Recepcin: nov.

2011 Aceptacin/publicacin: enero 2012

DOS APLICACIONES DE LA TCNICA DE ANLISIS DE FLUJOS METABLICOS

Ms. C. Osmn Fernndez-OlivaI, Dr. C. Julio C. Dustet-MendozaII, Dr. C. Ernesto Chico-VlizI osman@cim.sld.cu
I

Centro de Inmunologa Molecular, Ciudad de La Habana, Cuba; IIFacultad de Ingeniera Qumica, Instituto Superior Politcnico "Jos Antonio Echeverra", Ciudad de La Habana, Cuba

Resumen La Ingeniera Metablica es la rama de las ciencias biolgicas que se encarga del estudio y la evaluacin de los cambios que se producen de forma dirigida en el metabolismo. Entre los objetivos que persigue esta metodologa integradora est lograr el incremento del rendimiento del producto de inters hasta valores cercanos al mximo terico. Disponer de un modelo matemtico para describir el metabolismo de la clula objeto de estudio es la base para realizar trabajos de Ingeniera Metablica. En este trabajo se aplica la modelacin matemtica del metabolismo al caso de estudio de la sobreproduccin de lisina con la bacteria Corynebacterium glutamicum. Con la aplicacin de la tcnica de Anlisis de Flujos Metablicos y haciendo uso de la simulacin matemtica se determin el mximo rendimiento terico para la produccin de lisina y con estas distribuciones de flujos se identificaron los nodos principales en la red metablica. Se arriba a las mismas conclusiones que las obtenidas experimentalmente y reportadas en la literatura. Palabras clave: flujo metablico, rendimiento terico, modelacin matemtica, metabolismo Abstract Metabolic Engineering is the branches of biological science that deals with the study and evaluation of the changes that occurs in a targeted manner in metabolism. Among the objectives of this integrated methodology is to obtain the products yield of interest to values near the theoretical maximum. A mathematical model to describe the cell metabolism under study is the basis for metabolic engineering. In this paper, mathematical modeling of metabolism is applied to lysine overproduction in Corynebacterium glutamicum. With metabolic flux analysis technique application and using mathematical simulation was determined the maximum theoretical yield for the production of lysine and with these flux distributions were identified the principal nodes in the metabolic network. We arrived to the same conclusions as those obtained experimentally and reported in the literature. Keywords: metabolic flux, theoretical yield, mathematical modeling, metabolism. Introduccin Los procesos industriales para cultivar organismos productores de protenas de inters mdico tienen su origen hace ms de medio siglo con la produccin a gran escala de la penicilina. A partir del descubrimiento del ADN (cido Desoxirribonucleico) por Watson y Crick, como el material responsable de la transmisin de la informacin hereditaria y los avances en la ingeniera gentica para manipular el mismo e insertarlo en organismos vivos, la explosin de productos derivados de la biotecnologa ha sido gigantesca. Cuando se calcula el rendimiento terico de un producto en base a la fuente de carbono y energa por la estequiometra del proceso de fermentacin o por la termodinmica del proceso, el valor que se obtiene generalmente es mucho mayor que el valor del rendimiento real que se alcanza en un proceso de

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fermentacin. Estrategias basadas en la aplicacin de la Ingeniera Gentica, as como la optimizacin del proceso como resultado de la aplicacin de la metodologa de la Ingeniera de Bioprocesos, logran incrementar de manera importante el rendimiento del producto. Entre las variantes usadas con xito por la Ingeniera Gentica se encuentra la incorporacin de vectores de expresin con copias mltiples de casetes de expresin /1/. Sin embargo, la sobreexpresin del producto que no es ms que un rendimiento de expresin cercano al terico, solo se logra con la alteracin de algunas de las rutas del metabolismo. A pesar de haberse reconocido desde hace varias dcadas la necesidad de conocer mejor el metabolismo de la clula y usar esa informacin para el diseo de la mejor estrategia de operacin, siguen existiendo en la actualidad numerosos estudios basados en el tanteo y error para mejorar los rendimientos del producto de inters en los procesos de fermentacin. La ingeniera en una ruta metablica para obtener un producto determinado comienza generalmente con el anlisis de los pasos finales relacionados con el producto de inters. Sin embargo, tanto la velocidad de formacin como el rendimiento estn limitados en ltima instancia por la canalizacin del carbono desde el metabolismo central hacia la ruta de biosntesis del producto /2/. Entre las caractersticas de las rutas metablicas centrales se tiene la existencia de puntos de ramificacin o nodos hacia otras rutas de degradacin o biosntesis de otros metabolitos. Se trata entonces de conocer en qu nodo hay que hacer cambios de la regulacin enzimtica para favorecer el flujo de metabolitos por la ruta que tributa al producto de inters. Entre las Ciencias Biolgicas la Ingeniera Metablica es la rama que se encarga del estudio y la evaluacin de los cambios que se producen de forma dirigida en el metabolismo /3/. La modelacin matemtica del metabolismo celular es una fuente de generacin de nuevos conocimientos, proporciona un ahorro considerable de tiempo y experimentos, y es la base para la realizacin de trabajos de Ingeniera Metablica.

