lado invalida la utilizacin de una cefalosporina de tercera generacin. Por otra parte, las cefalosporinas de cuarta generacin son una alternativa a las de tercera generacin en infecciones por microorganismos productores de AMP-C inducible porque es poco selector de mutantes derreprimidas. Si estos microorganismos producen adems una BLEE, las cefalosporinas de cuarta generacin ya no podrn ser utilizadas y deber informarse al mdico resistencia a estas drogas. Los mtodos de deteccin de BLEE para estos gneros no varan mucho de los disponibles para E. coli y Klebsiella spp. Los puntos de corte para las cefalosporinas de tercera generacin aplicables a Enterobacter spp y Serratia spp (y los otros productores de AMP-C) son los generales recomendados para enterobacterias (Ver Tabla 2)65. No se deben aplicar los puntos de corte especiales para E. coli y Klebsiella spp. De los otros mtodos descriptos para Klebsiella spp., el mtodo microbiolgico es el menos especfico ya que puede dar positivo por la presencia de la -lactamasa cromosmica tipo AMP-C. Existen

algunas consideraciones especiales en cuanto a los mtodos que utilizan el potencial inhibitorio de ac. clavulnico y sulbactam sobre las BLEE de Enterobacter spp o Serratia spp: I) el ac. clavulnico, adems de inhibir la BLEE, induce la produccin de la lactamasa tipo AMP-C de estos microorganismos y no posee poder inhibitorio sobre esta enzima; II) el sulbactam, adems de inhibir a la BLEE, puede tener una baja o moderada actividad inhibitoria sobre la enzima tipo AMP-C pero con despreciable efecto inductor sobre esta enzima. Por lo tanto en un aislamiento de alguno de estos gneros que produzca una BLEE adems del AMP-C propio de especie, el clavulnico tendr efectos contrapuestos. Cuando se realiza la prueba del doble disco estos efectos competirn. Por un lado el ac. clavulnico inhibir la BLEE resultando en una deformacin del halo de la cefalosporina de tercera generacin (efecto huevo), por otro lado este inhibidor inducir la produccin de enzima tipo AMP-C propia de estos gneros que hidrolizar a las cefalosporinas de tercera generacin determinando el achatamiento del halo producido por estas drogas. Como se puede ver, estos efectos son totalmente opuestos. En nuestra experiencia la lucha entre los dos fenmenos la gana la inhibicin de la BLEE, por lo que predomina el efecto huevo sobre el achatamiento (ver figura 21). En conclusin el mtodo de doble disco utilizando amoxicilina-ac. clavulnico y cefotaxima o ceftazidima tiene muy buena sensibilidad y especificidad para detectar aislamientos productores de BLEE en microorganismos que producen, adems, una enzima cromosmica inducible tipo AMP-C. El sulbactam se comporta de manera diferente. Es un buen inhibidor de la BLEE por lo tanto en cepas productoras de estas enzimas va a dar positivo el efecto huevo. Uno de los inconvenientes es que tiene algo de poder inhibitorio sobre la enzima cromosmica tipo AMP-C. Si la resistencia a cefalosporinas de tercera generacin en un aislamiento de Enterobacter spp o Serratia spp (u otros productores de AMP-C) est mediada por hiperproduccin de la enzima cromosmica y no por una BLEE, probablemente la prueba de doble disco de un resultado falso positivo (efecto huevo) por la inhibicin que sulbactam tiene sobre las enzimas tipo AMP-C (Ver figura 13). De todas maneras, para fines clnicos la diferenciacin de estos mecanismos (BLEE y derrepresin de AMP-C en cepas resistentes a cefalosporinas de 3 generacin) no tiene demasiada importancia ya que en cualquiera de los dos casos las cefalosporinas de cuarta generacin no son una opcin segura. Figura 21
Lectura incorrecta
FEP AMC

DETECCION de BLEE

E. cloacae productor de PERPER-2

ANTIBIOGRAMA FOX: 6mm CTX: 12mm CTC: 25mm CAZ: 6mm CAC: 19mm FEP: 18mm AMC: 6mm AMS: 6mm
CTC

Lectura correcta

INHIBICION (HUEVO)

CAC

FOX

INHIBICION:
(HUEVO)

AMS-CTX (mnimo) AMC-CTX AMC-CAZ AMC-FEP DELTAS CTX/Cla-CTX:13mm CAZ/Cla-CAZ:13mm

MINIMA INHIBICION (HUEVO)

AMS

CTX

CTX

AMC

INHIBICION (HUEVO)

CAZ CAZ

NOTA: Cuando se leen dimetros de inhibicin de cefalosporinas de espectro extendido en aislamientos productores de BLEE se debe ignorar la deformacin que produce la proximidad de inhibidores de lactamasas como el ac. Clavulnico, sulbactam o tazobactam

