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Mise au point et dveloppement d'outils et de mthodes

Les outils de la biologie molculaire pour lanalyse microbiologique des boues actives
La biologie molculaire est devenue incontournable dans ltude des processus biologiques impliqus dans le traitement des eaux rsiduaires. Cet article prsente les outils couramment utiliss aujourdhui pour caractriser les populations microbiennes des boues actives, apportant des informations essentielles la comprhension et loptimisation du fonctionnement des stations dpuration.

ongtemps, ltude des stations dpuration sest limite au suivi des donnes physicochimiques en entre et en sortie de linstallation, considrant le bassin biologique comme une bote noire o avaient lieu des ractions chimiques mal comprises, ralises par des micro-organismes non identis. La microbiologie des boues actives a permis de lever de nombreuses zones dombre sur la nature des ractions existant dans le bassin biologique et le rle des micro-organismes prsents. Avec larrive de la biologie molculaire, de nouvelles informations capitales ont t apportes, notamment sur la relation identit/fonction des microorganismes, amliorant encore notre connaissance des mcanismes de dpollution mis en jeu au sein des stations dpuration.

Lexique
1. Squence : ordre denchanement de nuclotides (voir encadr ). 2. ADN : acide dsoxyribonuclique (voir encadr ). 3. Rgions conserves : squences dADN identiques retrouves chez tous les micro-organismes, par opposition aux rgions variables. 4. Flocs : agglomrats constitus de bactries et de particules organiques et inorganiques. 5. Sondes : petits fragments dADN de quelques nuclotides, marqus une extrmit par un fluorophore (molcule uorescente). 6. Ribosomes : organites intracellulaires permettant la synthse des protines. 7. ARNr : acide ribonuclique constituant des ribosomes. 8. Phylogntique : se rapporte la classication des tres vivants avec pour objectif de rendre compte des degrs de parent entre les espces et donc de leur histoire volutive (ou phylognie). 9. Electrophorse : mthode danalyse qui consiste sparer des molcules charges (ADN) en prsence dun champ lectrique. 10. Amorces : petits fragments dADN de quelques nuclotides, utiliss par paire et dont les squences sont complmentaires de celles encadrant le fragment dADN amplier par PCR. 11. Agents intercalants : molcules uorescentes uorescentes sinsrant entre les bases de lADN.

Pour caractriser laptitude des boues actives traiter un type de polluant, le microbiologiste doit rpondre plusieurs questions dont les principales sont : qui, combien, comment ? Les mthodes de microbiologie traditionnelles, dites pasteuriennes, ne rpondent que trs imparfaitement ces questions. Lidentication et le dnombrement des micro-organismes se font par microscopie sur des critres morphologiques ou de coloration, ou encore par tests biochimiques aprs isolement et culture sur botes de Petri ou en milieux liquides. Or, la trs grande majorit des micro-organismes est incultivable sur ces milieux car les facteurs ncessaires leur croissance restent inconnus. De plus, ces mthodes requirent lisolement du micro-organisme de son milieu naturel et de sa communaut, ce qui biaise forcment lvaluation de ses activits. Les mthodes molculaires, en saffranchissant de la mise en culture, rduisent normment les biais des mthodes
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pasteuriennes. Elles permettent de caractriser les microorganismes dun chantillon, quils soient cultivables ou non, dans leur environnement naturel (Huybens et al., 2009). Ces techniques utilisent des squences1 dADN2 spcifiques des micro-organismes cibles afin de les identier et de les dnombrer. Selon que la squence cible est choisie dans une rgion trs conserve 3 des

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Prolifration lamenteuse de Thiothrix sp. au sein dun oc. Dtection simultane des bactries totales (sonde EUBmix-FITC) en vert et de Thiothrix sp. (sonde G123T-Cy3/G123T-C) en rouge. La couleur jaune est due la colocalisation des deux marquages.
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gnes marqueurs, ou au contraire dans une rgion trs variable, il sera mis en vidence des groupes microbiens trs divers, ou bien des micro-organismes trs cibls (espce ou sous-espce bactrienne). Dun point de vue pratique, seule une centaine de millilitres de boue active est ncessaire la ralisation de dizaines, voire de centaines danalyses molculaires. Ces techniques sont donc particulirement puissantes ds lors que la reprsentativit de lchantillonnage est bien assure. Cet article prsente les outils couramment utiliss aujourdhui pour caractriser les populations microbiennes des boues actives (identication, biodiversit, quantication) en dtaillant leurs principes et en donnant quelques exemples dapplication en puration des eaux rsiduaires (tableau ).

