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PRCTICA N: 1: DESNATURALIZACIN DE UNA PROTENA - LECHE

OBJETIVOS Desnaturalizacin de una protena. Determinar el procedimiento adecuado para la desnaturalizacin de una protena

FUNDAMENTO Las protenas se desnaturalizan cuando pierden su estructura tridimensional (conformacin espacial) y as el caracterstico plegamiento de su estructura. Las protenas son filamentos largos de aminocidos unidos en una secuencia especfica. Son creadas por los ribosomas que "leen" codones de los genes y ensamblan la combinacin requerida de aminocidos por la instruccin gentica, en un proceso conocido como transcripcin gentica. Las protenas recin creadas experimentan una modificacin posmodificacin en la que se agregan tomos o molculas adicionales, como el cobre, zinc e hierro. Una vez que finaliza este proceso, la protena comienza a plegarse sin alterar su secuencia (espontneamente, y a veces con asistencia de enzimas) de forma tal que los residuos hidrfobos de la protena quedan encerrados dentro de su estructura y los elementos hidrfilos quedan expuestos al exterior. La forma final de la protena determina cmo interaccionar con el entorno. Si la forma de la protena es alterada por algn factor externo (por ejemplo, aplicndole calor, cidos o lcalis), no es capaz de cumplir su funcin celular. ste es el proceso llamado desnaturalizacin. Prdida de funcin; La mayora de las protenas pierden su funcin biolgica cuando estn desnaturalizadas, por ejemplo, las enzimas pierden su actividad cataltica, porque los sustratos no pueden unirse ms al centro activo, y porque los residuos del aminocido implicados en la estabilizacin de los sustratos no estn posicionados para hacerlo. Los agentes que provocan la desnaturalizacin de una protena se llaman agentes desnaturalizantes. Se distinguen agentes fsicos (calor) y qumicos (detergentes, disolventes orgnicos, pH, fuerza inica). Como en algunos casos el fenmeno de la desnaturalizacin es reversible, es posible precipitar protenas de manera selectiva mediante cambios en: La polaridad del disolvente disminuye cuando se le aaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la acetona. Con ello disminuye el grado de hidratacin de los grupos inicos superficiales de la molcula proteica, provocando la agregacin y precipitacin. Los disolventes orgnicos interaccionan con el interior hidrfobo de las protenas y desorganizan la estructura terciaria, provocando su desnaturalizacin y precipitacin. La accin de los detergentes es similar a la de los disolventes orgnicos. Un aumento de la fuerza inica del medio (por adicin de sulfato de amonio, urea o cloruro de guanidinio, por ejemplo) tambin provoca una disminucin en el grado de hidratacin de los grupos inicos superficiales de la protena, ya que estos solutos compiten por el agua y rompen los puentes de hidrgeno o las interacciones electrostticas, de forma que las molculas proteicas se agregan y precipitan. En muchos casos, la precipitacin provocada por el aumento de la fuerza inica es reversible. Mediante una simple dilisis se puede eliminar el exceso de soluto y recuperar tanto la estructura como la funcin original. A veces es una disminucin en la fuerza inica la que provoca la precipitacin. As, las protenas que se disuelven en medios salinos pueden

desnaturalizarse al dialisarlas frente a agua destilada, y se renaturalizan cuando se restaura la fuerza inica original... El pH ;Los iones H+ y OH- del agua provocan efectos parecidos, pero adems de afectar a la envoltura acuosa de las protenas tambin afectan a la carga elctrica de los grupos cidos y bsicos de las cadenas laterales de los aminocidos. Esta alteracin de la carga superficial de las protenas elimina las interacciones electrostticas que estabilizan la estructura terciaria y a menudo provoca su precipitacin. La solubilidad de una protena es mnima en su punto isoelctrico, ya que su carga neta es cero y desaparece cualquier fuerza de repulsin electrosttica que pudiera dificultar la formacin de agregados. Cuando la temperatura es elevada aumenta la energa cintica de las molculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de las protenas, y se desnaturalizan. Asimismo, un aumento de la temperatura destruye las interacciones dbiles y desorganiza la estructura de la protena, de forma que el interior hidrfobo interacciona con el medio acuoso y se produce la agregacin y precipitacin de la protena desnaturalizada..