ESTADO ACTUAL DE LA RESISTENCIA A LOS ANTIMICROBIANOS EN MICROORGANISMOS DEL GRUPO KES EN ARGENTINA. Red WHONET-Argentina perodo 1997-2000

Klebsiella spp Klebsiella spp es uno de los patgenos aislados con mayor frecuencia en el laboratorio hospitalario. Es colonizante del tracto intestinal humano y en menor proporcin de nasofaringe. En el ambiente hospitalario la colonizacin por este germen aumenta dramticamente y es directamente proporcional al tiempo de internacin. El tratamiento previo con antibiticos de amplio espectro es uno de los factores de riesgo ms importantes para la infeccin por este microorganismo. Los principales reservorios de Klebsiella spp. en el hospital los constituyen el tracto gastrointestinal de los pacientes y las manos del personal66. Adems la presin antibitica conduce a la seleccin de resistencia. Durante el perodo 1997-2000 se estudiaron, en los centros pertenecientes a la Red Nacional para la Vigilancia de la Resistencia a los Antimicrobianos WHONETArgentina, 8.918 aislamientos de Klebsiella spp aislados de muestras clnicas, siendo el 3er microorganismo en importancia (ver figura 2). Ms de la mitad provinieron de muestras de orina (58,6%), el 11,4% correspondieron a cepas recuperadas por hemocultivo y el 8,4% se aislaron de materiales respiratorios (ver figura 22). En infecciones del tracto urinario se encuentra segunda despus de E. coli, en muestras de sangre esta en tercer lugar despus de S. aureus y S. coag. neg. y en materiales respiratorios ocupa el quinto lugar detrs de S. aureus, P. aeruginosa, S. pneumoniae y haemophilus spp. (ver figura 23).
Figura 22
Klebsiella spp.

Perodo 1997-00 (n=8630) Distribucin por muestras clnicas

Orina (58,6%)

Otros (10,6%)

Piel (1,6%) Liq. abdominal (2,3%) Cateter (2,9%) Herida (4,1%) Respiratorio (8,4%) Sangre (11,4%)

Figura 23

Distribucin de microorganismos por muestras clnicas Red WHONET-Argentina.

Perodo 1997-00

ORINA N=71562
K. pneumoniae 8,8%

HEMO N=12872
K. pneumoniae 9,6% S. pneumoniae 8,4% S. coag. (-) 21,6% E. coli 8,4%

E. coli 61,0%

P. mirabilis 5,8%

P. aeruginosa 4,8%
P. aeruginosa 5,4% Enterococcus sp. 4,5% S. coag. (-) 3,6% Otros 10,8%

S. aureus 24,7%

Otros 22,6%

RESPIRATORIAS N=12648
S. pneumoniae 11,6% H. influenzae 7,3% P. aeruginosa 21,8% K. pneumoniae 6,8%

Otros 26,7% S. aureus 25,9%

Si analizamos la resistencia en Klebsiella spp. provenientes de los tres tipos de muestras ms comunes, podemos encontrar marcadas diferencias. Estas se observan principalmente para los antibiticos -lactmicos y los aminoglucsidos frente a aislamientos recuperados de sangre que presentan porcentajes de resistencia muy superiores a las cepas provenientes de orina y materiales respiratorios. Otros antimicrobianos como cotrimoxazol, quinolonas fluoradas y nitrofuranos no mostraron diferencias considerables (Ver figura 24).

Figura 24
Klebsiella spp. Perodo 1997-00 Porcentajes de resistencia a los antimicrobianos segn tipo de muestra

% 80
67 54 54 56 50 43 45 40 32 39 34 34 29 16 15 35 37 31 71 66 59 49 47 46 48

60

51

40

20
0 0 0

13

0
li ci pi m A /s na . ul . l a a z. na na in in zo em en ta c / c ci a oi n g i t a a a x e a n x n o a ic ip 3 am ra ili lo ef m nt Im rim C fu of A de ac t e r r o . o G ip ef C it r pe C C N Pi tin lo a

Orina (n=5007)

Sangre (n=1103)

Respiratorio (n=744)

Considerando slo los aislamientos de terapia intensiva, la distribucin por muestras se mantiene. Los tres primeros puestos continan siendo para orina, sangre y materiales respiratorios pero en este caso con porcentajes muy similares (ver figura 25). En estas tres muestras la posicin de Klebsiella spp. con respecto a los dems microorganismos es la misma que para los aislamientos en general. La nica excepcin la constituyen los aislamientos provenientes de materiales respiratorios donde este grmen asciende a cuarto lugar desplazando a S. pneumoniae.