Dtection et identication des micro-organismes en microscopie


En microscopie classique, il est possible dtudier la structure des ocs4 (taille, morphologie), mais il est trs difcile didentier les diffrents micro-organismes prsents. Des colorations (Gram, Neisser) permettent didentier quelques grands groupes de bactries, mais dstructurent compltement lorganisation du oc. La technique FISH ( Fluorescent In Situ Hybridization), qui combine biologie molculaire et microscopie, prsente lavantage considrable de pouvoir la fois identifier de manire fiable les micro-organismes

prsents et visualiser leur morphologie ainsi que leur rpartition spatiale au sein des flocs. La puissance de cette technique rside dans sa simplicit et sa rapidit de ralisation (quelques heures). Son principe repose sur lutilisation de sondes 5 uorescentes

Principes, objectifs et applications de quelques techniques de biologie molculaire.


Technique Principe Objectif Exemple dapplication Avantages Inconvnients

FISH

Marquage uorescent de l'ARNr Copie dun fragment dADN cible in vitro lectrophorse en gradient de dnaturant

Identication molculaire et rpartition spatiale des micro-organismes Amplication de lADN tude de la biodiversit des micro-organismes (possibilit didentication ultrieure des espces dominantes) Quantication des micro-organismes

Identication des bactries lamenteuses DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)

Rapide Possibilit de multiplexage Rapide Grand nombre dchantillons traits Grand nombre dchantillons traits Rapide Plusieurs mthodes de dtection disponibles

Microscope piuorescence (cot) Raction pouvant tre inhibe par des impurets dans les extraits dADN

PCR

DGGE

qPCR

Amplication quantitative de lADN

Comparaison de diffrents types de stations dpuration Impact de conditions particulires sur les microorganismes Inventaire molculaire de tous les microorganismes prsents et/ou de leurs fonctions associes

Lourdeur des exprimentations

Seuil de quantication souvent limit aux populations prsentes plus de 102 cellules/mL de boues Lourdeur des exprimentations et de lanalyse des donnes Cot lev

Squenage

Lecture de linformation gntique

Identication molculaire des microorganismes

Approche exhaustive

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Pour en savoir plus sur ladn


LADN, support de linformation gntique, est constitu de deux brins contenant chacun plusieurs milliards de nuclotides. Chaque nuclotide est constitu : dun acide phosphorique, dun sucre (le dsoxyribose), et dune base azote qui peut tre ladnine (A), la guanine (G), la thymine (T) ou la cytosine (C). La molcule dADN adopte une structure en double hlice ; les deux brins sont relis entre eux par des liaisons tablies entre bases azotes dites complmentaires : ladnine dun brin est relie la thymine de lautre brin par deux liaisons, la guanine dun brin est relie la cytosine de lautre brin par trois liaisons.

En routine, le FISH se rvle trs utile pour identier rapidement et simplement les bactries lamenteuses, qui peuvent tre responsables de dysfonctionnements biologiques en stations dpuration (foisonnement des boues et/ou moussage). En effet, les techniques classiques de coloration ne permettent pas toujours de le faire avec certitude (variabilit des colorations, exprience de lobservateur). Il est alors possible de mettre en place sur site des solutions prventives ou curatives adaptes la bactrie incrimine.