La modelacin matemtica del metabolismo es una tarea compleja debido al nmero grande de reacciones involucradas en los procesos, los sistemas de regulacin de las clulas para responder ante los cambios del entorno y el nmero de rutas alternativas para responder ante los cambios. Los modelos matemticos estequiomtricos del metabolismo celular describen la red metablica como un conjunto de ecuaciones estequiomtricas que representan las reacciones bioqumicas que ocurren. El objetivo de este trabajo es mostrar como mediante la simulacin matemtica de una red metablica se pueden determinar los nodos principales de la misma y el rendimiento terico del producto. Se toma como ejemplo de caso de estudio la sobreproduccin de lisina en Corynebacterium glutamicum y se comparan los resultados tericos con los obtenidos experimentalmente por /4/.

Fundamentacin terica
Clasificacin de los nodos de una red del metabolismo
Los nodos son puntos en una red metablica donde una secuencia de reacciones se bifurca entre dos o ms rutas metablicas diferentes /5/. La regulacin de una ruta metablica puede ocurrir a diferentes niveles, el primero a travs de la velocidad de reaccin de cada una de las reacciones enzimticas (depender del pH y de las concentraciones intracelulares del sustrato, del producto y del cofactor, que son los elementos primarios para la regulacin de la actividad enzimtica), el segundo nivel se efecta a travs de la accin de las enzimas reguladoras (muchas enzimas reguladoras son inhibidas por el producto final de la secuencia en la que actan), el tercer nivel es a travs del control gentico de la velocidad de sntesis de la enzima, y en los organismos multicelulares que poseen sistemas endocrinos, la regulacin metablica se ejerce an a otro nivel /6/ (las hormonas elaboradas por las glndulas endocrinas son mensajeros qumicos que pasan por la sangre hasta ciertos tejidos que constituyen su objetivo y en los que estimulan o inhiben actividades metablicas especficas).

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La Ingeniera Metablica se encarga de modificar la regulacin de las rutas en los dos primeros niveles, haciendo uso de varios conceptos como rigidez de la red y nodos principales. Los conceptos de rigidez de una red, nodos flexibles y rgidos fueron planteados por /5/. La sobreproduccin de un metabolito particular se puede realizar mediante la desregulacin de la ruta directamente asociada con la sntesis del mismo o por la transformacin de una clula hospedera mediante la introduccin de genes que codifican para la sntesis del producto de inters. Estas modificaciones sin embargo no necesariamente implican altos moles de producto rendimientos del producto (moles de sustrato ), ya que las distribuciones de flujos metablicos en los puntos ramales o nodos en el metabolismo primario (gluclisis, ciclo de los cidos tricarboxlicos, ruta de los fosfatos de pentosa) se redireccionan para asegurar un crecimiento balanceado de la clula. Esta resistencia inherente a la alteracin de los flujos metablicos se conoce como la rigidez de la red /5/. Aunque la actividad enzimtica global a travs de la rama para la obtencin del producto de inters indudablemente gobierna su velocidad de formacin, el rendimiento del producto es una funcin de las particiones o distribuciones de flujos que ocurren en los nodos de la red. Consecuentemente para lograr la sobreproduccin de un metabolito particular se requiere de alteraciones significativas de las distribuciones de flujos en los nodos del metabolismo primario comparadas con las distribuciones de flujos observadas para el crecimiento balanceado. No obstante el rendimiento del producto depende de la particin o distribucin de flujos que ocurre solamente en un pequeo nmero de todos los nodos que contiene la red metablica. Estos son los llamados nodos principales y su identificacin se realiza observando que en los mismos es donde ocurren los cambios ms significativos en las distribuciones de flujos como funcin del rendimiento del producto deseado. La distribucin de flujos requerida para el rendimiento es determinada por la tcnica del Anlisis de Flujos Metablicos con o sin datos experimentales.

Cuando la identificacin se realiza sin datos experimentales, se toman las distribuciones de flujos obtenidas de la simulacin de los rendimientos del producto de inters. Sobre la base de la rigidez de los nodos es posible clasificar las estructuras de control de la red metablica en tres categoras. Para comprender estas clasificaciones es importante tener en cuenta que la cintica de la rama est referida a la respuesta local de todas las enzimas que actan en la rama y que la razn de flujo de la rama est referida al flujo canalizado a travs de la misma entre el flujo que entra al nodo. Los nodos donde las particiones de flujos dentro de cada rama cambian fcilmente para satisfacer la demanda metablica se conocen como nodos flexibles . En un nodo flexible las enzimas participantes en cada rama muestran una afinidad similar por el sustrato y las velocidades de reaccin de cada rama son de igual magnitud. El flujo a travs de cada rama est controlado por una retroinhibicin ejercida por el metabolito terminal correspondiente (figura 1).