Figura 25
Klebsiella spp. Perodo 1997-00

(n=818) Distribucin por muestras de aislamientos provenientes de terapia intensiva

Orina (27,1%)

Otros (8,6%)

Sangre (21,4%)

Piel (1,8%) LCR (2,4%) Herida (3,3%) Liq. abdominal (5,3%

Cateter (10,5%) Respiratorio (19,6%)

Klebsiella spp. tiene una especial facilidad para adquirir mecanismos de resistencia que se refleja en la falta de actividad de las distintas familias de antibiticos sobre las cepas clnicas. La resistencia a los antimicrobianos se ha mentenido en niveles establemente altos en los ltimos cuatro aos. Durante muchos aos, las cefalosporinas de tercera generacin combinadas con aminoglucsidos, fueron la terapia de eleccin para infecciones severas en pacientes hospitalizados. La alta prevalencia de -lactamasas de espectro extendido y de enzimas inactivantes de aminoglucsidos ha elevado de una forma alarmante los niveles de resistencia a estas drogas colocndolos alrededor del 40%. La actividad antibacteriana de las combinaciones de -lactmico/inhibidor de lactamasa, sobre Klebsiella spp. productoras de BLEE, dependen de varios factores. Entre los ms importantes podemos destacar la cantidad y tipo de enzima producida, el inculo bacteriano, la actividad del inhibidor involucrado en la combinacin y la resistencia a la hidrlisis del -lactmico a proteger. Las combinaciones que muestran mayor actividad son piperacilina-tazobactam y cefoperazona-sulbactam. Sin embargo, las BLEE que predominan en nuestro pas determinan que ninguna de las combinaciones disponibles sea muy activa. Estudios realizados sobre 200 aislamientos de Klebsiella spp. colectados por la red WHONET-Argentina indican que la actividad de piperacilinatazobactam sobre estos aislamientos es muy similar a la de cefoperazona-sulbactam presentando slo un 25% de sensibilidad. La actividad de ampicilina-sulbactam, amoxicilina-ac. clavulnico y ticarcilina-ac. clavulnico no supera el 5% de las cepas en este estudio57. A este respecto hay varios trabajos que apoyan la utilizacin de las combinaciones de estas drogas con penicilinas o cefalosporinas como alternativa para el tratamiento de infecciones causadas por cepas productoras de BLEE68,69.70. Sin embargo la actividad de estas combinaciones se ve muy reducida por el efecto inculo71. La

eleccin de estas drogas para el tratamiento de pacientes con infecciones graves provocadas por cepas sensibles, debera estar condicionada a un exhaustivo anlisis de cada caso clnico en particular72,73,74. Los carbapenemes son los nicos antimicrobianos que an conservan casi total actividad sobre este patgeno (ver figura 26). Sin embargo ya se han aislado en nuestro pas, cepas de Klebsiella pneumoniae con resistencia a estas drogas. Esta situacin es sumamente grave ya que los carbapenemes son muchas veces las nicas alternativas posibles frente a cepas multirresistentes. Las quinolonas fluoradas representan otra familia de drogas que se presentan con buena actividad aunque la resistencia a ciprofloxacina se muestra con un lento pero progresivo aumento pasando, en cuatro aos desde el 13 al 17 % (ver figura 26). En la figura 26 se puede observar que Klebsiella pneumoniae presenta niveles de resistencia muy superiores a los de Klebsiella oxytoca para todas las drogas ensayadas excepto trimetoprima-sulfametoxazol para la cual ambas especies muestran valores similares. Si bien la resistencia a polipptidos es sumamente rara en este gnero y frecuentemente se utiliza como herramienta en la tipificacin, ya se han comenzado a aislar en nuestro pas unas pocas cepas resistentes (dato no mostrado). Analizando por separado los aislamientos provenientes de terapia intensiva y los del resto del hospital podemos ver que los porcentajes de resistencia en los primeros superan ampliamente a los otros. Siendo la diferencia mayor del 20% para ampicilinasulbactam, cefalotina, piperacilina-tazobactam, cefalosporinas de tercera generacin y aminoglucsidos (gentamicina y amicacina). Para Trimetoprima-sulfamentoxazol, ciprofloxacina y nitrofuranos la diferencia es algo menor y se ubica entre el 9 y el 17% dependiendo de la droga (ver figura 27). Figura 26

RESISTENCIA A LOS ANTIMICROBIANOS

RED WHONETWHONET-ARGENTINA 19971997-2000 N= 9.011
%
70 60 50 40

Klebsiella spp.

K. pneumoniae

%
70 60 50 40

30

Klebsiella spp

20 10 0
na /s ul . na /ta z. . ic in a in a a ip en em ge n ox az o in C ef al ot ac en ta m lo xa of C ip r lo xa ci na 3a ic ci na l rim C ot C ot r im ox az

Pi pe ra ci li

pi ci li

A m

de

Im

C ef .