tude de la biodiversit microbienne


complmentaires de squences spciques de lARN des ribosomes 6 (ARNr7 ) des cellules cibles. Aprs traitement chimique de la membrane des cellules, les sondes vont pouvoir y entrer et se xer sur leurs cibles. La uorescence mise est alors observable avec un microscope dit piuorescence (gure ). Il est possible dutiliser plusieurs sondes simultanment sur un mme chantillon, marques avec des uorophores diffrents (multiplexage). Pour identifier un microorganisme, il est toutefois ncessaire quune sonde spcique existe, ce qui nest pas toujours le cas, mme si plus de 2500 sondes ont t dveloppes ce jour (http://www.microbial-ecology.net/probebase/). Grce cette technique, il a t mis en vidence que les AOB ( Ammonia Oxidizing Bacteria ) et les NOB ( Nitrite Oxidizing Bacteria), bactries ralisant respectivement la premire et la deuxime tape de la nitrication, taient spatialement proches dans le oc, rendant les produits de la premire raction rapidement utilisables comme substrats pour la seconde (Mobarry et al., 1996). La technique FISH ne permettant de visualiser simultanment quun nombre limit despces diffrentes sur un mme chantillon, les tudes de diversit microbienne font gnralement appel dautres techniques appeles techniques de typage molculaire . Dans cette approche, les cellules sont lyses, leur ADN est puri et les gnes dintrt sont amplis par PCR (encadr ). Le plus souvent, les gnes cibls codent pour des ARNr microbiens et permettent une identication phylogntique8 des espces. Il peut aussi sagir de gnes dits de fonction , codant pour des enzymes importantes pour les ractions biochimiques de dpollution comme celles intervenant dans la nitrication ou la dnitrication. Les produits de PCR obtenus sont ensuite spars par lectrophorse9 dans une matrice de polymres. Une de ces techniques, la DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis), est un procd dlectrophorse sur gradient de dnaturants chimiques qui permet dobserver les diffrences de mobilit de fragments dADN de mme taille, mais de squence diffrente. Sous leffet dun champ lectrique, les produits de PCR migrent dans le gel et rencontrent des concentrations en dnaturants de plus en plus importantes, entranant la dnaturation progressive de leurs brins dADN selon leur composition en bases GC et AT (encadr ). Labondance des bandes sur le prol lectrophortique obtenu rete la biodiversit de la communaut pour les micro-organismes considrs, chaque bande correspondant au moins une espce cible (gure ). En dcoupant les bandes sur le gel et en rampliant par PCR lADN quelles contiennent, il est galement possible de connatre lidentit du microorganisme correspondant aprs squenage. (cf tableau et partie squenage ). La DGGE reste lourde mettre en uvre car elle ncessite au moins deux jours de manipulations, depuis lextraction dADN jusqu la rvlation des fragments dADN du gel sous illumination UV. De plus, lidentication des espces est longue car elle fait appel aux techniques de squenage dcrites ci-dessous. En revanche, elle prsente lavantage de pouvoir visualiser jusqu une trentaine despces en une seule fois et peut tre mise en uvre sur plusieurs dizaines dchantillons en parallle. La biodiversit des bactries nitriantes, qui assurent la transformation de lammoniaque en nitrates au sein du bassin biologique, est trs tudie. Cette technique a permis de montrer que des espces nitriantes diffrentes se dveloppaient dans les stations d'puration des

2 Gel DGGE montrant la stabilit de la biodiversit des bactries nitrosantes (AOB) dune station dpuration sur plusieurs semaines.

Chaque colonne correspond un prol, soit un prlvement. Chaque bande dADN (en noir) correspond au moins une espce de bactrie nitrosante.