Desnaturalizacin de la Leche: Desnaturalizacin irreversible de la protena de la leche y prdida de solubilidad, causadas por la alta temperatura (mientras se la fre). En muchas protenas la desnaturalizacion no es reversible; esto depende del grado de modificacin de las estructuras de la protena. Aunque se ha podido revertir procesos de desnaturalizacin quitando el agente desnaturalizante, en un proceso que puede tardar varias horas, incluso das; esto se debe a que el proceso de reestructuracin de la protena es tentativo, es decir, no asume su forma original inmediatamente, as muchas veces se obtienen protenas distintas a la inicial, adems con otras caractersticas como insolubilidad (debido a los agregados polares que puedan unrsele). Recientemente se ha descubierto que, para una correcta renaturalizacin, es necesario agregar trazas del agente desnaturalizante. Esto fue importante histricamente, porque condujo a la nocin de que toda la informacin necesaria para que la protena adopte su forma nativa se encuentra en la estructura primaria de la protena, y por lo tanto en el ADN que la codifica. Un ejemplo clsico de desnaturalizacin de protenas se da en la clara de los huevos, que son en gran parte albminas en agua. En los huevos frescos, la clara es transparente y lquida; pero al cocinarse se torna opaca y blanca, formando una masa slida intercomunicada. Esa misma desnaturalizacin puede producirse a travs de una desnaturalizacin qumica, por ejemplo volcndola en un recipiente con acetona. Otro ejemplo es la nata (nombre que proviene de la desnaturalizacin, que se produce por calentamiento de la lacto albmina de la leche (y que no tiene nada que ver con la crema) La protena de la leche se llama casena y se desnaturaliza cuando el pH de la leche se modifica. Esto se le conoce en lo cotidiano Se cort la leche. La casena se desnaturaliza cuando le agregas a un vaso de leche suficiente jugo de limn para modificar el pH de la leche. Estado nativo Estado desnaturalizado

PARTE EXPERIMENTAL

Materiales:

Tubo de Ensayo Guantes Mascarilla Gradilla Varilla de Agitacin Mascarilla

Embudo Papel Filtro Gotero Soporte Universal o Trpode Vaso Precipitado Rejilla Agua Termmetro Pinzas de Madera

Reactivos

cido Actico (CH3-COOH) cido Ntrico (HNO3) Leche Entera

El objetivo del procedimiento mencionado es primero identificar protenas y segundo es observar la desnaturalizacin de las protenas que pertenecen a la leche bovina. Procedimiento: Primero que nada hay que dividir la leche en sus componentes: suero y casena. Para ello tomamos 100ml de leche y se calienta entre 60C y 70C, se deja reposar unos 3minutos. Se extrae la capa superior (conocida como nata) y se aaden 5ml de cido actico (puede tambin usarse vinagre), en un lapso de 1minutos revolviendo con la varilla de agitacin la leche ya separo sus componentes, entonces se filtra usando un embudo y papel filtro. A continuacin se separa en un tubo de ensayo unos 10ml de suero y se aaden 3ml de cido ntrico, espontneamente una reaccin xantoprteica, cambiando a un color amarillo. Por lo que esta reaccin revela la presencia de protenas.

Conclusin: El suero al estar compuesto por protenas solubles, son sensibles al cambio de pH, entonces al mezclarse con un cido fuerte como el cido ntrico que desnaturaliza fcilmente una protena, se genera espontneamente esta reaccin lo que confirma la presencia de protenas. Tambin este experimento se puede realizar con la leche entera sin separar, ya que tanto el suero como la casena contienen protenas, para esta experiencia en el suero se aprecia mejor la reaccin.