Fig. 1 Esquema de un nodo flexible, donde S es un metabolito intermedio, P el producto deseado y B otro producto que no es de inters. Las lneas discontinuas representan la retroinhibicin.

De esta manera la razn de flujo de la rama puede variar entre cero y uno para satisfacer la demanda ubicada en los metabolitos terminales. Por ejemplo, si la retroinhibicin ejercida por el metabolito P (figura 1) es eliminada o si P es un precursor de un producto deseado, la razn de flujo de la rama P se acercar a la unidad.

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Los nodos flexibles son los ms fciles para alterar la distribucin de flujos en las ramas y pocas veces requieren modificacin. Un nodo es dbilmente rgido si la particin de flujos en el mismo est dominada por la cintica de una de sus ramas. Esto puede ser el resultado de una alta actividad enzimtica o una alta afinidad enzimtica por el sustrato, lo que hace que se necesite una retroinhibicin en la rama dominante B (figuras 2 y 3).

No obstante, el rendimiento del producto puede ser mejorado si se atena la actividad enzimtica de la rama dominante B y se amplifica la actividad enzimtica de la rama subordinada P lo suficiente para que canalice el incremento del flujo. Los nodos dbilmente rgidos son generalmente tratados con tcnicas de seleccin-mutacin. Un nodo es fuertemente rgido si la razn de flujos de una o ms de sus ramas est controlada hermticamente. Esto ocurre comnmente por una combinacin de los controles por retroinhibicin y trans-activacin de la enzima por un metabolito en la rama opuesta (figuras 4 y 5).

Fig. 2 Esquema de un nodo dbilmente rgido, donde S es un metabolito intermedio, P el producto deseado y B otro producto que no es de inters. Las lneas discontinuas representan la retroinhibicin. La formacin de B ocurre en la rama dominante del nodo. La formacin de P ocurre en una rama subordinada.

Fig. 4 Esquema de un nodo fuertemente rgido, donde S es un metabolito intermedio, P el producto deseado y B otro producto que no es de inters. Las lneas discontinuas representan la retroinhibicin y las flechas discontinuas la activacin por el metabolito terminal de la rama opuesta.

Fig. 3 Ejemplo del nodo -oxoglutarato presente en el ciclo de los cidos tricarboxlicos. Las lneas discontinuas representan la retroinhibicin. La formacin de succinil-coa es la rama dominante del nodo alfa-oxoglutarato.

Aun cuando la rama subordinada P est desregulada (o sea que se elimine la retroinhibicin) o P sea un precursor de un producto deseado, una fraccin significativa del flujo seguir entrando a la rama dominante y limitar el rendimiento del producto.

Fig. 5 Ejemplo del nodo Fosfoenolpiruvato presente en la Gluclisis. Las lneas discontinuas representan la retroinhibicin y la flecha discontinua la activacin por el metabolito terminal de la rama opuesta. El aspartato (ASP) acta como inhibidor de la secuencia de reacciones en la rama en que se forma y a la vez como activador de la rama para la formacin del Acetil-Coa.

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En este caso particular adems de inhibir su propia sntesis, los metabolitos P y B actan con un efecto positivo en la rama opuesta. Esta arquitectura estabiliza las particiones de flujos en el nodo, proporcionando concentraciones en el estado estacionario de P y B lo suficientemente altas para inhibir su propia sntesis en ausencia de sus correspondientes activadores B y P respectivamente. Por ejemplo, si el flujo a travs de la rama B disminuye debido al incremento de la razn de flujos en la rama P, la velocidad de sntesis de P va a disminuir por la prdida de activacin por B y por el aumento de la inhibicin debido a la concentracin remanente de P, dejando la razn de flujos de cada rama prcticamente constante. Sin embargo, las simulaciones indican que el incremento de la demanda de P, la eliminacin de la retroinhibicin de P y bloqueando la demanda de B tienen un pequeo efecto en la razn de flujos de la rama P. La determinacin de la rigidez de los nodos se realiza solamente por la va experimental; y en funcin de esto ltimo se proponen las modificaciones genticas a realizar en la clula para logar el objetivo de la sobreproduccin del producto de inters.