Am

20 10 0

1997 (n=1.326)

1998 (n=1.679)

1999 (n=2.346)

2000 (n=1.920)

%
70 60 50 40 30 20 10 0
a/ ta z. ge n. ul .

pi ci lin a/ su l. C ef al ot Pi in pe a ra ci lin a/ ta C z. ef .d e 3a ge n. Im ip en em G en ta m ic in a Am ic ac in C a ot rim ox az C ol ip ro flo xa ci na

K. oxytoca

A m

1997 (n=1.709) 1998 (n=2.061) 1999 (n=2.890) 2000 (n=2.351)

ic in a

pi ci lin a/ s

C ef al ot in

ip en

ac ili n

am

Pi pe r

C ef .

Am

1997 (n=168)

1998 (n=245)

en t

1999 (n=324)

Am

de

Im

ic ac in a

3a

em

2000 (n=271)

ol

30

ip ro f

Figura 27 Klebsiella spp. Perodo 1997-00

Porcentajes de resistencia a los antimicrobianos Comparacin de aislamientos provenientes de terapia intensiva y de otras salas

Klebsiella spp. (n=911) resistencia en terapia intensiva

% 100 75 80 53 41 40 28 76 68 65 59 60 63

Klebsiella spp. (n=8838) resistencia general

% 100

20 0 0
s a/ lin . ul C a ef tin lo Pi a ac ili z. /t a na C 3a n. ge a a ol na na in in em ci az oi ic ac en nt xa m ox ic ip ra ta m f lo Im rim fu A t en ro o ro G ip t C i C N

80
A

c pi m

r pe

e .d ef

55 60

57 44 44 37 33 16 47

40

34

20 0 0 % 100

Klebsiella spp. (n=8007) resistencia en otros que terapia intensiva

a in to an

m A

c pi

ili

/ na

l. su

al ef C

a tin ac ili

na

z. /ta e .d ef C

3a

ge

n.

r pe Pi

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em en G

ic m ta

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a ic m A

a in rim ot C

ox

ol az

c xa flo ur ro of ip tr C Ni

a in

80 53 55 41 40 31 42 34 32 15 20 0 0
ili / na l. su al ef C a in ot ra pe Pi ci a/ lin z ta . 3a n ge . ip Im em en G ic m ta en in a ic m A ac a in ol na na ci az oi nt xa ox ra lo r im fu of t r o o ip C itr C N

60

46

c pi m A

e .d ef C

Enterobacter spp
Este gnero est compuesto por muchas especies con distinta importancia clnica. En Argentina las especies ms frecuentemente aisladas en el laboratorio hospitalario son E. cloacae (67%), E. aerogenes (23%) y E. agglomerans (9%). Las otras especies representan slo el 1% restante predominando en este grupo E. sakazakii. Como se ha descripto es raro aislar en muestra clnicas E. taylorae, E. gergoviae, E. asburiae y E. amnigenus75. Se han descripto infecciones por Enterobacter spp adquiridas en la comunidad. Sin embargo este es un patgeno fundamentalmente hospitalario que se asocia a distintos factores de riesgo. Entre los ms importantes podemos enumerar el tiempo de la internacin, el tratamiento antibitico previo, la inmunosupresin, la presencia de enfermedades de base serias (por ej. cancer, quemaduras, diabetes) y la instrumentacin de los pacientes (por ej. catteres venosos, tubos endotraqueales, catteres urinarios). Si bien se describieron brotes de infecciones causadas por distintos factores externos, en general paso previo para la infeccin por Enterobacter spp es la colonizacin del paciente75. De todas las cepas de Enterobacter spp. aisladas en el perodo 1997-2000 (n=3943) por la Red WHONET-Argentina, aproximadamente la mitad correspondieron a muestras de orina, siguieron en importancia las muestras de sangre (10%), herida (10%) y materiales respiratorios (7%) (ver figura 28).

Figura 28

Enterobacter spp. Perodo 1997-00 (n=3943) Distribucin por muestras clnicas

Orina (48,0%)

Otros (15,5%)

Liq. abdominal (2,8%) Piel (2,9%) Cateter (3,4%) Respiratorio (7,4%) Sangre (10,2%)Herida (9,9%)

La prevalencia de las distintas especies de Enterobacter dentro de cada tipo de muestra fue muy similar (ver figura 29). Slo se observaron diferencias en los materiales respiratorios donde Enterobacter aergenes aumento su proporcin a costa de la disminucin de Enterobacter cloacae, Enterobacter agglomerans. Las otras especies minoritarias se mantuvieron en porcentajes similares a los descriptos para las otros tres tipos de muestra.
Figura 29 Enterobacter spp. Perodo 1997-00 (n=3943) Distribucin de especies segn tipo de muestra