Tambin hay otros mtodos que verifican la existencia de protenas. Procedimiento: Tomar 10ml de leche y agregar reactivo biuret. Para apreciar presencia de protenas se debe forma debajo de la capa del reactivo un anillo de color malva. Para preparar el reactivo biuret se debe mezclar suero1 con hidrxido de sodio Na(OH) al 40%, en este procedimiento se hizo a escala menor, se us solo 1ml de suero y 0,4gr de hidrxido de sodio, hay que ser precisos entonces en ese caso se usa la balanza electrnica, una vez obtenido los 0,4gr de Na(OH) se disuelve en agua destilada y se mezcla con el suero, a continuacin se mezcla con el Sulfato de Cobre disuelto en agua destilada (una solucin de Cu(SO4) muy diluido). El resultado mostro evidentemente que presencia de protenas fue positiva.

PRACTICA N: 2 PREPARACION DEL BUFFER

BUFFER con pH = 4 (3ml CH3COOH 0,2M + 7ml CH3COONa 0,2 M) Datos: Densidad: 1,1 g/mol (98% V7V) V=? [ ]= [ ]= [ ]=17,97 M Si se tiene que: V1 x C1=V2 x C2 x. 17,967= 50ml x (0.2) CH3COOH

x =0,567 Acido Actico -50ml

CH3COONa .3H2O 60g-------- 1M -------1000ml X -----------0,2M ------50 ml X= 0,6 g CH3COONa .3H2O

0.6 g-----100% X -------98% X= 0,58 g V= 0,58 g / 1,1049 V= 0,56 ml de Acetato de Sodio

PRACTICA N: 3 EXTRACCIN DEL ALMIDON EN CARNE DE RES

OBJETIVOS: FUNDAMENTOS: Probablemente no existe otro compuesto orgnico tan ampliamente distribuido en los vegetales como el almidn. Es el producto de asimilacin ms importante de la fotosntesis y constituye la principal sustancia de reserva de los vegetales. Qumicamente el almidn o fcula es un polisacrido homogneo que est formado por una mezcla de dos polisacridos estructuralmente diferentes: amilosa y amilopectina. - Amilosa es una molcula lineal compuesta por 250 a 300 unidades de -D-glucopiranosa enlazadas por uniones 1-4. Recordar los conceptos de hidrlisis al realizar la prctica. Identificar la estructura del almidn. Reconocer que compuestos da por hidrlisis el almidn.

- La amilopectina es ramificada, constituida por 1.000 a 3.000 unidades de glucosa conectadas por uniones 1-4 y 16 en los puntos de ramificacin. El almidn es insoluble en agua fra; en agua caliente se hincha formando engrudo; se tie de azul a azul violeta con sol. R lugol; da glucosa como producto final de la hidrlisis total. Se usa en la alimentacin; por degradacin parcial se obtiene una mezcla de polisacridos denominados como dextrina; obtencin industrial de glucosa por hidrlisis total; como reactivo indicador en yodometra; como apresto de textiles y papel, etc. Como es sabido, el almidn est formado por la fraccin amilosa de cadena recta de molculas de glucosa unidas por enlaces glucosdicos alfa-1,4; en tanto que la fraccin amilopectina, adems de la cadena recta, presenta ramificaciones con enlaces glucosdicos 1,6. El alfa-amilasa cataliza la hidrlisis de la cadena lineal (amilosa) y la ramificada (amilopectina) del almidn, rompiendo enlaces 1,4 interiores (endoamilasa) para formar una mezcla de dextrinas; Por ello se la conoce como enzima dextrinognica (mezcla de amilodextrina, eritrodextrina, acrodextrina y maltodextrina) con poca produccin de maltosa. Por su accin, el alfa-amilasa provee de fragmentos menores que pueden ser utilizados por la enzima beta-amilasa. La enzima alfa-amilasa requiere de un activador como, por ej., cloruro de sodio. Es sensible a una acidez elevada y se vuelve inactiva a pH 3,3 o a pH menor a 0C por 15 min. El pH ptimo de accin est dentro del rango 5-7, siendo de 6,5 para la alfa-amilasa bacteriana y pancretica. La enzima es resistente al calor, pues a 70C conserva un 70% de su actividad. Acta sobre almidones crudos y gelatinizados. Fundamentalmente: - La hidrlisis cida por accin del HCl a 100C produce una hidrlisis total del almidn y forma glucosa, maltosa, e isomaltosa. - La hidrlisis enzimtica por accin de la enzima alfa amilasa produce una hidrlisis parcial produciendo maltosa, glucosa y dextrina lmite que es una cadena ramificada y para poder romperla se necesita de -1-6 glucosidasa.