velocidades de reaccin bajo la hiptesis de estado pseudoestacionario, justificada por el hecho de que los cambios metablicos son muy rpidos (milisegundos a dcimas de segundos) en comparacin con el crecimiento celular (horas a das) /10/. El modelo que se obtiene contiene una matriz cuyos elementos son los nmeros estequiomtricos de los diferentes metabolitos en las distintas reacciones. Entre las tcnicas de anlisis ms importantes que se aplican en la Ingeniera Metablica para la modelacin matemtica del metabolismo se encuentra la de Anlisis de Flujos Metablicos (MFA). Esta tcnica se emplea con el fin de describir el estado fisiolgico de la clula para las condiciones in vivo haciendo uso de mediciones de flujos externos en el medio de cultivo (que son el resultado del intercambio de nutrientes y productos entre la clula y el medio) para el clculo de los flujos internos (velocidades de las reacciones de la red). Si se toma como sistema a la clula, que intercambia materia con el medio exterior (medio de cultivo) se tiene para el metabolito i el siguiente balance de masa:
(1)

Modelacin matemtica del metabolismo. Anlisis de flujos metablicos

Los modelos matemticos ms usados para el metabolismo se pueden dividir en dos grupos: Los modelos cinticos y los modelos estequiomtricos o basados en restricciones. Los modelos cinticos brindan informacin acerca de la dinmica con que ocurren las reacciones en la clula, pero no han prevalecido sobre los estequiomtricos debido a la falta de informacin sobre las constantes cinticas de las enzimas para las condiciones in vivo /7/. Como una red integrada de reacciones qumicas, el metabolismo obedece a las leyes generales de la qumica como la ley de la conservacin de la masa /8, 9/. Para plantear el modelo estequiomtrico del metabolismo se toman en cuenta restricciones de balance de masa para cada metabolito, dadas por la estequiometra de las reacciones donde este participa, y se determinan los flujos metablicos internos o

donde: es la cantidad de sustancia del metabolito i. es el flujo de cantidad de sustancia del metabolito i que entra al sistema. es el flujo de cantidad de sustancia del metabolito i que sale del sistema. es el nmero estequiomtrico del metabolito i de tienen signo en la reaccin j. Los valores positivo cuando el metabolito i es producto de la reaccin y signo negativo cuando es reactivo en la reaccin. j es el grado de avance de la reaccin j. es la velocidad de la reaccin j o flujo metablico de la reaccin j. n es el nmero total de reacciones de la red metablica.

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Si para cada metabolito principal de la ruta metablica se plantea un balance de masa, incluyendo a la biomasa y el producto de inters y asumiendo un estado pseudoestacionario se obtiene un sistema de ecuaciones lineales que puede ser representado de forma matricial de la siguiente manera: Ax = q donde: A es una matriz de dimensin m n que contiene los nmeros estequiomtricos de los metabolitos en las reacciones. Siendo m el nmero de metabolitos balanceados y n el nmero de reacciones que componen la red metablica. (2)

x es el vector de dimensin n 1 que contiene los flujos metablicos o velocidades de reaccin de todas las reacciones que componen la red. q es el vector de dimensin m x 1 que contiene las velocidades netas de salida desde la clula de todos los metabolitos balanceados. La resolucin del modelo se realiza a travs del Mtodo de los Mnimos Cuadrados. La ventaja fundamental de la tcnica de MFA radica en que permite la determinacin exacta de la magnitud de los flujos metablicos (velocidades de reaccin) de una ruta in vivo /11/. Los flujos metablicos constituyen un determinante fundamental de la fisiologa de la clula, ya que indican una medida del grado de ajuste de varias rutas metablicas en las funciones celulares globales y procesos metablicos.

Fig. 6 Mapa de flujos metablicos para Saccharomyces cerevisiae con crecimiento anaerobio. Tomado de /7/.

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El resultado final que se obtiene con la aplicacin de la tcnica de MFA es un mapa de flujos metablicos mediante un diagrama de las reacciones bioqumicas y un estimado del flujo metablico para cada reaccin en el diagrama (figura 6). Estos mapas de flujos metablicos, contienen informacin til acerca de la contribucin de varias rutas a los procesos metablicos globales de consumo de sustratos y formacin de productos. Como con MFA se caracteriza la red metablica estudiada in vivo bajo diferentes condiciones ambientales, se puede entonces conocer mejor el funcionamiento dinmico de la clula. Adems de la obtencin de los flujos metablicos, el Anlisis de Flujos Metablicos puede proporcionar informaciones adicionales sobre otras caractersticas fisiolgicas importantes de las clulas como la identificacin de puntos de control (nodos rgidos) en las rutas celulares, el impacto que ha tenido una modificacin gentica realizada en la clula, la identificacin de rutas alternativas para la formacin del producto de inters, el clculo de los flujos extracelulares no medidos experimentalmente, y el clculo del mximo rendimiento terico para el producto de inters /11/.