% 80
66,6 70,3 69,8 61,5

60

40
21,9 20,9 10,2 20,7 7,7 8

31

20

7,1

1,3 0
O rin a N=1928 r ng a S e

1,1

1,5

0,4

N=432

id er H

a N=411 p es

rio to a r i

N=282

E. cloacae

E. aerogenes

P. agglomerans

otros

Los aislamientos provenientes de orina fueron los ms resistentes a los antimicrobianos ensayados, especialmente piperacilina-tazobactam, trimetoprima-sulfamentoxazol y quinolonas fluoradas. Para las cefalosporinas de espectro extendido y los aminoglucsidos las diferencias fueron menores. Nitrofurantona fue la nica excepcin con porcentajes de resistencia muy parecidos para los aislamientos provenientes de las distintas muestras (ver figura 30).
Figura 30 Enterobacter spp. Perodo 1997-00

Porcentajes de resistencia a los antimicrobianos segn tipo de muestra

% 100 80
58 61 62 51 40 38 42 39 35 32 30 27 26 19 11 10 14 0 0 0 0 41 34 29 27 29 23 18 23 18

60 40 20 0

49

48 34 33 34

16

a er ip

/ na ili

z. ta .d ef e

3a

ge

n. ef C

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e i Im n pe

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in

a A i m c ca

a in r im ot

az ox

ol of pr l

ac ox

in

a ra fu

n oi nt

o itr

Orina (n=1928)

Sangre (n=432)

Herida (n=411)

Respiratorio (n=282)

En general se vieron resistencias muy altas a cefalosporinas de tercera generacin (45%) y aminoglucsidos (gentamicina, 36% y amicacina, 25%). En Argentina, la resistencia a cefalosporinas de tercera generacin est mediada por mecanismos enzimticos64. A nivel mundial, el mecanismo enzimtico que ms comnmente afecta a estas drogas, es la derrepresin de la -lactamasa cromosmica tipo AMP-C. Nuestro pas no fue la excepcin a este respecto, pero si bien la derrepresin del AMP-C fue el mecanismo ms comn, estudios llevados a cabo sobre cepas de Enterobacter de todo el pas indican que algo menos de la mitad de los aislamientos resistentes a cefalosporinas de tercera generacin producen una -lactamasa plasmdica de espectro extendido64. Cabe destacar en este punto que, si bien las cefalosporinas de cuarta generacin presentan una actividad in vitro muy superior a las cefalosporinas de tercera generacin, no es conveniente utilizar este tipo de drogas, ni en las cepas productoras de BLEE ni en las que tienen su AMP-C derreprimido. Esto se debe al fuerte efecto inculo y al riesgo de seleccionar mutantes de impermeabilidad, respectivamente. Cualquiera de estos fenmenos conferir al aislamiento resistencia a las cefalosporinas de cuarta generacin. Este gnero presenta los niveles de resistencia ms altos a las quinolonas fluoradas dentro de las enterobacterias (ciprofloxacina 27%) junto con M. morganii, Providencia spp y Citrobacter spp. Esto puede deberse a la alta frecuencia de seleccin que presenta ciprofloxacina frente a Enterobacter spp76. Al igual que Klebsiella spp., los carbapenemes fueron casi totalmente activos frente a los aislamientos de este gnero, slo con unas pocas cepas resistentes. Otro grupo de antimicrobianos con alta actividad sobre

Enterobacter spp. son los polipptidos, polimixina y colistin (datos no mostrados). Si analizamos los porcentajes de resistencia de cada una de las tres especies de Enterobacter ms frecuentes, nos encontramos con que, contrariamente a lo que indica la bibliografa75, E. agglomerans es, en Argentina, la especie con niveles de resistencia mayores para todos los antimicrobianos ensayados (ver figura 31).
Figura 31 Enterobacter spp. Perodo 1997-00 Enterobacter spp. Porcentajes de resistencia a los antimicrobianos segn especie

Resistencia segun especie

100 80

63 64

60
40

54 47 32 36

53 47 35 33 23 24 36 27 29 29

56 49 44

40 20 0

25 24

14 13 0 0 0

ic ac in a

Pi

E. cloacae (n=2313)

E. aerogenes (n=756)

Los aislamientos de Enterobacter spp. de terapia intensiva mostraron niveles de resistencia muy superiores a los del resto del hospital para todos los antimicrobianos ensayados (Ver figura 32). La distribucin de Enterobacter spp por muestras en este tipo de salas fue muy distinta a la general. Predominando las muestras de origen respiratorio, seguidas muy de cerca por las de orina y las de sangre. En pacientes internados en terapia intensiva Enterobacter se ha encontrado en un nmero importante de muestras de cateter (ver figura 33).

ip ro f lo xa ci na N it r of ur an to in a

a/ ta z.

ip en em

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3a

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de

Am

Im

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im

ox az ol

ge n.