PARTE EXPERIMENTAL:

Materiales

Vaso precipitado Bagueta Embudo Papel filtro Soporte universal Reactivos: Agua destilada cido clorhdrico HCl 6N Etanol 95% Hidroxido alcohlico al 8% Muestra Eter Dietilico

PROCEDIMIENTO:

Pesar 10g de la muestra preparada en un beaker de 50 ml y con la ayuda de 50 ml de solucin de KOH alcohlico al 8%, trasferir la muestra cuantitativamente en un erlenmeyer de 250 ml y colocar en bao de agua hirviente agitando frecuentemente hasta disolver totalmente la muestra. Agregar 100 ml de alcohol al 50% dejar en bao de agua hirviendo aproximadamente por media hora; enfriar7 sedimentar y decantar el lquido sobrenadante filtrndolo por papel whatman N1 con embudo buchner. Lavar el papel filtro con 60 ml de KOH acuoso al 6%, recogiendo el lavado en un beaker de 250 ml, llevar a bao de agua hirviendo durante media hora agitando frecuentemente, enfriar y transferir a un baln de 250 ml con ayuda de agua destilada, enrasar y dejar reposar por 1 hora. Tomar una alcuota con pipeta volumtrica de 5 ml (sin agitar ni tomar del fondo del baln) y trasferir a un beaker de 250 ml, acidificar con cido actico (aproximadamente 2 ml) y agregar 50 ml de etanol al 95% para precipitar el almidn, se deja en reposo por media hora. Filtrar a travs del embudo Buchner con papel doble whatman N2, previamente desecado (en un pesafiltro), en estufa a 105 C por 1 hora y pesado. Lavar cuidadosamente con volmenes pequeos (aproximadamente. 10 ml) de etanol al 50% luego con alcohol absoluto y por ultimo con ter dietlico. Desecar el papel (en el papel filtro) en estufa a 105 C por 4 horas y pesar la diferencia entre las dos pesadas representa el contenido de almidn presente en la muestra.

Hidrlisis Acida: Agregar 20 ml de almidn al 2% en una fiola, luego agregar 1ml de HCl concentrado, mezclar, llevar a un bao de Mara hirviendo, anotar el tiempo de inicio de la hidrlisis, luego cada 5 minutos hacer una reaccin con lugol en una placa de porcelana. Hacer la reaccin hasta que ya no haya el color negruzco sino que adquiera el color del lugol que es como caf. Anotar el tiempo de la hidrlisis cida y la fiola siempre debe estar en el bao. Se hizo una prueba de fehling para ver la presencia de glucosa. Conclusiones: La carne no presenta mucho almidn, como es en el caso del pollo, la tcnica no resulta muy til si se trabaja con grandes cantidades de muestra.

PRACTICA N: 5 OBTENCION DEL COLESTEROL EN HIGADO DE POLLO

OBJETIVO

El alumno, aprovechando las

propiedades de solubilidad de los lpidos en solventes orgnicos, extraer el colesterol a partir de una muestra de hgado.