La representacin de la red metablica de Corynebacterium glutamicum fue construida principalmente a partir de las redes que presentan las bacterias cidos glutmicas, aunque pueden existir diferencias entre ellas /13/. En este caso las rutas principales a considerar son la gluclisis, la ruta de los fosfatos de pentosa, el ciclo de cidos tricarboxlicos y sus rutas anaplerticas, la fosforilacin oxidativa y la biosntesis de glutamato, glutamina, alanina, valina y lisina. Tambin se toman en consideracin las formaciones de trealosa y de cido actico como productos colaterales del metabolismo central del carbono y la formacin de biomasa.

Anlisis de sensibilidad de la matriz de los nmeros estequiomtricos

El anlisis de la matriz que representa una red bioqumica cualquiera se hace a travs de los conceptos de lgebra Lineal, lo que permite traducir los conceptos y conocimientos matemticos a conceptos biolgicos y viceversa /14/. Es importante medir la sensibilidad o el grado de propagacin de los errores de la matriz. El anlisis de sensibilidad consiste en conocer si la matriz est bien-condicionada. Una matriz malcondicionada con pequeas variaciones en las mediciones experimentales provoca grandes cambios en los flujos metablicos calculados / 11/. Una medida de esta sensibilidad est dada por el nmero de condicin, definido como:
(3)

Materiales y metodos
Lnea celular. El microorganismo estudiado es la Corynebacterium glutamicum ATCC 21253 /4/
Obtencin de la matriz de los nmeros estequiomtricos El modelo matemtico se construy siguiendo las reglas generales para aplicar la tcnica de MFA descritas en /11/ y para establecer la ecuacin para la formacin de la biomasa se siguieron las reglas descritas en /12/. Para poder comparar los resultados tericos con los reportados por /4/ se tuvo en cuenta la informacin bioqumica reportada experimentalmente para esta lnea celular.

donde: representa alguna norma matricial. A representa la matriz de los nmeros estequiomtricos. AT representa la matriz transpuesta de los nmeros estequiomtricos. Si el nmero de condicin se encuentra entre 0 y 100 se dice que la matriz est biencondicionada, o sea que es poco sensible. Por el contrario si el nmero de condicin es mayor

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que 1 000 se dice que la matriz est malcondicionada.

Mtodo de los Mnimos Cuadrados

La solucin de mnimos cuadrados v del sistema Ax = q satisface la ecuacin normal AT Ax = AT q y recprocamente cualquier solucin de la ecuacin normal es solucin de mnimos cuadrados. Adems, si ATA es invertible, la solucin es nica y viene dada por v = (ATA)-1 ATq. La matriz (ATA)-1 AT es anloga con A-1, y se denomina indistintamente inversa generalizada de A o matriz pseudoinversa de A. La condicin necesaria para que ATA sea invertible es que el rango de A sea igual al nmero de columnas. El rango de una matriz no es ms que el nmero mximo de filas linealmente independientes, por lo que para cumplir la condicin necesaria el nmero de balances de metabolitos linealmente independientes tiene que ser igual al nmero de reacciones de la red metablica (nmero de incgnitas del sistema de ecuaciones). Debido a que la mayora de las clulas son capaces de utilizar una gran variedad de compuestos como fuentes de carbono, nitrgeno y energa; existen muchas rutas complementarias que operan al mismo tiempo y que incluidas en la matriz de los nmeros estequimtricos crean una dependencia lineal responsable de la variacin en el rango de la matriz /15/.

bacteria posee al menos tres sistemas fosfotransferasas habilitados para el consumo de glucosa, fructosa y sacarosa /13/. Para el caso de estudio la glucosa es el nico azcar presente en el medio de cultivo, por lo que el sistema de la glucosafosfotransferasa es el nico de los tres que pudiera estar activo. J. Vallino, 1991 /13/ demostr tambin que aunque Corynebacterium glutamicum posee la enzima glucoquinasa, es el sistema catalizado por la glucosa-fosfotransferasa el que est involucrado en el transporte y la fosforilacin de la glucosa extracelular, ya que la glucosafosfotransferasa presenta una mayor actividad que la otra enzima. Entre las cuatro rutas anaplerticas slo la fosfoenolpiruvatocarboxilasa ha sido detectada con una alta actividad en Corynebacterium glutamicum /13/. Por otra parte, aunque es indiscutible la existencia del ciclo del glioxilato en Corynebacterium glutamicum , su grado de induccin cuando hay glucosa en el medio de cultivo es bastante ambiguo (Vallino, J., 1991 /13/ determin experimentalmente que la actividad de la enzima que inicia el ciclo isocitrato liasa es inhibida por la glucosa presente en el medio de cultivo). Como la enzima es necesaria para el ciclo, si esta no tiene actividad no se tiene en cuenta en el modelo matemtico las reacciones que dependen de la misma. En la tabla 1 aparecen las reacciones que componen el modelo matemtico para el metabolismo de la bacteria en las condiciones de estudio.