ic

E. agglomerans (n=312)

Figura 32 Enterobacter spp. Perodo 1997-00

Porcentajes de resistencia a los antimicrobianos Comparacin de aislamientos provenientes de terapia intensiva y de otras salas
Enterobacter spp. (n=911) resistencia en terapia intensiva
100 80 60 40 20

Enterobacter spp. (n=3688) resistencia general

100 80 60 40 20 0
ob az . ac ef C on ax tri a e C m pi fe a ta en m a in ic Am a in ac ic . na et na ci oi m nt xa lfa a o u r l f u /S ro of et ip itr C im N Tr

0
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Enterobacter spp. (n=3368) resistencia en otros que terapia intensiva

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r pe Pi

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Figura 33
Enterobacter spp. Perodo 1997-00

(n=389) Distribucin por muestras de aislamientos provenientes de terapia intensiva

Respiratorio (20,6%)

Orina (20,3%)

Otros (14,1%)

Piel (3,3%) Liq. abdominal (5,9%) Sangre (17,0%) Herida (8,7%) Cateter (10,0%)

-lactamasas en enterobacterias: que probar, como interpretar y como informar. Que probar? Como hemos visto a lo largo de este documento, prcticamente todas las enterobacterias producen alguna -lactamasa cromosmica, en realidad este concepto puede ampliarse tambin a los bacilos gram negativos no fermentadores. Teniendo en cuenta este hecho, no tendra sentido investigar si este tipo de microorganismos produce o no -lactamasas, el ensayo de presencia de estas enzimas slo debe realizarse para microorganismos que normalmente no las producen (Haemophilus influenzae, Neisseria gonorrhoeae y Enterococcus spp., Staphyococcus spp y Moraxella catarrhalis). Para el gnero Enterobacteriaceae, el antibiograma generalmente es efectivo y suficiente para la deteccin de la gran parte de los mecanismos de resistencia bacterianos a los distintos antimicrobianos utilizados en clnica. Pero existen algunas excepciones en las cuales se hace necesario emplear alguna metodologa adicional, sobre todo cuando el mecanismo presente confiere al microorganismo un nivel bajo o mederado de resistencia. Una de estas excepciones la constituyen las -lactamasas de espectro extendido, sobre todo las del tipo SHV y TEM cuyo nivel de produccin y actividad especfica sobre C3G, frecuentemente es bajo. Las bacterias que sintetizan este tipo de enzimas, en muchos casos presentan, franca resistencia slo a las penicilinas y cefalosporinas de primera generacin. Sin embargo est comprobado que la utilizacin de C3G, C4G o monobactames en el tratamiento de infecciones debidas a microorganismos productores de estas BLEE, puede resultar en falla clnica, lo que hace indispensable su deteccin en el laboratorio. En nuestro pas a diferencia de lo que ocurre en EEUU o Europa, las BLEE predominantes no son derivadas de TEM o SHV. La enzima ms distribuda es CTX-M-2 (>65%), fenotpicamente esta -lactamasa confiere siempre resistencia a CTX, pero puede ser sensible o no a CAZ, dependiendo de la especie bacteriana y del nivel de produccin enzimtica como ya hemos visto anteriormente. Continan en prevlencia con valores muy similares, las derivadas de SHV (SHV-2 y SHV-5) y PER-2. El fenotipo conferido por la presencia de enzimas del tipo SHV es variable de acuerdo a la derivada de que se trate. PER-2 generalmente se expresa como resistente de alto nivel a CAZ y si bien la actividad de esta enzima sobre CTX es considerablemente menor, hasta el momento no se han detectado aislamientos productores con sensibilidad a esta droga. SHV-5 presenta un fenotipo prcticamente indistinguible de PER-2. El problema se presenta con las cepas productoras de SHV-2 cuya actividad especfica sobre cefalosporinas de espectro extendido y monobactames es bajo, presentando algunas dificultades en la deteccin. Hasta el momento no hemos encontrado en Argentina microorganismos resistentes a C3G debido a produccin de BLEE derivadas de TEM. Otro mecanismo comn de resistencia a las C3G generalmente se debe a derrepresin de AMP-C en microorganismos codificantes de -lactamasa cromosmica inducible tipo AMP-C (CCI). La primer recomendacin que surge de todo lo expuesto para la correcta deteccin de BLEE en microorganismos del grupo KES, es el ensayo en el antibiograma de al menos las dos C3G ms comunes (CTX y CAZ). Esto se debe a que las distintas BLEE se pueden presentar con fenotipo disociado: ceftazidima sensible con cefotaxima resistente (caso de algunas cepas productoras de CTX-M-2) o ceftazidima resistente con cefotaxima sensible (muy poco frecuente en Argentina). La deteccin mejora, slo en el caso de microorganismos que no producen CCI como Klebsiella spp., si se agrega el disco de cefpodoxima. Recordar que este disco puede dar falsos positivos con Enterobacter spp. y Serratia spp. productores de -lactamasa cromosmica tipo AMP-C inducible (lo mismo