FUNDAMENTOS Los lpidos son una familia muy heterogenia de substancias en

cuanto a su composicin qumica; sin embargo, casi todos comparten una propiedad comn, ser solubles en solventes orgnicos (ter, cloroformo, acetona etc.). Existen 3 grupos fundamentales de lpidos:

1.- Los simples: formados por la unin de un alcohol ms cido graso (grasas, aceites, ceras). 2.- Los compuestos: adems de alcohol y cidos grasos, contiene en su molcula otra sustancia, por ejemplo los fosfolpidos (contiene fosforo en su molcula)

3.- Los derivados: de estructura muy variable y compleja, derivan de una estructura bsica repetitiva llamada unidad isoprenoide. Ejemplo de este grupo: el colesterol.

El colesterol es un compuesto de tipo lipidito, que solo existe en los productos de origen animal (los vegetales no contienen colesterol), se halla en numerosos alimentos, pero aun cuando nos alimentemos con aquellos que no lo contengan, siempre abra colesterol en nuestro cuerpo, o en el de los animales, dado que el hgado lo produce, y otras clulas tambin, de aqu que este ampliamente difundido en muchas clulas del cuerpo.

El colesterol realiza constantes funciones dentro del organismo, pero su exceso puede llegar a ser perjudicial. Puede acumularse en el interior de los vasos sanguneos, reduciendo la luz de los mismos (arteriosclerosis).

Materiales

Licuadora 2 vasos p.p. 1000 ml 1 vaso p.p. 250 ml 1 varilla de vidrio 1 embudo buchner 1 matras kitasato 1 bomba de vaco 2 papel filtro 1 matraz baln 500 ml con brazo

PARTE EXPERIMENTAL

1.- Pese 25 gr, de hgado de pollo. 2.- Colquelos en un vaso de licuadora y anadeles 100 ml de acetona. 3.- Licuar durante 1 min. 4.- Pasar el licuado a un vaso de p.p. de 1000 ml. 5.- Lavar el vaso de la licuadora con 15 ml de acetona y vaciar este lavado al vaso de p.p. de 1000 ml, para mezclarlo con el que tiene el paso 4. 6.- Agitar por 10 minutos usando una varilla de vidrio.

7.- Filtrar la suspensin a travez de un embudo bucher, montado sobre el matraz kitasato, el cual a su vez se conecta a la bomba de vaco. 8.- Pasar el filtrado del martaz kitasato a un vaso de precipitado de 1000 ml; conservar este filtrado. 9.- Tomar el residuo que queda en el embudo buchner, y pasarlo al vaso de la licuadora usando 50 ml de acetona. 10.- Licuar durante un minuto. 11.- Filtrar a travs del embudo buchner tal y como hizo en el paso 7. 12.- Mezclar el filtrado obtenido en el matraz kitasato con el del vaso de precipitado que contiene el filtrado del paso 8. 13.- Transferir los filtrados del paso 12 a un matraz baln de 1000 ml. 14.- Armar el equipo de destilacin (refrigerante), conectarlo con el matraz baln. (Pida ayuda de su instructor). Abrir la llave del agua. 15.- Aplicar calor suave al matraz baln para eliminar la acetona por destilacin. 16.- Una vez destilada toda la acetona, enfriar el matraz baln en agua corriente. 17.- Disolver el material del matraz del baln en un volumen mnimo de alcohol caliente. 18.- Filtrar aun en caliente, a travs de papel filtro (colocado sobre un embudo). 19.- Secar el colector al aire y anote el rendimiento en peso (considere descontar el peso del papel filtro).

Conclusiones A pesar de que en higado existen numerosos lpidos como: cidos grasos, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas, fosfatidilcolinas, esfingolipidos, etctera, estas no son soluble en acetona, por lo tanto, no son extriados del cerebro. El colesterol si es soluble en acetona, y al usar alcohol caliente se puede cristalizar, de ai que se espere obtener en el papel filtro estos cristales de colesterol. Para comprobar que esto es realmente colesterol, se podra aplicar posteriormente sobre el producto la prueba de lieberman-burchard (dara color verde muy intenso), a la prueba de salkowski (2 capas de color, una rojiza en la porcin superior y una amarillenta en la porcin anterior).

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