Resultados y discusin

Seleccin del conjunto de reacciones que representan la red del metabolismo y el modelo matemtico
Para obtener la matriz de los nmeros estequiomtricos para aplicar la tcnica MFA se necesita hacer primeramente la seleccin de las rutas metablicas principales que aportan la energa y los precursores requeridos para la formacin de la biomasa, as como analizar las reacciones que forman la ruta biosinttica del producto de inters. En el caso de Corynebacterium glutamicum los anlisis genticos y bioqumicos indican que esta

Determinacin de la sensibilidad de la matriz de los nmeros estequiomtricos

La matriz obtenida que representa la red metablica (tabla 1) tiene una dimensin de 37 34 con un rango de 34 y un nmero de condicin de 59 por lo que es funcional matemticamente y poco sensible (el nmero de condicin es menor que 100. Cumplida esta condicin el modelo puede ser aplicado para la solucin de los problemas de inters.

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TABLA 1. REACCIONES DE LA RED DEL METABOLISMO PARA LA SOBREPRODUCCIN DE LISINA POR Corynebacterium glutamicum QUE FORMAN EL MODELO MATEMTICO

Aplicacin 1: Determinacin del mximo rendimiento terico de lisina a partir de glucosa en Corynebacterium glutamicum
Un primer estimado del rendimiento mximo terico para el producto de inters, se obtiene a partir de los balances de materiales por elementos (generalmente C, H, O, N) de la ecuacin global de un proceso de fermentacin en la que no se tiene en cuenta la formacin de biomasa: C fH g O h + aNH 3 + bO 2 = zC k H r O s N t + cH 2 O + dCO 2. En este caso se tienen cinco nmeros estequiomtricos desconocidos (a, b, z, c, d) y

cuatro balances elementales, de manera que para darle solucin al sistema es necesario aadir una ecuacin ms que sera la restriccin . El mximo rendimiento terico calculado por la estequiometria de la ecuacin global de moles de lisina fermentacin es de 0,857 moles de glucosa, o sea el 85,7 % de la glucosa es transformada a lisina. El problema principal asociado al clculo del rendimiento de esta manera, es la alta probabilidad de que exista una distribucin de flujos que no sea factible debido a que no se tienen en cuenta las restricciones bioqumicas de la clula.

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Es por esto que se realiza el clculo mediante la distribucin de flujos tericos. La distribucin terica de flujos es generada si se eliminan los balances de metabolitos que hacen a la matriz de los nmeros estequiomtricos sobredeterminada. As, las velocidades para la biomasa (reaccin 33 en las tablas 1 y 2), la glucosa (reaccin 1 en las tablas 1 y 2) y el producto de inters son fijadas en 0, -100 y Yp respectivamente, donde Yp es el rendimiento molar del producto (mol lisina/mol glucosa en la tabla 2), y se va simulando su valor hasta que se tenga una distribucin de flujos que no sea factible. Es en este

punto donde se obtiene el mximo rendimiento terico. De esta manera, se eliminan los balances de CO2, NH3 y O2 de la matriz de los nmeros estequiomtricos, lo que provoca un aumento del nmero de condicin a 881. Este valor es aceptable (el nmero de condicin es menor que 1 000) teniendo en cuenta que se encuentra en el intervalo establecido y especialmente si se considera que no existe incertidumbre en el valor del vector de las mediciones. En la tabla 2 se observan los resultados de los flujos metablicos de las diferentes reacciones obtenidos para los diferentes valores de rendimiento.

TABLA 2. DISTRIBUCIN DE FLUJOS TERICOS PARA DIFERENTES VALORES DE RENDIMIENTO DE LISINA A PARTIR DE GLUCOSA EN Corynebacterium glutamicum. LOS FLUJOS ESTN EXPRESADOS EN MMOL/L h