puede ocurrir con el resto de los productores de este tipo de enzimas). Se debe tener especial cuidado de aplicar los puntos de corte correctos para las C3G y monobactames. Para Klebsiella spp. se utilizan los puntos de corte especiales que figuran al final de la tabla 2A de las normas NCCLS para difusin por discos (M2-A7) y para Enterobacter spp y Serratia spp los puntos de corte generales para enterobacterias de la tabla 2A del documento M2-A7. Si existen dudas de la presencia o no de una enzima inactivante de C3G, el mtodo ms sencillo de confirmacin es el de doble disco (efecto huevo). Tambin se puede utilizar los discos con la combinacin de cefotaxima-ac. clavulnico y ceftazidima-ac. clavulnico y comparar los dimetros de inhibicin con los de cefotaxima y ceftazidima solos (la ventaja sobre el doble disco es la independencia de la distancia entre los discos). Si se va a utilizar la prueba confirmatoria por e-test, recordar que en Argentina la tira ms sensible para la deteccin es la de cefotaxima y cefotaxima-ac. clavulnico ya que por nuestra epidemiologa de BLEE la tira de ceftazidima y ceftazidima-ac. clavulnico tiene muy baja sensibilidad. Los tres mtodos confirmatorios, doble disco , combinacin de C3G con ac. clavulnico y el e-test fueron pensados para E. coli y Klebsiella spp. Sin embargo, en Argentina, funcionan aceptablemente para detectar BLEE en microorganismos productores de -lactamasa cromosmica tipo AMP-C inducible como Enterobacter spp y Serratia spp77 Se recomienda colocar en el antibiograma un disco de cefoxitina. Este antimicrobiano se utiliza poco para tratamiento pero es una droga muy til como ayuda en la identificacin bioqumica. Sobre todo si se coloca prxima a una cefalosporina de tercera generacin para ver si la cepa es o no productora de -lactamasa cromosmica tipo AMP-C inducible. Resumiendo, se recomienda colocar continuos en el antibiograma los siguientes discos en el orden indicado: cefoxitina, ceftazidima, amoxicilina-ac. clavulnico (o ampicilina sulbactam) y cefotaxima (o ceftriaxona).

como interpretar? Para el caso del antibiograma comn, la resistencia a una sola o varias de las cefalosporinas de tercera generacin o los monobactames se debe interpretar como resistencia a todas las penicilinas, cefalosporina y monobactames independientemente de la eventual sensibilidad in vitro de alguno de ellos. La I) visualizacin de efecto huevo entre las C3G y ampicilina-sulbactam o amoxicilina-ac. clavulnico, II) una diferencia mayor o igual a 5 mm entre los dimetros de inhibicin de los discos de cefotaxima o ceftazidima con y sin ac. clavulnico o III) una relacin mayor o igual a 8/1 en la prueba de E-test, entre la CIM de la C3G y su respectiva combinacin con ac. clavulnico, son indicadores de la presencia de una -lactamasa de espectro extendido. La interpretacin en este caso es resistencia a todas las penicilinas, cefalosporinas y monobactames aunque estas resistencias no se observen en el antibiograma. Si el aislamiento da un dimetro de inhibicin de cefoxitina correspondiente a interpretacin de resistente pueden pasar tres cosas: 1) que se trate de una cepa productora de AMP-C inducible, Enterobacter spp o Serratia spp (los otros productores de esta enzima dan tambin este fenotipo: C. freundii, M morganii o Providencia spp.), 2) que se trate de Enterobacter spp. o Serratia spp. con su AMP-C derreprimido o 3) de una Klebsiella spp portadora de una -lactamasa plasmdica derivada de AMP-C (genotipo muy raro en Argentina) o impermeable. Si se tratara del caso 1, se observar induccin de cefoxitina sobre las C3G, para diferenciar entre los dos aislamientos posibles, disponemos del colistin o la polimixina (Enerobacter spp ser sensible y Serratia spp, resistente). El fenotipo 2 presentar un antibiograma muy particular, resistencia a todos los antibiticos -lactmicos con excepcin de los carbapenemes y las cefalosporinas de cuarta generacin. El fenotipo 3 no mostrar induccin de cefoxitina sobre las C3G y si la causa

fuera impermeabilidad debera verse resistencia de bajo nivel a otras drogas como cloranfenicol, tetraciclinas y quinolonas fluoradas. Si la cepa presenta un dimetro de inhibicin para cefoxitina correspondiente a interpretacin de sensibilidad, en la mayora de los casos se tratar de una Klebsiella spp., tener en cuenta que existen aislamientos de Serratia spp. que pueden presentar este fenotipo. Para la diferenciacin, en este caso, podemos observar la interaccin entre cefoxitina y una C3G o prueba de induccin (+ para Serratia spp. y negativa para Klebsiella spp) o el halo de inhibicin con el disco de colistin o polimixina (Serratia spp. resistente y Klebsiella spp. sensible)
Klebsiella spp impermeable o c/AMP-C plasmdico Serratia spp
R CEFOXITINA S Induccin -