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La pcr : tape damplification de ladn avant analyse


La technique PCR (Polymerase Chain Reaction) permet de reconnatre et damplier un fragment dADN spcique, parmi les millions de gnes dun micro-organisme et les milliards de micro-organismes dun chantillon, en quelques heures seulement. La raction PCR consiste en une succession de ractions chimiques appeles cycles , chacun contenant trois tapes (gure ) : la dissociation des brins dADN ( 95 C) ; lhybridation spcique des amorces10 aux deux extrmits de la squence amplier (entre 50 et 60 C) ; llongation des brins dADN partir de chaque amorce grce laction de lADN polymrase ( 72 C). Cet enzyme va synthtiser de nouveaux brins dADN en assemblant les nuclotides par complmentarit avec les brins dADN matrice. Le nombre de copies de lADN cible est doubl chaque cycle. Au bout de trente cycles, on obtient donc thoriquement 230 copies du fragment dintrt, soit plusieurs milliards.
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Principe de la PCR. Un seul brin dADN est reprsent pour ltape dlongation.

eaux uses urbaines et industrielles, en fonction principalement de la concentration en ammonium de linuent (Kreuzinger et al., 2003). En routine, la DGGE peut tre utilise, par exemple, pour valuer limpact de conditions de fonctionnement particulires dune station dpuration sur une communaut microbienne donne. . Les bactries nitrosantes (AOB) tant trs sensibles aux conditions environnementales (temprature, variation de charge, toxique), la nitrification peut tre facilement impacte et les niveaux de rejet en sortie de station non respects.

donnes. Il est utilis pour raliser linventaire des espces ou des fonctions potentielles dun cosystme comme les boues actives par exemple. Le squenage selon la mthode originale de Sanger a t mis au point dans les annes 1970. Ce fut une rvolution dans le domaine de lidentication des microorganismes. Cependant, la limitation de cette technique tenait principalement sa faible capacit de lecture et sa lenteur : il aurait fallu en effet plusieurs dizaines dannes un squenceur fonctionnant jour et nuit pour dcrypter les millions de bases dun gnome bactrien. Aussi, le nombre de squences analysables ntait que de quelques centaines et les inventaires raliss sur des boues actives ne permettaient dobserver que les espces prsentes plus de 108 cellules par millilitre, cest--dire reprsentant quantitativement moins de 1 % de la communaut. Avec cette approche, les bactries nitrifiantes, prsentes souvent des concentrations
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Inventaire des micro-organismes prsents dans les boues


Le squenage permet, partir dune squence cible dADN, de retrouver lidentit du micro-organisme correspondant aprs comparaison avec une base de

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4 Quantication des bactries lamenteuses du type Microthrix parvicella en qPCR. En haut, dtermination des valeurs de Cq. En bas, comparaison des valeurs de Cq des chantillons (X, en bleu) celles de la gamme talon (O, en vert).

de 106 108 cellules par millilitre de boues actives, ntaient pas dtectes. Depuis 2005, avec le squenage haut-dbit dit de nouvelle gnration , , la mme opration est dornavant ralise en quelques heures seulement et le nombre de squences obtenues slve plusieurs millions. Toutefois, le traitement du grand nombre de donnes gnres est lourd, il ncessite des connaissances approfondies en bioinformatique et plusieurs jours danalyse. Cette technique a permis de grandes avances dans la connaissance phylogntique des bactries lamenteuses. On sest en effet rendu compte que des bactries trs proches morphologiquement taient en fait trs loignes phylogntiquement et avaient des fonctions et activits diffrentes (Wagner et Cloete, 2002). Lapport de cette technique est capital : il est dsormais possible dinventorier les diffrents micro-organismes prsents dans un chantillon de boues actives sur une
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seule plaque de squenage (de moins d1 cm2), ou davoir accs leur activit mtabolique un instant donn.

Quantication des micro-organismes


Pour amliorer la comprhension des procds, les donnes obtenues laide des outils molculaires doivent tre quantitatives. Loutil le plus utilis aujourdhui est la PCR en temps rel (qPCR), technique prcise, rapide, et facilement automatisable. Le principe est le mme que celui dune PCR classique (encadr ), la diffrence que lamplication du fragment dADN est mesure en continu laide dagents intercalants11 de lADN double brin ou de sondes uorescentes. Cette mthode ncessite la ralisation dune gamme talon laide de solutions dADN cible de concentrations connues. Le nombre de copies dADN cible tant doubl chaque cycle, la uorescence augmente de la mme faon. Le logiciel dtermine alors pour chaque chantillon un seuil