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Como puede observarse, la primera distribucin de flujos tericos que no es factible ocurre a un valor de rendimiento de lisina de 64 %. En esta situacin el flujo metablico de la reaccin 7 alcanza el valor de cero, y de seguir aumentando el rendimiento implicara valores de flujos negativos. Esto no sera posible debido a que dicha reaccin es irreversible. Vallino, J., 1991 /13/ demostr experimentalmente que en la bacteria Corynebacterium glutamicum existe actividad de la enzima PEP-sintetasa que cataliza la siguiente reaccin: PYR + ATP + H2O = PEP + AMP + Pi. Por tanto, para rendimientos mayores que 64 % esta reaccin sustituye a la reaccin 7, de manera que los flujos negativos con la nueva estequiometria den positivos, indicando que esta ltima reaccin es la que lleva a cabo la formacin del fosfoenolpiruvato. La prxima distribucin de flujos que no es factible ocurre para un valor de rendimiento de lisina de 75 %, en donde aquellas reacciones del ciclo de los cidos tricarboxlicos (reacciones 11 a 16 en las tablas 1 y 2) que son irreversibles alcanzan el valor de cero (reaccin 11), adems para ese rendimiento la reaccin de formacin de Acetil-CoA a partir de Piruvato que tambin es irreversible, su flujo metablico toma el valor de cero. Por tanto, bajo estas condiciones se alcanza un mximo de rendimiento terico de lisina de 75 %. Este valor, aunque es menor que el calculado por el balance de materiales por elementos de la ecuacin estequiomtrica que representa el proceso de fermentacin, es ms confiable debido a que tiene en cuenta las restricciones bioqumicas. As se puede

concluir que el concepto de mximo rendimiento terico no es tan concreto como se puede pensar. Para tener precisin, el mximo rendimiento terico reportado debe siempre estar acompaado por la bioqumica usada para determinarlo y la limitacin en que se incurri, como se hizo en este caso.

Aplicacin 2: Identificacin de los nodos principales de la red metablica para la sobreproduccin de lisina
Para la identificacin de los nodos principales se utilizan los valores de flujos obtenidos en la simulacin para conocer el rendimiento terico mximo. De la figura 7 se puede observar que los nodos principales de la red metablica son glucosa-6-fosfato, piruvato y fosfoenolpiruvato por mostrar los mayores cambios en su razn de flujos metablicos en funcin del rendimiento de lisina. Los cambios en el nodo oxalacetato se deben a los del nodo fosfoenolpiruvato, por lo que este tipo de nodo se conoce como principal trivial. Estos resultados (identificacin de los nodos principales) coinciden con los reportados en un trabajo experimental /13/. Se demuestra entonces que la simulacin matemtica es una va posible para la identificacin de los nodos principales de una red metablica. Una vez identificados los nodos principales debe determinarse por la va experimental el tipo de rigidez de cada uno; y en funcin de esto ltimo se proponen las modificaciones genticas a realizar en la clula para lograr el objetivo de la sobreproduccin del producto de inters. Esta es la esencia de la Ingeniera Metablica.

Fig. 7 Cambios en la relacin de flujos metablicos en los nodos presentes en la red metablica para la sobreproduccin de lisina.

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Conclusiones
La metodologa de Anlisis de Flujos Metablicos permite estimar el mximo rendimiento terico de un producto y a partir de las distribuciones de flujo determinar los nodos principales de la red metablica mediante la simulacin del funcionamiento de la red con el modelo matemtico que la describe. Esto se demuestra en el caso de estudio de la sobreproduccin de lisina en Corynebacterium glutamicum a partir de glucosa. La importancia del uso de la simulacin radica en el ahorro de tiempo y adems permite dirigir mejor los experimentos a realizar para la determinacin de la rigidez de los nodos identificados como principales.

11. STEPHANOPOULOS, G.; A. ARISTIDOU; J. NIELSEN. Metabolic Engineering: Principles and Methodologies . Academic Press, 1998. 12. ZUPKE, C.; G. STEPHANOPOULOS. Intracellular Flux Analysis in Hybridomas Using Mass Balances and in vitro 13 C NMR, Biotechnology and Bioengineering, Vol. 45, pp. 292-303, 1995. 13. VALLINO, J. "Identification of Branch-Point Restrictions in Microbial Metabolism Through Metabolic Flux Analysis and Local Network Perturbations". PhD Thesis, Massachusetts Institute of Technology, 1991. 14. SCHILLING, C.; S. SCHUSTER; B. PALSSON. "Metabolic Pathway Analysis: Basic Concepts and Scientific Applications in the Post-genomic Era". Biotechnology Progress. Vol. 15, pp. 296-303, 1999. 15. FERNNDEZ, O. "Modelacin matemtica del metabolismo, una base para trabajos de Ingeniera Metablica. Aplicacin a casos de estudio". Tesis de Diploma. Instituto Superior Politcnico "Jos Antonio Echeverra". Ciudad de La Habana, 2008.