Serratia spp
Induccin +

COL R COL S

Serratia spp

Enterobacter spp

Enterobacter spp

Enterobacter spp

Klebsiella spp Serratia spp

Induccin +, COL R

Klebsiella spp impermeable o c/AMP-C plasmdico

Induccin -, COL S

Serratia spp

Klebsiella spp

Como informar?
En general el antibiograma nos da la informacin necesaria para informar la sensibilidad bacteriana. En algunos casos, sin embargo, se deben hacer algunas consideraciones especiales. A continuacin detallaremos algunas de esas consideraciones. Si, por algunos de los mtodos descriptos, se comprueba la presencia de una lactamasa de espectro extendido debe informarse resistencia a todas las penicilinas, cefalosporinas y monobactames (aztreonam). Estas enzimas no hidrolizan cefoxitina por lo que esta droga se informa, como sensible o resistente, segn el resultado del antibiograma. Las BLEE son inhibibles por los inhibidores de -lactamasas plasmdicas, ac. clavulnico, sulbactam y tazobactam. El informe de las combinaciones de estas drogas con otros antibiticos -lactmicos se debe basar en la actividad que cada una de ellas demuestra en el antibiograma. Dado el efecto inculo que afecta a estas drogas, la eleccin o no de las mismas para el tratamiento de infecciones causada por cepas productoras de BLEE, es una decisin del cuerpo mdico que evaluar cada caso en particular. Una duda bastante comn, es como informar las cefalosporinas de tercera generacin en aislamientos de Enterobacter spp., Serratia spp y los otros microorganismos productores de -lactamasa cromosmica tipo AMP-C inducible que presentan sensibilidad a estas drogas en el antibiograma. Si bien es cierto que toda infeccin causada por cualquiera de estos microorganimos tiene una muy pequea subpoblacin de individuos con su lactamasa derreprimida resistentes a piperacilina, ticarcilina y C3G, esto no siempre es

sinnimo de falla de tratamiento con estas drogas. La seleccin de esas pocas mutantes derreprimidas intratratamiento depende de muchos factores algunos estn relacionados al microorganismo, pero sobre todo influyen los relacionados al paciente y el sitio de infeccin. Teniendo en cuenta que toda poblacin de microorganismos tiene potencialmente individuos resistentes a diferentes drogas antimicrobianas (por ej. quinolonas fluoradas frente a enterobacterias), sera incorrecto informar resistencia a C3G en microoganismos de este grupo. En todo caso el microbilogo debera informar sensibilidad con la aclaracin de la posible seleccin de resistencia intratratamiento. Esto alerta al mdico para que, si quiere utilizar alguna de estas drogas, tome todos los recaudos necesarios para detectar la posible falla de tratamiento. Otra opcin es no informar las C3G, sobre todo en los casos donde existen otras alternativas. Si el mdico quiere utilizarlas, probablemente se acerque al laboratorio para solicitar la sensibilidad a esas drogas, dndonos la oportunidad de explicarles el problema. Recordar que en estos casos las cefalosporinas de cuarta generacin son una alternativa en aislamientos sensibles a C3G, antes de llegar a los carbapenemes. Estas ltimas drogas debemos reservarlas ya que frecuentemente son la nica herramienta en el tratamiento de bacilos gram negativos multirresistentes. En la mayora de los aislamientos productores de lactamasa cromosmica tipo AMP-C derreprimida, cefepime mantiene su actividad presentando dimetros de inhibicin reducidos pero en la categora de sensibilidad. En estos casos la utilidad de las cefalosporinas de cuarta generacin est muy discutida. Las razones principales para dudar de la efectividad de esta droga son, el fuerte efecto inculo que sufren y por otro lado, la facilidad con que se seleccionan mutantes de permeabilidad totalmente resistentes. Teniendo en cuenta esto, sumado a que la resistencia mediada por BLEE tambin compromete la actividad de las cefalosporinas de cuarta generacin, una recomendacin general sera: en todo aislamiento de Enterobacter spp. o Serratia spp. resistente a C3G (por produccin de BLEE o derrepresin de AMP-C), el uso de cefalosporinas de cuarta generacin no estara recomendado a pesar de que stas presenten sensibilidad in vitro. En lneas generales no hay recomendaciones especficas para la interpretacin e informe de las pruebas de sensibilidad para antibiticos no -lactmicos frente a aislamientos del grupo KES. Para estas drogas, un antibiograma correctamente estandarizado es suficiente para determinar si un aislamiento es sensible o resistente.

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