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de quantication (Cq), correspondant au nombre de cycles pour lequel la uorescence devient signicativement diffrente du bruit de fond. Compare celles de la gamme talon, la valeur de Cq permet destimer la quantit dADN cible de lchantillon correspondant (gure ). Le nombre de micro-organismes dintrt peut ensuite tre dduit en connaissant le nombre moyen de copies du gne cibl par cellule (www.mmg.msu.edu). Cette technique a permis de quantifier dans les boues actives des micro-organismes appels AOA ( Ammonium Oxidizing Archaea ), arches capables de raliser la premire tape de la nitrication (Park et al., 2006). Dveloppe lorigine pour quantier les squences dADN et dnombrer ainsi les microorganismes, cette technique est actuellement adapte la quantification des ARN afin de quantifier lexpression de gnes dintrt et approcher lactivit des micro-organismes. En routine, la qPCR peut tre utilise, par exemple, pour suivre limpact dun traitement curatif (chloration, sels mtalliques) sur la quantit de bactries lamenteuses prsentes dans les boues actives, et de pouvoir ainsi conclure sur son efcacit ou bien adapter le dosage sur site.

progrs sont trs rapides et ces techniques en constante volution, devenant au l des annes plus rapides, plus efcaces et moins coteuses. De plus, la plupart des techniques utilises aujourdhui peuvent tre automatises pour traiter rapidement un grand nombre dchantillons. Cependant, la microbiologie des boues actives reste un domaine o de grandes inconnues subsistent, cause de la complexit de ce milieu, tant au niveau des processus biologiques que des micro-organismes impliqus. Aujourdhui, le couplage systmatique des mthodes de microbiologie molculaire celles du gnie des procds permet toutefois de mieux comprendre et optimiser les procds de traitement des eaux rsiduaires. p

Les auteurs
Lauriane JUZAN et Jean-Jacques PERNELLE
Irstea, UR HBAN, Hydrosystmes et bioprocds, 1 rue Pierre-Gilles de Gennes, CS 10030, 92761 Antony Cedex : lauriane.juzan@irstea.fr : jean-jacques.pernelle@irstea.fr

Conclusion
La liste de mthodes prsente ici est loin dtre exhaustive. De nombreuses autres techniques molculaires sont utiles lanalyse microbiologique des boues actives. Les

Patrick DABERT
Irstea, UR GERE, Gestion environnementale et traitement biologique des dchets, 17 avenue de Cucill, CS 64427, 35044 Rennes Cedex : patrick.dabert@irstea.fr

Quelques rfrences cls...


HUYBENS, N., MAINIL, J., MARLIER, D., 2009, Les techniques de biologie molculaire danalyse des populations bactriennes complexes, Annales de Mdecine Vtrinaire., n 153, p. 112-128. KREUZINGER, N., FARNLEITNER, A., WANDL, G., HORNEK, R., MACH, R., 2003, Molecular biological methods (DGGE) as a tool to investigate nitrication inhibition in wastewater treatment, Water Science and Technology, n 47, p. 165-172. MOBARRY, B.K., WAGNER, M., URBAIN, V., RITTMANN, B.E., STAHL, D.A., 1996, phylogenetic probes for analyzing abundance and spatial organization of nitrifying bacteria, Appl. Environ. Microbiol., 62(6), p. 2156-2162. PARK, H.D., WELLS, G.F., BAE, H., CRIDDLE, C.S., FRANCIS, C.A., 2006, Occurrence of ammonia-oxidizing archaea in wastewater treatment plant bioreactors, Appl. Environ. Microbiol., 72(8), p. 5643-7. WAGNER, A.M., CLOETE, E.T., 2002, 16S rRNA sequence analysis of bacteria present in foaming activated sludge, Systematic and Applied Microbiology, 25(3), p. 434-439. Consulter lensemble des rfrences sur le site de la revue www.set-revue.fr

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