Bibliografa
1. MANSUR, M."Sistema de obtencin de insulina humana a partir de Pichia pastoris". Tesis de Doctorado en Ciencias Biolgicas. Centro de Ingeniera Gentica y Biotecnologa. Universidad de La Habana. Ciudad de La Habana, 2007. 2. LIAO, J. C.; S. HOU; Y. CHAI. "Pathway Analysis, Engineering, and Physiological Considerations for Redirecting Central Metabolism". Biotechnology and Bioengineering. Vol. 52, pp. 129-140, 1996. 3. SHIMIZU, H. "Metabolic Engineering-Integrating Methodologies of Molecular Breeding and Bioprocess Systems Engineering. Journal of Bioscience and Bioengineering. Vol. 94, 563-573, 2002. 4. VALLINO, J.; G. STEPHANOPOULOS. "Metabolic Flux Distribution in Corynebacterium glutamicum During Growth and Lysine Overproduction". Biotechnology and Bioengineering. Vol. 41, pp. 633-646, 1993. 5. STEPHANOPOULOS, G.; J. VALLINO. "Network Rigidity and Metabolic Engineering in Metabolite Overproduction". Science. Vol. 252, pp. 1675-1681, 1991. 6. LEHNINGER, A. Principios de Bioqumica. Omega, 2005. 7. PATIL, K. R.; M. AKESSON; J. NIELSEN. "Use of GenomeScale Microbial Models for Metabolic Engineering". Current Opinion in Biotechnology. Vol. 15, 64-69, 2004. 8. CORTASSA, S.; A. IGLESIAS; D. LLOYD. An Introduction to Metabolic and Cellular Engineering. World Scientific, 2002. 9. KAUFFMAN, K. J.; P. PRAKASH; J. S. EDWARDS. "Advances in Flux Balance Analysis". Biochemical Engineering. Vol. 14, 491496, 2003. 10. FELL, D. "Metabolic Control Analysis: a Survey of its Theoretical and Experimental Development". Biochemical Journal, Vol. 286, pp. 313-330, 1992.

Nomenclaturas, smbolos y letras griegas

A: Adenosina AC: cido Actico AcCoA: Acetil-CoA ACE: Acetaldehdo ADP: Adenosina- Difosfato ALA: Alanina AMP: Adenosina-Monofosfato ARG: Arginina SN: Asparagina ASP: Aspartato ATP: Adenosina-Trifosfato CH: Carbohidratos CIT: Citrato CO2: Dixido de Carbono CoA: Coenzima A CTP: Citidina-Trifosfato CYS: Cistena DHAP: Dihidroxiacetona DHF: Dihidrofolato dTTP: Timidina- Trifosfato E4P: Eritrosa-4-Fosfato F1,6DP: Fructosa-1,6-Difosfato

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Revista Cubana de Qumica, pgs. 70-82

F6P: Fructosa-6-Fosfato FAD: Flavina Adenina Dinucletido FADH2: Flavina Adenina Dinucletido reducida FOR: Formiato FUM: Fumarato G1,3DP: 1,3 Difosfoglicerato G2P: 2- Fosfoglicerato G3P: 3-Fosfoglicerato G6P: Glucosa-6-Fosfato GAP: Gliceraldehdo-3-Fosfato GDP: Guanosina- Difosfato Glc: Glucosa GLN: Glutamina GLU: Glutamato GLY: Glicina GTP: Guanosina-Trifosfato H+: Ion Hidronio H2O: Agua HCO3-: Ion Hidrgeno Carbonato HIS: Histidina ILE: Isoleucina ISOCIT: Isocitrato LAC: Lactato LEU: Leucina LYS e: Lisina extracelular LYS: Lisina MAL: Malato MET: Metionina N10- Formil- THF: N10- Formil- Tetrahidrofolato N 5 - Formimino- THF: N 5- FormiminoTetrahidrofolato N 5, N 10- Metiln- THF: N 5, N 10- MetilnTetrahidrofolato NAD+: Nicotinamina Adenina Dinucletido NADH: Nicotinamina Adenina Dinucletido reducida NADP+: Nicotinamina Adenina Dinucletido Fosfato

NADPH: Nicotinamina Adenina Dinucletido Fosfato reducida NH3: Amonaco NH4: Amonio O2: Oxgeno OAA: Oxalacetato OLC: cido Oleico PEP: Fosfoenolpiruvato PHE: Fenilalanina. Pi: Fsforo Inorgnico PRO: Prolina PRPP: 5- Fosfo- Ribosa-Pirofosfato PYR: Piruvato QUI r: Quinona reducida QUI: Quinona R5P: Ribosa-5-Fosfato Ru5P: Ribulosa-5-Fosfato S7P: Sedoheptulosa-7-Fosfato SER: Serina SO32-: Ion Sulfito SUC: Succinato SucCoA: Succinil-CoA THF: Tetrahidrofolato THR: Treonina TRE: Trealosa TRP: Triptfano TYR: Tirosina UTP: Uridina- Trifosfato VAL: Valina X5P: Xilulosa-5-Fosfato KG: -Oxoglutarato ij nmero estequiomtrico del metabolito i en la reaccin j j grado de avance de la reaccin j (cantidad de sustancia/volumen) velocidad de la reaccin j o flujo metablico de la reaccin j (cantidad de sustancia/volumen tiempo)

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